CN104109659A - 羧酸酯酶、其编码基因及其应用 - Google Patents

羧酸酯酶、其编码基因及其应用 Download PDF

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王超凡
李俊俊
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Abstract

本发明提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶、编码上述羧酸酯酶的基因、包含上述基因的重组载体、包含上述基因的重组菌株和上述羧酸酯酶在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用。本发明的羧酸酯酶基因CarEW来源于温泉环境，并证实其在45℃条件下具有很好的活性和稳定性，可用于环境中酞酸酯类化合物(邻苯二甲酸酯)，如邻苯二甲酸二异丁酯的降解，在环境污染治理方面具有重要意义。

Description

羧酸酯酶、其编码基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种羧酸酯酶、其编码基因及其应用。
背景技术
邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutyl phthalate,DIBP)属于酞酸酯类化合物，是塑料工业中广泛应用的增塑剂和软化剂，其作用是增加塑料的可塑性和韧性，提高塑料强度(赵振华，环境化学，1991，10(3)：64-68)。此外，DIBP在涂料、印染、化妆品和香料的生产过程中应用也较为广泛。近年来研究表明，DIBP仅靠分子间作用与高分子塑料结合，随着时间的推移该类物质可以通过食品包装材料直接迁移到食品中，也可通过含有该物质的塑料制品迁移到环境中，从而对空气、水、土壤和食品等造成污染，并可通过呼吸、饮食和皮肤进入人体内，对人体造成危害(Zhang et al.,Environ Geochem Health,2014,36:505-515)。因此，寻找合理、有效的降解DIBP的方法和途径逐渐成为各国研究者所关注的问题。由于生物降解是处理环境中DIBP类污染物的主要途径，因此筛选高效专性或兼性的DIBP类有机污染物降解菌或降解酶成为研究的热点。
羧酸酯酶(Carboxylesterases,EC3.1.1.1)是一类能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶，与脂肪酶同属于α/β水解酶家族成员，其氨基酸序列含有Ser-Asp-His三联体结构，Ser，Asp，His构成了羧酸酯酶的催化活性中心(Nardini et al.,Current Opinion in Structural Biology,1999,9:732-737)。羧酸酯酶广泛分布于动物、植物和微生物中(Melloney et al.,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2005,32:261-270)，在催化酯水解、酯合成和酯交换等过程中具有重要应用价值，具有良好的区域选择性和立体选择性(Ramos et al.,Agricultural and Biological Chemistry,1987,51:1833-1838)。但迄今为止，关于羧酸酯酶对酞酸酯类化合物降解的研究甚少。
利用微生物降解酞酸酯类化合物大多数是依靠胞内酶解作用，但由于野生菌株产酶能力有限、发酵周期长、纯化复杂、难以大量生产，生产成本高，限制了其推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种羧酸酯酶。
本发明的再一目的是提供编码上述羧酸酯酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一个目的是提供上述羧酸酯酶在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用。
本发明所述羧酸酯酶CarEW可得自芽孢杆菌(Bacillus sp.)，如Bacillussp.ATCC31072，羧酸酯酶CarEW的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的羧酸酯酶CarEW总共含有488个氨基酸，理论分子量为53.76kDa。该酶以4-硝基苯丁酸酯(pNPC4)为最适底物；最适温度45℃；最适pH值7.5；终浓度1mM的金属离子K+、Cu2+、Na+和Zn2+对羧酸酯酶CarEW有激活作用，Ag+、Hg2+等对羧酸酯酶CarEW有较强的抑制作用；在37℃和45℃下保温60min，羧酸酯酶的酶活分别保持在54％和58％以上；在pH值5.0～10.0的缓冲液中处理60min，羧酸酯酶的酶活在pH值7.0～8.0之间比较稳定，保持80％以上的酶活力；在pH值7.5及45℃反应时，羧酸酯酶CarEW对0.6mmol/L的pNPC4比活力为636U±0.01U/mg。此外，羧酸酯酶CarEW对α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯(pNPC2)、己酸-4-硝基苯酯(pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯(pNPC8)、对硝基苯酚癸酸酯(pNPC10)、月桂酸-4-硝基苯酯(pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
本发明提供了编码上述羧酸酯酶的基因CarEW，该基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明通过PCR的方法克隆了羧酸酯酶基因CarEW，其全长1464bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。
本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因CarEW的重组载体，优选为pEASYTM-E2-CarEW。将本发明的羧酸酯酶基因与pEASYTM-E2进行T-A连接，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEASYTM-E2-CarEW。
本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因CarEW的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/CarEW。
本发明制备羧酸酯酶CarEW的方法按以下步骤进行：
1)用上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组羧酸酯酶表达；
3)回收并纯化所表达的羧酸酯酶CarEW。
其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/CarEW。
本发明提供了羧酸酯酶基因CarEW，其编码的羧酸酯酶CarEW以4-硝基苯丁酸酯(pNPC4)为最适底物；最适温度45℃；最适pH7.5；终浓度为1mM的金属离子K+、Cu2+、Na+和Zn2+对羧酸酯酶CarEW有激活作用，Ag+、Hg2+等对羧酸酯酶CarEW有较强的抑制作用；在37℃和45℃下保温60min，酶活分别保持在54％和58％以上；在pH5.0-10.0缓冲液中处理60min，羧酸酯酶的酶活在pH7.0-8.0之间比较稳定，保持80％以上的酶活力；在pH7.5及45℃反应时，羧酸酯酶CarEW对0.6mmol/L pNPC4的比活力为636U±0.01U/mg。此外，羧酸酯酶CarEW对α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯(pNPC2)、己酸-4-硝基苯酯(pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯(pNPC8)、对硝基苯酚癸酸酯(pNPC10)、月桂酸-4-硝基苯酯(pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
本发明的羧酸酯酶CarEW在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用，其中，邻苯二甲酸二异丁酯为增塑剂。
其应用方法如下：
取1U羧酸酯酶CarEW加入到含有浓度为30mg/L的增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯的10mmol/L、pH值7.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，总反应体系为0.5mL，37℃反应，即可对增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯进行降解。
取抽提液于气质联用(GC/MS)上进行定量分析，结果表明，90min内有77％的邻苯二甲酸二异丁酯被降解。
本发明的羧酸酯酶基因CarEW来源于温泉环境，并证实其在45℃条件下具有很好的活性和稳定性，可用于环境中酞酸酯类化合物(邻苯二甲酸酯)的降解，尤其可高效降解邻苯二甲酸二异丁酯，在环境污染治理方面具有重要意义。此外，酞酸酯类化合物对生物和环境的危害近年来才逐渐被认知，相关研究报道较少，而生物降解是处理环境中DiBPs的主要途径，因此本发明对开发微生物来源的羧酸酯酶对酞酸酯类化合物降解的应用具有重要意义。同时，本发明具有培养周期短、易于获得纯蛋白等优点。
附图说明
图1为在大肠杆菌中表达的重组羧酸酯酶CarEW的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的重组羧酸酯酶CarEW；
图2为羧酸酯酶的温度和酶活的曲线图；
图3为羧酸酯酶的温度稳定性的曲线图；
图4为羧酸酯酶的pH值和酶活的曲线图；
图5为羧酸酯酶的pH稳定性试验结果；
图6为羧酸酯酶CarEW的1/[S]与1/V的关系曲线图；
图7为增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯的标准曲线；
图8为重组羧酸酯酶CarEW对邻苯二甲酸二异丁酯的降解曲线。
具体实施方式
实验材料和试剂
1、菌株及载体：芽孢杆菌(Bacillus sp.)同文献报道菌种性质，如Bacillussp.ATCC31072；大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)购于Novagen公司；表达载体pEASYTM-E2购于全式金生物有限(TransGen)公司。
2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；T4连接酶购自Promega公司；α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯(pNPC2)、4-硝基苯丁酸酯(pNPC4)、己酸4-硝基苯酯(pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯(pNPC8)、对硝基苯酚癸酸酯(pNPC10)、月桂酸4-硝基苯酯(pNPC12)购自Sigma公司；邻苯二甲酸二异丁酯溶液标准品购自北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；其它试剂均购自国药集团。
3、培养基：
LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，pH自然(约为7.0)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1：羧酸酯酶基因CarEW的克隆
采用天根细菌基因组提取试剂盒(DP302)提取芽孢杆菌K91基因组DNA。
根据芽孢杆菌K91全基因组测序及基因注释分析羧酸酯酶基因CarEW并设计表达引物CarEW F和CarEW R：
上游引物CarEW F:5’-ACTCATCAAATAGTAACGAC-3’
下游引物CarEW R:5’-TTCTCCTTTT GAAGGGAATA G-3’
上游引物T7:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’
下游引物T7ter:5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’
T7和T7ter为PCR检测阳性克隆子引物。
以嗜热芽孢杆菌K91基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应参数为：94℃预变性1min30sec；然后94℃变性30sec；58℃退火(每个循环降0.5℃)30sec；72℃延伸1min40sec；28个循环后94℃变性30sec；44℃退火30sec；72℃延伸1min30sec；7个循环后72℃保温10min。
取4μL PCR产物与1μL表达载体pEASYTM-E2进行T-A连接，25℃连接10min，连接产物全部转入Trans-I感受态细胞中，37℃温箱过夜培养。从转化板上挑取几株单菌落，使用引物(本基因上游引物，T7ter)进行菌落PCR扩增，筛选正向连接的阳性克隆子。对菌落PCR验证正确的克隆子采用T7和T7ter引物测序，由北京华大基因测序完成。对于测序正确的阳性克隆子接种并提取质粒pEASYTM-E2-CarEW，取0.01uL pEASYTM-E2-CarEW质粒转化到100uL BL21(DE3)表达感受态细胞中，涂布于含Ampr的LB固体平板上，37℃温箱过夜培养，从转化板上挑取几株单菌落，进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/CarEW。
实施例2：重组羧酸酯酶CarEW的制备
取含有重组质粒pEASYTM-E2-CarEW的BL21(DE3)菌株和只含有pEASYTM-E2的空质粒BL21(DE3)菌株，以0.1％的接种量接种于LB(含100ug/mL Ampr)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100ug/mL Ampr)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD600达到0.4-0.7)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。12000rpm离心10min，收集菌体。用适量的pH7.0柠檬酸-Na2HPO4缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。对其进行SDS-PAGE分析，结果参见图1，图1为在大肠杆菌中表达的重组羧酸酯酶CarEW的SDS-PAGE分析，图1表明，重组羧酸酯酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。
实施例3：纯化的重组羧酸酯酶CarEW的性质测定
1、重组羧酸酯酶CarEW的活性分析
纯化的重组酯酶CarEW采用对硝基苯酚法(p-nitrophenol)进行活性测定：取4只1.5mL离心管，分别编号1、2、3、4，其中1、2、3号试管为实验组(3个重复)，4号为对照组。向四只离心管中分别加入420μL pH7.5的由50mM柠檬酸-Na2HPO4缓冲液、0.4％Trion-100、0.1％阿拉伯胶组成的乳化液和30μL10mM底物pNPC4，37℃预热5min后，每隔10s分别向1、2和3号管中加入50μL稀释适当倍数的酶液，4号对照管加等量水，37℃反应5min后每隔10s向1、2、3实验管中加入50μL0.1M Na2CO3终止反应，4号对照管同样加入等体积终止液后立即将4只离心管插到冰上，酶标仪405nm读取OD值。1个酶活单位(U/mL)定义为一定条件下，每分钟分解底物pNPC4生成1μmoL对硝基苯酚所需要的酶量。以pNPC2、pNPC6、pNPC8、pNPC10、pNPC12、α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯为底物测定方法及酶活力计算同pNPC4。
结果表明，在pH7.5及45℃反应时，羧酸酯酶CarEW对0.6mmol/L pNPC4的比活力为636U±0.01U/mg。同时，羧酸酯酶CarEW对α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯(pNPC2)、己酸-4-硝基苯酯(pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯(pNPC8)、对硝基苯酚癸酸酯(pNPC10)、月桂酸-4-硝基苯酯(pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
2、重组羧酸酯酶CarEW的最适温度和热稳定性的测定
酶的最适温度测定：将重组羧酸酯酶CarEW在50mM pH7.5的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液条件下，分别在0℃、10℃、20℃、30℃、37℃、45℃、50℃、60℃、70℃、75℃下进行酶促反应。结果参见图2，图2为羧酸酯酶的温度和酶活的曲线图，由图2可知，羧酸酯酶CarEW的最适温度为45℃。
温度稳定性的测定：将重组酯酶CarEW在50mM pH7.5的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液条件下，在37℃、45℃和55℃三个温度下分别保温10min、20min、30min、40min、50min和60min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPC4为底物，反应5min，测定重组羧酸酯酶CarEW的酶学性质。结果参见图3，图3为羧酸酯酶的温度稳定性的曲线图，由图3可知，该酶在37℃和45℃处理60min后仍剩余50％以上的活性；55℃保温60min后，酶活性保持在30％以上。
3、重组羧酸酯酶CarEW的最适pH和pH稳定性的测定
酶的最适pH的测定：将重组羧酸酯酶CarEW在37℃，分别在pH5.0、6.0、7.0、7.5、8.0的50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、pH8.0、9.0的50mMTris-HCL缓冲液以及pH9.35、10.0的50mM硼酸-硼砂的缓冲液中进行酶促反应。结果参见图4，图4为羧酸酯酶的pH值和酶活的曲线图，由图4可知，羧酸酯酶CarEW的最适pH值为7.5。
pH稳定性的测定：将重组羧酸酯酶CarEW用pH5.0、6.0、7.0、7.5、8.0的50mM柠檬酸-Na2HPO4缓冲液；pH8.0、9.0的50mM Tris-HCL缓冲液；pH9.35、10.0、的50mM硼酸-硼砂缓冲液稀释适当倍数后分别在37℃下耐受60min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPC4为底物，反应5min，测定纯化的重组羧酸酯酶CarEW的酶学性质。结果参见图5，图5为羧酸酯酶的pH稳定性试验结果，由图5可知，经pH7.0、7.5、8.0的50mM柠檬酸-Na2HPO4缓冲液；pH8.0Tris-HCl缓冲液37℃条件下处理60min后仍然保持80％以上的活性，重组羧酸酯酶CarEW在pH7.0-8.0之间酶学性质比较稳定。
4、不同金属离子及化学试剂对重组羧酸酯酶CarEW活性的影响
在酶促反应体系中加入终浓度1mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。以pNPC4为底物，在45℃，pH7.5条件下，反应5min，测定纯化的重组羧酸酯酶CarEW的酶活力。结果参见表1和表2，表1为不同金属离子及化学试剂对羧酸酯酶活性影响的检测结果，表2为不同有机试剂对羧酸酯酶活性影响的检测结果。
表1 不同金属离子及化学试剂对羧酸酯酶活性影响的检测结果
表2 不同有机试剂对重组羧酸酯酶CarEW活性的影响
表1和表2表明，终浓度为1mM的金属离子K+、Na+、Cu+、Zn2+，终浓度为2％的有机溶剂2-propanol、ethanol、methanol对所述羧酸酯酶有较强的激活作用；1mM的Hg2+、Mn2+、Fe2+、Ag+、DTT，终浓度2％的Triton X-100以及终浓度为0.1％的SDS，CTAB对酶有较强的抑制作用；1mM的Co2+、Li1+以及2％的Tween80对酶几乎无影响。
5、重组羧酸酯酶CarEW的动力学参数的测定
在45℃，pH7.5条件下，以pNPC4为底物，依次在酶促反应的1-10min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.1mM-1.3mM的pNPC4为底物([S])，在45℃，pH7.5和一级反应时间下测定酶活，计算出相应的反应速度(ν)，结果参见图6，图6为羧酸酯酶CarEW的1/[S]与1/V的关系曲线图，根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定，在45℃，pH7.5条件下，重组酯酶CarEW对pNPC4的Km和Vmax分别为0.6mM和666.67U/mg。
6、重组羧酸酯酶CarEW对底物pNPC2、pNPC4、pNPC6、pNPC8、pNPC10和pNPC12的水解
在45℃，pH7.5条件下，重组羧酸酯酶CarEW对10mM的pNPC2、pNPC4、pNPC6、pNPC8、pNPC10、pNPC12的比活力分别为323.04U/mg、343.49U/mg、298.70U/mg、203.29U/mg、100.78U/mg、21.11U/mg。
实施例4：纯化的重组羧酸酯酶CarEW在增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯的降解中的应用
取1U纯化重组的羧酸酯酶CarEW加入到含有浓度为30mg/L的增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯的10mmol/L、pH7.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，总反应体系为0.5mL，37℃反应；对照组以缓冲液代替酶液；每隔15min取样品，加入等体积的正己烷终止反应，充分震荡混匀，12000rpm离心5min，回收上层有机相用于GC/MS定量分析。
色谱分析所用仪器为Agilent GC7890-MS5975型气相色谱(美国)，检测器为FID，柱子为Agilent DB-17(30m×0.32mm×0.25um)，操作条件：进样量1μl，不分流，进口温度为280℃，He压力为14.992psi，柱流量1ml/min，离子源230℃，MS四级杆150℃，柱箱程序升温：180℃(保持1min)，以15℃/min的速度上升至240℃，保持3min，总时间8min。
分别配制不同浓度的增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯标准品，根据以上色谱分析方法分析，积分计算不同浓度下的峰面积，每个浓度重复3次，计算峰面积平均值，以增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标做出邻苯二甲酸二异丁酯标准曲线，结果参见图7，其检测限为0.05mg/L，方法回收率为81.6％-83.8％。
羧酸酯酶CarEW对增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯的降解结果如图8所示，图8表明在上述条件下，90min内有77％的邻苯二甲酸二异丁酯被降解。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种羧酸酯酶，其特征在于，其具有(I)或(II)所示的氨基酸序列中任意一个：
(I)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(II)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
2.一种编码如权利要求1所述的羧酸酯酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或者由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个碱基获得。
4.包含权利要求2或3所述基因的重组载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.包含权利要求2或3所述基因的菌株。
7.根据权利要求6所述的菌株，其特征在于，所述菌株为重组菌株。
8.根据权利要求7所述的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
9.权利要求1所述的羧酸酯酶在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其具体方法为：将羧酸酯酶加入到含有邻苯二甲酸二异丁酯的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中进行反应。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109402087A (zh) * 2018-12-07 2019-03-01 南京农业大学 一种新型阿魏酸酯酶及其制备方法和应用
CN109943515A (zh) * 2019-04-30 2019-06-28 江南大学 一种产羧酸酯酶的重组菌及其应用
CN110038250A (zh) * 2019-04-30 2019-07-23 江南大学 一种降解含金属离子或有机溶剂的邻苯二甲酸酯类的方法
CN111699250A (zh) * 2017-12-13 2020-09-22 科德克希思公司 用于酰胺偶联的羧酸酯酶多肽
CN113637657A (zh) * 2021-08-05 2021-11-12 云南师范大学 一种羧酸酯酶CarCB2及其全细胞催化剂和应用
CN113637653A (zh) * 2021-08-05 2021-11-12 云南师范大学 一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUNLAP,C.等: "登录号：AIC99736.1", 《GENBANK》 *
JIAO Y等: "Identification and characterization of a cold-active phthalate esters hydrolase by screening a metagenomic library derived from biofilms of a wastewater treatment plant", 《PLOS ONE》 *
MARUYAMA K等: "Purification and characterization of an esterase hydrolyzing monoalkyl phthalates from Micrococcus sp. YGJ1", 《J BIOCHEM》 *
NOZAWA T等: "Anaerobic metabolism of phthalate and other aromatic compounds by a denitrifying bacterium", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
NTHANGENI,M.B.等: "登录号：AY692083.1", 《GENBANK》 *
曾锋等: "不同菌源的微生物对邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）生物降解性的比较", 《中国环境科学》 *
胡晋红: "《皮肤药理学》", 31 January 2008 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111699250A (zh) * 2017-12-13 2020-09-22 科德克希思公司 用于酰胺偶联的羧酸酯酶多肽
CN111699250B (zh) * 2017-12-13 2024-01-09 科德克希思公司 用于酰胺偶联的羧酸酯酶多肽
CN109402087A (zh) * 2018-12-07 2019-03-01 南京农业大学 一种新型阿魏酸酯酶及其制备方法和应用
CN109943515A (zh) * 2019-04-30 2019-06-28 江南大学 一种产羧酸酯酶的重组菌及其应用
CN110038250A (zh) * 2019-04-30 2019-07-23 江南大学 一种降解含金属离子或有机溶剂的邻苯二甲酸酯类的方法
CN109943515B (zh) * 2019-04-30 2021-07-27 江南大学 一种产羧酸酯酶的重组菌及其应用
CN113637657A (zh) * 2021-08-05 2021-11-12 云南师范大学 一种羧酸酯酶CarCB2及其全细胞催化剂和应用
CN113637653A (zh) * 2021-08-05 2021-11-12 云南师范大学 一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用
CN113637653B (zh) * 2021-08-05 2023-05-23 云南师范大学 一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用
CN113637657B (zh) * 2021-08-05 2024-01-30 云南师范大学 一种羧酸酯酶CarCB2及其全细胞催化剂和应用

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