CN112813131A - 一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用 - Google Patents

一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用，本发明提供的羧酯酶作为催化剂在不对称拆分手性环己烯甲酸酯制备手性环己烯甲酸的应用中，底物耐受性好，光学纯度高(ees值达99％以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大。因此，本发明的羧酯酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。

Description

一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸 中的应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用。
背景技术
(S)-3-环己烯-1-甲酸(分子式：C7H10O2，分子量：126.15，沸点：118℃/6mmHg，CAS号为5708-19-0，是新型口服抗凝药依度沙班的关键手性中间体。
手性环己烯甲酸分子结构具有高度对称性，是合成医药、农药及其它精细化学品的重要手性砌块。研究人员已开发出多种光学活性手性酸合成的方法，包括动力学拆分和不对称合成。其中，利用酶法动力学拆分手性酯合成光学活性手性酸的途径，是生产光学纯环己烯甲酸的重要方法。另外，利用化学法合成手性环己烯甲酸的方法包括狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应和外消旋酸拆分法，其中Diels-Alder反应是目前合成手性3-环己烯-1-甲酸的主要方法，然而该方法操作难度大，反应条件苛刻，反应步骤繁琐，收率较低，因此其应用受到限制。另一化学拆分法需要在丙酮中进行至少六次重结晶才可分离出光学纯的对映异构体，导致丙酮的大量使用，拆分收率仅20～30％，原子经济性低。生物催化方法不仅反应条件温和、对环境友好，具有高度的区域选择性和立体选择性，而且避免了生产中有机试剂的大量使用，恰好弥补了化学方法的不足之处，因此近几年来生物催化的动力学拆分反应在手性酸合成中的应用越来越受到重视。
生物催化法立体选择性合成环己烯甲酸主要采用商品酶、野生菌或重组工程菌的细胞或游离酶进行催化。在前期的报道中，本实验室从自然界筛选到了可水解外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯的野生菌，现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCCNo.17220。经过条件优化，菌株JNU9335可以产生233U·L-1水解酶，在水/异辛烷两系统中可耐受高达1.0M底物。通过精确控制反应时间实现了(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的完全水解，最终可获得(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，ees值为99.6％，分离得率为34.7％(Enzyme.Microb.Tech.,2020,139,109580)。后期构建了JNU9335的鸟枪法基因文库，通过高通量筛选成功鉴定了目标酯酶AcEst1，可反应底物浓度是2.0M(280g/L)，是目前报道的最高水平，所用催化剂为本实验室筛选的重组表达的AcEst1(来源于Acinetobactersp.JNU9335，CGMCC No.17220)，反应20h后ees>99％，分离得到715mM(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯(Bioresource Technol.,2020,317,123984)；虽然也有很多其它报道可以催化环己烯甲酸甲酯的不对称拆分，但都普遍存在光学活性偏低或底物上载量较低等问题,不具备规模化应用的可行性。2004年，Cihangir T等考察了一批商品酶包括猪肝酯酶PLE、马肝酯酶HLE和猪胰脂肪酶PPL在20℃条件下水解70mM外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的效果。其中，PLE反应4h后，产物为(S)-3-环己烯-1-甲酸，光学纯度>99％，产率为43％；HLE催化产物也为(S)-3-环己烯-1-甲酸，ee值为97％，产率有41％；PPL和前两者相反，水解产物为(R)-3-环己烯-1-甲酸，ee值为91％，产率为43％(Tetrahedron Asymmetry,2004,15,2057–2060)。然而，上述酶为动物来源的商品酶，其实际应用的过程中存在：价格昂贵、同工酶干扰、批次间差异较大和引入病毒的风险等。2016年，汪钊等人公开了一种商品蛋白酶拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸的方法，以外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯为底物，在pH 7.5的磷酸盐缓冲液中反应，可获得(S)-3-环己烯-1-甲酸的ee值为99.5％，产率为32.8％(中国专利CN106119303B)。2019年，Xiafen Wu等设计了大肠杆菌酯酶BioH，通过合理的设计提高了其对(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的对映选择性。通过空间和芳香相互作用的组合，阳性突变体Mu3(L24A/W81A/L209A)在水解外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯方面具有较高的(S)-选择性，ee值从32.3％(野生型)提高到70.9％。此外，优化了Mu3在3-环己烯-1-羧酸甲酯水解中的反应条件，在30℃和含有2.5％吐温80的磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，Mu3可水解40mM底物，转化率提高了2倍(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2019,83,1263–1269)。重组酶BioH虽然具有水解3-环己烯-1-甲酸甲酯的活性，但对映选择性较低。
然而，以上报道仅限于实验室规模，且存在催化剂大多为商品酶、底物耐受性差、产物浓度或者选择性不够高等问题。因此针对环己烯甲酸酯化合物，亟需筛选高效和高选择性的生物催化剂，以满足工业需要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用。
本发明的第一个目的是提供一种羧酯酶在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用，所述的羧酯酶是如下(a)或(b)的羧酯酶：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有羧酯酶活性的由(a)衍生的羧酯酶。
进一步地，所述的羧酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，编码所述的羧酯酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述的环己烯甲酸酯的结构式如下所示：
Figure BDA0002943855020000031
其中，R为甲基、乙基、异丙基或丁基。
进一步地，所述的应用具体是在磷酸盐缓冲液中，在所述的羧酯酶的催化下，利用环己烯甲酸酯进行不对称拆分反应，形成光学活性环己烯甲酸。
进一步地，在所述的应用中，环己烯甲酸酯在反应液中的浓度为1～5000mmol/L，羧酯酶的用量为0.01～120kU/L。
进一步地，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸-磷酸钠缓冲液或磷酸-磷酸钾缓冲液。
进一步地，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.2mol/L。磷酸盐缓冲液浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。
进一步地，所述的不对称拆分反应的条件是：在搅拌或振荡条件下，反应温度为20～35℃，反应时间为2～24h。
进一步地，所述羧酯酶在所述的不对称拆分反应中的添加形式较佳地为所述羧酯酶的冻干细胞。
本发明的第二个目的是提供一种羧酯酶突变体，所述的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第三个目的是提供一种编码所述的羧酯酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第四个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。表达载体可通过本领域常规方法将上述羧酯酶基因克隆到各种表达载体上构建而成。所述的表达载体较佳地包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体优选地为pET28a质粒。
本发明的第五个目的是提供一种表达所述的羧酯酶突变体的重组菌。重组菌是通过将上述表达载体转化至宿主细胞中制备得到。宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，并且其所携带的羧酯酶基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选地为：大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)或大肠埃希氏菌E.coli DH5α。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供的羧酯酶作为催化剂在不对称拆分手性环己烯甲酸酯制备手性环己烯甲酸的应用中，底物耐受性好，光学纯度高(ees值达99％以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大。因此，本发明的羧酯酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细说明如后。
附图说明
图1为粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中所述室温为本领域常规室温，室温范围是20～40℃。
表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。
E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，DNA Marker，购自北京天根生化科技有限公司。
限制性内切酶NdeI和XhoI购自大连宝生物有限公司
实施例1：羧酯酶基因的克隆
根据Genbank收录的预测为不动杆菌(Acinetobacter sp.WCHAc010052)羧酯酶的基因序列(Genebank登录号：AXY61874.1)为依据，设计PCR引物如下：
上游引物：5'-gtgccgcgcggcagccatatgATGGTTGCGTTTAATACAAAGATTCA-3'
下游引物：5'-gtggtggtggtggtgctcgagTTAGCGCTGGCGATCCCA-3'；
其中，上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)下划线部分为NdeI酶切位点，下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)下划线部分为XhoI酶切位点。
以不动杆菌Acinetobacter sp.WCHAc010052的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 10μL，上游引物和下游引物各1μL(0.3μmol/L)，DNA模板1μL(0.1μg)和ddH2O 7μL。PCR扩增程序为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。获得一条完整的羧酯酶全长基因序列，经DNA测序，全长1068bp，命名为CarEst3。所述基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
实施例2：羧酯酶重组质粒和重组表达转化体的制备
将实施例1所得的羧酯酶基因DNA片段及pET28a空质粒在37℃用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28a-CarEst3。
将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌E.coli DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-CarEst3，菌落PCR和基因测序验证阳性克隆。
实施例3：羧酯酶的表达
将实施例2所得的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞，冷冻干燥24h即可得冻干细胞，收集后4℃保存。还可将所得的静息细胞悬浮于pH 7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组羧酯酶的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(图1)，重组羧酯酶以可溶的形式存在。
实施例4：羧酯酶活力的测定
通过检测405nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定羧酯酶的活力。羧酯酶活力测定方法如下：于200μL反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 8.0)中，加入1mmol/L环己烯甲酸对硝基苯酚酯，30℃保温2min后加入适量实施例3制备的粗酶液，迅速混匀，检测405nm处吸光值的变化。酶活力(U)的定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol环己烯甲酸对硝基苯酚酯所需的酶量。
实施例5-8：羧酯酶催化不同酯的不对称拆分反应
在10mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 8.0)中加入2U实施例3制备的CarEst3粗酶液在30℃，120rpm振荡反应，每隔一段时间取样监测反应情况。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和ee值。结果见表1。
产物ee值的具体分析条件如下：
使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱B-DM(30m×0.25mm×0.25μm,Sigma)，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，检测器温度280℃，初始柱温50℃，2℃/min至160℃保持10min。
表1 CarEst3对不同3-环己烯-1-甲酸酯的活性和产物光学纯度
Figure BDA0002943855020000061
实施例9-13：羧酯酶催化3-环己烯-1-甲酸甲酯的不对称拆分反应
在100mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 8.0)中加入实施例3制备的CarEst3的冻干细胞为4，4，10，20或70kU/L，分别加入底物至终浓度为1，2，3，4或5mol/L。转化至底物ee>99.0％(S)，结果如表2所示。CarEst3表现出非常稳定的催化性能，尤其是在较高底物浓度条件下(5mol/L，700g/L)仍然具有较高的立体选择性。
表2利用CarEst3冻干细胞催化3-环己烯-1-甲酸甲酯的不对称拆分反应
Figure BDA0002943855020000062
实施例14：羧酯酶突变体的制备
将实施例1所得的羧酯酶CarEst3全长基因序列(SEQ ID NO:1)进行3个碱基的突变，突变体的突变位置分别是将环己烯甲酸酯酶基因编码序列的第133位的V突变为L，第232位的D突变为S，第247位的L突变为F，得到的突变基因的序列如SEQ ID NO:3所示。所述羧酯酶的突变基因通过如实施例2-3的方法制备冻干细胞和重组突变环己烯甲酸酯酶粗酶。经活力测定，突变酶的比活力是野生型的3.2倍。
实施例15：羧酯酶及突变体催化3-环己烯-1-甲酸甲酯反应
在100mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 8.0)中加入实施例14制备的CarEst3突变酶的冻干细胞(70kU/L)，加入底物至终浓度为5mol/L。与野生型相比，转化至底物ee>99.0％(S)，需要CarEst3突变酶的添加量更少，反应时间更短，具有较好的应用开发潜力。反应结束后用2.0M NaOH调pH至12，然后用二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂即可得到(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯。然后将(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯加入1.0M NaOH水溶液50℃加热回流搅拌反应6h，再加入1.0M HCl水溶液调节pH至5.0，加入等体积二氯甲烷萃取3次，合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，旋转蒸发得到(S)-3-环己烯-1-甲酸，所得产物为具有特殊气味的液体，分离后总得率为37％，光学纯度为99％ee。
不同酶催化不对称拆分3-环己烯-1-甲酸甲酯结果的比较。其中酶1，2和3(PLE,HLE和PPL)制备方法参见参考文献1(Tetrahedron Asymmetry,2004,15,2057–2060)；酶4、5制备方法参见参考文献2(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2019,83,1263–1269)；酶6制备方法参见参考文献3(Enzyme.Microb.Technol.,2020,139,109580)；酶7制备方法参见参考文献4(Bioresource Technol.,2020,317,123984)；酶8为实施例3制备所得，酶9为实施例14制备所得。具体不对称拆分结果如表3所示。
表3不同来源的酶不对称拆分3-环己烯-1-甲酸甲酯结果比较
Figure BDA0002943855020000071
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1071
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
atggttgcgt ttaatacaaa gattcagaaa atgatggaaa aaggacaggg cgcggcagcc 60
cgtaccttag atcgtttgcc gggcatcgct caagaaaccc tgagcaaggc gcttggatat 120
ccctaccact accctgattt agaccctttc atcaaatgta tgatggctgc tcaaatcaaa 180
caaggtaaaa ttggttttat tggcgatgac cctgcccatt cacgtaaggt gttcgaccaa 240
cagatgcaat ccattcgtgc gcaagccacg ccggtgaaac gcatcgaaga cttgcgcctg 300
ccactgcact ctggaacgat cttcgcacgt cactatcatc ccgcgcctca caaaaaactt 360
ccgatgatcg tattctatca tgggggaggt tttgtcgttg gggggatgga ttcccatgac 420
gaggcctgcc gcttgattgc ggttcatgcc ggagcccagg ttctgtccat tgattatcct 480
ctggctcccg aagcatcccc aaaacaactt atccaaacat gtgaagacgc attagcgtgg 540
gtgtaccaaa accgtcgtca gttcaagatt cttaaaaatc gcatcgctgt cgctggggac 600
tcggctggtg gtaatatcag tgcagttgtt gcccagcgca gtgccaacaa agtatacgct 660
ccagaggcac aatttttgat ttaccccgtg gtggacttta aatcgcgcca cccgtctttc 720
tatgcataca aagacggact ggtgttgacg ggagcagatg tggattacgt gacggattac 780
tacgctacac agcatgacat ccaattagat gaccctatga tctcacccac ctatggcaac 840
ttaaagcgcc aacctcctgc ctttgtggtc accgcggggc acgatttgct tcatgatgaa 900
ggcgagatct acgcacataa gttgcgtcat caggggaaca aggttgagta ccaggagtac 960
agcgatcaga ctcacggatt cctgaacctt accccggtgt cccgccgtgc taaaaagatt 1020
actatcgaga tctcaaaaaa ttttcgtaaa ttctgggatc gccagcgcta a 1071
<210> 2
<211> 356
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 2
Met Val Ala Phe Asn Thr Lys Ile Gln Lys Met Met Glu Lys Gly Gln
1 5 10 15
Gly Ala Ala Ala Arg Thr Leu Asp Arg Leu Pro Gly Ile Ala Gln Glu
20 25 30
Thr Leu Ser Lys Ala Leu Gly Tyr Pro Tyr His Tyr Pro Asp Leu Asp
35 40 45
Pro Phe Ile Lys Cys Met Met Ala Ala Gln Ile Lys Gln Gly Lys Ile
50 55 60
Gly Phe Ile Gly Asp Asp Pro Ala His Ser Arg Lys Val Phe Asp Gln
65 70 75 80
Gln Met Gln Ser Ile Arg Ala Gln Ala Thr Pro Val Lys Arg Ile Glu
85 90 95
Asp Leu Arg Leu Pro Leu His Ser Gly Thr Ile Phe Ala Arg His Tyr
100 105 110
His Pro Ala Pro His Lys Lys Leu Pro Met Ile Val Phe Tyr His Gly
115 120 125
Gly Gly Phe Val Val Gly Gly Met Asp Ser His Asp Glu Ala Cys Arg
130 135 140
Leu Ile Ala Val His Ala Gly Ala Gln Val Leu Ser Ile Asp Tyr Pro
145 150 155 160
Leu Ala Pro Glu Ala Ser Pro Lys Gln Leu Ile Gln Thr Cys Glu Asp
165 170 175
Ala Leu Ala Trp Val Tyr Gln Asn Arg Arg Gln Phe Lys Ile Leu Lys
180 185 190
Asn Arg Ile Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Gly Asn Ile Ser Ala
195 200 205
Val Val Ala Gln Arg Ser Ala Asn Lys Val Tyr Ala Pro Glu Ala Gln
210 215 220
Phe Leu Ile Tyr Pro Val Val Asp Phe Lys Ser Arg His Pro Ser Phe
225 230 235 240
Tyr Ala Tyr Lys Asp Gly Leu Val Leu Thr Gly Ala Asp Val Asp Tyr
245 250 255
Val Thr Asp Tyr Tyr Ala Thr Gln His Asp Ile Gln Leu Asp Asp Pro
260 265 270
Met Ile Ser Pro Thr Tyr Gly Asn Leu Lys Arg Gln Pro Pro Ala Phe
275 280 285
Val Val Thr Ala Gly His Asp Leu Leu His Asp Glu Gly Glu Ile Tyr
290 295 300
Ala His Lys Leu Arg His Gln Gly Asn Lys Val Glu Tyr Gln Glu Tyr
305 310 315 320
Ser Asp Gln Thr His Gly Phe Leu Asn Leu Thr Pro Val Ser Arg Arg
325 330 335
Ala Lys Lys Ile Thr Ile Glu Ile Ser Lys Asn Phe Arg Lys Phe Trp
340 345 350
Asp Arg Gln Arg
355
<210> 3
<211> 1071
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
atggttgcgt ttaatacaaa gattcagaaa atgatggaaa aaggacaggg cgcggcagcc 60
cgtaccttag atcgtttgcc gggcatcgct caagaaaccc tgagcaaggc gcttggatat 120
ccctaccact accctgattt agaccctttc atcaaatgta tgatggctgc tcaaatcaaa 180
caaggtaaaa ttggttttat tggcgatgac cctgcccatt cacgtaaggt gttcgaccaa 240
cagatgcaat ccattcgtgc gcaagccacg ccggtgaaac gcatcgaaga cttgcgcctg 300
ccactgcact ctggaacgat cttcgcacgt cactatcatc ccgcgcctca caaaaaactt 360
ccgatgatcg tattctatca tgggggaggt tttgtcctgg gggggatgga ttcccatgac 420
gaggcctgcc gcttgattgc ggttcatgcc ggagcccagg ttctgtccat tgattatcct 480
ctggctcccg aagcatcccc aaaacaactt atccaaacat gtgaagacgc attagcgtgg 540
gtgtaccaaa accgtcgtca gttcaagatt cttaaaaatc gcatcgctgt cgctggggac 600
tcggctggtg gtaatatcag tgcagttgtt gcccagcgca gtgccaacaa agtatacgct 660
ccagaggcac aatttttgat ttaccccgtg gtgagcttta aatcgcgcca cccgtctttc 720
tatgcataca aagacggatt tgtgttgacg ggagcagatg tggattacgt gacggattac 780
tacgctacac agcatgacat ccaattagat gaccctatga tctcacccac ctatggcaac 840
ttaaagcgcc aacctcctgc ctttgtggtc accgcggggc acgatttgct tcatgatgaa 900
ggcgagatct acgcacataa gttgcgtcat caggggaaca aggttgagta ccaggagtac 960
agcgatcaga ctcacggatt cctgaacctt accccggtgt cccgccgtgc taaaaagatt 1020
actatcgaga tctcaaaaaa ttttcgtaaa ttctgggatc gccagcgcta a 1071
<210> 4
<211> 356
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 4
Met Val Ala Phe Asn Thr Lys Ile Gln Lys Met Met Glu Lys Gly Gln
1 5 10 15
Gly Ala Ala Ala Arg Thr Leu Asp Arg Leu Pro Gly Ile Ala Gln Glu
20 25 30
Thr Leu Ser Lys Ala Leu Gly Tyr Pro Tyr His Tyr Pro Asp Leu Asp
35 40 45
Pro Phe Ile Lys Cys Met Met Ala Ala Gln Ile Lys Gln Gly Lys Ile
50 55 60
Gly Phe Ile Gly Asp Asp Pro Ala His Ser Arg Lys Val Phe Asp Gln
65 70 75 80
Gln Met Gln Ser Ile Arg Ala Gln Ala Thr Pro Val Lys Arg Ile Glu
85 90 95
Asp Leu Arg Leu Pro Leu His Ser Gly Thr Ile Phe Ala Arg His Tyr
100 105 110
His Pro Ala Pro His Lys Lys Leu Pro Met Ile Val Phe Tyr His Gly
115 120 125
Gly Gly Phe Val Leu Gly Gly Met Asp Ser His Asp Glu Ala Cys Arg
130 135 140
Leu Ile Ala Val His Ala Gly Ala Gln Val Leu Ser Ile Asp Tyr Pro
145 150 155 160
Leu Ala Pro Glu Ala Ser Pro Lys Gln Leu Ile Gln Thr Cys Glu Asp
165 170 175
Ala Leu Ala Trp Val Tyr Gln Asn Arg Arg Gln Phe Lys Ile Leu Lys
180 185 190
Asn Arg Ile Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Gly Asn Ile Ser Ala
195 200 205
Val Val Ala Gln Arg Ser Ala Asn Lys Val Tyr Ala Pro Glu Ala Gln
210 215 220
Phe Leu Ile Tyr Pro Val Val Ser Phe Lys Ser Arg His Pro Ser Phe
225 230 235 240
Tyr Ala Tyr Lys Asp Gly Phe Val Leu Thr Gly Ala Asp Val Asp Tyr
245 250 255
Val Thr Asp Tyr Tyr Ala Thr Gln His Asp Ile Gln Leu Asp Asp Pro
260 265 270
Met Ile Ser Pro Thr Tyr Gly Asn Leu Lys Arg Gln Pro Pro Ala Phe
275 280 285
Val Val Thr Ala Gly His Asp Leu Leu His Asp Glu Gly Glu Ile Tyr
290 295 300
Ala His Lys Leu Arg His Gln Gly Asn Lys Val Glu Tyr Gln Glu Tyr
305 310 315 320
Ser Asp Gln Thr His Gly Phe Leu Asn Leu Thr Pro Val Ser Arg Arg
325 330 335
Ala Lys Lys Ile Thr Ile Glu Ile Ser Lys Asn Phe Arg Lys Phe Trp
340 345 350
Asp Arg Gln Arg
355
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
gtgccgcgcg gcagccatat gatggttgcg tttaatacaa agattca 47
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
gtggtggtgg tggtgctcga gttagcgctg gcgatccca 39

Claims (10)

1.一种羧酯酶在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用，其特征在于，所述的羧酯酶是如下(a)或(b)的羧酯酶：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有羧酯酶活性的由(a)衍生的羧酯酶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的羧酯酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述的羧酯酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的环己烯甲酸酯的结构式如下所示：
Figure FDA0002943855010000011
其中，R为甲基、乙基、异丙基或丁基。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用具体是在磷酸盐缓冲液中，在所述的羧酯酶的催化下，利用环己烯甲酸酯进行不对称拆分反应，形成光学活性环己烯甲酸。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在所述的应用中，环己烯甲酸酯在反应液中的浓度为1～5000mmol/L，羧酯酶的用量为0.01～120kU/L。
7.一种羧酯酶突变体，其特征在于，所述的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.一种编码权利要求7所述的羧酯酶突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
9.一种携带权利要求8所述基因的表达载体。
10.一种表达权利要求7所述的羧酯酶突变体的重组菌。
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