CN1768134A - 偶联辅酶依赖型酶反应系统 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种反应系统，其中借助于偶联酶作用转化方法可得到对映异构体纯度高的有化学价值的化合物。在此范畴内的偶联酶作用反应系统包括消耗辅酶的酶转化反应，并使消耗的辅酶发生酶再循环，其中该过程在包括具有至少两个羟基或醚基的有机烃类的均匀水性溶剂系统中进行。
Description
技术领域
本发明涉及一种偶联酶作用反应系统，其特征在于反应在均匀的溶剂混合物中进行。具体而言，本发明涉及一种反应系统，其包括有机化合物的辅酶依赖型酶转化，其中该辅酶在相同的系统中用酶再生。
背景技术
通过生物催化方法制造诸如醇和氨基酸的光活性有机化合物越来越重要。具有辅酶再生作用的两种脱氢酶的偶联用途已成为大规模工业合成这些化合物的方法(DE19753350)。
方程式1：
用NAD依赖型甲酸脱氢酶在丙酮酸三甲基酯的还原性氨基化作用中于原位使NADH再生以得到L-叔亮氨酸(Bommarius等，TetrahedronAsymmetry 1995，6，2851-2888)。
在水性介质中有效使用的生物催化剂，除了其催化特性和功效以外，还具有以下优点：与大量的合成型含金属的催化剂相反，无需使用含金属的原料，特别是那些含有重金属并因此而有毒的物质。也无需在不对称还原反应中使用昂贵且有害的还原剂，例如硼烷。
然而，水溶性差的基材反应存在困难。相似的困难也存在于水溶性差的产品中。原则上可能的溶液可以是在极性有机溶剂或其水溶液中进行生物催化还原反应。这此情况下，酶和基材以及若合适的产品均应为水溶性的。然而，直接存在有机溶剂的普遍缺点在于：在这些条件下，酶活性通常会显著降低(例如参见Anderson等，Biotechnol.Bioeng.1998，57，79-86)。具体而言，作为工业规模上目前唯一使用并具有可商购数量的甲酸脱氢酶，FDH不幸地对有机溶剂具有高敏感性。这在比较例1中表现得很明显，比较例1使用在各种情况下的添加量为10％的DMSO、环丁砜、MTBE、丙酮、异丙醇和乙醇作为有机溶剂成分(参见图1)。
用于解决来自Candida boidinii的甲酸脱氢酶在有机溶剂存在的情况下的稳定化问题的各种配置品是已知的，例如额外使用表面活性剂作为表面活性物质来进行反应。然而，其缺点是反应速率下降约40倍，并发生甲酸脱氢酶的抑制作用(B.Orlich等，Biotechnol.Bioeng.1999，65，357-362.)。此外该作者还指出，因为所用的醇脱氢酶的稳定性低，所以在微乳液的这些条件下的还原反应不经济。
原则上另一种进行生物催化反应的可能性包括：在有机溶剂中使用固定化酶，或在含有水和可与水混溶的有机溶剂的均匀溶液中使用酶。然而，这些其中有机溶剂与酶发生直接接触的方法仅限于少数几种酶，特别是水解酶。因此例如DE4436149指出，“直接存在的有机溶剂(可与水混溶或不可与水混溶的)仅适合少数属于水解酶的酶”。此外，其它种类酶的一些实例虽然是已知的(例如尤其是醇腈酶)，但DE4436149的陈述仍适用于大多数的酶。例如来自Candida boidinii的FDH的有效固定化作用并不是已知的。此外，固定化作用本身会由于固定化步骤和固定化材料而产生额外成本。
因为酶的去活化或改性具有风险，因此工业上开发了避免存在有机溶剂的方法。例如DE4436149描述了一种方法，其中通过产品可透过的膜，特别是疏水膜，将产品从反应溶液中提取至有机溶剂中。然而，与搅拌釜反应器中的标准方法相比，尤其是因为所需的有机膜也是额外的价格因素，所以该方法需要明显更多的技术费用。此外，该方法仅适于连续处理。
总之，可以说还没有有助于克服上述缺点的方法是已知的。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种可能性，它使得偶联辅酶依赖型的酶反应足以在特别弱水溶性的有机化合物中进行，从而使其可在特别有利于经济和环保的条件下应用于工业规模。
该目的是根据本发明的权利要求加以实现的。权利要求1至8涉及一种根据本发明运行的反应系统。权利要求9保护一种装置。权利要求10涉及一种根据本发明运行的方法，而权利要求11和12涉及一种根据本发明的反应系统的优选的用途。
通过提供一种偶联酶反应系统，其包括有机化合物的辅酶依赖型的酶转化以及辅酶的酶再生，该反应系统在包括具有至少两个羟基或醚基的有机烃类的均匀水性溶剂系统中运行，特别地，所述目的通过惊人的、无法预计的且根据本发明而特别有利的方法加以实现。与可由现有技术得出的观点相反，虽然存在特别的水溶性有机烃类，仍可惊人地使该偶联酶反应系统能够在不由溶剂引发其中一种酶的活性损失的情况下运行。
已证明优选使用的有机烃类是通式(I)的化合物：
其中
n是0至10的整数，
m是0或1，
R1至R8相互独立地代表H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烷氧基烷基、(C6-C18)芳基、(C7-C19)芳烷基、(C1-C8)烷基-(C6-C18)芳基、(C3-C8)环烷基、(C1-C8)烷基-(C3-C8)环烷基、(C3-C8)环烷基-(C1-C8)烷基。
就此而言，特别优选使用乙二醇、DME或甘油。
本领域技术人员可以任意选择将有机助溶剂添加至反应混合物中的量。因此，最优的量可通过常规实验加以确定。基于存在的水性相，添加量优选为1至80体积％，更优选为5至60体积％，尤其优选为10至45体积％。
作为辅酶，优选使用在反应条件下最常见且运行最经济的辅酶。它们特别是辅酶NADH或NADPH。
优选使用脱氢酶作为用于使有机化合物转化的酶。然而原则上，该反应系统也可用任何其它辅酶依赖型的氧化还原酶来运行，其中该辅酶被氧化还原酶消耗并可通过第二酶系统再生，即该系统是偶联酶系统。其它合适的此类酶可参见文献(有机合成中的酶催化剂(EnzymeCatalysis in Organic Synthesis)；Ed.：K.Drauz，H.Waldmann，Vol.I and II，VCH，1995)。
已证明醇脱氢酶或氨基酸脱氢酶是优选使用的酶。
辅酶的再生特性主要取决于所用的辅酶本身。辅酶的各种再生方法参见上述文献。在溶剂、酶和空间/时间产率的给定边界条件下，本领域技术人员可自由选择再生介质。通常就作为辅酶的NAD+(在氧化反应中)而言，出自例如短乳杆菌或L.kefir的氧化酶NADH是合适的(DE10140088)。在还原反应的情况下，由甲酸脱氢酶使辅酶NADH再生也被进一步证明是非常成功的。
本发明还涉及一种用于使包含本发明反应系统的有机化合物转化的装置。其例如可为酶试剂盒。
有利地使用的装置是例如搅拌釜或串联搅拌釜，或膜反应器，其可以分批式地以及连续地工作。
在本发明的范畴内，膜反应器应理解为可将催化剂封闭入反应器中，而低分子量物质可被送入该反应器中或可将其去除的任何反应容器。此处的膜可直接整合到反应空间内，或于外部并入分离的过滤组件中，其中该反应溶液连续或间歇地流经该过滤组件，而残留的产品被再循环至所述反应器中。特别是WO 98/22415；以及Wandrey等在Yearbook 1998，Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen[Process Technology andChemical Engineering]，VDI p.151及随后页；Wandrey等在AppliedHomogeneous Catalysis with Organometallic Compounds，vol.2，VCH 1996，p.832及随后页；Kragl等，Angew.Chem.1996，6，684 et seq描述了合适的具体实施方案。
可在该装置中进行的连续过程，除分批式处理和半连续式处理以外，此处还可以根据需要以交叉流动过滤模式(图3)或终端过滤(图2)进行。现有技术中基本上描述了这两种不同的方法(Engineering Processesfor Bioseparations，ed.：L.R.Weatherley，Heinemann，1994，135-165；Wandrey等，Tetrahedron Asymmetry 1999，10，923-928)。
本申请还提供一种使用根据本发明的反应系统使有机化合物发生酶转化的方法。该方法优选用于制备对映异构体富集的有机化合物，优选为α-氨基酸或手性醇。
借助于所述的反应系统和下述的实施例，该工艺过程可由本领域技术人员如所期望地实现。因此，在给定的边界条件下对用于酶反应的其他已知的条件进行设定。
本发明一个方面还在于根据本发明的反应系统使有机化合物发生酶转化或用于判断或分析特殊的有机物质的用途。有机化合物的酶转化优选在形成对映异构体富集产品的情况下实施。
根据本发明，偶联酶系统应理解为在消耗辅酶的情况下进行有机化合物的酶转化，并且通过第二酶系统在原位使该辅酶再生。因此，这减少了昂贵的辅酶的使用。
这里令人十分惊奇的是，不同于现有的教导，存在的有机介质并不会破坏所用的两种酶，因此可以以非常优良的空间/时间产率制备所期望的产品。
如所示出的，与大多数导致所用的FDH迅速失活的有机溶剂(参见比较例)相反，使用DME和乙二醇，在数天以后仍可观察到甲酸脱氢酶突出的稳定性特性。例如，在丙酮和DMSO存在的情况下，酶的活性在24小时以内分别下降了35和66％，而在10％DME存在的情况下，即使在5天以后酶的活性仍保持在80％。DME和乙二醇的结果如图1所示，并列于表3中。其它有机溶剂的比较例也如图1中所示。
用来自Candida boidinii的野生型甲酸脱氢酶以及该酶通过基因工程改性的形式实施方法(DE19753350)。如上所述，优选使用NADH作为辅酶。对于实验性研究，例如可使用自然的或重组形式的来自红球菌属的ADH，优选来自红平红球菌的ADH作为ADH成分。所用的酶可以任何期望的提纯的天然形式或重组制备的形式用于该反应中。也可将它们以寄助物的完整全细胞的形式加以使用。在本说明书的范畴内，其中两种酶系统以适合于最优反应的状态存在于全细胞催化剂中(DE10218689)的实施方案同样是有利的。
更有趣的是，醇脱氢酶在式(I)的有机烃类存在的情况下也具有高稳定性。因此，根据本发明的溶剂系统适合于进行不对称生物催化还原反应。这通过分别从对氯乙酰苯或对-(正丁基)乙酰苯起始的不对称合成1-对氯苯乙烷-1-醇或1-正丁苯乙烷-1-醇而已经试验性地加以研究。
在110小时的反应时间之后，对氯乙酰苯或对-(正丁基)乙酰苯作为基材分别以59％或70％的形成率形成产品。
本方法的一个主要优点在于该方法的简单性。例如，该方法不包括昂贵的方法步骤，而且该方法可在分批式反应器中实施，也可连续地实施。与以前的方法相反，该方法也不需要将水性介质与有机介质分离的特殊膜。本方法中还省略了目前在一些方法中需要添加的表面活性剂。这一点无法从现有技术中看出，然而却使本方法极其有利。
直链型或分支型(C1-C8)烷基可为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基或辛基，包括它们所有相关的异构体。(C2-C8)烷氧基烷基是指烷基链被至少一个氧官能团间隔并且两个氧原子不能彼此相连的基团。碳原子数是指该基团中所含碳原子的总数。也包括所有相关的异构体。
(C3-C8)环烷基是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基等。由杂原子取代的环烷基优选为例如1-、2-、3-、4-哌啶基、1-、2-、3-吡咯烷基、2-、3-四氢糠基、2-、3-、4-吗啉基。
(C3-C8)环烷基-(C1-C8)烷基是指经由上述烷基与分子键结的上述环烷基。
(C6-C18)芳基是指具有6至18个碳原子的芳基。其特别包括诸如苯基、萘基、蒽基、菲基和联苯基的基团。
(C7-C19)芳烷基是经由(C1-C8)烷基与分子键结的(C6-C18)芳基。
对映异构体富集是指一种旋光对映体在它的其他旋光对映体的混合物中所占的比例大于50％。
所示的结构涉及所有可能的非对映体，并且就一个非对映体而言，涉及此处所讨论化合物的两种可能的对映异构体。
均匀的水性溶剂系统，根据本发明是指所用的烃类形成一种具有水相的均匀溶液，并因此最终仅存在一种液态相。
具体实施方式
用下述实施例阐明根据本发明的方法。
图2所示为具有终端过滤的膜反应器。将基材1经过泵2传递至包含膜5的反应器空间3中。在用搅拌器工作的反应器空间中，除溶剂以外，还有催化剂4、产品6和未反应的基材1。低分子量产品6主要由膜5滤出。
图3所示为具有交叉流过滤的膜反应器。此处将基材7经过泵8传递至搅拌的反应器空间中，其中还有溶剂、催化剂9和产品14。由泵16形成经过可能存在的热交换器12导入交叉流过滤室15中的溶剂流。此处由膜13将低分子量产品14分离开。然后使高分子量的催化剂9随溶剂流，若适当则再次经过热交换器12，若适当则经过阀11，返回反应器10中。
实验部分：
实施例1(FDH活性的比较例)
称出2.72g(0.8mol/l)的甲酸钠和1.14g(0.1mol/l)的三水合磷酸氢二钾，并溶解于40ml完全软化的水中。用氨水(25％)和甲酸(100％)或合适的稀释物将该溶液的pH调节至8.2。然后将该溶液移至50ml的容量瓶中，并用完全软化的水加满。除此以外，称出71.7mg(4mmol/l)的三水合NAD+，并溶解于约20ml完全软化的水中。用氨水(25％)和甲酸(100％)或合适的稀释物将该溶液的pH调节至8.2。然后将该溶液移至25ml的容量瓶中，并用完全软化的水加满。然后将各500μl基材溶液和NADH溶液在用于测量的1cm的室中混合。在添加10μl的酶溶液之后，使用有机溶剂(参见表)在水中的10％的溶液作为溶剂，将该混合物简单摇动，将该室置于光度计中并开始记录数据。仅在开始测量之前立即添加酶溶液。在一定的时间间隔之后通过光度测量由NAD+生成NADH的反应而确定酶的活性。在温度为30℃、波长为340nm及测量时间为15分钟的条件下进行光度测量。结果列于表1和表2中。
表1以U/ml计的FDH酶活性作为溶剂和时间的函数
| 时间[d] | 丁醇活性[U/ml] | MEK活性[U/ml] | DMSO活性[U/ml] | THF活性[U/ml] | 环丁砜活性[U/ml] | 乙腈活性[U/ml] |
| 0.0000.0420.1251.0972.0352.8965.9277.8859.94813.07314.89216.87519.938 | 0.52620.0006 | 0.00580.0011 | 0.79650.78800.77940.26690.23310.22010.17630.14040.12050.09150.07170.05400.0355 | 0.84920.43570.0414 | 0.00280.0003 | 0.79610.44940.08400.0008 |
表2以U/ml计的FDH酶活性作为溶剂和时间的函数
| 时间[d] | 丙酮活性[U/ml] | 乙醇活性[U/ml] |
| 0.0000.0420.7501.0001.8752.7603.7814.6465.8756.7787.7928.72911.75013.726 | 0.83550.74020.58930.54260.34840.26910.20040.16140.13250.09870.07940.06100.0333 | 0.84910.76890.63670.59330.46870.35100.28140.22400.17360.14860.12770.09980.05360.0421 |
实施例2(测量FDH活性)
按照实施例1中的方法测定活性，使用DME和乙二醇作为有机溶剂成分。结果列于表3中。
表3以U/ml计的FDH酶活性作为溶剂和时间的函数
| 时间[d] | 乙二醇活性[U/ml] | DME活性[U/ml] |
| 0.0000.0420.7501.0001.8752.7603.7814.6465.8756.7787.7928.72911.75013.72615.96918.81920.94822.75025.78127.74029.80232.92734.74736.72939.79242.83060.70875.781 | 0.83250.80530.78910.80700.81460.74150.75880.80110.65850.56970.44790.24630.0066 | 0.86680.82100.80950.81600.77670.74710.77890.69430.65350.64950.63910.55650.48140.46100.42720.36130.32490.29760.27030.23740.22160.19980.18830.16580.1586340.1434680.09436260.0470678 |
实施例3：
将在酶浓度为0.1U/ml S-ADH和0.2U/ml FDH(DM)下的含有25mM对氯乙酰苯以及0.1mM NAD+和75mM甲酸钠的反应混合物，在含有90体积％100mM pH为7.5的磷酸盐缓冲液和10体积％DME的溶剂系统中，在反应温度为30℃下搅拌110小时。然后用二氯甲烷将有机成分萃取出，丢弃水相并用硫酸钠干燥有机相。使过滤后所得的滤液在真空中去除易挥发的成分，并通过1H核磁共振光谱分析所得油的形成率。测得形成率为59％。
实施例4：
将在酶浓度为0.2U/ml S-ADH和0.4U/ml FDH(DM)下的含有25mM对-(正丁基)乙酰苯以及0.1mM NAD+和75mM甲酸钠的反应混合物，在含有90体积％100mM pH为7.5的磷酸盐缓冲液和10体积％DME的溶剂系统中，在反应温度为30℃下搅拌110小时。然后用二氯甲烷将有机成分萃取出，丢弃水相并用硫酸钠干燥有机相。使过滤后所得的滤液在真空中去除易挥发的成分，并通过1H核磁共振光谱分析所得油的形成率。测得形成率为70％。
实施例5：具有20％(体积/体积)的乙二醇含量的反应
将在酶含量为24U来自R.erythropolis(在E.coli中表达)的(S)-ADH和24U来自Candida boidinii(二突变体：C23S、C262A；在E.coli中表达)的甲酸脱氢酶下的含有1.3mmol对氯乙酰苯(208.3mg；13mM)以及0.24mmol NADH(169.4mg；2.4mM)和6.2mmol甲酸钠(62mM；421.7mg；4.8当量，基于酮)的反应混合物，在含有80体积％50mM pH为7.0的磷酸盐缓冲液和20体积％乙二醇的溶剂系统中，在反应温度为30℃下搅拌21小时。在此期间取出样品，并通过PLC测定特别的转化率。21小时之后，发现酮完全转化。然后用4×100ml的甲基叔丁基醚将有机成分萃取出，丢弃水相并用硫酸钠干燥有机相。使过滤后所得的滤液在真空中去除易挥发的成分，并且在进一步添加MTBE并将形成的两相分离之后，通过1H核磁共振光谱分析所得剩余物的形成率。测得形成率大于99％。
实施例6：具有40％(体积/体积)的乙二醇含量的反应
将在酶含量为52.4U来自R.erythropolis(在E.coli中表达)的(S)-ADH和52.4U来自Candida boidinii(二突变体：C23S、C262A；在E.coli中表达)的甲酸脱氢酶下的含有2.63mmol对氯乙酰苯(407.3mg；26.3mM)以及0.52mmol NADH(372.1mg；5.2mM)和14.4mmol甲酸钠(144mM；979.3mg；5当量，基于酮)的反应混合物，在含有60体积％50mM pH为7.0的磷酸盐缓冲液和40体积％乙二醇的溶剂系统中，在反应温度为30℃下搅拌21小时。在此其间取出样品，并通过PLC测定特别的转化率。21小时之后，发现酮完全转化。然后用2×100ml的甲基叔丁基醚将有机组分萃取出，丢弃水相并用硫酸钠干燥有机相。使过滤后所得的滤液在真空中去除易挥发的成分，并且在进一步添加MTBE并将形成的两相分离之后，通过1H核磁共振光谱分析所得剩余物的形成率。测得形成率大于99％。
Claims (12)
1、一种偶联酶反应系统，其包括有机化合物的辅酶依赖型的酶转化以及辅酶的酶再生，其中该反应系统在包括具有至少两个羟基或醚基的有机烃类的均匀水性溶剂系统中运行。
2、根据权利要求1所述的反应系统，其特征在于，该所用的有机烃类具有根据通式(I)的结构
其中
n是0至10的整数，
m是0或1，
R1至R8相互独立地代表H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烷氧基烷基、(C6-C18)芳基、(C7-C19)芳烷基、(C1-C8)烷基-(C6-C18)芳基、(C3-C8)环烷基、(C1-C8)烷基-(C3-C8)环烷基、(C3-C8)环烷基-(C1-C8)烷基。
3、根据权利要求1或2所述的反应系统，其特征在于，使用乙二醇、DME或甘油作为所述有机烃类。
4、根据前述权利要求之一所述的反应系统，其特征在于，基于水性相，所述有机烃类的含量为1至80体积％，更优选为5至60体积％，尤其优选为10至45体积％。
5、根据前述权利要求之一所述的反应系统，其特征在于，使用NADH或NADPH作为所述辅酶。
6、根据前述权利要求之一所述的反应系统，其特征在于，使用脱氢酶作为使所述有机化合物发生转化的酶。
7、根据权利要求6所述的反应系统，其特征在于，使用醇脱氢酶或氨基酸脱氢酶。
8、根据前述权利要求之一所述的反应系统，其特征在于，利用甲酸脱氢酶使所述辅酶再生。
9、用于使有机化合物转化的装置，其包含根据权利要求1所述的反应系统。
10、用于使有机化合物发生酶转化的方法，其包括使用根据权利要求1所述的反应系统。
11、根据权利要求1所述的反应系统用于使有机化合物发生酶转化或用于判断或分析的用途。
12、根据权利要求11所述的用途，其用于制备对映异构体富集的有机化合物的方法中。
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