CN113583992B - 一种还原胺化酶及其在仲胺合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种还原胺化酶及其在仲胺合成中的应用。在酮的还原胺化反应中还原胺化酶及属于其亚家族的还原胺化酶的催化性能有待进一步提升，因此迫切需求一些高性能的还原胺化酶。本发明公开了来源于Rhizobium sophorae的还原胺化酶编码基因及其氨基酸序列，以及利用所述还原胺化酶还原胺化环己酮与各种胺基供体合成仲胺的应用。相比于传统的化学合成法，本发明具有操作简单、反应条件温和、环境友好的优势，在胺类化合物的制备中具有很好的应用前景。

Description

一种还原胺化酶及其在仲胺合成中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种还原胺化酶，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组还原胺化酶或重组表达转化体作为催化剂，不对称还原制备仲胺化合物的应用。

背景技术

胺类化合物是一类重要的化学结构砌块，广泛存在于天然产物和药物分子中，同时，还被广泛用于精细化学品、农用化学品、聚合物、染料等的合成。与化学法相比，生物催化具有反应条件温和、环境友好、安全高效、选择性高等优点，因此近年广泛用于有机化合物的合成。还原胺化酶可以利用伯胺、仲胺、叔胺作为氨基供体催化酮的还原胺化，为实现仲胺和叔胺的一步高效制备提供了一种可供选择的生物催化剂。

具有高催化活性的天然还原胺化酶的报道还较少，最近Turner课题组发现一个来源于Aspergillus oryzae(米曲霉)的还原胺化酶RsRedAm，属于还原胺化酶亚家族，可以实现酮与胺的还原胺化反应，部分底物甚至可以在酮与胺等化学摩尔当量下完全转化。他们通过定点突变并结合晶体结构分析预测了关键活性位点，进而通过分子改造获得转化率显著提高的突变体，在胺类化合物的催化合成应用中，研究人员发现还原胺化酶RsRedAm的操作稳定性较差，在高于30℃的反应温度下，几小时内便迅速失活。

还原胺化酶对胺基供体具有广谱的特性，可合成许多高附加值的仲胺和叔胺，为发展更为高效的胺类化合物合成策略提供了新的思路，因此吸引了许多课题组竞相发掘新酶，促进了还原胺化酶催化还原胺化反应的快速发展。近5年，已在工业化应用研究中取得显著成果。基于还原胺化酶及属于其亚家族的还原胺化酶的前期研究基础，研究发现其在酮的还原胺化反应中的催化性能有待进一步提升，因此迫切需求一些高性能的还原胺化酶。

发明内容

尽管近几年对还原胺化酶及属于其亚家族的还原胺化酶取得显著成果，但在酮的还原胺化反应中其催化性能有待进一步提升，因此迫切需求一些高性能的还原胺化酶。

针对上述问题，本发明提供一种还原胺化酶，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组还原胺化酶或重组表达转化体作为催化剂，不对称还原制备仲胺化合物的应用。

本发明通过定向挖掘方法，获得了来源于槐根瘤菌(Rhizobium sophorae)的胺化还原酶。该酶可以催化环己酮和胺供体的还原胺化形成仲胺。本发明还公开了包括该还原胺化酶基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及所述重组还原胺化酶在仲胺化合物中合成的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供一种还原胺化酶，将其命名为RsRedAm，所述还原胺化酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明提供的还原胺化酶可以催化环己酮和胺供体进行还原胺化。

本发明提供的还原胺化酶为NADP⁺依赖型。

在本发明的一个实施方式中，所述还原胺化酶来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号为ACCC 19914的根瘤菌属(Rhizobium sophorae)。

申请人通过对菌株保藏编号为ACCC 19914的根瘤菌属(Rhizobium sophorae)及文献中报道的菌种进行大范围的虚拟筛选及实验筛选，其中，菌株保藏编号为ACCC 19914的根瘤菌属(Rhizobium sophorae)经过培养可以催化环己酮和胺基供体生成仲胺产物。通过在数据库中进行序列比对和结构-功能关系信息筛选，获得了该菌株中的一种还原胺化酶，将其命名为RsRedAm，这个还原胺化酶为NADP⁺依赖型。

本发明第二方面，提供一种编码如技术方案一所述还原胺化酶的核酸，其为如SEQID No.1所示核苷酸序列的核酸。

其中，编码所述还原胺化酶的核酸的DNA来源于相应菌株的基因组。

通过聚合链式反应(PCR)可获得RsRedAm的完整DNA编码序列。其中涉及的引物主要有：

SEQ ID No.3-上游引物：5’-CCCATATGATGGCGAATATTTCGGTTCTC

引物中下划线区域为限制性核酸内切酶Nde I的识别位点；

SEQ ID No.4-下游引物：5’-CCCTCGAGTCAGCTCATAGCGCTGTT

引物中下划线区域为限制性核酸内切酶Xho I的识别位点；

如SEQ ID No.1所示核苷酸序列全长为879个核苷酸碱基，其编码序列(CDS)从第一个碱基起至第879个碱基终止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，无内含子。

本发明第三方面，提供包含所述还原胺化酶RsRedAm核酸序列的重组表达载体。

在本发明的一些实施方式中，所述表达载体的构建可以采用双酶切、连接的方法构建而成，是本领域常见的重组质粒构建方法。

所述表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒，更优选质粒pET28a。

进一步的，在本发明的一个实施方式中，包含所述还原胺化酶RsRedAm核酸序列的重组表达载体由质粒载体pET28a(+)进行双酶切后连接目的基因DNA片段所构成。

本发明提供一种具体的操作方法，如下：用聚合酶链式反应(PCR)的方法将目的基因从基因组中克隆并回收，加入限制性内切酶将目的基因两端切割成粘性末端。与此同时，用同样的限制性内切酶对pET-28(a)+进行双酶切，回收上述目的基因与质粒，利用T4连接酶在16℃进行连接并构成相应的重组质粒。其中酶切体系如下：目的基因DNA/质粒各2μg，限制性内切酶2μL，Cutsmart 5μL，ddH₂O补足至50μL。

本发明第四方面，提供一种表达所述还原胺化酶RsRedAm的重组表达转化体。

在本发明的一些实施方式中，所述重组表达转化体可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所携带的基因可被有效表达即可。

在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选的为：大肠杆菌E.coli BL21(DH3)。将所述重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DH3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株。例如，将重组表达载体pET28a-(RsRedAm)转化至大肠杆菌E.coli BL21(DH3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DH3)/pET28a-RsRedAm。

本发明第五方面，提供还原胺化酶RsRedAm的制备方法。

本发明中还原胺化酶RsRedAm的较佳制备方法为：培养如上所述的重组表达转化体，分离获得重组表达的还原胺化酶。其中所述重组表达转化体培养所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明所述重组还原胺化酶的培养基。所述培养基优选TB培养基，其配方为：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 12.5g/L，pH 6.5-7.0。优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的试管培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1-2％(v/v)的接种量接入装有100mL TB培养基(含卡那霉素)的500mL三角摇瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃条件下诱导16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体湿细胞。将收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的10mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液中，高压匀浆破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组还原胺化酶的粗酶液。收集的粗酶液放置在-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到冻干酶粉。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内，用于手性胺的制备。

所述还原胺化酶的活力可用如下方法测定：以环己酮为模式底物，将含0.2-0.6mmol/L模式底物和0.15mmol/L NADPH的1mL反应体系(100mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.5，含有60mM氨供体)预热至30℃，然后加入适量的还原胺化酶，30℃下反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值。

根据下式计算得到酶活力：

酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×l)

式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)对应于上述条件下每分钟还原lμmol NADP⁺所需的酶量。

本发明第六方面，提供还原胺化酶催化剂，其是以下形式中的任意一种：

(1)培养所述重组表达转化体，分离含有还原胺化酶的转化体细胞；

(2)对所述含有还原胺化酶转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；

(3)对所述细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉。

本发明第七方面，提供上述还原胺化酶或还原胺化酶催化剂在催化环己酮和有机胺供体还原胺化生成胺中的应用。

其中所述胺产物的化学结构式如下所示：

反应方程式如图1所示。

在本发明的一个实施方式中，在所述还原胺化酶或还原胺化酶催化剂的应用中，环己酮的浓度为10-100mmol/L。

在本发明的一个实施方式中，在所述还原胺化酶或还原胺化酶催化剂的应用中，反应过程中利用葡萄糖为辅底物，通过葡萄糖脱氢酶催化的葡萄糖氧化反应实现反应体系中NADPH的辅酶循环，所述葡萄糖脱氢酶的活力为还原胺化酶催化剂活力的1.5倍，所述葡萄糖的用量为环己酮底物的1.5倍当量。NADP⁺的浓度为0.1mmol/L。

在本发明的一个实施方式中，不对称还原胺化反应中所需的缓冲液为本领域常规缓冲液，其浓度较佳为100mmol/L。

在本发明的一个实施方式中，所述的还原胺化反应在搅拌或者振荡的环境下进行。

在本发明的一个实施方式中，所述的还原胺化反应的温度为20～30℃，优先30℃。

在本发明的一个实施方式中，反应中，间歇取样测定底物转化率，反应时间为转化率达到最大为准。

转化率是通过气相色谱进行分析，例如，利用气相色谱柱DB1701(30m×0.25mm×0.25μm)，以氮气为载气，初始温度90℃，保留3min；以0.5℃/min上升至120℃，保留20min，以1℃/min上升至180℃，保留10min来进行。所述的不对称还原胺化反应时间以底物完全转化或者是转化率达到最大值为标准，优选反应时间小于24h。

在本发明的一个实施方式中，还原反应结束以后，采用常规的方法对反应液进行分离和提纯。优选的，反应结束后，加入HCl(2M)溶液调节反应液pH至1左右，等体积二氯甲烷萃取3次，保留水相，除去未完全转化的环己酮等杂质；然后在水相中加入NaOH溶液(10M)调节反应液pH>13，等体积二氯甲烷萃取3次，合并有机相；用适量饱和NaCl溶液洗涤，取有机相加入无水Na₂SO₄干燥过夜；过滤除去无水Na₂SO₄，加入5mL饱和氯化氢乙醚溶液，产物呈盐酸盐形式析出，减压蒸馏除去溶剂即得到盐酸盐形式的产物纯品。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明的还原胺化酶活性高，可高效催化环己酮和氨基供体的胺化还原反应，实现仲胺的高效合成，提高了工业化应用价值。

附图说明

图1为还原胺化酶RsRedAm催化环己酮和系列胺供体还原胺化示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

Rhizobium sophorae来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号为ACCC 19914的根瘤菌属(Rhizobium sophorae)。E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×TaqPCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。限制性内切酶Nde I和Xho I均为Takara公司的市售产品。

实施例1菌株保藏编号为ACCC 19914的根瘤菌属的培养

菌株保藏编号为ACCC 19914的根瘤菌属接种入50ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)中，37℃培养2-4天。培养液经8000rpm离心收集菌体。收集的菌体沉淀即刻使用，或4℃冰箱保存使用。

实施例2还原胺化酶RsRedAm的基因克隆

本发明采取酚氯仿法基因组抽提法提取菌体的完整基因组。将实施例1收集得到的菌体沉淀分别置于研钵内，加入适量液氮速冻，快速研磨，将冻干菌体研磨至发白粉末即可。将粉末状菌体转移至2mL离心管内，加入700μL TE buffer重悬菌体，加入700μL苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，轻轻颠倒混匀10min，于10000rpm离心10min，吸取上清至另一干净的1.5ml离心管。再次加入700μL苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，轻轻颠倒混匀10min，于10000rpm离心10min，用剪去尖端的枪头吸取上清至另一干净的1.5ml Eppendorf管。再加入1ml预先于-80℃预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，于-80℃静置30min。然后12,000rpm离心20min，此时会有白色沉淀生成。弃上清，加入1ml 70％乙醇浸泡2-3h，于12,000rpm离心2-3min，弃乙醇。加入1ml 70％乙醇洗涤至少3次。于8000rpm离心3min后弃乙醇，于无菌条件下自然风干。加入预先烘箱加热的50μL EB buffer溶解基因组。基因组于-20℃保存备用。

根据还原胺化酶RsRedAm(SEQ ID No.1)的完整DNA编码序列和开放阅读框。其中涉及的引物主要有：

SEQ ID No.3-上游引物：5’-CCCATATGATGGCGAATATTTCGGTTCTC，引物中下划线区域为限制性核酸内切酶Nde I的识别位点；

SEQ ID No.4-下游引物：5’-CCCTCGAGTCAGCTCATAGCGCTGTT，引物中下划线区域为限制性核酸内切酶Xho I的识别位点；

以菌株保藏编号为ACCC 19914的根瘤菌属的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μL，上游引物和下游引物(10ng/μL)各2.5μl，基因组DNA(100ng/μl)1μL和ddH₂O 19μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟后进行32次如下循环：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后72℃再延伸10分钟。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后，用DNA回收试剂盒回收目的片段。经过DNA测序，来源于Rhizobium sophorae的还原胺化酶的序列中编码开放阅读框全长分别为879bp，其碱基序列分别如SEQ ID No.1所示。

实施例3还原胺化酶RsRedAm重组表达转化体的制备

将实施例2中PCR扩增所得的还原胺化酶RsRedAm目的片段以及pET 28a空质粒同时用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切过夜；然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收。将回收的经酶切目的片段和空载体在T4 DNA连接酶的作用下，于16℃连接12小时，得到重组质粒pET28a-(RsRedAm)。

将所得重组质粒转化至E.coli BL21(DH3)，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养8小时，对长出来的菌落进行菌落PCR验证，挑取菌落PCR扩增出长度约1000bp的目的条带的阳性克隆。经测序验证后，提取相应的质粒，进一步转化至E.coliBL21(DH3)，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DH3)/pET28a-(RsRedAm)。

实施例4还原胺化酶RsRedAm的诱导表达

将实施例3中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DH3)/pET28a-(RsRedAm)接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有100ml LB培养基的500mL三角烧瓶中，放入摇床中在37℃、180rpm条件下振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.2mM进行诱导，16℃诱导24小时后，将培养液以8000rpm转速离心，收集细胞沉淀，用生理盐水洗涤，得到静息细胞。加入10mLTris-HCl(100mM，pH 8.5)重悬细胞，冰水浴中进行如下超声处理：400W功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下10,000rpm离心10分钟，收集上清液，即为重组还原胺化酶RsRedAm的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组还原胺化酶RsRedAm以可溶的形式存在。粗酶液冷冻干燥获得冻干酶粉。

实施例5重组还原胺化酶催化不同胺供体转化活力的测定

按照图1进行反应，活力测定在含有15mM环己酮底物、60mM各种胺供体(除胺供体i)以及0.15mM NADPH的100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中进行；对于胺供体i，直接使用2M的NH₃·H₂O-NH₄Cl缓冲液(pH 8.5)，反应体系为1mL，将反应体系，预热至30℃，然后加入适量的还原胺化酶，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录一分钟内吸光度的变化值。结果如下所示：

表1重组还原胺化酶RsRedAm对环己酮和一系列胺供体的活力测定

实施例6仲胺产物气相色谱分析

本发明还原胺化酶在胺的合成应用中，不同的产物转化率需要不同的色谱法进行分析，所有产物分析方法如下所示：

分析方法：使用色谱柱为气相色谱柱DB-1701-30m，升温程序：初始温度50℃，保留2min；以10℃/min上升至90℃，维持4min，以20℃/min上升至180℃，维持3min。

表2底物与产物的保留时间

实施例7-10还原胺化酶催化环己酮的还原胺化反应

1mL反应体系包含10mM环己酮、20mM氨基供体、50mM葡萄糖、0.1mM NADP⁺、适量RedAm粗酶粉、BmGDH粗酶粉(1U)、1％DMSO(v/v)、100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)。30℃、220rpm下反应12h，反应液中加入10M NaOH调节反应液pH至13，用甲基叔丁基醚(含1mM环戊酮作为内标)萃取，无水硫酸钠干燥2h后，用气相色谱分析环己酮的转化率。

表3还原胺化酶RsRedAm对环己酮的胺化反应结果

实施例11-12还原胺化酶催化环己酮的还原胺化反应

10mL制备反应体系包含：1mmol环己酮、2mmol胺基供体、1.5mmol葡萄糖、1μmolNADP⁺、适量还原胺化酶粗酶粉、20mg葡萄糖脱氢酶粗酶粉(100U)、0.1mL二甲基亚砜、9.9mLTris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.5)。反应在30℃、180rpm下进行，期间定时取样测定反应进程。

反应结束后，加入0.8mL HCl溶液(2M)调节反应液pH至1左右，等体积二氯甲烷萃取3次，保留水相，除去未完全转化的环己酮等杂质；在水相中加入0.8mL NaOH溶液(10M)调节反应液pH>13，等体积二氯甲烷萃取3次，合并有机相；用适量饱和NaCl溶液洗涤，取有机相加入无水Na₂SO₄干燥过夜；过滤除去无水Na₂SO₄，加入5mL饱和HCl的无水乙醚溶液，产物呈盐酸盐形式析出，减压蒸馏除去溶剂即得到盐酸盐形式的产物纯品。

表4还原胺化酶RsRedAm催化制备N-烷基取代环己胺

对比例1

以SEQ ID No.2所示氨基酸序列在BLAST数据库中进行同源搜索，序列编号WP_077989474.1与本发明还原胺化酶RsRedAm的同源性最高，为99.66％，经比较，两个序列存在一个氨基酸残基的差异，205位，本发明还原胺化酶RsRedAm所示氨基酸序列中为苯丙氨酸(Phe)，而WP_077989474.1编码蛋白的序列中为色氨酸(Trp)。

克隆得到如WP_077989474.1编码蛋白，如实施例5所示，对其进行活力测定，结果如表5所示，WP_077989474.1编码蛋白的活性低于本发明还原胺化酶RsRedAm。

表5 WP_077989474.1对环己酮和一系列胺供体的活力测定

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种还原胺化酶及其在仲胺合成中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 879

<212> DNA

<213> Rhizobium sophorae

<400> 1

atggcgaata tttcggttct cggcttggga gcgatgggac aggcgctggc cgcccgattt 60

ctgcagcaag ggcattcggt caccctctgg aatcgcacgg ccggcaaggc tggctttctg 120

gttgccaaag gagctcgcga aagcagcagc gcggcagacg ccatcgcctc gagcgacgtc 180

accgtgatct gcctattgga ctacgccgcg tcgaactctg tgctcgacag tgcggcctcg 240

gtgcttgccg ggcgtgcggt ggtcaatctc accaatggca cgccggccca ggcacgcgcc 300

accgccgagc ggctcgaaag cctcggcgcc gcctatctcg acggcggcat catggcgacg 360

cctccgatga tcggaggcga acatgcactt atcctctaca gcggttcgaa tgcggctttc 420

gaggcgcatg tcggcacgct taaggcgctc ggcgccgcca cctatctcgg tgcggatgcc 480

ggactggcgt cgctccacga tctcgccctt ctcagcggca tgtatgggct ttttgccggc 540

ttctttcacg ccagcgccct tgtcggttcc gaaggcatcg gcgcaagtgc atttctgaag 600

ctgctcggcc ccttcatgac cgcgatgatg ggtgaatttc ccggctatgc ggagaagatc 660

gataccggcc gccacggcgt caatgtcgcg tcgaatctgg cgatgcagac cgcagcgctc 720

gaaaacatcc tcactgctac ccgcgagcag ggtgtcgcca ccgatctgct tgacccgatg 780

ctggacctat tccgcaagcg cgacggtgcc ggacatggca acgaagacat ttcaggcgtg 840

tttgagctga tccggagcag gaacagcgct atgagctga 879

<210> 2

<211> 292

<212> PRT

<213> Rhizobium sophorae

<400> 2

Met Ala Asn Ile Ser Val Leu Gly Leu Gly Ala Met Gly Gln Ala Leu

1 5 10 15

Ala Ala Arg Phe Leu Gln Gln Gly His Ser Val Thr Leu Trp Asn Arg

20 25 30

Thr Ala Gly Lys Ala Gly Phe Leu Val Ala Lys Gly Ala Arg Glu Ser

35 40 45

Ser Ser Ala Ala Asp Ala Ile Ala Ser Ser Asp Val Thr Val Ile Cys

50 55 60

Leu Leu Asp Tyr Ala Ala Ser Asn Ser Val Leu Asp Ser Ala Ala Ser

65 70 75 80

Val Leu Ala Gly Arg Ala Val Val Asn Leu Thr Asn Gly Thr Pro Ala

85 90 95

Gln Ala Arg Ala Thr Ala Glu Arg Leu Glu Ser Leu Gly Ala Ala Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Gly Ile Met Ala Thr Pro Pro Met Ile Gly Gly Glu His

115 120 125

Ala Leu Ile Leu Tyr Ser Gly Ser Asn Ala Ala Phe Glu Ala His Val

130 135 140

Gly Thr Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ala Thr Tyr Leu Gly Ala Asp Ala

145 150 155 160

Gly Leu Ala Ser Leu His Asp Leu Ala Leu Leu Ser Gly Met Tyr Gly

165 170 175

Leu Phe Ala Gly Phe Phe His Ala Ser Ala Leu Val Gly Ser Glu Gly

180 185 190

Ile Gly Ala Ser Ala Phe Leu Lys Leu Leu Gly Pro Phe Met Thr Ala

195 200 205

Met Met Gly Glu Phe Pro Gly Tyr Ala Glu Lys Ile Asp Thr Gly Arg

210 215 220

His Gly Val Asn Val Ala Ser Asn Leu Ala Met Gln Thr Ala Ala Leu

225 230 235 240

Glu Asn Ile Leu Thr Ala Thr Arg Glu Gln Gly Val Ala Thr Asp Leu

245 250 255

Leu Asp Pro Met Leu Asp Leu Phe Arg Lys Arg Asp Gly Ala Gly His

260 265 270

Gly Asn Glu Asp Ile Ser Gly Val Phe Glu Leu Ile Arg Ser Arg Asn

275 280 285

Ser Ala Met Ser

290

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccatatgat ggcgaatatt tcggttctc 29

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccctcgagtc agctcatagc gctgtt 26

Claims (9)

1.一种还原胺化酶，其特征在于，所述还原胺化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种编码如权利要求1所述还原胺化酶的核酸，其特征在于，其为如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核酸。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包含编码权利要求1所述还原胺化酶核酸序列。

4.一种重组表达转化体，其特征在于，表达权利要求1所述还原胺化酶。

5.一种还原胺化酶的制备方法，其特征在于，培养权利要求4所述重组表达转化体，分离获得重组表达的还原胺化酶。

6.一种还原胺化酶催化剂，其特征在于，是以下形式中的任意一种：

(1)培养如权利要求4所述重组表达转化体，分离含有如权利要求1所述还原胺化酶的转化体细胞；

(2)对(1)中含有还原胺化酶的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；

(3)将(2)的细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉。

7.如权利要求1所述还原胺化酶或权利要求6所述还原胺化酶催化剂的应用，其特征在于，所述还原胺化酶或还原胺化酶催化剂催化环己酮与胺基供体的还原胺化反应，生成相应的仲胺；所述胺基供体是以下任一个化学结构式所示的化合物：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述还原胺化酶催化剂催化的反应需要辅酶NADPH，反应中NADPH氧化为NADP⁺，通过偶联葡萄糖脱氢酶，将NADP⁺还原再生为NADPH。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，环己酮的浓度为10-100mmol/L，所述还原胺化反应温度为20-30℃。

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