CN117535268A - 具有立体选择性的酯酶及其应用 - Google Patents

具有立体选择性的酯酶及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117535268A
CN117535268A CN202311491361.6A CN202311491361A CN117535268A CN 117535268 A CN117535268 A CN 117535268A CN 202311491361 A CN202311491361 A CN 202311491361A CN 117535268 A CN117535268 A CN 117535268A
Authority
CN
China
Prior art keywords
esterase
seq
sequence
formate
chiral
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311491361.6A
Other languages
English (en)
Inventor
王武宝
胡廷峰
孙方刚
刘刚
高小飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan Carbotang Biotech Co ltd
Original Assignee
Jinan Carbotang Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan Carbotang Biotech Co ltd filed Critical Jinan Carbotang Biotech Co ltd
Priority to CN202311491361.6A priority Critical patent/CN117535268A/zh
Publication of CN117535268A publication Critical patent/CN117535268A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本申请公开了一种具有立体选择性的酯酶及其应用，所述酯酶为：a)包含如SEQ ID NO:2所示的序列或者如SEQ ID NO:2所示的序列；或者b)包含一个或两个以上突变的基于SEQ ID NO:2的突变体，所述酯酶作为催化剂在不对称拆分制备手性氧杂环烷烃甲酸酯的应用中，底物耐受性好，光学纯度高(ees值达99％以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用开发前景。

Description

具有立体选择性的酯酶及其应用
技术领域
本申请涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种具有立体选择性的酯酶及其应用。
背景技术
(S)-氧杂环丁烷-2-甲酸是一种重要的手性化工原料和医药中间体，广泛应用于手性合成领域，特别是在手性药物制备方面，也是药物的重要手性构建单元，如兼具治疗II型糖尿病和肥胖症的Danuglipron(PF-06882961)，其需求量在飞速的增长。由于氧杂环丁烷-2-甲酸酯连接到手性中心的两个取代基差异很小，很少有报道的酶具有对映体选择性来区分杂环羧酸酯的两个对映体。此外，由于手性中心两侧基团差异较小，使得通过手性助剂法化学拆分杂环羧酸酯也具有挑战性。因此鉴定具有高对映体选择性的新型酯酶，对于高效合成手性氧杂环羧酸及其衍生物，阐明酯酶对映体选择性的分子机理具有重要意义。
用于生物法制备(S)-氧杂环丁烷-2-甲酸及(S)-氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯的生物催化剂既可以是整细胞，也可以是酶。因为细胞内含有多种酶，整细胞催化往往会遇到副反应的问题，副反应的存在会降低目标反应产物的得率。对于拆分氧杂环己烷-2-甲酸酯这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产酯酶，将为其在氧杂环丁烷-2-甲酸酯中的应用奠定良好的基础。
酯酶(Esterases，EC 3.1.1.1)是一类催化酯键(羧酯键、酰胺键、硫酯键等)水解和合成的酶。工业应用的酯酶多数来自微生物，这类微生物从分类上看主要是真菌，主要包括黑曲霉、链孢霉、青霉、黄曲霉、毛霉、犁头菌、红曲霉、根霉、白地霉、核盘菌、酵母菌和须霉等12属23种；其次是细菌，包括伯克霍尔德属、葡萄球菌属、假单胞菌属及芽孢杆菌属等。这些野生菌中酯酶含量较低并且比较杂，利用其作为生物催化剂进行大规模的工业化生产存在一定的难度，因而构建酯酶基因工程菌从而大量生产酯酶具有十分重要意义。因此针对氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯化合物，亟需筛选高效和高选择性的生物催化剂，以满足工业需要。
发明内容
本申请针对现有的生物催化动力学拆分氧杂环丁烷-2-甲酸酯制备(S)-氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯的反应中，可提供该反应的酯酶报道较少的问题，提供一种具有优异的不对称催化活性、立体选择性好的酯酶及其应用，所述酯酶的立体选择性好，光学纯度高，具有很好的工业应用价值。
本申请具体技术方案如下：
1.一种具有立体选择性的酯酶，所述酯酶为：
a)包含如SEQ ID NO:2所示的序列或者如SEQ ID NO:2所示的序列；或者
b)包含一个或两个以上突变的基于SEQ ID NO:2的突变体。
2.根据项1所述的酯酶，其中，所述突变体的氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO:2的V144、S148和E149中的至少一个位点的氨基酸突变，优选包含对应于SEQ ID NO:2的V144、S148和E149位点的氨基酸突变。
3.一种具有立体选择性的酯酶，其包含如SEQ ID NO:4所示的序列或者如SEQ IDNO:4所示的序列。
4.一种核酸分子，其编码项1-3中任一项所述的酯酶。
5.根据项4所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的序列或者如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的序列。
6.一种表达载体，其包含项4或5所述的核酸分子。
7.根据项6所述的表达载体，所述表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
8.一种宿主细胞，其包含项6或7所述的表达载体。
9.根据项8所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
10.项1-3中任一项所述的酯酶、项4或5所述的核酸分子、项6或7所述的表达载体或者项8或9所述的宿主细胞在生产手性氧杂环烷烃甲酸酯中的应用。
11.一种生产手性氧杂环烷烃甲酸酯的方法，包括：
使用项1-3中任一项所述的酯酶拆分氧杂环烷烃甲酸酯类化合物得到手性环烷烃甲酸酯。
12.根据项11所述的方法，所述氧杂环烷烃甲酸酯类化合物的结构式如式(I)所示：
其中，n为1-3中的任意整数，R为包括甲基、乙基、异丙基或苯基的基团。
发明的效果
本申请的酯酶作为催化剂在不对称拆分制备手性氧杂环烷烃甲酸酯的应用中，底物耐受性好，光学纯度高(ees值达99％以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用开发前景。
附图说明
图1为粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析示意图，其中，泳道1为破碎的上清液，泳道2为沉淀物。
图2A-图2B为实施例8的外消旋底物及产物气相色谱图，图2A外消旋氧杂环丁烷甲酸甲酯的气相色谱图，图2B是利用突变体制备的(S)-氧杂环丁烷甲酸甲酯的气相色谱图。
具体实施方式
下面对本申请做以详细说明。虽然显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本申请提供了一种具有立体选择性的酯酶，所述酯酶为：
a)包含如SEQ ID NO:2所示的序列或者如SEQ ID NO:2所示的序列；或者
b)包含一个或两个以上突变的基于SEQ ID NO:2的突变体。
所述立体选择性指的是在化学反应中，一种立体异构体比另一种立体异构体优先发生作用的化学特性。在本申请中，所述具有立体选择性的酯酶指的是所述酯酶优先作用于某一种特定的立体异构体，例如可以作为手性环烷烃甲酸酯，从而可以通过拆分得到手性环烷烃甲酸酯。
SEQ ID NO:2的氨基酸序列如下：
MTLDVKRWLALLKKVMQNDNKPFESLRVQETRDPAVQNFLKQLQGNMSEEEYTKAFEVPVTDGPMPIRDIFVRIYRPTNEEKLPVIIYFHGGGWVIGNIDTHDSLCRKLANQTNCVVISVDYRLAPEHKFPAAIEDCYDALKWVVENSEELGVDPNKIAVAGDSAGGNLAAVVTLMSRDKGGPKICFQILIYPVTDLEMETPSYEKYNEGYLLTKKAMEWFWDHYLPDPEDRQNPYVSPLLAEDFSNLPPAFIITAEYDPLRDEGEAYAEKLKEAGNPVTYKRYEGMIHGFINMSGVLDAAEALEEIAEYLKKFFL
所述突变体是指相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列，在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的基础上，包含一个或更多个位置处的改变，即取代、插入和/或缺失，并仍然保留其活性。
本申请所述的酯酶可以是采用祖先序列重建法构建酯酶祖先酶，通过人工合成氨基酸全序列所得的酯酶，通过基因工程方法克隆表达所得的酯酶。
在本申请中，所述祖先序列重建(ancestral sequence reconstruction，ASR)在Randall等(Nat.Commun.7：12847doi：10.1038/ncomms 12847(2016))中进行了讨论。作者将ASR的定义称为“在进化/系统发育背景下分析现代序列以推断在树的特定节点的祖先序列的过程”。祖先序列重建(ASR)用于分子进化研究。与通过水平比较系统发育树的不同分支末端的相关蛋白质同源物来研究蛋白质的传统进化方法不同，ASR以竖直方式探测树节点内统计推断的祖先蛋白。系统发育树是根据其物理或遗传特征的相似性和差异显示多种生物物种或其他实体之间进化关系的分支图。在有根的系统发育树中，每个带有后代的节点代表这些后代的推断的最近共同祖先。在ASR中，选择目的蛋白质的多种相关同源物，并以多序列比对(MSA)进行比对，构建系统发育树，其在分支的节点处具有统计推断序列。这些序列就是所谓的“祖先”。合成相应DNA，将其转化到细胞中并产生蛋白质的过程就是所谓的“重建”。
祖先序列通常是通过最大似然法(maximum likelihood)来计算的，然而也可执行贝叶斯法(Bayesian method)。由于祖先是从系统发育推断的，因此系统发育的拓扑和组成在输出ASR序列中发挥主要作用。ASR并不声称要重建古蛋白质/DNA的实际序列，而是可能与该节点处的序列相似的序列。最大似然(ML)法通过产生这样的序列来工作，其中每个位置的残基通过所使用的推论方法被预测最有可能占据该位置。通常来说，这是从现存序列计算的得分矩阵(类似于BLAST或MSA中使用的那些)。替代方法包括最大简约法(maximumparsimony，MP)，其基于序列进化模型构建序列，通常最少数目的核苷酸序列变化的概念代表发生的最有效的进化途径以及最有可能的。MP经常被认为是最不可靠的重建方法，因为其可能将进化过度简化至不适合十亿年的规模的程度。其他方法包括贝叶斯法，其涉及对残基不确定性的考虑。这样的方法有时用于补充ML法，但通常会产生更多模糊序列(即，包含无法预测明确置换的残基位置的序列)。通常在这种情况下，会产生涵盖大多数模糊的多个ASR序列并彼此比较。在一些实施方式中，采用在线软件FireProt-ASR(FireProt-ASR(muni.cz))进行祖先序列重建。
本申请所述的酯酶来源于不动菌属。所述酯酶通过祖先序列重建的方法获得，构建酯酶祖先酶，通过人工合成氨基酸全序列所得的酯酶，通过基因工程方法克隆表达所得的酯酶。
其中，在构建酯酶祖先酶后，通过测定比较水解酶的活力及其对外消旋氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯的立体选择性等，对所克隆的酶进行反复比较和筛选，最终获得催化性能最佳的酯酶祖先酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2。
在获得最佳的酯酶祖先酶后，依据相应的氨基酸序列，通过密码子优化获得全长基因序列，将基因序列交付基因合成公司进行人工合成。获得相应的基因后，通过PCR的手段对该基因进行扩增，并将该序列连接入pET28a中。所述的引物如下：
上游引物：
5'-gtgccgcgcggcagccatatgATGACCTTAGATGTGAAGCGTTGG-3'(SEQ ID NO:5)
下游引物：
5'-acggagctcgaattcggatccTTACAGGAAAAATTTTTTCAGATATTCG-3'(SEQ ID NO:6)
其中，上游引物核苷酸序列下划线部分为NdeI酶切位点，下游引物下划线部分为BamHI酶切位点。然后以人工合成的基因为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得完整的酯酶全长基因DNA片段。其中所述酯酶全长基因(核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.1所示)，命名Est，全长为951个核苷酸碱基。其编码序列从第1个碱基起至第951个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO:1的序列如下：
ATGACCTTAGATGTGAAGCGTTGGTTGGCGTTACTGAAGAAAGTCATGCAAAATGATAATAAGCCCTTCGAGAGTCTGCGCGTCCAGGAAACGCGCGATCCTGCCGTCCAGAACTTTTTGAAACAGTTGCAAGGTAATATGTCTGAAGAGGAATATACTAAAGCCTTTGAAGTACCCGTGACTGACGGTCCTATGCCTATTCGTGACATCTTTGTCCGCATTTATCGCCCGACCAACGAGGAGAAATTACCCGTAATTATCTACTTCCATGGAGGAGGTTGGGTAATTGGCAACATTGATACGCACGATTCGTTATGCCGTAAACTTGCCAACCAGACTAATTGCGTTGTCATCTCAGTGGACTATCGTTTGGCCCCAGAACATAAATTTCCGGCGGCAATTGAAGATTGCTATGACGCCTTAAAATGGGTTGTAGAGAATTCAGAGGAGTTAGGAGTCGATCCTAACAAGATCGCTGTCGCGGGAGACTCAGCCGGCGGTAACTTAGCTGCGGTCGTAACCCTTATGTCGCGCGACAAGGGGGGCCCGAAGATCTGCTTTCAGATCTTAATTTACCCGGTGACGGACTTGGAGATGGAGACCCCTTCCTATGAGAAGTACAATGAAG
GGTACCTTTTGACCAAGAAAGCAATGGAGTGGTTCTGGGACCATTACT
TACCTGACCCAGAAGACCGTCAGAACCCATATGTGAGCCCGCTTCTTG
CAGAAGACTTCAGTAACCTTCCTCCTGCGTTTATTATTACTGCGGAGTA
CGATCCTTTGCGTGATGAAGGGGAAGCATATGCCGAAAAGTTGAAAGA
GGCGGGTAATCCAGTTACATATAAACGCTATGAGGGAATGATCCACGGA
TTCATTAATATGTCAGGGGTCTTGGATGCCGCTGAGGCCCTGGAAGAGA
TTGCCGAATATCTGAAAAAATTTTTCCTGTAA。
由于密码子的兼并性，编码上述酯酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)的核酸分子不仅仅局限于序列如SEQ ID NO.1所示的核酸分子。还可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加核苷酸来提供一个多聚核苷酸的同系物。
在一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO:2的V144、S148和E149中的至少一个位点的氨基酸突变，优选包含对应于SEQ ID NO:2的V144、S148和E149位点的氨基酸突变。
所述对应于具有本领域普通技术人员通常理解的含义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。
在本申请中，可以将144位的V突变为T，将148位的S突变为F或将149位的谷氨酸突变为A；优选将144位的V突变为T，将148位的S突变为F以及将149位的谷氨酸突变为A，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO:4的序列如下：
MTLDVKRWLALLKKVMQNDNKPFESLRVQETRDPAVQNFLKQLQG
NMSEEEYTKAFEVPVTDGPMPIRDIFVRIYRPTNEEKLPVIIYFHGGGWVI
GNIDTHDSLCRKLANQTNCVVISVDYRLAPEHKFPAAIEDCYDALKWTV
ENFAELGVDPNKIAVAGDSAGGNLAAVVTLMSRDKGGPKICFQILIYPVT
DLEMETPSYEKYNEGYLLTKKAMEWFWDHYLPDPEDRQNPYVSPLLAE
DFSNLPPAFIITAEYDPLRDEGEAYAEKLKEAGNPVTYKRYEGMIHGFINM
SGVLDAAEALEEIAEYLKKFFL。
对于突变方法，本申请不作任何限制，其可以根据本领域常规的方法进行突变，例如可以采用定向诱变、随机诱变或合成寡核苷酸的构建，进而将所突变得到的DNA序列在宿主细胞中进行表达，得到氨基酸序列发生取代、插入和/或缺失的突变体。
本申请所述的酯酶酶活高，提高了该酶的工业应用潜力。
本申请所述的突变体与SEQ ID NO:2的同源性在90％以上。
本申请提供了一种核酸分子，其编码上述所述的酯酶。在一些实施方式中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的序列或者如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的序列。
所述SEQ ID NO:3的序列如下：
ATGACCTTAGATGTGAAGCGTTGGTTGGCGTTACTGAAGAAAGTCATGCAAAATGATAATAAGCCCTTCGAGAGTCTGCGCGTCCAGGAAACGCGCGATCCTGCCGTCCAGAACTTTTTGAAACAGTTGCAAGGTAATATGTCTGAAGAGGAATATACTAAAGCCTTTGAAGTACCCGTGACTGACGGTCCTATGCCTATTCGTGACATCTTTGTCCGCATTTATCGCCCGACCAACGAGGAGAAATTACCCGTAATTATCTACTTCCATGGAGGAGGTTGGGTAATTGGCAACATTGATACGCACGATTCGTTATGCCGTAAACTTGCCAACCAGACTAATTGCGTTGTCATCTCAGTGGACTATCGTTTGGCCCCAGAACATAAATTTCCGGCGGCAATTGAAGATTGCTATGACGCCTTAAAATGGACCGTAGAGAATTTTGCAGAGTTAGGAGTCGATCCTAACAAGATCGCTGTCGCGGGAGACTCAGCCGGCGGTAACTTAGCTGCGGTCGTAACCCTTATGTCGCGCGACAAGGGGGGCCCGAAGATCTGCTTTCAGATCTTAATTTACCCGGTGACGGACTTGGAGATGGAGACCCCTTCCTATGAGAAGTACAATGAAGGGTACCTTTTGACCAAGAAAGCAATGGAGTGGTTCTGGGACCATTACTTACCTGACCCAGAAGACCGTCAGAACCCATATGTGAGCCCGCTTCTTGCAGAAGACTTCAGTAACCTTCCTCCTGCGTTTATTATTACTGCGGAGTACGATCCTTTGCGTGATGAAGGGGAAGCATATGCCGAAAAGTTGAAAGAGGCGGGTAATCCAGTTACATATAAACGCTATGAGGGAATGATCCACGGATTCATTAATATGTCAGGGGTCTTGGATGCCGCTGAGGCCCTGGAAGAGATTGCCGAATATCTGAAAAAATTTTTCCTGTAA
本申请提供了一种表达载体，其包含上述所述的核酸分子。
在本申请中，所述表达载体是通过本领域常规方法将上述酯酶基因克隆到表达载体上构建而成，其中，表达载体包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选为pET-28a质粒。
在本申请中，所述粘粒指的是粘性质粒
例如可以通过下述方法制备得到表达载体：
将通过PCR扩增所得的酯酶基因产物用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切，同时将表达载体例如pET-28a用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切，形成互补的粘性末端，回收上述酯酶基因酶切产物以及酶切后的表达载体例如pET-28a质粒，利用T4 DNA连接酶连接，构建包含所述酯酶基因的表达载体例如pET28a-est。
本申请提供了一种宿主细胞，其包含上述所述的表达载体。
在本申请中，对于宿主细胞，其是本领域常规的宿主细胞，只要能满足表达载体可稳定的自行复制，并且其所携带的酯酶基因可被有效表达即可，宿主细胞例如可以为细菌、真菌、植物细胞、动物细胞等。
所述细菌优选为大肠杆菌，进一步优选为大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)或大肠埃希氏菌E.coli DH5α。
在本申请中，可以将表达载体例如pET28a-est转化至宿主细胞例如大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)中，即可得到宿主细胞，即大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-est。
本申请提供了一种酯酶的制备方法，其包含将上述所述的宿主细胞接种至培养基中进行发酵得到发酵液，并将发酵液离心收集菌体、破碎菌体得到酯酶。
所述培养基可为本领域中任何可使转化体生长并产生酯酶的培养基。例如，所述培养基可以为LB培养基，优选地，所述LB培养基的成分包括：蛋白胨5-15g/L，酵母膏1-10g/L，NaCl 5-15g/L，pH 6.0-8.0。
在本申请，对于培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生酯酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。
例如，菌株培养方法包括：将所述的宿主细胞(例如E.coli BL21(DE3))接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.6-0.8(优选0.6)时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L(优选0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达酯酶。
本申请提供了上述所述的酯酶、上述所述的核酸分子、上述所述的表达载体或者上述所述的宿主细胞在生产手性氧杂环烷烃甲酸酯中的应用。
本申请所述的酯酶，由于具有立体选择性，其可以通过拆分得到手性氧杂环烷烃甲酸酯。
本申请提供了一种生产手性氧杂环烷烃甲酸酯的方法，包括：
使用上述所述的酯酶拆分氧杂环烷烃甲酸酯类化合物得到手性环烷烃甲酸酯。在一些实施方式中，所述氧杂环烷烃甲酸酯类化合物的结构式如式(I)所示：
其中，n为1-3中的任意整数，R为包括甲基、乙基、异丙基或苯基的基团。
例如所述氧杂环烷烃甲酸酯类化合物可以为氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯、氧杂环戊烷-2-甲酸甲酯、氧杂环己烷-2-甲酸甲酯等。
在一些实施方式中，拆分反应的温度为20-60℃，优选为30-50℃。
例如拆分反应的温度可以为20℃、25℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、55℃、60℃等。
在一些实施方式中，拆分反应的pH为5.0-10.0，优选为6.0-8.0。
例如，拆分反应的pH可以为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0等。
在一些实施方式中，在缓冲液体系下，使用上述所述的酯酶拆分氧杂环烷烃甲酸酯类化合物得到手性环烷烃甲酸酯，优选地，所述缓冲液为磷酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液。
在一些实施方式中，将上述所述的酯酶溶于缓冲液中，并加入氧杂环烷烃甲酸酯类化合物至终浓度为100-1000mM，反应在20-60℃下进行，机械搅拌，通过补充1.0M NaOH控制pH，直至底物ee接近99％。反应结束后先用二氯甲烷萃取剩余的氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯三次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂即可得到(S)-氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯。
使用上述所述的酯酶拆分，可以使光学纯度达到99％，并且反应条件温和，操作比较简便，具有很好的工业应用前景。
实施例
本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1酯酶基因的克隆
根据本领域常规的祖先序列重建法构建的酯酶祖先酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，通过密码子优化获得其编码基因，进一步由基因合成公司人工合成全长序列，设计PCR引物如下：
上游引物：
5'-gtgccgcgcggcagccatatgATGACCTTAGATGTGAAGCGTTGG-3'
下游引物：
5'-acggagctcgaattcggatccTTACAGGAAAAATTTTTTCAGATATTCG-3'
其中，上游引物下划线部分为NdeI酶切位点，下游引物下划线部分为BamHI酶切位点。
以上述人工合成的酯酶祖先酶DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCRMasterMix 10μL，上游引物和下游引物各1μL(0.3μmol/L)，DNA模板1μL(0.1μg)和ddH2O 7μL。PCR扩增程序为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸2min；步骤(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。获得一条完整的酯酶全长基因序列，经DNA测序，全长951bp，命名为Est。所述基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
实施例2酯酶表达载体和表达转化体的制备
将实施例1所得的酯酶基因DNA片段及pET-28a空质粒在37℃用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，在4℃下连接过夜得到表达质粒pET28a-est。
将上述表达质粒转化到大肠埃希氏菌E.coli DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。培养该菌体，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性转化体大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-est，菌落PCR和基因测序验证阳性克隆。
实施例3酯酶的表达
将实施例2所得的大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞，冷冻干燥24h即可得冻干细胞，收集后4℃保存。还可将所得的静息细胞悬浮于pH 7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为酯酶的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析，其结果如图1所示，其中，泳道1为破碎的上清液，泳道2为沉淀物，可见酯酶是以可溶的形式存在。
实施例4酯酶活力的测定
通过检测405nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定实施例3所得到的酯酶的水解活力。活力测定方法如下：于200μL反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 8.0)中，加入1mmol/L对硝基苯酚乙酸酯，30℃保温2min后加入适量实施例3制备的粗酶液，迅速混匀，检测405nm处吸光值的变化。酶活力(U)的定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol对硝基苯酚乙酸酯所需的酶量，经测定酯酶对对硝基苯酚乙酸酯的比活力为18U/mg。
实施例5酯酶催化不同酯的不对称拆分反应
在10mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 8.0)中加入20U实施例3制备的粗酶液在30℃，120rpm振荡反应，每隔一段时间取样监测反应情况。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和ees值，其结果如表1所示。
其中，底物转化率和底物ees值的具体分析条件如下：
使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX(25m×0.25mm×0.25μm,Sigma)，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，检测器温度280℃，初始柱温50℃，2℃/min至160℃保持3min。
表1酯酶对不同环烷烃甲酸酯的活性和产物光学纯度
实施例6酯酶突变体的制备
采用本领域常规的方法构建酯酶的结构模型，将底物对接入活性中心后分析酯酶与底物的作用力，并通过本领域常规的方法引入突变强化酶与底物的作用力。
将实施例1所得的酯酶的全长基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)进行3个碱基的突变，突变体的突变位置分别是将所述酯酶基因编码序列的第144位的V突变为T，第148位的S突变为F，第149位的E突变为A得到的突变基因的序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，并按照实施例2-3所述的方法制备突变体粗酶液。
实施例7酯酶突变体催化不同酯的不对称拆分反应
在10mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 8.0)中加入20U实施例6制备的突变体粗酶液在30℃，120rpm振荡反应，每隔一段时间取样监测反应情况。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后按照实施例5的方法分析测定底物转化率和ees值，结果如表2所示。
表2突变体对不同环烷烃甲酸酯的活性和产物光学纯度
实施例8酯酶突变体催化氧杂环己烷-2-甲酸甲酯反应
在100mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 8.0)中加入实施例6制备的突变酶的粗酶液，分别加入终浓度为0.2，0.5，1或2mol/L。转化至底物ee>99.0％。反应结束后先用二氯甲烷萃取得到剩余的(S)-氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯三次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂即可得到(S)-氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯。分离后(S)-氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯总得率为32.3％，光学纯度为99％ee。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有立体选择性的酯酶，所述酯酶为：
a)包含如SEQ ID NO:2所示的序列或者如SEQ ID NO:2所示的序列；或者
b)包含一个或两个以上突变的基于SEQ ID NO:2的突变体。
2.根据权利要求1所述的酯酶，其中，所述突变体的氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO:2的V144、S148和E149中的至少一个位点的氨基酸突变，优选包含对应于SEQ ID NO:2的V144、S148和E149位点的氨基酸突变。
3.一种具有立体选择性的酯酶，其包含如SEQ ID NO:4所示的序列或者如SEQ ID NO:4所示的序列。
4.一种核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项所述的酯酶。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3所示的序列或者如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的序列。
6.一种表达载体，其包含权利要求4或5所述的核酸分子；
优选地，所述表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
7.一种宿主细胞，其包含权利要求6或7所述的表达载体；
优选地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
8.权利要求1-3中任一项所述的酯酶、权利要求4或5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体或者权利要求7所述的宿主细胞在生产手性氧杂环烷烃甲酸酯中的应用。
9.一种生产手性氧杂环烷烃甲酸酯的方法，包括：
使用权利要求1-3中任一项所述的酯酶拆分氧杂环烷烃甲酸酯类化合物得到手性环烷烃甲酸酯。
10.根据权利要求9所述的方法，所述氧杂环烷烃甲酸酯类化合物的结构式如式(I)所示：
其中，n为1-3中的任意整数，R为包括甲基、乙基、异丙基或苯基的基团。
CN202311491361.6A 2023-11-09 2023-11-09 具有立体选择性的酯酶及其应用 Pending CN117535268A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311491361.6A CN117535268A (zh) 2023-11-09 2023-11-09 具有立体选择性的酯酶及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311491361.6A CN117535268A (zh) 2023-11-09 2023-11-09 具有立体选择性的酯酶及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117535268A true CN117535268A (zh) 2024-02-09

Family

ID=89781784

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311491361.6A Pending CN117535268A (zh) 2023-11-09 2023-11-09 具有立体选择性的酯酶及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117535268A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104619835B (zh) 酮醇酸还原异构酶及其使用方法
CN112813131B (zh) 一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用
CN103555608B (zh) 一种奎宁酮还原酶及其在不对称合成(r)-3-奎宁醇中的应用
CN111876404A (zh) 一种醛缩酶突变体及其编码基因和应用
CN101463358B (zh) 一种腈水合酶基因簇及其应用
CN114317472B (zh) 一种高立体选择性亚胺还原酶及其制备方法和应用
CN113430181B (zh) 一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因
CN110358751B (zh) 一种重组脂肪酶突变体、编码基因、重组工程菌及应用
CN117535268A (zh) 具有立体选择性的酯酶及其应用
CN105296513A (zh) 一种海洋酯酶及其编码基因e22与应用
CN115772510A (zh) 一种环己烯甲酸酯水解酶突变体及其制备方法与应用
CN115896065B (zh) 一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用
CN115433721A (zh) 一种羰基还原酶突变体及其应用
JP2003502021A (ja) アスペルギルス起源のエポキシドヒドロラーゼ
JP4437170B2 (ja) 微生物、該微生物より得られるラクタマーゼ酵素、およびその使用
CN105593368B (zh) 2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法
CN114350630A (zh) L-泛解酸内酯脱氢酶、突变体及其应用
CN112410353B (zh) 一种fkbS基因、含其的基因工程菌及其制备方法和用途
CN115261342A (zh) 一种伯克霍尔德氏菌bjq0011来源酯合成酶jfn94_18195、编码基因及其应用
CN102839141B (zh) 一种产酯酶肠杆菌、其酯酶和基因及其在制备紫杉醇手性前体中的应用
CN101892228B (zh) 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用
JP2008212144A (ja) アルコール脱水素酵素、これをコードする遺伝子、およびそれを用いた光学活性（ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法
CN112646831A (zh) 一种穿梭质粒及构建方法及其在集胞藻转化外源基因中的应用
CN110713940B (zh) 一种高产重油出芽短梗霉菌株及其构建方法与用途
CN111518789B (zh) 一种重组脂肪酶突变体、基因、载体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination