CN115927219A - 一种烯还原酶及其在不对称还原中长链α-/β-不饱和酮酯中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苏梅斯温斯杆菌(Swingsia samuiensi)烯还原酶及其在不对称还原中长链α‑/β‑不饱和酮酯中的应用。通过基因挖掘获得来源于苏梅斯温斯杆菌的烯还原酶SsER，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组烯还原酶或重组表达转化体作为催化剂不对称还原中长链α‑/β‑不饱和酮酯的方法。与现有技术相比，本发明使用烯还原酶催化制备饱和酮酯，具有工艺简单、产品光学纯度高和环境友好的显著优势，有很好的工业应用前景。本发明提供一种新的烯还原酶，可立体选择性催化α‑/β‑不饱和酮酯不对称还原，反应条件温和，转化率高，催化活力高，产品光学纯度好，具有很好的工业应用前景。

Description

一种烯还原酶及其在不对称还原中长链α-/β-不饱和酮酯中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种来源于苏梅斯温斯杆菌(Swingsia samuiensi)的烯还原酶，编码所述烯还原酶的基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组烯还原酶或重组表达转化体作为催化剂催化中长链α-/β-不饱和酮酯不对称还原的方法。

背景技术

γ-酮酯的应用极为广泛，是合成多种杂环化合物(如吡咯、呋喃、内酯、β-内酰胺抗菌素等)和其它天然产物及药物的重要中间体。

γ-酮酯尤其在合成内酯方面具有极为广泛的应用。2014年，Díaz-Rodríguez等人使用醇脱氢酶不对称还原前手性γ-/δ-酮酯，生成相应的手性羟基酯，自发环化后形成一系列光学纯内酯(ACS Catal,2014,4(2):386-393)。2014年Classen报道用烯醇还原酶不对称还原α-/β-不饱和酮酯获得饱和γ-酮酯中间产物，并利用醇脱氢酶组合级联催化合成β-甲基取代的γ-戊内酯(ACS Catal.2014,4,1321-1331)，ee值为98-99％，最高收率90％，不过底物局限于甲基取代的短链内酯。2015年Brenna利用相同的合成路线，采用不同的氧化还原酶(OYE)合成了同样产物(J.Mol.Catal.B 2015,114,77-85)。2018年Kumru也利用相同的路线，丰富了合成的γ-酮酯上取代基的位置和种类，进而丰富了合成γ-内酯的种类和位置(ChemCatChem 2018,10,4917-4926)。

综上所述，γ-酮酯是许多内酯化合物的重要中间体，具有非常重要的应用价值。而生物催化法合成多取代手性γ-酮酯以及γ-内酯是大势所趋。以上方法需要用到α-/β-不饱和酮酯，利用这类化合物生物催化合成α-/β-取代的γ-酮酯，或者进一步还原羰基合成多取代手性γ-内酯，面临酶资源匮乏、可催化的底物谱窄、产品光学纯度差、收率低等问题，尚未实现工业化应用。

针对上述重大需求和问题，本研究对多取代手性内酯合成中所需的烯(酮)还原酶进行资源挖掘和分子改造，创制高立体选择性和高活力的酶催化剂，拓展底物谱范围。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述存在的问题而提供一种烯还原酶及其在不对称还原中长链α-/β-不饱和酮酯中的应用，即从α-/β-不饱和γ-酮酯出发，通过烯还原酶不对称还原获得高立体选择性的α-/β-取代的γ-酮酯。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的技术方案之一：

本发明提供一种烯还原酶，所述烯还原酶是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化α-/β-不饱和酮酯不对称还原制备光学活性α-/β-取代的γ-酮酯的由(a)衍生，同时催化活性高于(a)的蛋白质。

进一步地，(b)所述蛋白质为：由SEQ ID No.2所示氨基酸序列在第314位单独替换一个氨基酸后而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质。

优选地，(b)所述蛋白质为：

(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第314位丙氨酸替换为甘氨酸；

(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第314位丙氨酸替换为酪氨酸；

(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第314位丙氨酸替换为苏氨酸；

本发明所述烯还原酶的DNA序列，来源于一种苏梅斯温斯杆菌(Swingsiasamuiensi)AH83染色体上。

本发明还提供所述烯还原酶的获得方法：即通过基因挖掘以及实验室保藏微生物菌株的大规模筛选，发现苏梅斯温斯杆菌(Swingsia samuiensi)AH83染色体上的一个基因，通过人工合成的方式，并进行克隆表达，获得了能催化中长链α-/β-不饱和酮酯不对称还原的烯还原酶，命名为烯还原酶SsER，该酶是NADPH依赖型的。所述烯还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明中提及的克隆表达方法是本领域常规的生物技术手段。

本发明所述烯还原酶具有以下性能：可以催化中长链α-/β-不饱和酮酯不对称还原制备光学活性α-/β-取代的γ-酮酯。

本发明的技术方案之二：

本发明提供一种编码如技术方案一所述烯还原酶SsER的核酸，具体的，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，全长1068个核苷酸碱基。其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1068个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TTT，无内含子。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供所述烯还原酶SsER的编码DNA的来源：通过人工全序列合成的方法得到所述烯还原酶的编码DNA。

本发明的技术方案之三：

本发明提供一种包含所述烯还原酶SsER核酸序列的重组表达载体。

本发明所述重组表达载体可通过本领域常规方法将所述烯还原酶SsER核酸连接于各种表达载体上构建而成，所述表达载体包括本领域常规的各种质粒载体，优选质粒pET-28a。

较佳地，可通过下述方法制得本发明所述的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的烯还原酶SsER的基因序列DNA片段用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，同时将空载质粒pET-28a用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，回收上述酶切后的烯还原酶SsER的基因DNA片段以及pET-28a质粒，利用T₄ DNA连接酶连接，构建获得包含所述烯还原酶SsER基因的重组表达载体(pET28a-SsER)。

本发明的技术方案之四：

本发明提供一种包含所述烯还原酶SsER重组表达载体的重组表达转化体。

本发明所述重组表达转化体抗可通过将技术方案三所述的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所携带的烯还原酶SsER的基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)或大肠杆菌E.coli DH5α。本方案优选将所述重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得本发明优选的基因工程菌株(E.coli BL21(DE3)/pET28a-SsER)。

本发明得技术方案之五：

本发明提供一种烯还原酶催化剂，所述的烯还原酶催化剂是如下任一形式：

(1)培养如技术方案四所述的重组表达转化体，分离含有所述烯还原酶SsER的转化体细胞；

(2)培养如技术方案四所述的重组表达转化体，分离含有所述烯还原酶SsER的转化体细胞，对含有所述烯还原酶SsER的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；

(3)将所述烯还原酶SsER的细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉；

(4)所述烯还原酶SsER或烯还原酶SsER的突变体，其中所述烯还原酶SsER的突变体是指SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加几个氨基酸且可以催化中长链α-/β-不饱和酮酯不对称还原制备光学活性γ-酮酯，同时催化活性提高的蛋白质。

本发明还提供一种半理性构建烯还原酶SsER突变体的方法。在SWISS-MODEL中输入SsER的氨基酸序列，进行同源建模，然后用建模出来的蛋白质模型与4-氧代戊烯酸乙酯(E-2a)进行分子对接，根据短链脱氢酶的催化机理与结合能情况，选择合适的对接姿势模型。通过对底物口袋附近的氨基酸进行定点饱和突变和组合突变，进一步提高酶的活性。如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的SsER立体空间结构中，在底物4-氧代戊烯酸乙酯(E-2a)结合位点周围的氨基酸残基包括：293位天冬酰胺、294位谷氨酰胺、295天冬氨酸，296位酪氨酸、297位丝氨酸、314位丙氨酸、315位苯丙氨酸，316位甘氨酸，317位精氨酸以及318位赖氨酸等。采用定点饱和突变技术，对这些位点的氨基酸残基进行定点饱和突变。使用的引物如表1所示：

表1突变氨基酸位点的引物

只有第314位丙氨酸替换成一个氨基酸后形成的突变体是有效突变体，优选第314位丙氨酸替换为酪氨酸的SsER-A314Y突变体是对4-氧代戊烯酸乙酯(E/Z-2a)和4-氧代辛烯酸乙酯(E-2b)活力显著提升的突变体。

本发明还提供一种所述烯还原酶催化剂的制备方法，较佳地为：培养如技术方案四所述的重组表达转化体，分离获得重组表达的烯还原酶SsER。其中所述重组表达转化体培养所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的重组烯还原酶的培养基。所述培养基优选为LB培养基，其配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同，按本领域常规知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并生产所述烯还原酶SsER即可。重组表达转化体培养的具体操作可按本领域常规操作进行。优选地，将本发明所述的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-SsER，接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～1.0(优选OD₆₀₀为0.6)时，加入终浓度为0.1～1.0mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行产酶诱导，在16℃继续培养24h，即可高效表达本发明所述的烯还原酶SsER。培养结束后，离心收集沉淀的菌体细胞，即为重组表达转化体的静息细胞；将收获的细胞悬浮于PBS缓冲液(100mM，pH 7.0)中，超声破碎，破碎液离心，收集上清液，即可获得所述重组烯还原酶SsER的粗酶液；将离心收获的细胞沉淀冷冻干燥，可以获得冻干细胞，有利于长期存放，方便以后使用。

烯还原酶SsER的活性测定：将含2mmol/L α-/β-不饱和酮酯和0.1mmol/L NADPH的1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)预热至30℃，然后加入适量的烯还原酶SsER纯酶，混合均匀，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录一定时间内吸光度的变化值。

根据下式计算得到酶活力：

酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×l)

式中，EW为1min内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)对应于上述条件下每分钟氧化1μmol NADPH所需的酶量。

本发明的技术方案之六：

本发明提供一种所述烯还原酶催化剂在不对称还原中长链α-/β-不饱和酮酯中的应用。

所述中长链α-/β-不饱和酮酯化学结构如下所示：

进一步地，提供所述烯还原酶催化剂催化中长链α-/β-不饱和酮酯不对称还原中的应用。

其中所述中长链α-/β-不饱和酮酯通过烯还原酶SsER不对称还原催化路线如下所示：

所述α-/β-不饱和酮酯的不对称还原，可按下述优选方法进行：在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺的存在下，在所述烯还原酶催化剂的作用下，催化所述α-/β-不饱和酮酯的不对称还原反应。

所述应用中，底物在反应液中的浓度可以为0.1～100mmol/L。根据所采用的反应体系，所述烯还原酶(优选为SsER-A314Y突变体)的用量为1～500U/L。酶促中长链α-/β-不饱和酮酯不对称还原时，辅酶NADPH氧化生成NADP⁺，为了进行辅酶NADPH的循环再生，向反应体系中额外添加葡萄糖和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(J Ind MicrobBiotechnol,2011,38:633–641)。取决于不同的反应体系，葡萄糖脱氢酶的活力单位上载可以与所述烯还原酶相等。葡萄糖与底物的摩尔比为1.0～1.5，额外添加的NADP⁺的用量为0～1.0mmol/L。所述缓冲液为磷酸钠缓冲液，优选pH范围为6.0～8.0，更优选pH 7.0。磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.2mol/L。所述的酶促不对称还原反应的温度为25～40℃，优选30℃。反应过程中，间歇取样测定反应转化率，反应时间以底物完全转化或反应转化率停止增长的时间为准，一般为1～24h。本反应中，在2mL离心管中进行反应，1mL磷酸钠缓冲液(100mM，pH 7.0)中加入8mM的不同潜手性底物，12mM的葡萄糖，0.2mM的NADP⁺，1U的SsER-A314Y突变体纯酶，4U的葡萄糖脱氢酶。反应在振荡器上1000rpm，30℃下进行。反应12h，用2M硫酸溶液终止反应，用等体积的乙酸乙酯萃取，再加无水硫酸钠干燥过夜，测定底物转化率和还原产物的ee值，如表2所示。

表2 SsER-A314Y催化不同底物不对称还原的结果

反应转化率和产物对映体过量值(ee)可采用气相色谱法进行分析，优选地，使用-5Sil MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)进行转化率分析，载气为氮气，检测器为氢火焰离子化检测器(FID)。进样口温度为280℃，检测器温度为280℃。使用GC/CP-Chirasil-Dex CB毛细管色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm)进行还原产物的ee值分析，载气为氮气，检测器为氢火焰离子化检测器(FID)。进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温采用程序升温如表3所示。

表3 SsER-A314Y对不同底物不对称还原的产物ee值的分析条件

酶促不对称还原反应结束后，用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚等进行萃取，重复萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥。旋转蒸发除去溶剂，即可获得相应光学活性中长链多取代烷基内酯粗产品。

本发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的烯还原酶SsER及其优选SsER-A314Y突变体，是一种新的烯还原酶，能高效催化中长链α-/β-不饱和酮酯(尤其是对(E)-2a和(E)-2b)不对称还原，突变体活力高达8.5U/mg。

(2)本发明所述的饱和酮酯化合物，可作为香料产品的中间体，在香料市场上具有广泛的应用价值。

(3)本发明反应条件温和，转化率高，催化活力高，产品光学纯度好，ee值可高于99％，具有很好的工业应用前景。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，但不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。

下列实施例中的材料来源为：

母本重组质粒pET28a-SsER，含有如序列表SEQ ID No.1所示的核酸序列，是由上海擎科生物科技有限公司构建的序列。

表达质粒pET28a购自Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶EcoR I和Hind III均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。

实施例1烯还原酶SsER的基因克隆

根据烯还原酶SsER的开放阅读框，设计上、下游引物，以重组质粒pET28a-SsER的DNA为模板，进行PCR扩增。

设计的上、下游引物如下：

上游引物SEQ ID No.23：

5’-CCG GAATTC ATGGCAGACTTATTT-3’；

下游引物SEQ ID No.24：

5’-CCC AAGCTT AAACGGATAATCAAT-3’；

其中，上游引物下划线部分为限制性内切酶EcoR I的酶切位点，下游引物下划线部分为限制性内切酶Hind III的酶切位点。

PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μL，上游引物和下游引物(10ng/μL)各2.5μL，1μL重组质粒pET28a-SsER(100ng/μL)，以及19μL的ddH₂O。PCR扩增程序为：95℃预变性3min后进行20-32次如下循环：95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min；循环结束后，最后再72℃延伸5min。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后，用DNA回收试剂盒回收目的片段。经过DNA测序，该序列编码的开放阅读框全长1068bp，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2：烯还原酶SsER重组表达质粒和重组表达转化体的制备

将实施例2中PCR扩增所得的烯还原酶SsER的DNA片段以及pET-28a空载质粒同时用限制性内切酶EcoR I和Hind I双酶切10-20min，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA纯化试剂盒回收。将回收的酶切烯还原酶SsER的DNA片段和空载质粒在T₄ DNA连接酶的作用下，于16℃过夜连接12h，得到重组质粒pET28a-SsER。

将所得重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养8h以上，对长出来的菌落进行菌落PCR验证，挑取成功扩增出长度约1068bp的目的条带的阳性克隆。经测序验证后，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-SsER。

实施例3：烯还原酶SsER的诱导表达

将实施例2中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-SsER，接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12h，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有100mL的LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，放入摇床中，37℃、180rpm振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L进行诱导，16℃诱导24h后，将培养液以7500rpm转速离心，收集细胞沉淀，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞。

将0.5g如上方法所得的静息细胞悬浮于100mL的磷酸钠缓冲液(100mM，pH 6.0)中，冰水浴中进行超声破碎，离心收集上清液，即为重组烯还原酶SsER的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组烯还原酶SsER以可溶的形式存在。另外可将获得的重组烯还原酶SsER的粗酶液进行冷冻干燥，制得重组烯还原酶SsER的粗酶粉。

实施例4烯还原酶SsER的定点饱和突变

以pET28a-SsER为模板，使用PrimeStar HS DNAPolymerase进行PCR扩增。PCR体系为：pET28a-SsER质粒(100nM，1uL),上下游引物(10nM，1uL)，5×PrimeStar Buffer(Mg²⁺plus，4uL)，dNTP Mixture(2.5mM，1.6uL)，PrimeStar HS DNA Polymerase(0.2uL)，加灭菌蒸馏水补足至20uL。PCR反应程序：(1)95℃预变性3min；(2)98℃变性10s；(3)设置梯度温度退火10s；(4)72℃延伸6min40s步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min。再加0.5μL的Dpn I酶到8.5μL的PCR产物和1uL的rSmart cut buffer中并在37℃条件下保温3h消化模板，将消化产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对培养的细胞进行溶菌酶破壁，以NADPH为辅酶，在96孔板中对表达的蛋白进行高通量活力筛选，对活性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。

通过酶标仪高通量筛选，发现将第314位丙氨酸替换为酪氨酸(A314Y)、甘氨酸(A314G)和苏氨酸(A314T)等氨基酸对4-氧代戊烯酸乙酯-(E)和4-氧代辛烯酸乙酯-(E)的活性提高。对其进行纯化表征，对突变体进行了酶活测定和动力学参数测定(表4-表7所示)。其中SsER-A314Y为最佳突变体，其酶活力可达8.5U/mg，对4-氧代戊烯酸乙酯-(E)的催化效率(K_cat/K_m)相对SsER提升了1.3倍，对4-氧代辛烯酸乙酯-(E)的催化效率(K_cat/K_m)相对SsER提升了4倍，相比其他突变体具有更优的催化性能，是最佳突变体。SsER突变体酶活力测定方法：将含2mmol/L 4-氧代戊烯酸乙酯和0.1mmol/L NADPH的1mL反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)预热至30℃，然后加入适量的SsER突变体酶液，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处的吸光度变化，记录1min内吸光度的变化值，计算酶活力。SsER突变体的高通量活力筛选测定方法：将含2mmol/L 4-氧代戊烯酸乙酯和0.1mmol/L NADPH的磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)分装到96孔板中，预热至30℃，然后分别加入适量的SsER突变体酶液，30℃振荡反应，在酶标仪上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录10min内吸光度的变化值，计算相应的酶活力。

表4不同突变体对3-甲基-4-氧代戊烯酸乙酯-(E)的比活力

表5不同突变体对3-甲基-4-氧代辛烯酸乙酯-(E)的比活力

表6不同突变体对3-甲基-4-氧代戊烯酸乙酯-(E)的动力学参数

表7不同突变体对3-甲基-4-氧代辛烯酸乙酯-(E)的动力学参数

实施例5pH对烯还原酶SsER催化活性的影响

在pH 4.5～8.5的范围内按标准方法测定pH对重组羰基还原酶SsER活性的影响。缓冲液分别为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(4.5～6.0)，磷酸钠缓冲液(6.0～7.5)，Tris-HCl缓冲液(7.5～8.5)。

在1mL上述缓冲液体系中，加入4-氧代辛烯酸乙酯-(E)和NADPH至终浓度分别为2mmol/L和0.1mmol/L，预热至30℃，然后加入适量的烯还原酶SsER，混合均匀，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，测定不同pH的缓冲溶液中，烯还原酶SsER的活性差异，结果如表8所示。优选酶促反应的pH范围为6.0～7.0，更优选pH 6.5。

表8pH对SsER催化4-氧代辛烯酸乙酯-(E)不对称还原活性的影响

实施例6温度对烯还原酶SsER催化活性的影响

在1mL磷酸钠缓冲液(100mM，pH 6.5)体系中，加入4-氧代辛烯酸乙酯-(E)和NADPH至终浓度分别为2mmol/L和0.1mmol/L，在25～50℃环境中预热5min，然后加入适量的烯还原酶，混合均匀，在与预热温度相同的温度环境中保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，测定不同温度条件下烯还原酶SsER的活性差异，结果如表9所示。优选酶促反应的温度范围为30～40℃。

表9温度对SsER不对称催化还原的影响

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

华东理工大学

一种烯还原酶及其在不对称还原中长链α-/β-不饱和酮酯中的应用

24

SIPOSequenceListing 1.0

1

1068

DNA

Swingsia samuiensi

1

atggcagacttattttcgagcattaaaattggggacattattaccaagaaccgcatttttatggccccgctgacgcgcgcccgtgtggaaagagacgcggtgccggttccgatgatggcagaatattatgcccagagagcacaggcaggtttaattattagcgaggcaaccggtattagcagagaaggtctgggttggccgtatgcaccgggaatttggacagatgaacaggtggaagcatggaaaagtgtcacccaggcagttcatgataaaggcggaaagatagtttgtcagctgtgccatatgggacgtgcggttcacagtagcgtgacgggtttacagccagttagtgcaagtgaaacaaccgcaccggatgaagttcatacctatgatggaaaaaaaccgtatgaaaaagcacgtgcactgaccaaaagcgatattacccgtattctgaatgattatgaacaggcagcacgtaatgcaatgcgtgcaggttttgatggtgttcagattcatgcagcaaatggttatctgattgatcagtttctgcgtgatggtaccaatcatcgtagcgatgaatatggtggtagcctggaaaatcgtgttcgtctgctggttgaagttacccagcgtgttattgcaaccgttggtgcagaaaaaaccggtgttcgtctgagcccgaatggtgatagccagggtgttattgatagcgcaccggaaaaaatttttgttctggcagcacaggaactggaacgtctgggtgttgcatggctggaactgcgtgaaaatagcaccaccggtacctttctggcaccgaccgatcagccgaaactgagcccggaaattcgtaaagtttttcatcgtagcctggttctgaatcaggattatagctttgaagaagcacaggcagcaattcgtgatggtcatgcagatgcaattgcatttggtcgtaaatttattagcaatccggatctgccggatcgttttgcaaaaaatattccgctgcaggaaagcaatgttagcacctggtatagccgtggtgaagaaggttatattgattatccgttt

2

356

PRT

Swingsia samuiensi

2

MADLFSSIKIGDIITKNRIFMAPLTRARVERDAVPVPMMAEYYAQRAQAGLIISEATGISREGLGWPYAPGIWTDEQVEAWKSVTQAVHDKGGKIVCQLCHMGRAVHSSVTGLQPVSASETTAPDEVHTYDGKKPYEKARALTKSDITRILNDYEQAARNAMRAGFDGVQIHAANGYLIDQFLRDGTNHRSDEYGGSLENRVRLLVEVTQRVIATVGAEKTGVRLSPNGDSQGVIDSAPEKIFVLAAQELERLGVAWLELRENSTTGTFLAPTDQPKLSPEIRKVFHRSLVLNQDYSFEEAQAAIRDGHADAIAFGRKFISNPDLPDRFAKNIPLQESNVSTWYSRGEEGYIDYPF

3

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

3

cgtagcctgg ttctgnnkca ggattatagc ttt 33

4

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

4

aaagctataa tcctgmnnca gaaccaggct acg 33

5

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

5

agcctggttc tgaatnnkga ttatagcttt gaa 33

6

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

6

ttcaaagcta taatcmnnat tcagaaccag gct 33

7

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

7

ctggttctga atcagnnkta tagctttgaa gaa 33

8

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

8

ttcttcaaag ctatamnnct gattcagaac cag 33

9

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

9

gttctgaatc aggatnnkag ctttgaagaa gca 33

10

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

10

tgcttcttca aagctmnnat cctgattcag aac 33

11

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

11

ctgaatcagg attatnnktt tgaagaagca cag 33

12

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

12

ctgtgcttct tcaaamnnat aatcctgatt cag 33

13

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

13

catgcagatg caattnnktt tggtcgtaaa ttt 33

14

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

14

aaatttacga ccaaamnnaa ttgcatctgc atg 33

15。

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

15

gcagatgcaa ttgcannkgg tcgtaaattt att 33

16

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

16

aataaattta cgaccmnntg caattgcatc tgc 33

17

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

17

gatgcaattg catttnnkcg taaatttatt agc 33

18

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

18

gctaataaat ttacgmnnaa atgcaattgc atc 33

19

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

19

gcaattgcat ttggtnnkaa atttattagc aat 33

20

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

20

attgctaata aatttmnnac caaatgcaat tgc 33

21

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

21

attgcatttg gtcgtnnktt tattagcaat ccg 33

22

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

22

cggattgcta ataaamnnac gaccaaatgc aat 33

23

24

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

23

ccggaattca tggcagactt attt 24

24

24

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

24

cccaagctta aacggataat caat

Claims (10)

1.一种烯还原酶，其特征在于，所述烯还原酶是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)如SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在如SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加几个氨基酸且催化α-/β-不饱和酮酯不对称还原制备光学活性γ-酮酯的由(a)衍生，同时催化活性高于(a)的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的一种烯还原酶，其特征在于，其中(b)所述蛋白质为：由SEQ IDNo.2所示氨基酸序列第314位单独替换一个氨基酸后而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质。

3.根据权利要求2所述的一种烯还原酶，其特征在于，(b)所述蛋白质具有如下序列中的一种：

(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第314位丙氨酸替换为甘氨酸；

(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第314位丙氨酸替换为酪氨酸；

(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第314位丙氨酸替换为苏氨酸。

4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的烯还原酶。

5.根据权利要求4所述的一种分离的核酸，其特征在于，烯还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

6.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求5所述的核酸。

7.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求6所述的重组表达载体。

8.一种烯还原酶催化剂，其特征在于，选自以下形式中的任一种：

(1)培养如权利要求7所述的重组表达转化体，分离含有如权利要求1所述烯还原酶的转化体细胞；

(2)培养如权利要求7所述的重组表达转化体，分离含有如权利要求1所述烯还原酶的转化体细胞，对含有所述烯还原酶的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；

(3)培养如权利要求7所述的重组表达转化体，分离含有如权利要求1所述烯还原酶的转化体细胞，对含有所述烯还原酶的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液，将所述烯还原酶的细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉；

(4)如权利要求1所述的烯还原酶。

9.一种如权利要求8所述的烯还原酶催化剂的应用，其特征在于，所述烯还原酶催化剂在催化α-/β-不饱和酮酯不对称还原制备光学活性α-/β-取代的γ-酮酯中的应用。

10.如权利要求9所述的烯还原酶催化剂的应用，其特征在于，所述α-/β-不饱和酮酯的化学结构为如下任一种：