KR20050025631A

KR20050025631A - 칸디다 보이디나이로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소를사용하는 결합된 효소 반응 시스템

Info

Publication number: KR20050025631A
Application number: KR1020057001042A
Authority: KR
Inventors: 하랄트 그뢰거; 베르너 훔멜
Original assignee: 데구사 아게
Priority date: 2002-07-20
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2005-03-14
Also published as: EP1523565A1; CN1668753A; US20060068458A1; AU2003246390A1; WO2004009825A1; JP2005533496A

Abstract

본 발명은 유기상과 수성상으로 이루어진 2상 시스템에서 수행되는 결합된 효소 반응 시스템에 관한 것이다. 본 시스템은, 칸디다 보이디나이로부터 유래된 FDH에 의해 효소적으로 계속 재생되는 보조효소-의존성 효소로 수행된다.

Description

칸디다 보이디나이로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소를 사용하는 결합된 효소 반응 시스템{COUPLED ENZYMATIC REACTION SYSTEM USING A FORMATE DEHYDROGENASE DERIVED FROM CANDIDA BOIDINII}

본 발명은 2개의 상을 가지는 용매 혼합물 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 효소에 의해 수행되는 결합된 반응 시스템에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 보조효소-의존성 효소에 의한 유기 화합물의 전환 및 동일 시스템 내에서 칸디다 보이디나이(Candida boidinii)(또는 이에 기초한 돌연변이)로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소를 사용하는 효소에 의한 보조효소 재생을 포함하는 반응 시스템에 관한 것이다.

광학적으로 활성인 유기 화합물, 예를 들면 알콜 및 아미노산의 생촉매 수단에 의한 단리는 그 중요성이 증가하고 있다. 보조효소 재생을 포함하는 2개의 탈수소효소의 결합 사용은 상기 화합물의 산업적인 대규모 합성 방법으로 입증되었다(DE 197 53 350).

트리메틸 피루베이트의 L-슈도류신(pseudoleucine)으로의 환원 아미노화의 과정에서 칸디다 보이디나이로부터 유래된 NAD-의존성 포르메이트 탈수소효소를 이용하는 동일 반응 시스템 내에서의 NADH의 재생(문헌[Bommarius et al. Tetrahedron Asymmetry 1995, 6, 2851-2888])

이들의 촉매 특성 및 효율 외에도, 수성 매질에서 효율적으로 사용되는 생촉매는, 수많은 합성 금속 함유 촉매와 다르게 금속 함유 공급 물질, 특히 중금속을 함유하여 독성인 공급 물질의 사용이 불필요하게 될 수 있다는 장점을 추가적으로 갖는다. 게다가, 고가의 해로운 환원제(예컨대, 보란)의, 예를 들면 비대칭 환원의 과정에서의 사용 또한 불필요하게 될 수 있다.

그러나, 난수용성 기질의 전환 과정에서 어려움이 발생한다. 난수용성 생성물과 관련하여서도 유사한 어려움이 존재한다. 특히, 상기 개념에 따른 광학적으로 활성인 알콜의 제조에 그러하며, 이는 출발 화합물로서 필요한 케톤이 반응식 1에서 사용되는 α-케토산 보다 명백하게 더 낮은 용해도를 갖기 때문이다.

원칙적으로 고려할 수 있는 한가지 해결책은 극성 유기 용매 내에 또는 이의 수성 용액 내에서 알콜 탈수소효소 및 포르메이트 탈수소효소를 사용하는 생촉매 환원을 수행하는 것일 수 있다. 이 경우, 두 효소 모두와 기질과 임의적으로 생성물이 용해성이어야 한다. 그러나, 유기 용매가 직접적으로 존재함으로 인한 일반적인 단점은 이들 조건하에서 일반적으로 발생하는 효소 활성의 상당한 감소에 의한 것이다(예를 들면, 문헌[Anderson et al., Biotechnol. Bioeng. 1998, 57, 79-86] 참조). 특히, 지금까지 산업적인 규모로 사용되고 상업적인 양으로 입수가능한 유일한 NADH 재생 효소인, 칸디다 보이디나이로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소는 유감스럽게도 유기 용매에 높은 민감도를 나타낸다(EP 1 211 316). 이는, 또한 유기 용매 성분으로 각각의 경우 단지 10 부피%의 보충적인 양으로 DMSO, 술폴란, MTBE, 아세톤, 이소프로판올 및 에탄올 등을 사용한 비교예 1로부터도 입증된다(도 1 참조).

유기 용매의 존재하에서 칸디다 보이디나이로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소의 안정화에 관련한 이 문제를 해결하려는 다양한 접근법, 예를 들면 표면-활성 물질로서 계면활성제의 추가적인 사용을 통한 반응의 수행이 알려져 있다. 그러나, 대략 40 (!)배나 감소되는 반응 속도 및 포르메이트 탈수소효소 발생의 저해(문헌[B. Orlich et al., Biotechnol. Bioeng. 1999, 65, 357-362])는 이 경우의 단점인 것으로 판명되었다. 게다가, 상기 저자는, 알콜 탈수소효소의 낮은 안정성 때문에 이들 조건하에서의 마이크로에멀젼의 환원 방법은 경제적이지 않음을 언급하고 있다. EP 340 744에 기재된 방법으로 수성 및/또는 유기상의 존재하에 이액성 중간상(lyotropic mesophase)이 반응 부위로서 선택되는 방법 또한 본질적으로 마찬가지이다.

생촉매 반응의 수행을 위한 또다른 기본적인 가능성은 유기 용매 내에 고정화 효소의 사용, 또는 물과 수-혼화성 유기 용매로 이루어진 균질 용액 내에 효소의 사용을 포함한다. 그러나, 유기 용매와 효소의 직접적인 접촉이 발생하는 이들 기술의 성공은 일부 효소군, 특히 가수분해효소에 제한되어 있다. 예를 들어, DE 44 36 149에서는, "유기 용매(수-혼화성 또는 수-비혼화성)의 직접적인 존재는 가수분해효소 군에 속하는 단지 일부 효소에 의해서만 허용된다"고 언급되어 있다. 다른 효소군으로부터의 일부 추가의 예가 한편으로는 알려졌지만(특히, 효모로부터 유래된 FDH 및 옥시니트릴라제), DE 44 36 149에서의 언급은 대부분의 효소에 대해 여전히 유효하다. 예를 들면, 칸디다 보이디나이로부터 유래된 FDH의 효과적인 고정화는 알려지지 않았다. 게다가, 고정화 그 자체는 고정화 단계 뿐만 아니라 고정화 물질에 기인한 추가적인 비용을 수반한다.

따라서, 효소의 불활성화 또는 변성의 위험 때문에 유기 용매의 존재를 피하는 방법이 산업적으로 발달되었다. 예를 들면, DE 44 36 149는 생성물-투과성 멤브레인, 특히 소수성 멤브레인을 통해 반응 용액으로부터 유기 용매로 생성물을 추출하는 방법을 기술한다. 그러나, 교반 탱크 반응기에서의 표준 방법과 비교하면, 이 방법은 기술적으로 분명히 더 복잡하며, 게다가 필수적인 유기 멤브레인 또한 추가적인 비용 요인이다. 게다가, 이 방법은 연속 공정에만 적절하다. 더욱이, 이 절차를 이용하여 달성가능한 시공간 수율이 비교적 낮다는 단점이 있다. 예를 들면, 아세토페논의 환원 과정에서 단지 88 g/(L*d)의 시공간 수율이 얻어진다(문헌[S. Rissom et al., Tetrahedron: Asymmetry 1999, 10, 923-928]). 이와 관련하여, 아세토페논 그 자체는 상대적으로 양호한 수용성 케톤이나, 대부분의 유사체인 치환된 아세토페논 케톤 및 동족 케톤은 매우 낮은 용해도를 지니므로 전형적인 소수성 케톤에 대한 시공간 수율은 현저히 더 낮음을 알아야 한다. 이러한 상당한 단점에도 불구하고, 이 방법이 지금까지 단리된 효소를 사용하는 난수용성 케톤의 비대칭 생촉매 환원에 대한 바람직한 방법으로 여겨지고 있다(문헌[A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Industrial Biotransformations, Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 2000, pp. 103-106] 또한 참조).

요약하면, 현재 상기에 열거된 단점을 피할 수 있게 하고, 유기 용매의 "직접적인" 존재하에 칸디다 보이디나이(또는 이에 기초한 돌연변이)로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소를 사용하는 산업적인 규모에서 난수용성 기질의 효소에 의한 제조를 가능케 하는 방법은 알려져 있지 않음을 결과적으로 알 수 있다.

도 3은 종말 여과를 사용하는 멤브레인 반응기를 도시한다. 펌프 (2)를 경유하여 기질 (1)을 멤브레인 (5)를 갖는 반응 챔버 (3)으로 옮긴다. 용매와 더불어 촉매 (4), 생성물 (6) 및 비전환된 기질 (1)이 교반기가 구동되는 반응기 챔버에 위치한다. 주로 저분자 생성물 (6)이 멤브레인 (5)를 통하여 여과된다.

도 4는 교차흐름 여과를 사용한 멤브레인 반응기를 도시한다. 여기서 기질 (7)을 펌프 (8)을 경유하여 또한 용매, 촉매 (9) 및 생성물 (14)가 위치한 교반 반응기 챔버 내로 옮긴다. 펌프 (16)을 통하여 용매의 흐름을 설정하고, 임의적으로 존재하는 열교환기 (12)를 통하여 교차흐름 여과 셀 (15)로 이르게 한다. 여기서, 저분자 생성물 (14)가 멤브레인 (13)을 통하여 분리된다. 고분자 촉매 (9)를 후속적으로 용매의 흐름을 이용하여, 임의적으로는 열교환기 (12)를 다시 경유하여, 임의적으로는 밸브 (11)을 경유하여, 반응기 (10)으로 다시 인도한다.

따라서, 본 발명의 목적은, 특히 난수용성 유기 화합물이, 산업적인 규모의 전환이 경제적으로 및 생태학적으로 이로운 조건 하에서 수행될 수 있을 만큼 충분한 정도로 결합된 보조효소-의존성 효소에 의한 전환에 이용될 수 있는 방법에 대한 가능성을 구체화 하는 것이다. 특히, 한 목적은 이러한 방법이 난수용성 케톤의 환원에 적절하여야 하고, 유기 용매의 "직접적인" 존재하에(즉, 소수성 멤브레인에 의한 분리 없이) 칸디다 보이디나이로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소의 사용을 가능하게 해야 한다는 것이다.

이 목적은 청구의 범위에 기재된 방식으로 달성된다. 청구항 1 내지 8은 본 발명에 따라 수행되는 반응 시스템에 관한 것이다. 청구항 9는 장치에 관한 것이다. 청구항 10은 본 발명에 따라 수행되는 방법에 관한 것이며, 청구항 11 및 12는 본 발명에 따른 반응 시스템의 바람직한 용도에 관한 것이다.

수성상이 액체 유기상과 접촉하는 2상 용매 시스템 내에서, 알콜 탈수소효소를 이용한 유기 화합물의 NADH-의존성 효소에 의한 전환 및 칸디다 보이디나이 또는 이의 돌연변이로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소를 이용한 NADH의 효소 재생을 포함하는 결합된 효소 반응 시스템을 이용함으로써, 언급된 목적으로의 해결책이, 특히 예견할 수 없는 본 발명에 따른 수단에 의해 놀랍고, 특히 이로운 방식으로 얻어진다. 선행 문헌으로부터 추론될 수 있는 견해와는 반대로, 유기 용매의 존재에도 불구하고, 산업적인 규모에서 충분한 시공간 수율로 결합된 효소 반응 시스템을 효소 중 하나의, 특히 칸디다 보이디나이로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소의 용매에 기인한 활성의 손실 없이 수행하게 하는 것이 놀랍게도 가능하다. FDH는 유기체인 칸디다 보이디나이로부터 유래되거나, 또는 동일한 유기체의 추가로 개발된 rec-돌연변이 또한 사용될 수 있다(DE 197 53 350). C23S/C262A 아미노산 치환을 나타내는 돌연변이의 사용이 특히 매우 유익하다. 관찰되었던 유기 용매와 관련한 높은 불안정성에도 불구하고(실시예 부분에서 비교예 1 참조), 칸디다 보이디나이로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소가 이들 조건 하에서 매우 효율적으로 사용될 수 있다는 사실이 이와 관련하여 특히 놀랍다.

반응 시스템에 사용되는 유기 용매는, 상기에 설명된 바와 같이, 존재하는 수성상과 2개의 별개의 상을 형성하도록 의도된 것이다. 이 필수요건의 범위 내에서, 당업자는 원칙적으로 유기 용매의 선택에 자유롭다. 그러나, 유기상의 경우, 가능한 한 낮은 물에서의 용해도(log P 값 ≥3, 바람직하게는 ≥3.1, 더욱 바람직하게는 ≥3.2 등)를 갖도록 용매를 선택하는 것이 유익하다고 판명되었다. 유기 용매가 동시에 난수용성 반응물도 용해시켜야 하기 때문에, 추가로 상기 용매는 사용된 유기 화합물과 관련하여 가능한 한 높은 용해도를 갖는 것이 또한 중요하다.

반응 시스템에 우선적으로 사용될 수 있는, 이러한 유형의 유기 용매는 주어진 반응 조건 하에서 액상인 방향족 또는 지방족 탄화수소이다. 특히, n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, n-옥탄, 이소옥탄, 시클로헥산, 메틸시클로헥산 및 이들의 분지쇄 이성질체가 매우 바람직하다. 할로겐화 탄화수소 또한 사용될 수 있다(CHCl₃, CH₂Cl₂, 클로로벤젠 등). 방향족 탄화수소로는, 톨루엔, 크실렌 또는 벤젠이 고려된다.

유기 용매 대 수성 부분의 정량적인 비는 임의적으로 선택될 수 있다. 유기 용매는 총 부피에 대해 정량적으로 5 내지 80 부피%, 바람직하게는 10 내지 60 부피%, 특히 바람직하게는 약 50 부피%의 양으로 사용된다.

선행 문헌에 제안된 접근법, 즉 효소에 의한 전환을 촉진시키기 위해 효소 반응 혼합물에 계면활성제를 첨가하여 반응 과정에서 상 전이를 최소화하는 선행 방법과는 대조적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 반응 시스템의 사용이 계면활성제를 함유하지 않은 경우에 특히 성공적으로 수행됨을 증명하고 있다.

본 명세서에서, "계면활성제"라는 용어는 미셀 구조(micellar structure)를 형성할 수 있거나 또는 액체-액체 상 계면의 표면 장력을 낮출 수 있는 모든 물질을 의미하는 것으로 이해된다.

이미 지적한 바와 같이, 기질이 반응 시스템에서 사용될 때의 농도는 경제적인 관점에서 유리한 전환율이 이루어질 수 있도록 되어야 한다. 따라서, 유기 화합물은 반응 개시 이전에 유리하게는 용매의 총 부피(유기 용매 및 수성 부분의 부피의 합) L 당 > 25 mM, 바람직하게는 > 100 mM, 특히 바람직하게는 > 200 mM, 더욱 바람직하게는 > 500 mM의 농도로 존재하여야 한다. 농도의 상한은 반응의 실행가능성이 보장되는지에 의해 자연적으로 설정된다. 특히, 모든 경우에 반응 혼합물의 교반이 가능해야 한다. 그러나, 바람직하게는 기질 또는 생성물에 대한 포화 한계를 넘어서 실시될 수도 있다.

본 발명에 따른 구체적인 결합된 효소 반응 시스템은 케토기를 알콜기로 전환시키는 본 목적을 위해 당업자에 의해 고려되는 모든 효소 반응에 사용될 수 있다. 그러나, 언급된 바와 같은 산화환원효소 반응이 바람직하다. 본 방법은 어떤 유형의 알콜 탈수소효소의 사용에도 적절하다. 본 발명에 따라 사용되는 알콜 탈수소효소는 바람직하게는 유기체인 로도코쿠스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) (S-ADH) 또는 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir) (R-ADH)로부터 유래된다(문헌[ADH derived from R. erythropolis: J. Peters, T. Zelinski, M.-R. Kula, Purification and characterization of a novel carbonyl reductase silated from Rhodococcus erythropolis, J. Biotechnol. 1994, 33, 283-292], 문헌[ADH derived from Lactabacillus kefir: C. W. Bradshaw, W. Hummel, C.-H. Wong, Lactobacillus kefir Alcohol Dehydrogenase: A Useful Catalyst for Synthesis, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532-1536.]).

본 발명은 또한 본 발명에 따른 반응 시스템을 포함하는 유기 화합물 전환용 장치에 관한 것이다. 유익하게 사용될 수 있는 장치로는, 예를 들면 교반 탱크 또는 교반-탱크 캐스케이드(cascade), 또는 배치 조작에서 및 연속으로 모두 작동될 수 있는 멤브레인 반응기가 있다.

본 발명의 범위 내에서, "멤브레인 반응기"란 용어는, 저분자 물질이 반응기로 공급되거나 또는 이를 떠날 수 있는 반면, 반응기 내에 촉매가 넣어진 임의의 반응 용기를 의미하는 것으로 이해된다. 이와 관련하여, 멤브레인은 반응 챔버 내로 직접 통합될 수 있거나, 또는 별도의 여과 모듈로 외부에 장착되어 반응 용액이 여과 모듈을 통해 연속적으로 또는 간헐적으로 유동하고 농축물이 반응기 내로 재순환될 수 있다. 적절한 실시태양은 특히, WO 98/22415 및 문헌[Wandrey et al. in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik and Chemieingenieurwesen, VDI p 151 ff.], 문헌[Wandrey et al. in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH 1996, p 832 ff.], 문헌[Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684 f]에 기재되어 있다. 본 장치에 가능한 연속 모드 조작과 배치 및 반연속 모드 조작은 교차흐름 여과 모드에서(도 4) 또는 종말 여과의 형태에서(도 3) 바람직하게 수행될 수 있다. 두 공정의 방법의 변형은 대체로 선행 문헌에 기재되어 있다(문헌[Engineering Processes for Bioseparations, Ed.: L.R. Weatherley, Heinemann, 1994, 135-165], 문헌[Wandrey et al., Tetrahedron Asymmetry 1999, 10, 923-928]).

본 발명은 또한 본 발명에 따른 반응 시스템을 사용하는 유기 화합물의 효소에 의한 전환 방법에 관한 것이다. 본 방법은 바람직하게는 거울상이성질적으로 풍부한 유기 화합물, 바람직하게는 키랄 알콜의 제조를 포함한다. 본 방법의 디자인은, 기재된 반응 시스템 및 이하에 나타내는 실시예를 토대로 당업자의 재량하에 수행될 수 있다. 주어진 한정 조건 하에서, 효소에 의한 전환에 달리 공지된 조건들을 적합하게 설정한다.

본 발명의 다음 측면은 유기 화합물의 효소에 의한 전환 방법 또는 유기 화합물, 바람직하게는 알콜의 확인 또는 분석에 있어서 본 발명에 따른 반응 시스템의 용도에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 반응 시스템은, 진술한 바와 같이, 거울상이성질적으로 풍부한 유기 화합물, 바람직하게는 알콜의 제조 방법에 사용된다.

놀랍게도, 칸디다 보이디나이로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소(FDH)는 2상 용매 시스템에 매우 우수한 안정성을 지닌다. 이는 칸디다 보이디나이로부터 유래된 FDH의 다양한 용매 시스템 내 장기간 안정성에 관한 실험에 기초하여 조사될 수 있다. 이들 실험에서는, 비교예 1 및 본 발명에 따른 실시예 2에 따르면, 유기 용매의 비율을 각각 총 부피에 대하여 10 % 및 20 %로 선택하였다. 칸디다 보이디나이로부터 유래된 FDH의 급속한 비활성화에 이르게 하는 수용성 유기 용매(비교예 1 참조)와 달리, 2상 시스템에서, 특히 상기에 언급된 탄화수소 성분(예컨대, n-헥산)을 사용하는 경우, 예를 들면 칸디다 보이디나이(이 실시예에서 이중 돌연변이의 형태로 사용됨)로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소의 탁월한 안정성이 수일 후에도 여전히 관찰되었다. 예를 들면, 촉매 활성이 아세톤 또는 DMSO의 존재하에는 24 시간 이내에 각각 35 % 또는 66 %가 감소한 반면, 20 부피% 헥산의 존재하에는 90 % 촉매 활성이 3일 후에도 여전히 기록되었다. n-헥산을 사용한 이 결과(실시예 2)는 표 3 및 그래프로 도 1에 나타나 있다. 다른 유기 용매를 사용하는 비교예는 도 1 및 표 1에 이와 같이 기록되어 있다.

본 발명에 따르면, 수비혼화성이어서 2상을 형성하는 다른 유기 용매도 기술된 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 유기 용매 성분으로 n-헵탄을 유기 용매 비율 20 %로 이용하여 매우 높은 용해도를 또한 달성할 수 있었다. 이 경우 27 시간 후의 안정성은 탁월한 99.8 %이었다(실시예 3 및 표 4 참조). 따라서, 아주 놀랍게도, 이 활성은 순수한 수성 용액에서의 활성보다 명백히 더 높은 것이며, 즉, 2상 시스템의 사용을 통한 칸디다 보이디나이로부터 유래된 FDH의 현저한 안정화를 보여주는 것이다(실험 부분의 실시예 3, 표 4 및 도 2 또한 참조).

게다가, 본 발명에 따른 반응 시스템을 통하여, 유기 용매의 부피비가 더 높은 2상 시스템을 사용하는 경우에도 효소에 의한 전환이 성공적으로 수행됨에 주목해야 한다. 이는, n-헵탄을 더 높은 용매 비율로 사용하여 수행된 실험에 의해 입증된다(실시예 3, 표 4 참조). 유기 용매인 n-헵탄의 비율이 60 부피%인 경우, 27 시간 후의 잔류 활성이 82.8 %인 점에서 명백한 바와 같이, 장기간에 걸친 높은 활성이 또한 유지될 수 있다. 다양한 부피비의 유기 용매를 이용한 장기간 안정성 시험 결과(실시예 3, 표 4에 따른)는 도 2의 그림에서 그래프로 나타나 있다.

본 발명은 알콜 탈수소효소/NADH/FDH/포름산 시스템에 의하여 제공된 예를 기초로 설명될 수 있다. 알콜의 비대칭 합성을 상응하는 케톤으로부터 출발하여 이 반응 시스템에 의해 수행하였다.

반응 혼합물의 처리를, MtBE로 추출하고 유기상을 증발에 의하여 농축함으로써 수행하였다. 상응하는 알콜을 이 방식으로 장치의 측면에서 매우 간단하게 69%의 수율과 99%의 거울상이성질선택성(enantioselectivity)으로 얻었다(실시예 4).

그러나, 탁월한 거울상이성질선택성은 출발 물질로 다른 케톤을 사용하여도 얻어진다. 예를 들어, 상기 반응 조건 하에서 페녹시아세톤을 환원시킴으로써 >99.8 % ee의 양으로 거울상이성질적으로 순수한 생성물을 얻었다(실시예 5).

그러나, 본 발명에 따른 반응 시스템은, 또한 입체적으로 요구되는(sterically demanding) 케톤에 대하여도 적절하다. 이는 α,m-디클로로아세토페논에 의하여 제공되는 예를 기초로 하여 예시적으로 설명될 것이다. 이 케톤은 메틸기와 방향족 고리 상에서 모두 염소 원자에 의하여 치환된다. 이 경우, 2상 시스템 내의 생촉매 환원은 원하는 생성물인 2-클로로-1-(m-클로로페닐)에탄올을 > 99.2 %의 놀라운 거울상이성질선택성으로 제공한다(실시예 6). 전환율은 약 77 %이다.

이러한 높은 전환율 및 높은 거울상이성질선택성은, 유기 용매의 존재 때문에 종종 효소 활성의 감소(낮은 전환율과 함께) 뿐만 아니라 입체선택성에 대한 효소 특성의 변화(거울상이성질선택성의 감소와 함께)가 관찰될 수 있는 이유만으로도, 놀라운 것이다.

그러나, 이러한 맥락에서, 상승된 기질 농도에서의 실험의 결과는 특히 놀라운 것으로 밝혀졌다. 모델 기질로서 p-클로로아세토페논을 이용하여 실험을 수행하였다. 10 mM의 기질 농도(이 기질 농도는 선행 문헌에서의 실험의 경우에서의 농도에 상당함)에서의 상기 실험에서 69 %의 전환율을 얻자(실시예 4), 상승된 기질 농도에서는 저해 등의 이유 등으로 수율의 감소가 일어날 수 있다는 널리 알려진 견해와 상반되게, 이 유형의 반응으로 20 mM의 농도로부터 출발하여 전환율을 증가시킬 수 있었고, 75 % (40 mM에서) 및 74 % (100 mM에서)의 더 높은 전환율을 얻을 수 있었다(실시예 7, 8, 반응식 3, 도 5).

본 방법은 결과적으로 특히, 높은 기질 농도에서 케톤의 효소에 의한 환원에 또한 적절하다.

이 반응의 주요한 이점은 간단함에 있다. 예를 들어, 어떠한 세밀한 공정 단계가 포함되지 않으며, 이 반응은 배치 반응기에서 및 연속적으로 모두 수행될 수 있다. 유사하게, 이전의 방법과 대조적으로, 유기 매질로부터 수성 매질을 분리하는 어떠한 특수한 멤브레인도 요구되지 않는다. 이전의 일부 방법에서 요구된 계면활성제의 첨가도 이 방법에서는 불필요하다. 또 다른 주요 이점은 기술적으로 의미 깊은 기질 농도인 > 25 mM로 광학적으로 활성인 알콜의 효소에 의한 제조를 이루어낸 최초의 가능성에 있다. 상기 이점은 선행 기술로부터는 자명하게 얻을 수 없는 것이다.

"거울상이성질적으로 풍부한"이란 용어는 하나의 광학적인 거울상이성질체가 > 50 %에 달하는 비로 다른 대응되는 것과 함께 혼합물에 존재하는 것을 나타낸다.

입체중심(stereocenter)이 존재하는 경우, 제공되는 구조는 가능한 거울상이성질체 모두와 관련되고, 하나 이상의 입체중심이 분자 내에 존재하는 경우, 모든 가능한 부분입체이성질체와 관련되고, 하나의 부분입체이성질체에 대해서 이에 의해 내포되는 해당 화합물의 가능한 두개의 거울상이성질체와 관련된다.

유기체 칸디다 보이디나이는 번호 ATCC 32195 하에서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 기탁되어 있고, 공공에게 입수가능하다.

"결합된 효소 시스템(coupled enzymatic reaction system)"이란 표현은, 본 발명에 따르면 유기 화합물의 효소에 의한 전환이 보조효소의 소모에 의해 일어나고, 제2 효소 시스템(본원에서, 칸디다 보이디나이 또는 이의 돌연변이로부터 유래된 FDH)에 의하여 보조효소가 동일 반응계 내에서 재생되는 것을 의미한다고 이해된다. 그 결과, 고가의 보조효소의 사용을 줄일 수 있게 한다.

이 문헌에서 명명된 선행 문헌은 본 개시에 의하여 일체로 포함되는 것으로 간주한다.

실시예 1 (칸디다 보이디나이(이중 돌연변이: C23S/C262A)로부터 유래된 FDH를 사용한 FDH 활성의 비교예)

소듐 포르메이트 2.72 g (0.8 mol/L) 및 디포타슘 히드로겐포스페이트 트리히드레이트 1.14 g (0.1 mol/L)을 칭량하고, 완전 탈이온수 40 mL에 용해시켰다. 암모니아 용액(25 %) 및 포름산(100 %)으로, 또는 상응하는 희석 용액으로 용액의 pH를 8.2로 맞추었다. 다음에, 용액을 50 mL 눈금 플라스크로 옮기고, 완전 탈이온수로 위를 채워 넣었다. 이와 별도로, 71.7 mg (4 mmol/L) NAD⁺ 트리히드레이트를 칭량하고, 약 20 mL의 완전 탈이온수에 용해시켰다. 암모니아 용액(25 %) 및 포름산(100 %)으로, 또는 상응하는 희석 용액으로, 용액의 pH 값을 8.2로 설정하였다. 다음에, 용액을 25 mL 눈금 플라스크로 옮기고, 완전 탈이온수로 위를 채웠다. 다음에, 기질 용액 및 NADH 용액 각각 500 ㎕를 측정에 사용되는 1 cm 셀 내에서 혼합하였다. 효소 용액 10 ㎕의 첨가 후에, 물 중의 10 % 유기 용매 용액(표 참조)을 용매로 사용하여, 쉐이킹을 간략히 수행하고, 셀을 광도계에 넣고, 데이타 기록을 시작하였다. 처음에, 측정 이전에 효소 용액을 직접 첨가하였다. NADH를 형성하는 NAD⁺의 반응을 검출하는 광도측정 검사에 의하여 어느 시간 경과 후에 칸디다 보이디나이(이중 돌연변이: C23S/C262A)로부터 유래된 FDH의 활성을 측정하였다. 30 ℃ 온도 에서, 340 nm의 파장에서 15분의 측정시간으로 광도측정을 행하였다. 결과를 표 1 및 2에 나타내었다.

용매 및 시간의 함수로서 칸디다 보이디나이(이중 돌연변이: C23S/C262A)로부터 유래된 FDH의 효소 활성(U/mL)

실시예 2 (칸디다 보이디나이(이중 돌연변이: C23S/C262A)로부터 유래된 FDH 활성의 측정)

헥산을 유기 용매 성분으로 하여 활성의 측정을 실시예 1에서의 교시에 따라서 수행하였다. 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.

헥산 및 시간의 함수로서 칸디다 보이디나이(이중 돌연변이: C23S/C262A)로부터 유래된 FDH의 효소 활성(U/mL)

실시예 3 (칸디다 보이디나이(이중 돌연변이: C23S/C262A)로부터 유래된 FDH 활성의 측정)

n-헵탄을 유기 용매 성분으로 하여 활성의 측정을 실시예 1에서의 교시에 따라서 수행하였다. 결과를 아래의 표 4에 나타내었으며, 여기서 평가는 퍼센트로 나타냈고, 개별 기질 농도에서의 결과는 각각의 경우에 100 %로 나타낸 초기 활성과 관련된 것이다.

실시예 4 (p-클로로아세토페논을 이용한 전환)

10 mL n-헵탄 및 40 mL 포스페이트 버퍼 중에 p-클로로아세토페논(78.4 mg; 10 mM), 소듐 포르메이트 (50 mM) 및 NADH(2 mM)로 이루어지는 용액에, 10.1 U의 알콜 탈수소효소(로도코쿠스 에리트로폴리스로부터 유래됨) 및 10 U의 포르메이트 탈수소효소(칸디다 보이디나이로부터 유래된 FDH, 이. 콜라이(E. coli)에서 발현, 이중 돌연변이 C23S/C262A)를 첨가하였다. 이로 인한 반응 혼합물을 30 ℃에서 21 시간 동안 교반해 두었다. 다음으로 3 x 25 mL MTBE로 추출을 하여 반응을 진행하고, 수집된 유기상을 소듐 술페이트로 건조하였다. 진공에서 용매를 제거한 후 얻어지는 조생성물을 전환율(¹H-NMR 분광 조사) 및 거울상이성질선택도(키랄 GC)에 관하여 조사하였다.

전환율 : 69 %

거울상이성질선택도 : > 99 % ee

실시예 5 (페녹시아세톤을 이용한 전환)

10 mL n-헵탄 및 40 mM 포스페이트 버퍼 중에 페녹시아세톤(76.0 mg; 10 mM), 소듐 포르메이트(50 mM) 및 NADH(2 mM)로 이루어지는 용액에, 10.1 U의 알콜 탈수소효소(로도코쿠스 에리트로폴리스로부터 유래됨) 및 10 U의 포르메이트 탈수소효소(칸디다 보이디나이로부터 유래된 FDH, 이. 콜라이에서 발현, 이중 돌연변이 C23S/C262A)를 첨가하였다. 이로 인한 반응 혼합물을 30 ℃에서 21 시간 동안 교반해 두었다. 다음으로 3 x 25 mL MTBE로 추출을 하여 반응을 진행하고, 수집된 유기상을 소듐 술페이트로 건조하였다. 진공에서 용매를 제거한 후 얻어지는 조생성물을 전환율(¹H-NMR 분광 조사) 및 거울상이성질선택도(키랄 GC)에 관하여 조사하였다.

전환율 : > 95 %

거울상이성질선택도 : > 99.8 % ee

실시예 6 (2,3'-디클로로아세토페논을 이용한 전환)

10 mL n-헵탄 및 40 mM 포스페이트 버퍼 중에 2,3'-디클로로아세토페논(102.7 mg; 10 mM), 소듐 포르메이트(50 mM) 및 NADH(2 mM)로 이루어지는 용액에, 10.1 U의 알콜 탈수소효소(로도코쿠스 에리트로폴리스로부터 유래됨) 및 10 U의 포르메이트 탈수소효소(칸디다 보이디나이로부터 유래된 FDH, 이. 콜라이에서 발현, 이중 돌연변이 C23S/C262A)를 첨가하였다. 이로 인한 반응 혼합물을 30 ℃에서 21 시간 동안 교반해 두었다. 다음으로 3 x 25 mL MTBE로 추출을 하여 반응을 진행하고, 수집된 유기상을 소듐 술페이트로 건조하였다. 진공에서 용매를 제거한 후 얻어지는 조생성물을 전환율(¹H-NMR 분광 조사) 및 거울상이성질선택도(키랄 GC)에 관하여 조사하였다.

전환율 : 77%

거울상이성질선택도 : > 99.2% ee

실시예 7 (40 mM에서 p-클로로아세토페논을 이용한 전환)

2.5 mL n-헵탄 및 10 mM 포스페이트 버퍼 중에 p-클로로아세토페논(78.4 mg; 10 mM), 소듐 포르메이트(50 mM) 및 NADH(2 mM)로 이루어지는 용액에, 10.1 U의 알콜 탈수소효소(로도코쿠스 에리트로폴리스로부터 유래됨) 및 10 U의 포르메이트 탈수소효소(칸디다 보이디나이로부터 유래된 FDH, 이. 콜라이에서 발현, 이중 돌연변이 C23S/C262A)를 첨가하였다. 이로 인한 반응 혼합물을 30 ℃에서 21 시간 동안 교반해 두었다. 다음으로 3 x 25 mL MTBE로 추출을 하여 반응을 진행하고, 수집된 유기상을 소듐 술페이트로 건조하였다. 진공에서 용매를 제거한 후 얻어지는 조생성물을 전환율(¹H-NMR 분광 조사) 및 거울상이성질선택도(키랄 GC)에 관하여 조사하였다.

전환율 : 75 %

실시예 8 (100 mM에서 p-클로로아세토페논을 이용한 전환)

1 mL n-헵탄 및 4 mM 포스페이트 버퍼 중에 p-클로로아세토페논(78.4 mg; 10 mM), 소듐 포르메이트(50 mM) 및 NADH(2 mM)로 이루어지는 용액에, 10.1 U의 알콜 탈수소효소(로도코쿠스 에리트로폴리스로부터 유래됨) 및 10 U의 포르메이트 탈수소효소(칸디다 보이디나이로부터 유래된 FDH, 이. 콜라이에서 발현, 이중 돌연변이 C23S/C262A)를 첨가하였다. 이로 인한 반응 혼합물을 30 ℃에서 21 시간 동안 교반해 두었다. 다음으로 3 x 25 mL MTBE로 추출을 하여 반응을 진행하고, 수집된 유기상을 소듐 술페이트로 건조하였다. 진공에서 용매를 제거한 후 얻어지는 조생성물을 전환율(¹H-NMR 분광 조사) 및 거울상이성질선택도(키랄 GC)에 관하여 조사하였다.

전환율 : 74 %

Claims

수성상이 액체 유기상과 접촉하는 2상 용매 시스템 내에서, 알콜 탈수소효소를 이용하는 유기 화합물의 NADH-의존성 효소에 의한 전환, 및 칸디다 보이디나이 또는 이의 돌연변이로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소를 이용하는 NADH의 효소 재생을 포함하는 결합된 효소 반응 시스템.
제1항에 있어서, 상기 사용되는 유기 용매가 가능한 한 낮은 수용해도 및 상기 사용되는 유기 화합물에 대해서는 가능한 한 높은 용해도를 갖는 것을 특징으로 하는 반응 시스템.
제1항 또는 제2항에 있어서, 반응 조건 하에서 액체이고, 특히 > 3의 log P 값을 가지는 방향족 또는 지방족 탄화수소가 유기 용매로서 사용되는 것을 특징으로 하는 반응 시스템.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 용매가 총 부피에 대해 10 내지 60 부피%의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 반응 시스템.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 화합물이 반응 개시 이전에 용매 혼합물의 L 당 > 25 mM, 특히 > 100 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 반응 시스템.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 계면활성제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 반응 시스템.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 락토바실루스 케피르로부터 유래된 알콜 탈수소효소가 유기 화합물의 전환용 효소로 사용되는 것을 특징으로 하는 반응 시스템.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 로도코쿠스 에리트로폴리스로부터 유래된 알콜 탈수소효소가 유기 화합물의 전환용 효소로 사용되는 것을 특징으로 하는 반응 시스템.
제1항에 따른 반응 시스템을 포함하는 유기 화합물 전환용 장치.
제1항에 따른 반응 시스템의 적용에 의한 유기 화합물의 효소에 의한 전환 방법.
유기 화합물의 효소에 의한 전환, 또는 바람직하게는 알콜의 확인 또는 분석을 위한 제1항에 따른 반응 시스템의 용도.
제11항에 있어서, 거울상이성질적으로 풍부한 유기 화합물, 바람직하게는 알콜을 제조하기 위한 방법에서의 용도.