CN115896065A - 一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用。本发明的立体选择性羧酯酶对多种环烷烃甲酯类底物具有较高的活力，利用本发明所述的羧酯酶催化动力学拆分环烷烃甲酯类底物时，反应条件温和，操作过程简便，易于放大；通过该动力学拆分反应制备所得的手性酸产物浓度高，光学纯度高，ee值可达99％，具有良好的工业应用前景。

Description

一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

(S)-氧杂环己烷-2-甲酸((S)-THPCA)是一种重要的手性化工原料和医药中间体，广泛的应用于手性合成领域，特别是在手性药物制备方面，也是药物的重要手性构建块，如针对II型糖尿病的Danuglipron(PF-06882961)，其需求量在飞速的增长。由于氧杂环己烷-2-甲酸酯连接到手性中心的两个取代基差异很小，很少有报道的酶具有对映体选择性来区分杂环羧酸酯的两个对映体。此外，使用手性助剂的杂环羧酸酯的化学拆分也具有挑战性，这也是因为其特殊的对称结构。因此鉴定具有高对映体选择性的新型羧酸酯酶，对高效合成手性氧杂环羧酸及其衍生物，阐明羧酸酯酶对映体选择性的分子机理具有重要意义。

用于生物法制备(S)-THPCA的生物催化剂既可以是整细胞，也可以是酶。因为细胞内含有多种酶，整细胞催化往往会遇到副反应的问题，副反应的存在会降低目标反应产物的得率。对于拆分氧杂环己烷-2-甲酸酯这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产酯酶，将为其在氧杂环己烷-2-甲酸酯中的应用奠定良好的基础。

羧酯酶(Carboxylesterases，EC 3.1.1.1)是一类催化酯键(羧酯键、酰胺键、硫酯键等)水解和合成的酶。工业应用的羧酯酶多数来自微生物，这类微生物从分类上看主要是真菌，主要包括黑曲霉、链孢霉、青霉、黄曲霉、毛霉、犁头菌、红曲霉、根霉、白地霉、核盘菌、酵母菌和须霉等12属23种；其次是细菌，包括伯克霍尔德属、葡萄球菌属、假单胞菌属及芽孢杆菌属等。这些野生菌中羧酯酶含量较低并且比较杂，利用其作为生物催化剂进行大规模的工业化生产存在一定的难度，因而构建羧酯酶基因工程菌从而大量生产重组羧酯酶具有十分重要意义。因此针对氧杂环己烷-2-甲酸酯化合物，亟需筛选高效和高选择性的生物催化剂，以满足工业需要。

发明内容

为解决上述问题，本发明针对现有的生物催化动力学拆分氧杂环己烷-2-甲酸酯制备(S)-THPCA的反应中，可提供该反应的羧酯酶报道较少的问题，提供一种具有优异的不对称催化活性、立体选择性好的羧酯酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及重组酶和该重组酶的制备方法，以及该羧酯酶或其突变重组酶的应用。

本发明的第一个目的是提供一种立体选择性羧酯酶，所述的立体选择性羧酯酶是如下(a)或(b)的羧酯酶：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶；

(b)由(a)中所述羧酯酶经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的具有羧酯酶活性的衍生蛋白质。

SEQ ID NO.2的序列具体如下：

MAIRETVGVDGTPLVYSVTGDPDARALVLLHGWAQSSKCWGPGVLDELAARYRVIAVDLRGHGYSGAPDTGYDDSAVWAGDVDAVLTAEGVTSGAVLLGWSYGGLVICDYLASNGTSAVDGVVLVGAITSIGRGEAGGKVGAAMRAAIPGAMSEEPREAIRALGAFGNALTGPPEGKGAQSQALFGASLTTPPRVRAALFNRSASHDDLLRSLDVPVLVLHGTEDSVVDVSAGRHAAELIPQARASFWEGCDHGPFVEDPERFVKEVGEFVDNLG。

进一步地，所述的衍生蛋白质是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶的第144位甲硫氨酸突变为苏氨酸，第148位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第149位脯氨酸突变为丙氨酸，该突变体(M144T/I148F/P149A)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4的序列具体如下：

MAIRETVGVDGTPLVYSVTGDPDARALVLLHGWAQSSKCWGPGVLDELAARYRVIAVDLRGHGYSGAPDTGYDDSAVWAGDVDAVLTAEGVTSGAVLLGWSYGGLVICDYLASNGTSAVDGVVLVGAITSIGRGEAGGKVGAATRAAFAGAMSEEPREAIRALGAFGNALTGPPEGKGAQSQALFGASLTTPPRVRAALFNRSASHDDLLRSLDVPVLVLHGTEDSVVDVSAGRHAAELIPQARASFWEGCDHGPFVEDPERFVKEVGEFVDNLG。

本发明所述羧酯酶的来源较佳地包括：提取自然界中天然存在的羧酯酶，通过人工合成氨基酸全序列所得的羧酯酶，通过基因工程方法克隆表达所得的羧酯酶。

本发明所述羧酯酶较佳地来源于红球菌属。所述羧酯酶通过基因组挖掘的方法获得，通过测定比较水解酶的活力及其对外消旋氧杂环己烷-2-甲酸酯的立体选择性等，对所克隆的酶进行反复比较和筛选，最终获得催化性能最佳的羧酯酶，即来自红球菌Rhodococcus opacus的羧酯酶RoCE(Genbank登录号：ANS30253.1)，测所述羧酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述羧酯酶的基因来源包括：通过基因克隆技术获得羧酯酶基因，或者通过人工全基因合成的方法得到所述羧酯酶基因。本发明所述羧酯酶基因来源较佳地为：红球菌(Rhodococcus opacus)。其具体制备方法较佳地包括：根据Genbank中收录的预测为水解酶的红球菌(Rhodococcus opacus)基因(Genebank登录号：CP009111.1)序列设计合成引物，所述引物优选地为：

上游引物：5'-gtgccgcgcggcagccatatgATGGCAATTCGTGAGACCGT-3'

下游引物：5'-acggagctcgaattcggatccTTAACCCAGATTGTCCACGAATT-3'

其中，上游引物核苷酸序列下划线部分为NdeI酶切位点，下游引物下划线部分为BamHI酶切位点。然后以Rhodococcus opacus菌的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得完整的羧酯酶全长基因DNA片段。其中所述羧酯酶全长基因(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示)，命名RoCE，全长为828个核苷酸碱基。其编码序列从第1个碱基起至第828个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

由于密码子的兼并性，编码上述羧酯酶(氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示)的核酸分子不仅仅局限于序列如SEQ ID NO.1所示的核酸分子。还可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加核苷酸来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示的核酸分子的一个或多个碱基在保持羧酯酶活性范围内进行替换、缺失或增加来获得。所述羧酯酶基因的突变优选地为3个碱基的突变，分别为将前述羧酯酶基因编码序列的第144位的M突变为T，第148位的I突变为F，第149位的P突变为A，从而得到所述羧酯酶基因的突变体，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述立体选择性羧酯酶的基因。

进一步地，所述编码立体选择性羧酯酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.3所示。

SEQ ID NO.1的序列具体如下：

ATGGCTATTCGTGAAACAGTCGGCGTCGACGGAACGCCCCTCGTCTACTCGGTGACCGGTGACCCCGACGCGCGGGCCCTGGTACTCCTGCACGGTTGGGCGCAGTCCTCGAAGTGCTGGGGCCCCGGGGTGCTCGACGAACTCGCGGCCCGCTACCGCGTCATCGCTGTCGACCTGCGCGGACACGGCTACTCGGGTGCGCCCGACACCGGCTACGACGACTCCGCGGTCTGGGCCGGGGACGTCGACGCGGTGCTCACGGCCGAAGGTGTCACGTCCGGCGCCGTGCTCCTCGGCTGGTCCTACGGCGGCCTCGTGATCTGCGACTACCTGGCGTCGAACGGCACGTCCGCCGTCGACGGTGTGGTCCTCGTCGGAGCCATCACCAGCATCGGCCGCGGGGAGGCAGGCGGCAAGGTCGGTGCCGCGATGCGCGCGGCGATCCCCGGCGCGATGTCCGAGGAACCGCGCGAGGCGATCCGCGCGCTGGGCGCATTCGGCAACGCGCTCACCGGACCGCCGGAAGGCAAGGGCGCACAGTCGCAGGCGCTGTTCGGGGCCAGCCTCACCACCCCGCCCCGGGTGCGGGCCGCCCTCTTCAACCGGTCCGCGAGCCACGACGACCTGCTCCGGTCCCTCGACGTGCCGGTGCTCGTCCTGCACGGCACCGAGGACTCCGTCGTCGATGTCTCGGCTGGTAGGCACGCTGCAGAACTGATCCCGCAGGCGCGGGCGTCGTTCTGGGAAGGCTGCGATCACGGACCGTTCGTGGAGGATCCCGAGAGGTTCGTGAAGGAGGTCGGCGAGTTCGTCGACAACCTCGGTTAA。

SEQ ID NO.3的序列具体如下：

ATGGCTATTCGTGAAACAGTCGGCGTCGACGGAACGCCCCTCGTCTACTCGGTGACCGGTGACCCCGACGCGCGGGCCCTGGTACTCCTGCACGGTTGGGCGCAGTCCTCGAAGTGCTGGGGCCCCGGGGTGCTCGACGAACTCGCGGCCCGCTACCGCGTCATCGCTGTCGACCTGCGCGGACACGGCTACTCGGGTGCGCCCGACACCGGCTACGACGACTCCGCGGTCTGGGCCGGGGACGTCGACGCGGTGCTCACGGCCGAAGGTGTCACGTCCGGCGCCGTGCTCCTCGGCTGGTCCTACGGCGGCCTCGTGATCTGCGACTACCTGGCGTCGAACGGCACGTCCGCCGTCGACGGTGTGGTCCTCGTCGGAGCCATCACCAGCATCGGCCGCGGGGAGGCAGGCGGCAAGGTCGGTGCCGCGACCCGCGCGGCGTTTGCAGGCGCGATGTCCGAGGAACCGCGCGAGGCGATCCGCGCGCTGGGCGCATTCGGCAACGCGCTCACCGGACCGCCGGAAGGCAAGGGCGCACAGTCGCAGGCGCTGTTCGGGGCCAGCCTCACCACCCCGCCCCGGGTGCGGGCCGCCCTCTTCAACCGGTCCGCGAGCCACGACGACCTGCTCCGGTCCCTCGACGTGCCGGTGCTCGTCCTGCACGGCACCGAGGACTCCGTCGTCGATGTCTCGGCTGGTAGGCACGCTGCAGAACTGATCCCGCAGGCGCGGGCGTCGTTCTGGGAAGGCTGCGATCACGGACCGTTCGTGGAGGATCCCGAGAGGTTCGTGAAGGAGGTCGGCGAGTTCGTCGACAACCTCGGTTAA。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的重组表达载体。所述重组表达载体可通过本领域常规方法将上述羧酯酶基因克隆到各种表达载体上构建而成，其中，表达载体包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述表达载体优选为pET-28a质粒。

进一步地，可通过下述方法制得所述重组表达载体：将通过PCR扩增所得的羧酯酶基因产物用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切，同时将表达载体pET-28a用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切，形成互补的粘性末端，回收上述羧酯酶基因酶切产物以及酶切后的pET-28a质粒，利用T4 DNA连接酶连接，构建包含所述羧酯酶基因的重组表达载体pET28a-RoCE。

本发明的第四个目的是提供表达所述立体选择性羧酯酶的宿主细胞。

进一步地，所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，并且其所携带的羧酯酶基因可被有效表达即可，如细菌、真菌、植物细胞、动物细胞等。

进一步地，所述细菌优选为大肠杆菌，更优选地为：大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)或大肠埃希氏菌E.coli DH5α。将前述重组表达载体pET28a-RoCE转化至大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)中，即可得基因工程菌株，即大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-RoCE。

进一步地，上述立体选择性羧酯酶由以下步骤制备得到：将上述表达立体选择性羧酯酶的宿主细胞接种至培养基中进行发酵，获得发酵液；将发酵液进行离心，收集菌体；将菌体进行破碎后离心，获得细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液进行提取，获得上述立体选择性羧酯酶。

进一步地，所述的培养基可为本领域中任何可使转化体生长并产生羧酯酶的培养基。所述培养基优选LB培养基：蛋白胨5-15g/L，酵母膏1-10g/L，NaCl 5-15g/L，pH 6.0-8.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生羧酯酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。菌株培养方法优选的包括：将本发明所述的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3))接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.6-0.8(优选0.6)时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L(优选0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明羧酯酶。

本发明的第五个目的是提供一种生产手性环烷烃甲酸的方法，包括以下步骤：以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶或由其经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的具有羧酯酶活性的衍生蛋白质为催化剂，通过拆分反应制备手性环烷烃甲酸。

进一步地，以环烷烃甲酯类化合物为底物制备手性环烷烃甲酸。

进一步地，所述环烷烃甲酯类化合物包括氧杂环烷烃甲酸酯或二甲基环烷烃甲酸酯。其中，氧杂环烷烃甲酸酯包括氧杂环烷烃甲酸甲酯或氧杂环烷烃甲酸乙酯，如氧杂环丙烷-2-甲酸甲酯、氧杂环丙烷-2-甲酸乙酯、氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯、氧杂环丁烷-2-甲酸乙酯、氧杂环戊烷-2-甲酸甲酯、氧杂环戊烷-2-甲酸乙酯、氧杂环己烷-2-甲酸甲酯、氧杂环己烷-2-甲酸乙酯；二甲基环烷烃甲酸酯包括2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯或2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯等。

进一步地，所述反应体系中，温度为20-60℃，优选为30-50℃。

进一步地，所述反应体系中，pH为5.0-10.0，优选为6.0-8.0。

进一步地，所述反应体系中，缓冲液优选为磷酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液。具体地，以氧杂环己烷甲酸酯化合物为例，在磷酸钠盐缓冲液中，在所述羧酯酶的催化下，利用氧杂环己烷甲酸酯化合物进行不对称拆分反应，形成光学活性氧杂环己烷甲酸。

进一步地，酶促氧杂环己烷-2-甲酸酯水解拆分反应的条件如下：重组RoCE冻干细胞，溶解于缓冲液中，加入底物氧杂环己烷-2-甲酸乙酯至终浓度为100-1000mM。反应在20-60℃下进行，机械搅拌，通过补充1.0M NaOH控制pH，直至底物ee接近99％。反应结束后先用二氯甲烷萃取除去剩余的氧杂环己烷-2-甲酸乙酯底物，剩余水相用20％浓硫酸调pH至酸性，然后用二氯甲烷萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂即可得到(S)-氧杂环己烷-2-甲酸。

本发明的有益效果：

本发明的羧酯酶作为催化剂在不对称拆分手性环烷烃甲酸酯制备手性环烷烃甲酸的应用中，底物耐受性好，光学纯度高(ee_s值达99％以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用开发前景。

附图说明

图1为重组RoCE的破碎上清及沉淀，泳道1为破碎上清，泳道2为沉淀。

图2为外消旋底物及产物气相色谱图，(A)外消旋氧杂环己烷甲酸乙酯(THPCE)，(B)利用重组RoCE制备的(R)-氧杂环己烷甲酸乙酯。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1羧酯酶基因的克隆

根据Genbank收录的预测为红球菌(Rhodococcus opacus)羧酯酶的基因序列(Genebank登录号：ANS30253.1)为依据，设计PCR引物如下：

上游引物：5'-gtgccgcgcggcagccatatgATGGCAATTCGTGAGACCGT-3'

下游引物：5'-acggagctcgaattcggatccTTAACCCAGATTGTCCACGAATT-3'

其中，上游引物下划线部分为NdeI酶切位点，下游引物下划线部分为BamHI酶切位点。

以红球菌Rhodococcus opacus的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 10μL，上游引物和下游引物各1μL(0.3μmol/L)，DNA模板1μL(0.1μg)和ddH₂O 7μL。PCR扩增程序为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。获得一条完整的羧酯酶全长基因序列，经DNA测序，全长828bp，命名为RoCE。所述基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

实施例2羧酯酶重组表达载体和重组表达转化体的制备

将实施例1所得的羧酯酶基因DNA片段及pET-28a空质粒在37℃用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28a-RoCE。

将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌E.coli DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-RoCE，菌落PCR和基因测序验证阳性克隆。

实施例3羧酯酶的表达

将实施例2所得的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞，冷冻干燥24h即可得冻干细胞，收集后4℃保存。还可将所得的静息细胞悬浮于pH 7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组羧酯酶的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(图1)，重组羧酯酶以可溶的形式存在。

实施例4羧酯酶活力的测定

通过检测405nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定羧酯酶的水解活力。活力测定方法如下：于200μL反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH8.0)中，加入1mmol/L对硝基苯酚乙酸酯，30℃保温2min后加入适量实施例3制备的粗酶液，迅速混匀，检测405nm处吸光值的变化。酶活力(U)的定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol对硝基苯酚乙酸酯所需的酶量。

实施例5羧酯酶催化不同酯的不对称拆分反应

在10mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 8.0)中加入20U实施例3制备的RoCE粗酶液在30℃，120rpm振荡反应，每隔一段时间取样监测反应情况。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和ee_s值。结果见表1。

底物转化率和底物ee_s值的具体分析条件如下：

使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX(25m×0.25mm×0.25μm,Sigma)，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，检测器温度280℃，初始柱温50℃，2℃/min至160℃保持3min。

表1RoCE对不同环烷烃甲酸酯的活性和产物光学纯度

实施例6羧酯酶突变体的制备

将实施例1所得的羧酯酶RoCE全长基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)进行3个碱基的突变，突变体的突变位置分别是将所述羧酯酶基因编码序列的第144位的M突变为T，第148位的I突变为F，第149位的P突变为A得到的突变基因的序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述羧酯酶的突变基因通过如实施例2-3所述的方法制备冻干细胞和重组突变氧杂环己烷甲酸酯酶粗酶。

实施例7羧酯酶突变体催化不同酯的不对称拆分反应

在10mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 8.0)中加入20U实施例6制备的RoCE粗酶粉在30℃，120rpm振荡反应，每隔一段时间取样监测反应情况。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和ee_s值。结果见表2。

表2RoCE突变体对不同环烷烃甲酸酯的活性和产物光学纯度

实施例8羧酯酶突变体催化氧杂环己烷-2-甲酸乙酯反应

在100mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 8.0)中加入实施例6制备的RoCE突变酶的冻干细胞，分别加入终浓度为0.2，0.5，1或2mol/L。转化至底物ee>99.0％。反应结束后先用二氯甲烷萃取得到剩余的(R)-氧杂环己烷-2-甲酸乙酯，剩余水相用20％浓硫酸调pH至酸性，然后用二氯甲烷萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂即可得到(S)-氧杂环己烷-2-甲酸。分离后(R)-氧杂环己烷-2-甲酸乙酯总得率为24％，光学纯度为99％ee。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种立体选择性羧酯酶，其特征在于，所述立体选择性羧酯酶是如下(a)或(b)的羧酯酶：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶；

(b)由(a)中所述羧酯酶经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的具有羧酯酶活性的衍生蛋白质。

2.根据权利要求1所述的立体选择性羧酯酶，其特征在于：所述的衍生蛋白质是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶的第144位甲硫氨酸突变为苏氨酸，第148位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第149位脯氨酸突变为丙氨酸。

3.编码权利要求1或2所述的立体选择性羧酯酶的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

5.携带权利要求3或4所述的基因的重组表达载体。

6.表达权利要求1或2所述的立体选择性羧酯酶的宿主细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。

8.权利要求1或2所述的立体选择性羧酯酶、权利要求3或4所述的基因、权利要求5所述的重组表达载体或权利要求6或7所述的宿主细胞在生产手性环烷烃甲酸中的应用。

9.一种生产手性环烷烃甲酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：以氨基酸序列如SEQID NO.2所示的羧酯酶或由其经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的具有羧酯酶活性的衍生蛋白质为催化剂，通过拆分反应制备手性环烷烃甲酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：以环烷烃甲酯类化合物为底物制备手性环烷烃甲酸。

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