CN111699250B - 用于酰胺偶联的羧酸酯酶多肽 - Google Patents

用于酰胺偶联的羧酸酯酶多肽 Download PDF

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Abstract

本发明提供了与天然存在的野生型羧酸酯酶相比具有改进的性质的工程化羧酸酯酶、以及编码工程化羧酸酯酶的多核苷酸、能够表达工程化羧酸酯酶的宿主细胞、以及在酰胺化反应中使用工程化羧酸酯酶的方法。

Description

用于酰胺偶联的羧酸酯酶多肽
本申请要求于2017年12月13日提交的美国临时专利申请序列第62/598,189号的优先权，其在此出于所有目的通过引用以其整体并入。
对序列表、表格或计算机程序的引用
以文件名CX2-165US1_ST25.txt经由EFS-Web以计算机可读形式(CRF)根据37C.F.R.§1.821随本申请同时提交的序列表通过引用并入本文。序列表的电子拷贝于2018年12月7日创建，文件大小为420千字节。
发明领域
本发明提供了与天然存在的野生型(WT)羧酸酯酶相比具有改进的非天然性质的工程化羧酸酯酶(E.C.3.1.1)、以及编码工程化羧酸酯酶的多核苷酸、能够表达工程化羧酸酯酶的宿主细胞以及将工程化羧酸酯酶应用于酰胺化反应的方法。
发明背景
酰胺键是多种合成分子中的关键功能部分，包括聚合物(例如，蛋白质、尼龙)、农药(例如，敌稗(propanil)、氯苯胺灵(chlorpropham))和药物(例如，缬沙坦(valsartan)、赖氨酸安非他命(lisdexamfetamine)。最近一项关于寻找新药物候选物中使用的反应类型的普遍性的调查列出，在所有这些反应中，N-酰基酰胺化占约16％。(Roughley和Jordan,J.Med.Chem.,54:3451-3479[2011])。当使用传统化学方法产生时，酰胺键形成是一种资源密集的转化。酰胺键通常从羧酸和胺合成。然而，这两个官能团之间的反应在环境温度不会自发发生，必须消除水、仅在高温(例如，200℃)才发生。这些条件倾向于对底物和产物有害。
为了在更合适的条件下发生酰胺化，通常需要将羧酸活化以与胺偶联。羧酸活化通常借助于偶联试剂以形成活化的酯或酸酐或者通过将羧酸转化成相应的酰氯(即，通过Schotten-Baumann反应；参见El-Faham和Albericio,Chem.Rev.,111:6557-6602[2011])而发生。这些反应用超化学计量浓度或化学计量浓度的昂贵的偶联试剂进行，其使用原子效率低的合成路线(参见，Pattabiraman和Bode，Nature，480:471-479(2011)。此外，试剂以及所得的废弃物可以是高度毒性并且环境不友好的。在这些反应中形成的每个产物分子产生至少一当量的废弃物，引起非常低的原子经济性。从反应混合物去除废弃物是一个冗长且昂贵的过程。因此，在本领域中需要更有效和环境友好的手段用于在多种环境中产生酰胺键。
脂肪酶已经在商业规模上应用于脂肪酸酯的水解，并且已经被用于酯的酰胺化(参见Faber,Biotransformations in Organic Chemistry,于Special Techniques,Springer-Verlag,New York,NY,[2011]；和Kalkote等,Asian J.Biochem.,2:279-283[2007])。使用酶形成酰胺键是高度原子经济的过程(highly atom economical process)，因为不存在如经典偶联方法下使羧酸活化的需要。酶在这些反应中的使用提供了巨大的工业价值，因为它们是环境友好的，在温和的条件下发生，并且比目前可得的化学途径更便宜。尽管真核蛋白酶和脂肪酶能够形成酰胺键(参见，Adolfsson等,Chem.Soc.Rev.,43:2714-2742[2014]；Guzman等,Elec.J.Biotech.,10(2)[2007]；和Asano等,J.Biosci.Bioeng.,100(6):662-666[2005])，这些酶通常在原核表达系统中表达差，并且可以在有机溶剂中表现差。相比之下，借助于定向演化(directed evolution)，本发明的羧酸酯酶已经容易地在原核(大肠杆菌(E.coli))表达系统中产生并且在更适于这种反应类型的有机溶剂方案(organic solvent regime)中具有增加的耐受性和实用性。
附图简述
图1示出了编码褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca,T.fusca)的野生型羧酸酯酶的大肠杆菌密码子优化的多核苷酸序列(SEQ ID NO:1)与随本申请提交的序列表中示出的编码工程化羧酸酯酶序列的每一个多核苷酸序列(SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133和135)的序列比对。所有这些公开的多核苷酸序列彼此在98.9％-99.9％之间相同。
图2示出了从褐色嗜热裂孢菌的野生型羧酸酯酶得到的多肽序列(SEQ ID NO:2)与在随本申请提交的序列表中示出的每一个工程化多肽羧酸酯酶序列(SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136)的序列比对。所有这些公开的多肽序列彼此在98.6％-99.8％之间相同。
发明概述
本发明提供了与天然存在的野生型(WT)羧酸酯酶相比具有改进的非天然性质的工程化羧酸酯酶(E.C.3.1.1)、以及编码工程化羧酸酯酶的多核苷酸、能够表达工程化羧酸酯酶的宿主细胞以及将工程化羧酸酯酶应用于酰胺化反应的方法。
本发明提供了包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大序列同一性的多肽序列的工程化羧酸酯酶或其功能片段，其中工程化羧酸酯酶在其多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的位置处的取代：39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、
103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438和470，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些另外的实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的取代：39/323、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、153、153/215、164/271、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224/268/372、249/284、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、372、372/376、373、376、377、405、420、427、428和429，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些另外的实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的取代：39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、
118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、190H、190K、190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428V和429L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些其他实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的取代：T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428V和A429L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:2来编号。在一些实施方案中，工程化羧酸酯酶包含位置282处的取代，其中位置参考SEQID NO:2来编号。在一些其他实施方案中，位置282处的取代是脂肪族的、非极性的、碱性的、极性的或芳香族的。在又一些另外的实施方案中，取代选自：X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282T和X282R。
本发明还提供了包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽序列的工程化羧酸酯酶或其功能片段，其中工程化羧酸酯酶在多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的位置处的取代：63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、
189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373和377，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些其他实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的至少一个取代：63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/280G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、
69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189I/320W/377I、189I/343V、189I/377I、189L、189Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373G和377L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些其他实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的至少一个取代：P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、
A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M189I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M189Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373G和F377L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。
本发明还提供了包含与SEQ ID NO:138具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽序列的工程化羧酸酯酶或其功能片段，其中工程化羧酸酯酶在其多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:138来编号。
本发明还提供了包含与SEQ ID NO:140具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽序列的工程化羧酸酯酶或其功能片段，其中工程化羧酸酯酶在多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:140来编号。
本发明还提供了包含选自以下的多肽序列的工程化羧酸酯酶：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136。
本发明还提供了与SEQ ID NO:2的野生型褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶相比表现出至少一种改进的性质的工程化羧酸酯酶。在一些实施方案中，改进的性质选自：改进的酰胺化活性、溶剂耐受性、热稳定性、pH稳定性、区域选择性、立体选择性、底物范围和/或降低的底物抑制或产物抑制，以及降低的对产生工程化羧酸酯酶的细菌宿主细胞的毒性。在一些另外的实施方案中，细菌宿主细胞包括大肠杆菌。在仍然一些另外的实施方案中，工程化羧酸酯酶表现出对选自以下的至少一种溶剂的改进的溶剂耐受性：丙酮、乙腈、甲苯、四氢呋喃、异丙醇、乙酸异丙酯、二甲基亚砜和/或甲基乙基酮。在一些其他实施方案中，工程化羧酸酯酶对选自以下的至少一种底物表现出比野生型褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶更大的活性：苯胺、异丁胺、正丁胺、叔丁胺、N’-叔丁氧羰基-苯酰肼、4-甲基哌啶、O-叔丁基羟胺、苄胺、2,6-二甲基苯胺、(S)-(-)-α-甲基苄胺、(R)-(+)-α-甲基苄胺、苯乙酸甲酯、乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、2-吡嗪基乙酯、4-乙基-1H-吲哚酯、N,N-二乙基甘氨酰甲酯。在一些另外的实施方案中，工程化羧酸酯酶对选自以下的至少一种底物或底物集表现出比野生型褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶更大的活性：苯胺、异丁胺、正丁胺、叔丁胺、N’-叔丁氧羰基-苯酰肼、4-甲基哌啶、O-叔丁基羟胺、苄胺、2,6-二甲基苯胺、(S)-(-)-α-甲基苄胺、(R)-(+)-α-甲基苄胺、苯乙酸甲酯、乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、2-吡嗪基乙酯、4-乙基-1H-吲哚酯、N,N-二乙基甘氨酰甲酯。在又一些其他实施方案中，工程化羧酸酯酶在产生选自以下的至少一种产物中表现出比野生型褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶更大的活性：乙酰苯胺；N-正丁基-苄基乙酰胺；N-[(S)-1-苯基乙基]-吡嗪酰胺；N-[(S)-1-苯基乙基]-苯甲酰胺；N-[(R)-1-苯基乙基]-苯甲酰胺；N’-叔丁氧羰基-苯酰肼；1-苯甲酰基-4-甲基哌啶；2-吡嗪基-4-甲基哌啶；N-异丁基-苯甲酰胺；N-叔丁基-苯甲酰胺；N-叔丁基羟基-苯甲酰胺；N-异丁基-1H-吲哚-4-酰胺；N’,N’-(二乙基氨基)-N-苯乙酰胺；N’,N’-(二乙基氨基)-N-苄基乙酰胺；和N’,N’-(二乙基氨基)-N-2,6-二甲基苯乙酰胺(即，利多卡因(lidocaine))。在一些实施方案中，本发明的工程化羧酸酯酶包含选自以下的至少一种取代：X343V、X372L、X320W/G、X214R、X282C、X271Y、X65G，其中取代参考SEQ ID NO:2来编号，并且其中工程化羧酸酯酶对用于从苯甲酸乙酯和2,6-二甲基苯胺形成N’,N’-(二乙基氨基)-N-2,6-二甲基苯乙酰胺的受阻胺表现出比野生型褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶更大的活性，如以下示意图中示出的。
在又一些另外的实施方案中，工程化羧酸酯酶包含选自以下的至少一种取代：X268A、X63A/R、X189Q/I/E、X214R、X282G/C、X381L和X69W，其中取代参考SEQ ID NO:2来编号，并且其中工程化羧酸酯酶对用于从苯甲酸乙酯和4-甲基-哌啶形成1-苯甲酰基-4-甲基-哌啶的仲胺表现出比野生型褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶更大的活性，如以下示意图中示出的。
在又一些另外的实施方案中，本文提供的工程化羧酸酯酶是纯化的。在仍然一些其他实施方案中，工程化羧酸酯酶是被固定的。本发明还提供了包含本文提供的至少一种工程化羧酸酯酶的组合物。
本发明还提供了编码本文提供的至少一种工程化羧酸酯酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽序列的至少一种工程化羧酸酯酶或其功能片段，其中工程化羧酸酯酶在其多肽序列中包含至少一个取代或取代集，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的位置处的取代的至少一种工程化羧酸酯酶：39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438和470，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的至少一个取代或取代集的至少一种工程化羧酸酯酶：39/323、62/117、63、64、65、66、68、69、
70、71、71/263、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、153、153/215、164/271、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224/268/372、249/284、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、372、372/376、373、376、377、405、420、427、428和429，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的至少一个取代或取代集的至少一种工程化羧酸酯酶：39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、190H、190K、190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、
282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428V和429L，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些其他实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的至少一个取代或取代集的至少一种工程化羧酸酯酶：T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428V和A429L，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码在位置282处包含取代的至少一种工程化羧酸酯酶，其中位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些其他实施方案中，位置282处的取代是脂肪族的、非极性的、碱性的、极性的或芳香族的。在又一些另外的实施方案中，取代选自X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282T和X282R。
本发明还提供了编码包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽序列的至少一种工程化羧酸酯酶或其功能片段的多核苷酸序列，其中工程化羧酸酯酶在其多肽序列中包含至少一个取代或取代集，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码在选自以下的位置处包含至少一个取代或取代集的工程化羧酸酯酶：63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、
68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373和377，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些其他实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的至少一个取代或取代集的工程化羧酸酯酶：63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/280G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189I/320W/377I、189I/343V、189I/377I、189L、189Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373G和377L，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些其他实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的至少一个取代或取代集的工程化羧酸酯酶：P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M189I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M189Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373G和F377L，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。
本发明还提供了编码至少一种工程化羧酸酯酶或其功能片段的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含与以下至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137和/或139。
本发明还提供了编码本文提供的工程化羧酸酯酶的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列可操作地连接至控制序列。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列是经密码子优化的。
本发明还提供了包含编码本文提供的工程化羧酸酯酶的至少一种多核苷酸序列的表达载体。此外，本发明提供了包含本文提供的至少一种表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明还提供了包含编码本文提供的至少一种工程化羧酸酯酶的至少一种多核苷酸序列的宿主细胞。
本发明还提供了在宿主细胞中产生工程化羧酸酯酶的方法，所述方法包括在合适的条件下培养包含含有编码至少一种工程化羧酸酯酶的至少一种多核苷酸的表达载体的宿主细胞，使得产生至少一种工程化羧酸酯酶。在一些实施方案中，方法还包括从培养物和/或宿主细胞回收至少一种工程化羧酸酯酶。在一些另外的实施方案中，方法还包括纯化至少一种工程化羧酸酯酶的步骤。
发明描述
本发明提供了与天然存在的野生型(WT)羧酸酯酶相比具有改进的非天然性质的工程化羧酸酯酶(E.C.3.1.1)、以及编码工程化羧酸酯酶的多核苷酸、能够表达工程化羧酸酯酶的宿主细胞、以及将工程化羧酸酯酶应用于酰胺化反应的方法。
转换酶功能和酶底物范围是可行的，因为已经观察到酶活性位点能够经由一个氨基酸突变催化若干不同的化学反应(参见Rauwerdink和Kazluaskas,ACS Cat.,5:6153-6176[2015])。为了改进羧酸酯酶功能性和底物范围，对野生型羧酸酯酶进行了定向演化。使用胺和羧酸酯底物对的多种集合，所得变体在产生酰胺键中具有改进的能力(参见，下文方案1)。工程化羧酸酯酶不仅在水性体系中具有活性，而且在有机共溶剂并且甚至接近全部为有机溶剂的浓度(near-total organic solvent concentrations)(例如，～98％v/v)的存在下也具有活性，如本文描述的。此外，这些工程化羧酸酯酶的固定化促进用于酰胺产生的连续流动操作，有助于最终酰胺产物的纯化，以及改进酰胺化操作的效率和总成本。
本发明提供了新的工程化羧酸酯酶多肽，连同它们的相应多核苷酸序列和应用方法，其展示了通用的酰胺键形成(参见，下文的方案1)。在一些实施方案中，工程化多肽具有扩展这些酶与天然存在的野生型褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶(SEQ ID NO:2)相比的功能性和活性范围的改良的性质。改进的羧酸酯酶性质包括但不限于：溶剂稳定性、酶促活性、区域特异性、立体选择性、降低的宿主细胞毒性、热稳定性、pH稳定性、底物范围和/或降低的底物抑制或产物抑制。本发明还提供了已经被改进以促进期望的多肽在非天然宿主生物体(例如，大肠杆菌)中表达的多核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供的羧酸酯酶多肽具有扩展这些酶与天然存在的野生型嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)羧酸酯酶(SEQ ID NO:138)相比的功能性和活性范围的改良的性质。在一些情况下，这些多肽是相对于野生型结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)羧酸酯酶(SEQ ID NO:140)增强的羧酸酯酶。此外，在一些实施方案中，本发明提供了已经被改进以促进期望的多肽在非天然宿主生物体(例如，大肠杆菌)中表达的多核苷酸。
展示的羧酸酯酶变体的改进的性质与工程化酰胺化多肽相关，所述工程化酰胺化多肽在特定的残基位置处包含与参考的褐色嗜热裂孢菌的羧酸酯酶序列或另一种参考的工程化酰胺化多肽诸如SEQ ID NO:8的序列的残基差异。在一些实施方案中，残基差异存在于以下氨基酸位置中的至少一个处：X39、X62、X63、X64、X65、X66、X68、X69、X70、X71、X77、X103、X104、X105、X107、X108、X109、X110、X111、X113、X114、X115、X117、X118、X119、X126、X147、X153、X164、X174、X181、X183、X184、X185、X186、X187、X188、X189、X190、X209、X210、X211、X212、X213、X214、X215、X216、X217、X224、X231、X249、X263、X268、X269、X270、X271、X276、X277、X278、X279、X280、X281、X282、X283、X284、X285、X286、X287、X311、X317、X320、X321、X323、X324、X331、X343、X345、X346、X349、X372、X373、X374、X376、X377、X381、X405、X416、X420、X427、X428、X429、X438、X445、X459和X470。
在一些实施方案中，本文提供的工程化羧酸酯酶的特征为与野生型多肽相比在相同的反应条件下表现出增加的热稳定性。工程化羧酸酯酶能够介导酰胺化转化(参见，下文的方案1)，如通过比起WT羧酸酯酶在更高的温度且持续更长的时间持续形成产物指示的。在一些实施方案中，工程化羧酸酯酶多肽在更高浓度的底物酯(I)和/或胺(II)诸如300mM异丁胺的存在下保持或具有增加的活性。在一些实施方案中，工程化羧酸酯酶多肽与WT羧酸酯酶相比在具有多种pH水平(例如，pH 9.0)的条件下保持或具有增加的活性。在一些实施方案中，具有增加的热稳定性、pH稳定性和/或底物稳定性的工程化多肽包含与SEQ IDNO:2和/或8的参考序列至少约80％、82％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，工程化羧酸酯酶能够相对于野生型羧酸酯酶(SEQ ID NO:2)或参考工程化羧酸酯酶(SEQ ID NO:8)的活性至少约1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、150倍、500倍或更多倍改进生物催化活性用于在合适的反应条件下将一种或更多种底物化合物转化为一种或更多种产物(参见，下文的方案1)。在一些实施方案中，酶活性的这些改进延伸至热稳定性、立体选择性、立体专一性、区域专一性、溶剂稳定性、pH稳定性和/或底物结合的相关增加，或降低的底物抑制和/或产物抑制。
在一些实施方案中，工程化羧酸酯酶的特征为对结构上有差异的多种羧酸酯(I)或胺(II)底物的活性。在一些实施方案中，工程化多肽能够以比SEQ ID NO:2的WT多肽和/或工程化多肽SEQ ID NO:8更大的速率生物催化转化酯类(N,N-二乙基氨基甘氨酸甲酯、苯甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡嗪-2-羧酸乙酯、1H-吲哚-4-羧酸乙酯、苯乙酸甲酯)和胺类(正丁胺、异丁胺、苯胺、苄胺、2,6-二甲基苯胺、叔丁胺、N’-叔丁氧羰基-苯肼、4-甲基哌啶、O-叔丁基羟胺、2,6-二甲基苯胺，或立体选择性转化(S)-(-)-α-甲基苄胺、(R)-(+)-α-甲基苄胺)为它们相应的酰胺产物。
在一些实施方案中，改进的工程化变体多肽包含对应于以下的氨基酸序列：SEQID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138或140。在一些实施方案中，本文提供的羧酸酯酶通过诱变编码工程化羧酸酯酶多肽的基因来获得，所述工程化羧酸酯酶多肽与天然存在的褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶的氨基酸序列(SEQID NO:2)至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同。
在本发明的一些另外的实施方案中，羧酸酯酶多肽变体由多核苷酸或在高度严格的条件下杂交以产生这样的多核苷酸的多核苷酸编码，如本文提供的。在一些实施方案中，多核苷酸包含可用于编码的工程化羧酸酯酶的表达的启动子和其他调控元件，并且可以使用为特定表达系统优化的密码子。
在一些实施方案中，编码改进的羧酸酯酶的多核苷酸包含选自以下的序列：SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137和139。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了包含本文提供的多核苷酸和/或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是褐色嗜热裂孢菌，而在一些可选的实施方案中，它们是其他生物体(例如，大肠杆菌)。宿主细胞可用于表达编码的多核苷酸以产生工程化羧酸酯酶，以及分离本文描述的工程化羧酸酯酶。在一些实施方案中，宿主细胞可用于将一种或更多种底物直接转化为一种或更多种期望的产物。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了用于使用本文提供的任何工程化羧酸酯酶进行反应方案1(下文示出)的方法。在一些实施方案中，方法包括在用于将底物转化为相应的酰胺产物的合适的反应条件下，使羧酸酯(I)和胺(II)底物与本发明的工程化羧酸酯酶多肽接触或一起孵育，从而将底物转化为产物化合物。不论用全细胞、细胞提取物或纯化的羧酸酯酶实施所述方法，单一羧酸酯酶可以被使用或可选地，至少两种羧酸酯酶的混合物可以被使用。
方案1
本发明的工程化羧酸酯酶能够将羧酸酯(方案1，I)和胺(II)底物的多种集合转化为它们相应的酰胺产物(III)。当考虑式(I)的R1和R2时，可得的羧酸酯底物的范围可以是详细的。在一些实施方案中，R1和R2处的基团的官能性包括多种组分，从氢原子至烷基、烯基、炔基、烷氧基、羧基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、羧基烷基、氨基烷基、卤代烷基、烷基硫代烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、杂环烷基、杂芳基和杂芳基烷基组分，除了R2不能是氢。在一些另外的实施方案中，胺(II)的R3和R4位置处的选择的官能性由氢原子、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羧基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、羧烷基、氨基烷基、卤代烷基、烷基硫代烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、杂环烷基、杂芳基和杂芳基烷基组成。在一些其他实施方案中，选择的R1和R2可以被连接以形成3元至10元环，但注意R3和R4处的基团单独地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、羧基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、羧烷基、氨基烷基、卤代烷基、烷基硫代烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基，并且还可以被连接以形成3元至10元环；并且任选地，R1或R2可以经由与R3或R4相连的烷基、烯基、炔基、烷氧基、羧基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、羧基烷基、氨基烷基、卤代烷基、烷基硫代烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、杂环烷基、杂芳基或杂芳基烷基连接。酰胺化过程以化合物(I)和式(II)的化合物进行，
其中R1和R2如上文定义的，
其中R3和R4如上文定义的，并且工程化多肽在合适的反应条件下具有酰胺化活性。在本文提供的反应方法的一些实施方案中，本文展示的WT褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶(SEQID NO:2)或参考工程化多肽(例如，SEQ ID NO:8)、羧酸酯酶衍生物能够产生匹配通式(III)的伯酰胺和仲酰胺。本文提供的工程化酰胺化酶(例如，偶数编号的序列标识符SEQID NO:4-136的工程化羧酸酯酶多肽)可用作上文的反应(方案1)的生物催化剂。
定义
参考本发明，本文的描述中使用的技术和科学术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有具体定义。因此，以下术语意图具有以下含义。本文引用的所有美国专利和公布的美国专利申请，包括这样的专利和专利申请内公开的所有序列被明确地通过引用并入。除非另有指示，本发明的实践包括分子生物学、发酵、微生物学和相关领域中通常使用的常规技术，这些技术是本领域技术人员已知的。除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料可以被用于实践或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。实际上，不意图本发明受限于本文描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以根据使用它们的环境而变化。本文提供的标题不限制本发明的多个方面或实施方案。
尽管如此，为了便于理解本发明，下文定义了许多术语。数值范围包括限定该范围的数值。因此，本文公开的每个数值范围意图涵盖落在这样的较宽数值范围内的每个较窄数值范围，如同这样的较窄数值范围在本文被全部明确地书写。还意图本文公开的每个最大的(或最小的)数值限制包括每个较低(或较高)的数值限制，如同这样的较低(或较高)数值限制在本文被明确地书写。
如本文使用的，术语“包含(comprising)”及其同源词以其包含性意义被使用(即，等同于术语“包括(including)”和其相应的同源词)。
如在本文和在所附权利要求中使用的，单数的“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文有清楚指示。因此，例如提及“宿主细胞”包括多于一个这样的宿主细胞。
除非另有指示，分别地，核酸以5’至3’方向从左向右书写，而氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。
本文提供的标题不是对可以通过整体参考说明书而获得的本发明的多个方面或实施方案的限制。因此，下文定义的术语通过整体参考说明书被更充分地定义。
如本文使用的，“羧酸酯酶”被定义为天然具有针对羧酸酯水解(引起有机酸和醇的形成)的催化活性的酶。
如本文使用的，“酰胺化”或酰胺合成是指产生酰胺键、得到甲酰胺(有机酰胺)的过程。
如本文使用的，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，是指通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，而不论长度或翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、脂质化、豆蔻酰化(myristilation)、泛素化等)。此定义内包括D-氨基酸和L-氨基酸以及D-氨基酸和L-氨基酸的混合物。
如本文使用的，“多核苷酸”和“核酸”是指共价连接在一起的两个或更多个核苷。多核苷酸可以完全包括核糖核苷(即，RNA)、完全包括2’脱氧核糖核苷酸(即，DNA)或核糖核苷和2’脱氧核糖核苷的混合物。虽然核苷将通常经由标准磷酸二酯键连接在一起，但多核苷酸可以包括一个或更多个非标准连接。多核苷酸可以是单链或双链的，或者可以包括单链区域和双链区域二者。此外，虽然多核苷酸将通常包括天然存在的编码核苷碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)，但它可以包括一种或更多种修饰的和/或合成的核苷碱基(例如，肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤等)。在本发明的一种实施方案中，这样的修饰的或合成的核苷碱基将是编码核苷碱基。
如本文使用的，“编码序列”是指编码蛋白质的氨基酸序列的核酸部分(例如，基因)。
如本文使用的，“天然存在的”、“野生型”和“WT”是指自然界中发现的形式。例如，天然存在的或野生型多肽或多核苷酸序列是存在于可以从自然界中的来源分离的生物体中并且尚未被人工操作有意修饰的序列。
如本文使用的，当本发明中关于(例如细胞、核酸或多肽)使用时，“非天然存在”或“工程化”或“重组”是指一种物质或相应于该物质的天然(natural)或天然(native)形式的物质，其已经以自然界中原本不存在的方式修饰，或与其相同但产生或源自合成物质和/或通过使用重组技术被操作。非限制性实例包括，除其他以外，表达天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因或表达原本以不同水平表达的天然基因的重组细胞。
如本文使用的，“序列同一性百分比”、“同一性百分比”和“相同百分比”是指多核苷酸序列或多肽序列之间的比较，并且通过在比较窗上比较两个最佳比对序列来确定，其中与参考序列相比，比较窗中多核苷酸或多肽序列的部分可以包括添加或缺失(即，空位)，用于两个序列的最佳比对。百分比通过如下计算：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基或者核酸碱基或氨基酸残基与空位比对的位置的数目，以产生匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。确定最佳比对和序列同一性百分比使用BLAST和BLAST 2.0算法来进行(参见，例如，Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410[1990]；和Altschul等,Nucleic AcidsRes.3389-3402[1977])。用于进行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站公共可得。
简而言之，BLAST分析包括首先通过鉴定查询序列内长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当所述短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某种赋正值的阀值评分T。T被称为相邻字评分阈值(Altschul等,上文)。这些最初的邻近字击中(word hit)用作启动检索的种子以找到包含它们的更长HSP。然后字击中沿着每个序列的两个方向延伸直到累积比对评分不能增加的程度。对于核苷酸序列，累积评分使用参数M(对于匹配残基对的奖励评分；永远＞0)和N(对于错配残基的惩罚评分；永远＜0)计算。对于氨基酸序列，评分矩阵被用于计算累积评分。当以下情况时，字击中在每一个方向上的延伸被终止：累积比对评分从其最大达到值下降了量X；由于累积一个或更多个负评分残基比对，累积评分达到0或以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下作为默认项：字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为默认项：字长(W)为3、期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff,Proc Natl AcadSci USA 89:10915[1989])。
许多其他算法是可得的和本领域已知的，这些算法在提供两个序列的同一性百分比方面与BLAST起相似作用。用于比较的序列的最佳比对可以使用本领域已知的任何合适方法(例如，通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482[1981]的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443[1970]的同源性比对算法；通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988]的相似性方法的搜索；和/或通过这些算法的计算机化实现[GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA]，或通过目视检查，使用本领域通常已知的方法进行。另外地，序列比对和序列同一性百分比的确定可以使用所提供的默认参数，使用GCG Wisconsin软件包(Accelrys,Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序。
如本文使用的，“参考序列”是指另一序列被与之比较的定义的序列。参考序列可以是更大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的区段(segment)。通常，参考序列为至少20个核苷酸或氨基酸残基长、至少25个残基长、至少50个残基长，或核酸或多肽的全长。因为两个多核苷酸或多肽可以各自(1)包含两个序列之间相似的序列(即，完整序列的一部分)并且(2)还可以包含两个序列之间趋异的(divergent)序列，两个(或更多个)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过在比较窗上比较两个多核苷酸的序列来鉴定和比较局部区域的序列相似性来进行。术语“参考序列”不意图受限于野生型序列，并且可以包括工程化序列或改变的序列。例如，在一些实施方案中，“参考序列”可以是先前工程化或改变的氨基酸序列。
如本文使用的，“比较窗”是指至少约20个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念性区段(conceptual segment)，其中序列可以与至少20个连续核苷酸或氨基酸的参考序列比较，并且其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，序列在比较窗中的部分可以包含20％或更少的添加或缺失(即，空位)用于两个序列的最佳比对。比较窗可以长于20个连续残基，并且包括任选地30个、40个、50个、100个或更长的窗。
如本文使用的，当在给定的氨基酸或多核苷酸序列的编号的情况下使用时，“对应于”、“参考”和“相对于”是指当给定的氨基酸或多核苷酸序列与参考序列相比时指定的参考序列的残基的编号。换言之，给定聚合物的残基数目或残基位置关于参考序列被指定，而不是通过给定氨基酸或多核苷酸序列内残基的实际数字位置被指定。例如，给定氨基酸序列，诸如工程化羧酸酯酶的氨基酸序列可以通过引入空位来与参考序列比对以优化两个序列之间的残基匹配。在这些情况下，尽管存在空位，在给定氨基酸或多核苷酸序列中残基的编号关于与其已经比对的参考序列做出。如本文使用的，如下文进一步描述的对残基位置诸如“Xn”的提及，将被理解为指“对应于…的残基”，除非另有特别说明。因此，例如“X94”是指多肽序列(例如，SEQ ID NO:2、4、10、26或42)中位置94处的任何氨基酸。
如本文使用的，“立体选择性”是指一种立体异构体相对于另一种立体异构体或立体异构体的另一集合在化学或酶促反应中的优先形成。立体选择性可以是部分的，其中一种立体异构体的形成优于另一种，或它可以是完全的，其中仅形成一种立体异构体。当立体异构体是对映异构体时，立体选择性被称为对映选择性，即两种对映异构体的总和中一种对映异构体的分数(通常报告为百分比)。它在本领域中通常可选择地报告为根据以下的式从中计算的对映异构过量(e.e.)(通常为百分比)：[主要对映异构体-次要对映异构体]/[主要对映异构体+次要对映体]。当立体异构体是非对映异构体时，立体选择性被称为非对映选择性，即两种非对映异构体的混合物中一种非对映异构体的分数(通常报告为百分比)，通常可选择地报告为非对映异构过量(d.e.)。对映异构过量和非对映过量是立体异构过量的类型。还将理解，立体选择性不限于单一立体异构体，并且可以用立体异构体的集合来描述。
如本文使用的，“高度立体选择性”是指能够以至少约75％的立体异构过量将底物转化成其相应的手性酰胺产物的化学或酶促反应。
如本文使用的，“增加的酶促活性”和“增加的活性”是指工程化酶的改进的特性，其可以通过与参考酶相比，比活性(例如，产生的产物/时间/重量蛋白)的增加或底物向产物的转化百分比(例如，使用指定量的羧酸酯酶，在指定时间段内起始量的底物向产物的转化百分比)的增加来表示。在实施例中提供了确定酶活性的示例性方法。可以影响与酶活性相关的任何性质，包括经典的酶性质Km、Vmax或kcat，其变化可以导致增加的酶促活性。羧酸酯酶活性可以通过用于测量羧酸酯酶的标准测定中的任何一种来测量，诸如底物或产物浓度的变化。酶活性的比较使用定义的酶制品、在设定条件下定义的测定和一种或更多种定义的底物进行，如本文进一步详细描述的。通常，当比较细胞裂解物中的酶时，确定细胞的数目和测定的蛋白质的量，以及使用相同的表达系统和相同的宿主细胞以使由宿主细胞产生并且存在于裂解物中的酶的量的变化最小化。
如本文使用的，“转化”是指将底物酶促转化成相应产物。
如本文使用的，“转化百分比”是指在指定的条件下在一个时间段内转化成产物的底物的百分比。因此，例如，羧酸酯酶多肽的“酶促活性”或“活性”可以表示为底物向产物的“转化百分比”。
如本文使用的，“区域特异性”是指其中在其他异构体理论上也可能时一种结构异构体排他地产生的化学反应。
如本文使用的，“热稳定的(thermostable)”或“热稳定的(thermal stable)”可互换地使用，是指与未处理的酶相比，在暴露于一组温度条件(例如40-80℃)一段时间(例如0.5-24小时)时对失活耐受，因此在暴露于升高的温度后保持某一水平的残留活性(例如，多于例如60％至80％)。
如本文使用的，“溶剂稳定的”是指与未处理的酶相比，多肽在暴露于不同浓度(例如5％-99％)的溶剂(例如异丙醇、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、甲苯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚等)一段时间(例如0.5-24小时)后，维持相似活性(例如，多于例如60％至80％)的能力。
如本文使用的，“氨基酸差异”或“残基差异”是指多肽序列的一个位置处的氨基酸残基相对于参考序列中对应位置处的氨基酸残基的差异。本文中氨基酸差异的位置通常被称为“Xn”，其中n是指残基差异所基于的参考序列中的对应位置。例如，“与SEQ ID NO:2相比在位置X40处的残基差异”是指在对应于SEQ ID NO:2的位置40的多肽位置处的氨基酸残基的差异。因此，如果SEQ ID NO:2的参考多肽在位置40处具有组氨酸，那么“与SEQ ID NO:2相比在位置X40处的残基差异”是指在对应于SEQ ID NO:2的位置40的多肽位置处除组氨酸以外的任何残基的氨基酸取代。在本文的大多数情况下，在一个位置处的特定氨基酸残基差异指示为“XnY”，其中“Xn”指定如上文描述的对应位置，并且“Y”是见于工程化多肽的氨基酸的单字母标识符(即，与参考多肽中的不同的残基)。在一些情况下，本发明还提供了由常规符号“AnB”表示的特定氨基酸差异，其中A是参考序列中的残基的单字母标识符，“n”是参考序列中的残基位置的编号，并且B是工程化多肽的序列中残基取代的单字母标识符。在一些情况下，本发明的多肽可以包括相对于参考序列的至少一个氨基酸残基差异，其由其中相对于参考序列存在残基差异的一列指定位置指示。在一些实施方案中，当多于一个氨基酸可以在多肽的指定残基位置中使用时，可以使用的多种氨基酸残基由“/”隔开(例如X192A/G)。本发明包括包含至少一个氨基酸差异的工程化多肽序列，所述氨基酸差异包括保守性氨基酸取代和非保守性氨基酸取代之一或二者。包括于本发明的序列表中的特定重组羧酸酯酶多肽的氨基酸序列包括起始甲硫氨酸(M)残基(即，M代表残基位置1)。然而，技术人员理解，该起始甲硫氨酸残基可以通过诸如宿主细胞中或体外翻译系统中的生物加工机制去除，以产生缺乏起始甲硫氨酸残基但在其他方面保持酶的性质的成熟蛋白质。因此，如本文使用的，术语“相对于SEQ ID NO:2在位置Xn处的氨基酸残基差异”可以指位置“Xn”或已经被加工以使起始甲硫氨酸缺乏的参考序列中的对应位置(例如，位置(X-1)n)。
如本文使用的，措辞“保守氨基酸取代”是指具有相似侧链的残基的可互换性，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别内的氨基酸取代多肽中的氨基酸。通过举例且非限制性的方式，在一些实施方案中，具有脂肪族侧链的氨基酸被另一个脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)取代；具有羟基侧链的氨基酸被另一个具有羟基侧链的氨基酸(例如，丝氨酸和苏氨酸)取代；具有芳香族侧链的氨基酸被另一个具有芳香族侧链的氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)取代；具有碱性侧链的氨基酸被另一个具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸和精氨酸)取代；具有酸性侧链的氨基酸被另一个具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)取代；和/或疏水性氨基酸或亲水性氨基酸分别被另一个疏水性氨基酸或亲水性氨基酸取代。任何氨基酸或残基的适当分类对于本领域专业人员将是明显的，特别是按照本文提供的详细描述的发明。示例性保守取代在表1中提供。
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如本文使用的，措辞“非保守取代”是指用具有显著差异的侧链性质的氨基酸取代多肽中的氨基酸。非保守取代可以使用定义的组之间而非定义的组之内的氨基酸，并影响(a)取代(例如，用脯氨酸取代甘氨酸)的区域中肽骨架的结构，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。通过举例且非限制性的方式，示例性非保守取代可以是用碱性氨基酸或脂肪族氨基酸取代酸性氨基酸；用小氨基酸取代芳香族氨基酸；和用疏水性氨基酸取代亲水性氨基酸。
如本文使用的，“缺失”是指通过从参考多肽去除一个或更多个氨基酸来修饰多肽。缺失可以包括去除1个或更多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸或者20个或更多个氨基酸、上至构成多肽的氨基酸的总数目的10％或上至构成多肽的氨基酸的总数目的20％，同时保持酶促活性和/或保持工程化酶的改进的性质。缺失可以涉及多肽的内部部分和/或末端部分。在多种实施方案中，缺失可以包括连续的区段，或可以是不连续的。
如本文使用的，“插入”是指通过将一个或更多个氨基酸添加至参考多肽来修饰多肽。在一些实施方案中，改进的工程化羧酸酯酶包括将一个或更多个氨基酸插入天然存在的羧酸酯酶多肽，以及将一个或更多个氨基酸插入工程化羧酸酯酶多肽。插入可以在多肽的内部部分中，或至羧基或氨基末端。如本文使用的，插入包括如本领域已知的融合蛋白。插入可以是氨基酸的连续区段，或由天然存在的多肽中的一个或更多个氨基酸隔开。
术语“氨基酸取代集”或“取代集”是指与参考序列相比，多肽序列中的一组氨基酸取代。取代集可以具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，取代集是指存在于实施例中提供的表格中所包括的变体羧酸酯酶的任一个中的氨基酸取代集。
如本文使用的，“片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失，但其中剩余的氨基酸序列与序列中的对应位置相同的多肽。片段通常可以具有全长羧酸酯酶多肽例如SEQ IDNO:4的多肽的约80％、约90％、约95％、约98％或约99％。在一些实施方案中，片段是“有生物活性的”(即，它表现出与全长序列相同的酶促活性)。
在本文可互换使用的“功能片段”或“生物活性片段”是指如下多肽：所述多肽具有一个或更多个氨基末端缺失和/或羧基末端缺失和/或内部缺失，但其中剩余的氨基酸序列与和它相比的序列(例如，本发明的全长工程化褐色嗜热裂孢菌酶)中的对应位置相同，并且保持全长多肽的基本上全部的活性。
如本文使用的，“分离的多肽”是指与天然伴随它的其他污染物(例如蛋白、脂质和多核苷酸)基本上分离的多肽。该术语包括已经从其天然存在的环境或表达系统(例如，宿主细胞或体外合成中)取出或纯化的多肽。改进的羧酸酯酶可以存在于细胞内、存在于细胞培养基中，或以多种形式诸如裂解物或分离的制品制备。因此，在一些实施方案中，本发明的工程化羧酸酯酶多肽可以是分离的多肽。
如本文使用的，“基本上纯的多肽”是指如下组合物，其中多肽物类为存在的优势物类(即，在摩尔或重量基础上，它比组合物中的任何其他单独的大分子物类更丰富)，并且当目标物类构成存在的大分子物类的按摩尔或％重量计至少约50％时通常为基本上纯化的组合物。通常，基本上纯的工程化羧酸酯酶多肽组合物将包括所有大分子物类的以存在于组合物中的摩尔或％重量计约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多或约99％。溶剂物类、小分子(<500道尔顿)和元素离子物类不被认为是大分子物类。在一些实施方案中，分离的改进的羧酸酯酶多肽是基本上纯的多肽组合物。
如本文使用的，当关于核酸或多肽使用时，术语“异源”是指通常不由生物体(例如，野生型生物体)表达并且分泌的序列。在一些实施方案中，该术语涵盖包含两个或更多个子序列的序列，发现所述子序列彼此之间的关系与在自然界中通常发现的关系不同，或所述序列被重组工程化使得其表达水平或与细胞中的其他核酸或其他分子的物理关系或结构不是自然界中通常发现的。例如，异源的核酸通常通过重组方式产生，具有以自然界中未发现的方式排列的来自不相关的基因的两个或更多个序列(例如，本发明的核酸开放阅读框(ORF)可操作地连接至被插入到表达盒诸如载体中的启动子序列)。在一些实施方案中，“异源多核苷酸”是指通过实验室技术引入宿主细胞中的任何多核苷酸，并且包括从宿主细胞中取出、经历实验室操作并且然后再引入宿主细胞中的多核苷酸。
如本文使用的，“密码子优化的”是指编码蛋白质的多核苷酸的密码子向特定生物体中偏好使用的那些密码子的改变，使得编码的蛋白质在感兴趣的生物体中有效地表达。在一些实施方案中，编码羧酸酯酶的多核苷酸可以经密码子优化用于优化从选择用于表达的宿主生物体的产生。
如本文使用的，“控制序列”在本文中被定义为包括对本发明的多核苷酸和/或多肽的表达是必需或有益的所有组分。每个控制序列对于感兴趣的多核苷酸可以是天然的或外源的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。
如本文使用的，“可操作地连接的”在本文被定义为如下配置：其中控制序列被适当放置(即，以功能关系)在相对于感兴趣的多核苷酸的位置处，使得控制序列指导或调控感兴趣的多核苷酸和/或多肽的表达。
如本文使用的，“合适的反应条件”是指生物催化反应溶液中的那些条件(例如酶载量的范围、底物载量、温度、pH、缓冲液、共溶剂等)，在所述条件下，本发明的羧酸酯酶多肽能够将底物化合物转化成产物化合物(例如，将一种化合物转化成另一种化合物)。在本发明中提供了并且通过实施例说明了示例性的“合适的反应条件”。
如本文使用的，诸如“化合物载量”、“酶载量”或“底物载量”中的“载量”是指在反应开始时反应混合物中组分的浓度或量。
如本文使用的，在生物催化剂介导的过程的情况中，“底物”是指生物催化剂所作用的化合物或分子。
如本文使用的，在生物催化剂介导的过程的情况中，“产物”是指由生物催化剂的作用得到的化合物或分子。
如本文使用的，如本文使用的“平衡”是指在化学或酶促反应(例如，两种物质A和B的相互转化)中得到稳定状态浓度的化学物类的过程，包括立体异构体的相互转化，如通过化学或酶促反应的正向速率常数和逆向速率常数确定的。
如本文使用的，“烷基”是指具有从1至18个碳原子(包括端点)的，直链的或支链的，更优选地从1个至8个碳原子(包括端点)，并且最优选地1个至6个碳原子(包括端点)的饱和烃基团。具有指定数目的碳原子的烷基在括号中表示(例如，(C1-C4)烷基是指1个至4个碳原子的烷基)。
如本文使用的，“烯基”是指具有从2个至12个碳原子(包括端点)的、直链或支链的、包含至少一个双键但任选地包含多于一个双键的基团。
如本文使用的，“炔基”是指具有从2个至12个碳原子(包括端点)的、直链或支链的、包含至少一个三键但任选地包含多于一个三键，并且另外任选地包含一个或更多个双键键合部分的基团。
如本文使用的，“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”是指其中一个或更多个碳原子各自独立地被相同或不同的杂原子或杂原子基团替代的如本文定义的烷基、烯基和炔基。可以替代碳原子的杂原子和/或杂原子基团包括但不限于-O-、-S-、-S-O-、-NRα-、-PH-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)NRα-、-S(O)2NRα-等，包括其组合，其中每个Rα独立地选自氢、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基。
如本文使用的，“芳氧基”是指基团–ORβ，其中Rβ是如上文定义的芳基基团，包括还如本文定义的任选地被取代的芳基基团。
如本文使用的，“芳基”是指具有单环(例如，苯基)或多个稠环(例如，萘基或蒽基)的具有从6个至12个碳原子(包括端点)的不饱和芳族碳环基团。示例性芳基包括苯基、吡啶基、萘基等。
如本文使用的，“氨基”是指基团-NH2。被取代的氨基是指基团–NHRδ、NRδRδ和NRδRδRδ，其中每个Rδ独立选自被取代的或未被取代的烷基、环烷基、环杂烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、酰基、烷氧基羰基、硫烷基、亚硫酰基、磺酰基等。经典的氨基基团包括但不限于二甲基氨基、二乙基氨基、三甲基铵、三乙基铵、甲基磺酰基氨基、呋喃基-氧基-磺氨基等。
如本文使用的，“氧代”是指＝O。
如本文使用的，“氧基”是指二价基团-O-，其可以具有多种取代基以形成不同的氧基基团，包括醚和酯。
如本文使用的，“羧基”是指-COOH。
如本文使用的，“羰基”是指-C(O)-，其可以具有多种取代基以形成不同的羰基基团，包括酸、酰基卤、醛、酰胺、酯和酮。
如本文使用的，“烷基氧基羰基”是指-C(O)ORε，其中Rε是如本文定义的烷基基团，其可以被任选地取代。
如本文使用的，“氨基羰基”是指-C(O)NH2。被取代的氨基羰基是指–C(O)NRδRδ，其中氨基基团NRδRδ是如本文定义的。
如本文使用的，“卤素(halogen)”和“卤代(halo)”是指氟、氯、溴和碘。
如本文使用的，“羟基”是指-OH。
如本文使用的，“氰基”是指-CN。
如本文使用的，“杂芳基”是指具有从1个至10个碳原子(包括端点)和1个至4个在环内的选自氧、氮和硫的杂原子(包括端点)的芳族杂环基团。这样的杂芳基基团可以具有单环(例如，吡啶基或呋喃基)或多个稠环(例如，吲嗪基(indolizinyl)或苯并噻吩基)。
如本文使用的，“杂芳基烷基”是指被杂芳基取代的烷基(即，杂芳基-烷基-基团)，优选地在烷基部分中具有从1个至6个碳原子(包括端点)并且在杂芳基部分中具有从5个至12个环原子(包括端点)。这样的杂芳基烷基基团的实例是吡啶基甲基等。
如本文使用的，“杂芳基烯基”是指被杂芳基取代的烯基(即，杂芳基-烯基-基团)，优选地在烯基部分中具有从2个至6个碳原子(包括端点)并且在杂芳基部分中具有从5个至12个环原子(包括端点)。
如本文使用的，“杂芳基炔基”是指被杂芳基取代的炔基(即，杂芳基-炔基-基团)，优选地在炔基部分中具有从2个至6个碳原子(包括端点)并且在杂芳基部分中具有从5个至12个环原子(包括端点)。
如本文使用的，“杂环”、“杂环的”和可互换的“杂环烷基”是指具有单环或多个稠环的、具有从2个至10个碳环原子(包括端点)和在环内的选自氮、硫或氧的从1个至4个杂环原子(包括端点)的饱和的或不饱和基团。这样的杂环基团可以具有单环(例如，哌啶基或四氢呋喃基)或多个稠环(例如，二氢吲哚基、二氢苯并呋喃或奎宁环基(quinuclidinyl))。杂环的实例包括但不限于呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪(quinolizine)、异喹啉、喹啉、酞嗪(phthalazine)、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑(carbazole)、咔啉(carboline)、菲啶(phenanthridine)、吖啶、菲咯啉(phenanthroline)、异噻唑、吩嗪(phenazine)、异噁唑、酚噁嗪(phenoxazine)、吩噻嗪(phenothiazine)、四氢咪唑(imidazolidine)、咪唑啉(imidazoline)、哌啶、哌嗪、吡咯烷、二氢吲哚等。
如本文使用的，“元环(membered ring)”意指包括任何环状结构。术语“元”之前的数字表示构成环的骨架原子的数目。因此，例如环己基、吡啶、吡喃和噻喃是6元环，并且环戊基、吡咯、呋喃和噻吩是5元环。
除非另有指定，在前述基团中被氢占据的位置可以用以下取代基进一步取代，所述取代基例如但不限于：羟基、氧代、硝基、甲氧基、乙氧基、烷氧基、被取代的烷氧基、三氟甲氧基、卤代烷氧基、氟、氯、溴、碘、卤代、甲基、乙基、丙基、丁基、烷基、烯基、炔基、被取代的烷基、三氟甲基、卤代烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、硫基、烷硫基、酰基、羧基、烷氧基羰基、甲酰氨基、被取代的甲酰氨基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基氨基、磺酰氨基、被取代的磺酰氨基、氰基、氨基、被取代的氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氨基烷基、酰基氨基、脒基、脒肟基(amidoximo)、羟基甲酰基(hydroxamoyl)、苯基、芳基、被取代的芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、吡啶基、咪唑基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂芳氧基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、被取代的环烷基、环烷基氧基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉代、杂环、(杂环)氧基和(杂环)烷基；并且优选的杂原子是氧、氮和硫。应理解，当在这些取代基上存在开放化合价时，它们可以进一步被烷基、环烷基、芳基、杂芳基和/或杂环基团取代，当碳上存在这些开放化合价时，它们可以进一步被卤素和被氧-、氮-或硫-键合的取代基取代，并且其中当存在多个这样的开放化合价时，这些基团可以通过直接形成键或通过与新的杂原子(优选地，氧、氮或硫)键合形成键而连接以形成环。还应理解，可以进行上文的取代，条件是用取代基替代氢不会对本发明的分子带来不可接受的不稳定性，并且在其他方面在化学上是合理的。
如本文使用的，“任选的”和“任选地”意指随后描述的事件或情形可以发生或可以不发生，并且该描述包括当事件或情形发生时的情况和其中事件或情形不发生的情况。本领域普通技术人员将理解，对于被描述为包含一个或更多个任选的取代基的任何分子，仅意在包括空间上实用的和/或合成上可行的化合物。
如本文使用的，“任选地被取代的”是指在化学基团的术语或系列中所有随后的修饰语。例如，在术语“任选地被取代的芳基烷基”中，分子的“烷基”部分和“芳基”部分可以被取代或可以不被取代，并且对于一系列“任选地被取代的烷基、环烷基、芳基和杂芳基”，烷基、环烷基、芳基和杂芳基基团彼此独立地可以被取代或可以不被取代。
如本文使用的，“保护基团”是指当附接至分子中的反应性官能团时掩蔽、降低或阻止官能团的反应性的一组原子。通常地，保护基团可以在合成的过程期间如期望的被选择性地去除。保护基团的实例是本领域熟知的。可以具有保护基团的官能团包括但不限于羟基、氨基和羧基基团。代表性氨基保护基团包括但不限于甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苄基、苄基氧基羰基(“CBZ”)、叔丁氧基羰基(“Boc”)、三甲基甲硅烷基(“TMS”)、2-三甲基甲硅烷基-乙烷磺酰基(“SES”)、三苯甲基和取代的三苯甲基基团、烯丙基氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(“FMOC”)、硝基-藜芦基氧基羰基(“NVOC”)等。代表性羟基保护基团包括但不限于其中羟基基团被酰化的那些(例如，甲基和乙基酯、乙酸酯或丙酸酯基团或乙二醇酯)或其中羟基基团被烷基化的那些，诸如苄基和三苯甲基醚，以及烷基醚、四氢吡喃基醚、三烷基甲硅烷基醚(例如，TMS或TIPPS基团)和烯丙基醚。其他保护基团可以见于本文描述的参考文献。
工程化羧酸酯酶多肽
本发明提供了可用于酰胺化反应的具有羧酸酯酶活性的工程化多肽(本文也称为“工程化羧酸酯酶多肽”)。因此，在一方面，本发明提供了具有羧酸酯酶活性，能够如在实施例3中的表3.1中示出的将一种或更多种底物化合物转化成一种或更多种产物化合物的工程化多肽。另外，本发明提供了编码工程化多肽的多核苷酸、包含多核苷酸的相关载体和宿主细胞、用于制备工程化多肽的方法、以及用于使用工程化多肽的方法，包括合适的反应条件。
本发明的工程化多肽是被工程化为与褐色嗜热裂孢菌的野生型羧酸酯酶多肽(GenBank Acc.No.WP_011292850.1；SEQ ID NO:2)相比具有改进的酶性质(例如，增加的立体选择性)的非天然存在的羧酸酯酶。在一些实施方案中，本文提供的多种工程化羧酸酯酶多肽与本文提供的其他工程化参考羧酸酯酶多肽相比表现出改进的酶性质。在一些实施方案中，本发明的工程化多肽是被工程化为与嗜热脂肪地芽孢杆菌的野生型羧酸酯酶多肽(GenBank Acc.No.WP_033015113；SEQ ID NO:138)相比具有改进的酶性质(例如，增加的热稳定性)的非天然存在的羧酸酯酶。在一些其他实施方案中，工程化多肽是被工程化为与结核分枝杆菌的野生型羧酸酯酶多肽(GenBank Acc.No.WP_003407276；SEQ ID NO:140)相比具有改进的酶性质(例如，增加的热稳定性)的非天然存在的羧酸酯酶。
在一些实施方案中，本文提供的工程化羧酸酯酶变体包含与SEQ ID NO:2、参考工程化羧酸酯酶(SEQ ID NO:8)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中工程化羧酸酯酶在多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些实施方案中，具有羧酸酯酶活性的工程化多肽包括具有本文提供的氨基酸取代的多肽(参见，例如，表8.1和表11.1)。
本发明提供了包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽序列的工程化羧酸酯酶或其功能片段，其中工程化羧酸酯酶在其多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的位置处的取代：39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438和470，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:2来编号。在一些另外的实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的取代：39/323、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、153、153/215、164/271、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224/268/372、249/284、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、372、372/376、373、376、377、405、420、427、428和429，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些另外的实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的取代：39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、190H、190K、
190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428V和429L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:2来编号。在一些其他实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的取代：T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428V和A429L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些实施方案中，工程化羧酸酯酶包含位置282处的取代，其中位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些其他实施方案中，位置282处的取代是脂肪族的、非极性的、碱性的、极性的或芳香族的。在又一些另外的实施方案中，取代选自：X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282T和X282R。
本发明还提供了包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽序列的工程化羧酸酯酶或其功能片段，其中工程化羧酸酯酶在多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的位置处的取代：63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、
63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、
215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373和377，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些其他实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的取代：63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/280G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189I/320W/377I、189I/343V、189I/377I、189L、189Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373G和377L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些其他实施方案中，多肽序列中的至少一个取代或取代集包括选自以下的取代：P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M189I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M189Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373G和F377L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。
在一些实施方案中，本发明还提供了包含本文描述的任何工程化羧酸酯酶多肽的片段的工程化羧酸酯酶多肽，所述任何工程化羧酸酯酶多肽的片段保持该工程化羧酸酯酶多肽的功能羧酸酯酶活性和/或改进的性质。因此，在一些实施方案中，本发明提供了具有羧酸酯酶活性(例如，能够在合适的反应条件下将底物转化成产物)的多肽片段，其中该片段包含本发明的工程化多肽的全长氨基酸序列的至少约80％、90％、95％、98％或99％，本发明的工程化多肽诸如具有SEQ ID NO:2-136的偶数编号的序列标识符的示例性工程化多肽。
在一些实施方案中，本发明的工程化羧酸酯酶多肽包含与本文描述的工程化羧酸酯酶多肽序列中的任一个相比包含至少一个缺失、添加和/或取代的氨基酸序列，本文描述的工程化羧酸酯酶多肽序列诸如具有SEQ ID NO:2-136的偶数编号的序列标识符的示例性工程化多肽序列。因此，对于本发明的工程化羧酸酯酶多肽的每个和每一个实施方案，氨基酸序列可以包括1个或更多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、3个或更多个氨基酸、4个或更多个氨基酸、5个或更多的氨基酸、6个或更多个氨基酸、8个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸或20个或更多个氨基酸、上至羧酸酯酶多肽的氨基酸的总数目的10％、上至羧酸酯酶多肽的氨基酸的总数目的20％或上至羧酸酯酶多肽的氨基酸的总数目的30％的缺失、添加和/或取代，其中本文描述的工程化羧酸酯酶的相关的功能活性和/或改进的性质被保持。在一些实施方案中，缺失、添加和/或取代可以包括氨基酸残基的1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个、1-15个、1-20个、1-21个、1-22个、1-23个、1-24个、1-25个、1-30个、1-35个、1-40个、1-45个、1-50个、1-55个或1-60个缺失、添加和/或取代。在一些实施方案中，缺失、添加和/或取代的数目可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个或60个氨基酸残基。在一些实施方案中，缺失、添加和/或取代可以包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、18个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或30个氨基酸残基的缺失、添加和/或取代。
在一些实施方案中，本发明提供了一种具有与本文描述的工程化羧酸酯酶多肽序列中的任一个相比包含插入的氨基酸序列的工程化羧酸酯酶多肽，本文描述的工程化羧酸酯酶多肽序列诸如具有SEQ ID NO:2-136的偶数编号的序列标识符的示例性工程化多肽序列。因此，对于本发明的羧酸酯酶多肽的每个和每一个实施方案，插入可以包括一个或更多个氨基酸、2个或更多个氨基酸，3个或更多个氨基酸、4个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、6个或更多个氨基酸、8个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸或20个或更多个氨基酸，其中本文描述的工程化羧酸酯酶的相关功能活性和/或改进的性质被保持。插入可以是在羧酸酯酶多肽的氨基或羧基末端，或内部部分。
在一些实施方案中，本发明的多肽可以是融合多肽的形式，其中工程化多肽与其他多肽，诸如，以举例且非限制的方式，抗体标签(例如，myc表位)、纯化序列(例如，用于与金属结合的His标签)和细胞定位信号(例如，分泌信号)融合。因此，本文描述的工程化多肽可以与其他多肽融合或不融合使用。
本文描述的工程化羧酸酯酶多肽不限于遗传编码的氨基酸。因此，除了遗传编码的氨基酸之外，本文描述的多肽可以整体或部分地包括天然存在的和/或合成的非编码氨基酸。本文描述的多肽可以包含的某些常见的非编码氨基酸包括但不限于：遗传编码氨基酸的D-立体异构体；2,3-二氨基丙酸(Dpr)；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly或Sar)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(Bua)；叔丁基甘氨酸(Bug)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；萘基丙氨酸(Nal)；2-氯苯丙氨酸(Ocf)；3-氯苯丙氨酸(Mcf)；4-氯苯丙氨酸(Pcf)；2-氟苯丙氨酸(Off)；3-氟苯丙氨酸(Mff)；4-氟苯丙氨酸(Pff)；2-溴苯丙氨酸(Obf)；3-溴苯丙氨酸(Mbf)；4-溴苯丙氨酸(Pbf)；2-甲基苯丙氨酸(Omf)；3-甲基苯丙氨酸(Mmf)；4-甲基苯丙氨酸(Pmf)；2-硝基苯丙氨酸(Onf)；3-硝基苯丙氨酸(Mnf)；4-硝基苯丙氨酸(Pnf)；2-氰基苯丙氨酸(Ocf)；3-氰基苯丙氨酸(Mcf)；4-氰基苯丙氨酸(Pcf)；2-三氟甲基苯丙氨酸(Otf)；3-三氟甲基苯丙氨酸(Mtf)；4-三氟甲基苯丙氨酸(Ptf)；4-氨基苯丙氨酸(Paf)；4-碘代苯丙氨酸(Pif)；4-氨基甲基苯丙氨酸(Pamf)；2,4-二氯苯丙氨酸(Opef)；3,4-二氯苯丙氨酸(Mpcf)；2,4-二氟苯丙氨酸(Opff)；3,4-二氟苯丙氨酸(Mpff)；吡啶-2-基丙氨酸(2pAla)；吡啶-3-基丙氨酸(3pAla)；吡啶-4-基丙氨酸(4pAla)；萘-1-基丙氨酸(1nAla)；萘-2-基丙氨酸(2nAla)；噻唑基丙氨酸(taAla)；苯并噻吩基丙氨酸(bAla)；噻吩基丙氨酸(tAla)；呋喃基丙氨酸(fAla)；高苯丙氨酸(hPhe)；高酪氨酸(hTyr)；高色氨酸(hTrp)；五氟苯丙氨酸(5ff)；苯乙烯基丙氨酸(styrylkalanine)(sAla)；蒽基丙氨酸(aAla)；3,3-二苯基丙氨酸(Dfa)；3-氨基-5-苯基戊酸(Afp)；青霉胺(Pen)；1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(Mso)；N(w)-硝基精氨酸(nArg)；高赖氨酸(hLys)；膦酰基甲基苯丙氨酸(pmPhe)；磷酸丝氨酸(pSer)；磷酸苏氨酸(pThr)；高天冬氨酸(hAsp)；高谷氨酸(hGlu)；1-氨基环戊-(2或3)-烯-4-羧酸；哌可酸(PA)；氮杂环丁烷-3-羧酸(ACA)；1-氨基环戊烷-3-羧酸；烯丙基甘氨酸(aOly)；炔丙基甘氨酸(pgGly)；高丙氨酸(hAla)；正缬氨酸(nVal)；高亮氨酸(hLeu)、高缬氨酸(hVal)；高异亮氨酸(hIle)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基亮氨酸(AcLys)；2,4-二氨基丁酸(Dbu)；2,3-二氨基丁酸(Dab)；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)；高丝氨酸(hSer)；羟基脯氨酸(Hyp)和高脯氨酸(hPro)。可以构成本文描述的多肽的另外的非编码氨基酸对本领域技术人员将是明显的。这些氨基酸可以是L-构型或D-构型的。
本领域技术人员将认识到，具有侧链保护基团的氨基酸或残基还可以构成本文描述的多肽。这样的受保护氨基酸(其在本情况下属于芳香族类别)的非限制性实例包括(括号中列出保护基团)，但不限于：Arg(tos)、Cys(甲基苄基)、Cys(硝基吡啶氧硫基)、Glu(δ-苄基酯)、Gln(呫吨基)、Asn(N-δ-呫吨基)、His(bom)、His(苄基)、His(tos)、Lys(fmoc)、Lys(tos)、Ser(O-苄基)、Thr(O-苄基)和Tyr(O-苄基)。
可以构成本文描述的多肽的构象约束的非编码氨基酸包括但不限于N-甲基氨基酸(L-构型)；1-氨基环戊-(2或3)-烯-4-羧酸；哌可酸(pipecolic acid)；氮杂环丁烷-3-羧酸；高脯氨酸(hPro)和1-氨基环戊烷-3-羧酸。
如对技术人员将是明显的，前述残基位置和每个残基位置的特定氨基酸残基可以单独或以多种组合被使用，以合成具有期望的改进的性质的羧酸酯酶多肽，所述期望的改进的性质除了其他以外包括酶活性、底物/产物偏好、立体选择性、底物/产物耐受性和在多种条件下的稳定性，所述多种条件诸如增加的温度、溶剂和/或pH。
本发明的工程化羧酸酯酶多肽通过对SEQ ID NO:2的定向演化产生，用于在某些工业上相关的条件下将感兴趣的底物有效酰胺化为感兴趣的产物，并且与参考羧酸酯酶多肽相比具有一个或更多个残基差异。这些残基差异与多种酶性质的改进，特别是增加的活性、增加的溶剂耐受性和降低的对宿主细胞(诸如，大肠杆菌)的毒性相关。在一些另外的实施方案中，变体羧酸酯酶也表现出增加的立体选择性、增加的稳定性和对增加的底物和/或产物浓度的耐受性(例如，减少的产物抑制)。因此，在一些实施方案中，具有羧酸酯酶活性的工程化多肽能够在合适的条件下以相对于野生型褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶多肽(例如，SEQ ID NO:2)的活性增加至少约1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多的活性将一种或更多种底物化合物转化成一种或更多种产物。在一些实施方案中，具有羧酸酯酶活性的工程化多肽能够在合适的反应条件下在约48h、约36h、约24h或甚至更短的时间长度的反应时间中以至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的转化百分比将底物转化成产物。在一些实施方案中，具有羧酸酯酶活性的工程化多肽能够在合适的反应条件下以至少90％、95％、97％、98％、99％或更大的对映异构过量将底物转化成产物。
在一些实施方案中，具有羧酸酯酶活性的工程化多肽能够在合适的反应条件下将底物转化为产物，而相对于参考多肽(例如，SEQ ID NO:2)的底物耐受性增加对底物的存在的耐受性。因此，在一些实施方案中，工程化多肽能够在合适的反应条件下，在约72h、约48h、约36h、约24h或甚至更短的时间长度的反应时间中，在至少约1g/L、5g/L、10g/L、20g/L、约30g/L、约40g/L、约50g/L、约70g/L、约75g/L、约100g/L的底物载量浓度的存在下，以至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的转化百分比将底物转化成产物。
本文提供了一些合适的反应条件，在其下工程化多肽的上文描述的改进的性质可以关于多肽的浓度或量、底物、缓冲液、共溶剂、pH和/或包括温度和反应时间的条件来确定。在一些实施方案中，合适的反应条件包括下文和实施例中描述的测定条件。
在一些实施方案中，工程化多肽可以提供于固体支持物诸如膜、树脂、固体载体或其他固相材料上。固体支持物可以由有机聚合物诸如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯(polyethyleneoxy)和聚丙烯酰胺以及其共聚物和接枝物制成。固体支持物还可以是无机的，诸如玻璃、二氧化硅(silica)、可控孔隙玻璃(CPG)、反相二氧化硅或金属诸如金或铂。固体支持物的构型可以呈珠、球、颗粒(particle)、颗粒(granule)、凝胶、膜或表面的形式。表面可以是平面的、基本上平面的或非平面的。固体支持物可以是多孔的或无孔的，并且可以具有溶胀或非溶胀特征。固体支持物可以被配置为孔、凹陷或其他容器(container)、容器(vessel)、特征或位置的形式。
在一些实施方案中，具有羧酸酯酶活性的工程化多肽被结合或固定在固体支持物上，使得它们保持其相对于参考多肽(例如，SEQ ID NO:2)改进的性质的至少一部分。在这样的实施方案中，固定的多肽可以促进底物化合物向期望的产物的生物催化转化，并且在反应完成后容易保留(例如，通过保留其上固定有多肽的珠)并且然后在随后的反应中再使用或再循环。这样的固定化酶方法允许进一步提高效率和降低成本。因此，还预期，使用本发明的工程化羧酸酯酶多肽的任何方法可以使用结合或固定在固体支持物上的相同羧酸酯酶多肽进行。
工程化羧酸酯酶多肽可以被非共价地或共价地结合。用于将酶缀合和固定至固体支持物(例如，树脂、膜、珠、玻璃等)的多种方法是本领域熟知的。用于将酶缀合和固定至固体支持物(例如，树脂、膜、珠、玻璃等)的其他方法是本领域熟知的(参见，例如，Yi等,Proc.Biochem.,42:895-898[2007]；Martin等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,76:843-851[2007]；Koszelewski等,J.Mol.Cat.B:Enz.,63:39-44[2010]；Truppo等,Org.Proc.Res.Develop.,在线发表：dx.doi.org/10.1021/op200157c；和Mateo等,Biotechnol.Prog.,18:629-34[2002]等)。可用于固定本发明的工程化羧酸酯酶的固体支持物包括但不限于，包括具有环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有氨基环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有十八烷基官能团的苯乙烯/DVB共聚物或聚甲基丙烯酸酯的珠或树脂。可用于固定本发明的工程化羧酸酯酶的示例性固体支持物包括但不限于壳聚糖珠、Eupergit C和SEPABEAD(Mitsubishi)，包括以下不同类型的SEPABEAD：EC-EP、EC-HFA/S、EXA252、EXE119和EXE120。
在一些实施方案中，工程化羧酸酯酶多肽可以以阵列的形式提供，在所述阵列中多肽在定位上不同的位置中排列。在一些实施方案中，定位上不同的位置是固体支持物诸如96孔板中的孔。多于一种支持物可以被配置在阵列上多个位置处，所述多个位置是试剂的自动递送或通过检测方法和/或仪器可寻址的。这样的阵列可以被用于测试用于被多肽转化的多种底物化合物。
在一些实施方案中，本文描述的工程化多肽可以以试剂盒的形式提供。试剂盒中的多肽可以单独存在或作为多于一种多肽存在。试剂盒还可以包括用于进行酶促反应的试剂、用于评估多肽的活性的底物、以及用于检测产物的试剂。试剂盒还可以包括试剂分配器和试剂盒的使用说明。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括在不同可寻址位置处包含多于一种不同工程化羧酸酯酶多肽的阵列，其中不同多肽是各自具有至少一种不同的改进的酶性质的参考序列的不同变体。包含多于一种工程化多肽的这样的阵列及其使用方法是已知的(参见，例如，WO2009/008908A2)。
编码工程化羧酸酯酶的多核苷酸
在另一方面，本发明提供了编码工程化羧酸酯酶的多核苷酸。多核苷酸可以可操作地连接至控制基因表达的一个或更多个异源调控序列以产生能够表达多肽的重组多核苷酸。包含编码工程化羧酸酯酶的异源多核苷酸的表达构建体可以被引入适当的宿主细胞中以表达相应的羧酸酯酶多肽。
因为知晓对应于多种氨基酸的密码子，蛋白质序列的可得性提供了对能够编码目标的所有多核苷酸的描述。遗传密码的简并性(其中相同的氨基酸由可替代的密码子或同义密码子编码)允许制备极大数目的核酸，所有这些核酸编码本文公开的改进的羧酸酯酶。因此，鉴定了特定的氨基酸序列之后，本领域技术人员可以通过以不改变蛋白质的氨基酸序列的方式简单修改序列的一个或更多个密码子来制备任何数目的不同核酸。在此方面，本发明具体预期了通过选择基于可能的密码子选择的组合可以产生的每个和每一个可能的多核苷酸变化，并且所有这样的变化将被认为对于本文公开的任何多肽具体地公开，包括实施例中的表格中展示的氨基酸序列。在多种实施方案中，密码子被优选地选择为适应其中产生蛋白质的宿主细胞。例如，在细菌中使用的优选的密码子被用于在细菌中表达基因；在酵母中使用的优选的密码子被用于酵母中的表达；并且在哺乳动物中使用的优选的密码子被用于在哺乳动物细胞中表达。举例而言，SEQ ID NO:1的多核苷酸已经针对在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化，但另外编码褐色嗜热裂孢菌的天然存在的羧酸酯酶。
在一些实施方案中，多核苷酸编码包含选自以下的氨基酸序列的工程化羧酸酯酶多肽：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134或136。
在一些实施方案中，编码工程化羧酸酯酶或其功能片段的多核苷酸选自包含与以下至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多核苷酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137和/或139。
在一些实施方案中，多核苷酸能够在高度严格的条件下与包含以下的多核苷酸杂交：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137和/或139。
在一些实施方案中，多核苷酸编码本文描述的多肽，但在核苷酸水平与编码工程化羧酸酯酶的参考多核苷酸具有约80％或更大序列同一性、约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大序列同一性。在一些实施方案中，参考多核苷酸包括SEQ ID NO:1，而在一些其他实施方案中，参考多核苷酸包括SEQ ID NO:137。在一些其他实施方案中，参考多核苷酸序列包括SEQ ID NO:139。在一些另外的实施方案中，工程化羧酸酯酶序列包括包含被鉴定为有益的位置的序列，如实施例中描述的。
本发明还提供了编码本文提供的至少一种工程化羧酸酯酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽序列的至少一种工程化羧酸酯酶或其功能片段，其中工程化羧酸酯酶在其多肽序列中包含至少一个取代或取代集，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的位置处的取代的至少一种工程化羧酸酯酶：39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438和470，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的至少一个取代或取代集的至少一种工程化羧酸酯酶：39/323、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、153、153/215、164/271、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224/268/372、249/284、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、372、372/376、373、376、377、405、420、427、428和429，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的至少一个取代或取代集的至少一种工程化羧酸酯酶：39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、190H、190K、190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、
270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428V和429L，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些其他实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的至少一个取代或取代集的至少一种工程化羧酸酯酶：T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428V和A429L，其中氨基酸参考SEQ ID NO:2来编号。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码在位置282处包含取代的至少一种工程化羧酸酯酶，其中位置参考SEQ ID NO:2来编号。在一些其他实施方案中，位置282处的取代是脂肪族的、非极性的、碱性的、极性的或芳香族的。在又一些另外的实施方案中，取代选自X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282T和X282R。
本发明还提供了编码包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽序列的至少一种工程化羧酸酯酶或其功能片段的多核苷酸序列，其中工程化羧酸酯酶在其多肽序列中包含至少一个取代或取代集，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码在选自以下的位置处包含至少一个取代或取代集的工程化羧酸酯酶：63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373和377，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些其他实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的至少一个取代或取代集的工程化羧酸酯酶：63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/280G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189I/320W/377I、189I/343V、189I/377I、189L、189Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373G和377L，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。在一些其他实施方案中，多核苷酸序列编码包含选自以下的至少一个取代或取代集的工程化羧酸酯酶：P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M189I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、
A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M189Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373G和F377L，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:8来编号。
编码改进的羧酸酯酶多肽的分离的多核苷酸可以以多种方式被操作以提供多肽的表达。取决于表达载体，在分离的多核苷酸插入载体之前对分离的多核苷酸的操作可以是期望的或必要的。用于使用重组DNA方法改变多核苷酸和核酸序列的技术是本领域熟知的。
对于细菌宿主细胞，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子包括从大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因及原核β-内酰胺酶基因(参见，例如，Villa-Kamaroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3727-3731[1978])获得的启动子以及tac启动子(参见，例如，DeBoer等,Proc.Natl Acad.Sci.USA 80:21-25[1983])。另外的合适的启动子是本领域技术人员已知的。
对于丝状真菌宿主细胞，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适的启动子包括从米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定型α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶和尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)的基因获得的启动子，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体)，及其突变启动子、截短启动子和杂合体启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子包括但不限于来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因的那些启动子，以及其他可用于酵母宿主细胞的启动子(参见，例如，Romanos等,Yeast 8:423-488[1992])。
控制序列还可以是合适的转录终止子序列，转录终止子序列是由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列可操作地连接至编码多肽的核酸序列的3'末端。在本发明中可以使用在所选择的宿主细胞中有功能的任何终止子。
例如，用于丝状真菌宿主细胞的示例性转录终止子可以从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得。
用于酵母宿主细胞的示例性终止子可以从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得，以及本领域已知的其他可用于酵母宿主细胞的终止子(参见，例如，Romanos等,上文)。
控制序列还可以是合适的前导序列，前导序列是对由宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码多肽的核酸序列的5'末端。可以使用在所选择的宿主细胞中有功能的任何前导序列。用于丝状真菌宿主细胞的示例性前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得。用于酵母宿主细胞的合适的前导序列从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，多腺苷酸化序列是一种可操作地连接至核酸序列的3'末端的序列，并且其在转录时被宿主细胞识别为将多腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。本发明中可以使用在所选择的宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。用于丝状真菌宿主细胞的示例性多腺苷酸化序列可以来自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因，以及本领域已知的另外的可用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列(参见，例如，Guo等,Mol.Cell.Biol.,15:5983-5990[1995])。
控制序列还可以是信号肽编码区域，其编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列并且指导所编码的多肽进入细胞的分泌途径。核酸序列的编码序列的5'末端可以固有地包含信号肽编码区域，其符合翻译阅读框地(in translation reading frame)与编码分泌多肽的编码区域的区段天然地连接。可选地，编码序列的5'末端可以包含对编码序列而言外源的信号肽编码区域。当编码序列不天然地包含信号肽编码区域时可能需要外源信号肽编码区域。
可选地，外源信号肽编码区域可以单纯替换天然信号肽编码区域以增强多肽的分泌。然而，本发明中可以使用指导所表达的多肽进入所选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区域。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区域是从芽孢杆菌NClB 11837麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码区域、以及本领域已知的另外的信号肽(参见，例如，Simonen等,Microbiol.Rev.,57:109-137[1993])。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区域包括但不限于从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶和柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶的基因获得的信号肽编码区域。可用于酵母宿主细胞的信号肽可以来自酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因，以及另外的有用信号肽编码区域(参见，例如，Romanos等，1992，上文)。
控制序列还可以是编码位于多肽的氨基末端处的氨基酸序列的前肽编码区域。所得的多肽被称为酶原(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化裂解或自动催化裂解来自多肽原的前肽而被转换为成熟的活性多肽。前肽编码区域可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)乳糖酶(WO 95/33836)的基因获得。
当信号肽和前肽区域二者存在于多肽的氨基末端时，前肽区域紧邻多肽的氨基末端定位并且信号肽区域紧邻前肽区域的氨基末端定位。
添加允许相对于宿主细胞的生长调控多肽的表达的调控序列也可以是期望的。调控系统的实例为响应于化学或物理刺激物(包括调控化合物的存在)引起基因的表达被开启或关闭的那些。在原核宿主细胞中，合适的调控序列包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母宿主细胞中，合适的调控系统包括例如ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，合适的调控序列包括TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。
调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些包括在甲氨蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码本发明的羧酸酯酶多肽的核酸序列将与调控序列可操作地连接。
因此，在一些实施方案中，本发明还涉及包含编码工程化羧酸酯酶多肽或其变体的多核苷酸以及根据其将被引入的宿主的类型的一个或更多个表达调控区域诸如启动子和终止子、复制起点等的重组表达载体。上文描述的多种核酸和控制序列可以被连接在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或更多个方便的限制性位点，以允许在这样的位点处插入或取代编码多肽的核酸序列。可选地，本发明的核酸序列可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入到用于表达的适当载体中来表达。在产生表达载体时，编码序列位于载体中以使编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
所述重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可方便地进行重组DNA程序，并且可以引起多核苷酸序列的表达。载体的选择通常将取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性质粒或闭合的环状质粒。
表达载体可以是自主复制载体(即，作为染色体外实体存在的载体)，其复制独立于染色体复制(例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体)。载体可以包含用于确保自我复制的任何工具(means)。可选地，载体可以是当被引入宿主细胞时被整合进基因组中并且与其已经整合的一条或更多条染色体一起复制的载体。此外，可以使用单一载体或质粒或者一起包含待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA的两种或更多种载体或质粒，或者转座子。
本发明的表达载体优选地包含一个或更多个可选择标志物，其允许容易地选择转化的细胞。可选择标志物可以是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。细菌可选择标志物的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因或赋予抗生素抗性诸如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的标志物。用于酵母宿主细胞的合适的标志物是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。
用于在丝状真菌宿主细胞中使用的可选择的标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酸转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)及其等同物。用于在曲霉属(Aspergillus)细胞中使用的实施方案包括构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的表达载体可以包含允许将载体整合至宿主细胞的基因组中或允许载体在细胞中不依赖于基因组而自主复制的元件。为整合到宿主细胞基因组中，载体可以依赖编码多肽的核酸序列或通过同源重组或者非同源重组使载体整合到基因组中的载体的任何其他元件。
可选地，表达载体可以包含用于指导通过同源重组整合到宿主细胞的基因组中的另外的核酸序列。另外的核酸序列使载体能够在一条或更多条染色体中的一个或更多个准确位置处整合到宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应优选地包含足够数目的核酸，诸如100个至10,000个碱基对，优选地400个至10,000个碱基对，并且最优选地800个至10,000个碱基对，其与相应的靶序列高度同源以增加同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码的或编码的核酸序列。在另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体还可以包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的非限制性实例是允许在大肠杆菌中复制的P15A ori或质粒pBR322、pUC19、pACYCl77(该质粒具有P15A ori)或pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的pUB110、pE194或pTA1060的复制起点。用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米(2micron)复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。复制起点可以是具有使其在宿主细胞中的功能对温度敏感的突变的复制起点(参见，例如，Ehrlich,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1433[1978])。
本发明的核酸序列的多于一个拷贝可以被插入宿主细胞中以增加基因产物的产生。核酸序列的拷贝数的增加可以通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中，或通过在核酸序列中包括可扩增的可选择标志物基因来获得，其中包含可选择标志物基因的扩增的拷贝并且从而包含核酸序列的另外的拷贝的细胞可以通过在适当的可选择剂的存在下培养细胞来选择。
用于在本发明中使用的许多表达载体是商购可得的。合适的商业表达载体包括但不限于p3xFLAGTMTM表达载体(Sigma-Aldrich)，其包括用于在哺乳动物宿主细胞中表达的CMV启动子和hGH多腺苷酸化位点以及用于在大肠杆菌中扩增的pBR322复制起点和氨苄青霉素抗性标志物。其他商购可得的合适的表达载体包括但不限于pBluescriptII SK(-)和pBK-CMV载体(Stratagene)，以及源自pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pREP4、pCEP4(Invitrogen)或pPoly的质粒(参见，Lathe等,Gene 57:193-201[1987])。
技术人员将理解，在产生酶后，特别是根据所用的细胞系和酶的特定氨基酸序列，可能发生翻译后修饰。例如，这样的翻译后修饰可以包括某些前导序列的裂解、多种糖基化和磷酸化模式中多种糖部分的添加、脱酰胺化、氧化、二硫键扰乱(disulfide bondscrambling)、异构化、C-末端赖氨酸剪切和N-末端谷氨酰胺环化。本发明包括使用已经进行或已经经历一种或更多种翻译后修饰的工程化羧酸酯酶。因此，本发明的工程化羧酸酯酶包括已经经历翻译后修饰的工程化羧酸酯酶，诸如本文描述的。
脱酰胺化是一种酶促反应，主要以约3:1的比率将天冬酰胺(N)转化为异天冬氨酸(iso-aspartic acid)(异天冬氨酸(iso-aspartate))和天冬氨酸(aspartic acid)(天冬氨酸(aspartate))(D)。因此，该脱酰胺化反应与天冬氨酸(D)异构化成异天冬氨酸相关。天冬酰胺的脱酰胺化和天冬氨酸的异构化二者涉及中间琥珀酰亚胺。谷氨酰胺残基可以以类似的方式发生脱酰胺化，但程度要小得多。
氧化可以发生在生产和储存期间(即，在氧化条件的存在下)并且引起蛋白质的共价修饰，由活性氧物类直接诱导，或通过与氧化应激的次级副产物反应间接诱导。氧化主要发生在甲硫氨酸残基，但可能发生在色氨酸和游离半胱氨酸残基处。
二硫键扰乱可以发生在生产和基本储存条件期间。在某些情况下，二硫键可以断裂或不正确地形成，引起不成对的半胱氨酸残基(-SH)。这些游离的(不成对的)巯基(-SH)可以促进改组。
工程化羧酸酯酶中的N-末端谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(glutamate)(谷氨酸(glutamic acid))(E)可能经由环化形成焦谷氨酸(pGlu)。大多数pGlu形成发生在制造中，但是取决于处理和储存条件的pH和温度它可以非通过酶形成。
C-末端赖氨酸剪切是一种由羧肽酶催化的酶促反应，并且通常在酶中观察到。该过程的变化形式包括将赖氨酸从来自重组宿主细胞的酶去除。
在本发明中，上文描述的原始氨基酸序列中的翻译后修饰和改变不引起工程化羧酸酯酶的活性的显著变化。
用于表达羧酸酯酶多肽的宿主细胞
在另一方面，本发明提供了包含编码本发明的改进的羧酸酯酶多肽的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸可操作地连接到用于在宿主细胞中表达羧酸酯酶的一个或更多个控制序列。用于在表达由本发明的表达载体编码的羧酸酯酶多肽中使用的宿主细胞是本领域熟知的，并且包括但不限于细菌细胞诸如大肠杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、微小乳杆菌(Lactobacillusminor)、结核分枝杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)细胞；真菌细胞诸如酵母细胞(例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(ATCC登录号201178))；昆虫细胞诸如果蝇属(Drosophila)S2和灰翅夜蛾属(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞诸如CHO、COS、BHK、293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。用于上文描述的宿主细胞的适当的培养基和生长条件是本领域熟知的。
用于表达羧酸酯酶的多核苷酸可以通过本领域已知的多种方法引入细胞中。技术包括，除其他以外，电穿孔、生物弹射颗粒轰击(biolistic particle bombardment)、脂质体介导的转染、氯化钙转染和原生质体融合。用于将多核苷酸引入细胞中的不同方法对于技术人员将是明显的。
大肠杆菌W3110是可用于本发明的宿主菌株，尽管预期本发明不局限于这种特定的宿主菌株。表达载体通过将编码改进的羧酸酯酶的多核苷酸可操作地连接到质粒pCK110900中来产生，所述编码改进的羧酸酯酶的多核苷酸可操作地连接至处于lacI阻遏物的控制下的lac启动子。表达载体还包含P15A复制起点和氯霉素抗性基因。大肠杆菌W3110中包含目标多核苷酸的细胞可以通过使细胞经历氯霉素选择来分离。
产生工程化羧酸酯酶多肽的方法
在一些实施方案中，为了制备本发明的改进的羧酸酯酶多核苷酸和多肽，从褐色嗜热裂孢菌获得(或衍生)催化酰胺化反应的天然存在的羧酸酯酶。在一些实施方案中，亲本多核苷酸序列经密码子优化以增强羧酸酯酶在特定的宿主细胞中的表达。作为说明，编码褐色嗜热裂孢菌的野生型羧酸酯酶多肽的亲本多核苷酸序列从基于Genbank数据库中可得的褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶序列的已知多肽序列(Genbank登录号WP_011292850.1)制备的寡核苷酸构建。亲本多核苷酸序列，命名为SEQ ID NO:1，经密码子优化用于在大肠杆菌中表达，并且将密码子优化的多核苷酸克隆到表达载体中，将羧酸酯酶基因的表达放置在lac启动子和lacI阻遏物基因的控制下。鉴定了在大肠杆菌中表达有活性的羧酸酯酶的克隆并且基因经测序以确定其身份。密码子优化的多核苷酸序列，命名为SEQ ID NO:1，是用作从原始的野生型羧酸酯酶演化的工程化羧酸酯酶的大多数实验和文库构建的起始点的亲本序列。
在其他实施方案中，为了制备本发明的改进的羧酸酯酶多核苷酸和多肽，从嗜热脂肪地芽孢杆菌获得(或衍生)催化酰胺化反应的天然存在的羧酸酯酶。在一些实施方案中，亲本多核苷酸序列经密码子优化以增强羧酸酯酶在特定的宿主细胞中的表达。作为说明，编码嗜热脂肪地芽孢杆菌的野生型羧酸酯酶多肽的亲本多核苷酸序列从基于Genbank数据库中可得的嗜热脂肪地芽孢杆菌羧酸酯酶序列的已知多肽序列(Genbank登录号WP_033015113)制备的寡核苷酸构建。亲本多核苷酸序列，命名为SEQ ID NO:137，经密码子优化用于在大肠杆菌中表达，并且将密码子优化的多核苷酸克隆到表达载体中，将羧酸酯酶基因的表达放置在lac启动子和lacI阻遏物基因的控制下。鉴定了在大肠杆菌中表达有活性的羧酸酯酶的克隆并且基因经测序以确定其身份。多核苷酸序列，命名为SEQ ID NO:137，是用作从原始的野生型羧酸酯酶演化的工程化羧酸酯酶的大多数实验和文库构建的起始点的亲本序列。
在一些实施方案中，为了制备本发明的改进的羧酸酯酶多核苷酸和多肽，从结核分枝杆菌获得或衍生催化酰胺化反应的天然存在的羧酸酯酶。在一些实施方案中，亲本多核苷酸序列经密码子优化以增强羧酸酯酶在特定的宿主细胞中的表达。作为说明，编码结核分枝杆菌的野生型羧酸酯酶多肽的亲本多核苷酸序列从基于Genbank数据库中可得的结核分枝杆菌羧酸酯酶序列的已知多肽序列(Genbank登录号WP_003407276)制备的寡核苷酸构建。亲本多核苷酸序列，命名为SEQ ID NO:139，经密码子优化用于在大肠杆菌中表达，并且将密码子优化的多核苷酸克隆到表达载体中，将羧酸酯酶基因的表达放置在lac启动子和lacI阻遏物基因的控制下。鉴定了在大肠杆菌中表达有活性的羧酸酯酶的克隆并且基因经测序以确定其身份。密码子优化的多核苷酸序列，命名为SEQ ID NO:139，是用作从原始的野生型羧酸酯酶演化的工程化羧酸酯酶的大多数实验和文库构建的起始点的亲本序列，如本文描述的。
在一些实施方案中，通过对编码天然存在的羧酸酯酶的多核苷酸或编码天然存在的羧酸酯酶的多核苷酸的经密码子优化的形式进行诱变和/或定向演化方法来获得工程化羧酸酯酶，如上文讨论的。诱变可以根据本领域已知的任何技术来进行，包括随机诱变和定点诱变。定向演化可以用本领域已知的任何技术包括改组来进行以筛选改进的羧酸酯酶变体。诱变和定向演化方法是本领域熟知的(参见，例如，美国专利第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号、第5,837,458号、第5,928,905号、第6,096,548号、第6,117,679号、第6,132,970号、第6,165,793号、第6,180,406号、第6,251,674号、第6,265,201号、第6,277,638号、第6,287,861号、第6,287,862号、第6,291,242号、第6,297,053号、第6,303,344号、第6,309,883号、第6,319,713号、第6,319,714号、第6,323,030号、第6,326,204号、第6,335,160号、第6,335,198号、第6,344,356号、第6,352,859号、第6,355,484号、第6,358,740号、第6,358,742号、第6,365,377号、第6,365,408号、第6,368,861号、第6,372,497号、第6,337,186号、第6,376,246号、第6,379,964号、第6,387,702号、第6,391,552号、第6,391,640号、第6,395,547号、第6,406,855号、第6,406,910号、第6,413,745号、第6,413,774号、第6,420,175号、第6,423,542号、第6,426,224号、第6,436,675号、第6,444,468号、第6,455,253号、第6,479,652号、第6,482,647号、第6,483,011号、第6,484,105号、第6,489,146号、第6,500,617号、第6,500,639号、第6,506,602号、第6,506,603号、第6,518,065号、第6,519,065号、第6,521,453号、第6,528,311号、第6,537,746号、第6,573,098号、第6,576,467号、第6,579,678号、第6,586,182号、第6,602,986号、第6,605,430号、第6,613,514号、第6,653,072号、第6,686,515号、第6,703,240号、第6,716,631号、第6,825,001号、第6,902,922号、第6,917,882号、第6,946,296号、第6,961,664号、第6,995,017号、第7,024,312号、第7,058,515号、第7,105,297号、第7,148,054号、第7,220,566号、第7,288,375号、第7,384,387号、第7,421,347号、第7,430,477号、第7,462,469号、第7,534,564号、第7,620,500号、第7,620,502号、第7,629,170号、第7,702,464号、第7,747,391号、第7,747,393号、第7,751,986号、第7,776,598号、第7,783,428号、第7,795,030号、第7,853,410号、第7,868,138号、第7,783,428号、第7,873,477号、第7,873,499号、第7,904,249号、第7,957,912号、第7,981,614号、第8,014,961号、第8,029,988号、第8,048,674号、第8,058,001号、第8,076,138号、第8,108,150号、第8,170,806号、第8,224,580号、第8,377,681号、第8,383,346号、第8,457,903号、第8,504,498号、第8,589,085号、第8,762,066号、第8,768,871号、第9,593,326号、第9,665,694号、第9,684,771以及所有相关的非美国对应专利(counterpart)；Ling等,Anal.Biochem.,254(2):157-78[1997]；Dale等,Meth.Mol.Biol.,57:369-74[1996]；Smith,Ann.Rev.Genet.,19:423-462[1985]；Botstein等,Science,229:1193-1201[1985]；Carter,Biochem.J.,237:1-7[1986]；Kramer等,Cell,38:879-887[1984]；Wells等,Gene,34:315-323[1985]；Minshull等,Curr.Op.Chem.Biol.,3:284-290[1999]；Christians等,Nat.Biotechnol.,17:259-264[1999]；Crameri等,Nature,391:288-291[1998]；Crameri等,Nat.Biotechnol.,15:436-438[1997]；Zhang等,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,94:4504-4509[1997]；Crameri等,Nat.Biotechnol.,14:315-319[1996]；Stemmer,Nature,370:389-391[1994]；Stemmer,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:10747-10751[1994]；WO 95/22625；WO97/0078；WO 97/35966；WO 98/27230；WO 00/42651；WO 01/75767；和WO 2009/152336。不意图本发明受限于任何特定方法，因为多种方法可用于本领域中。
在一些实施方案中，在期望的改进的酶性质为热稳定性时，可以在将酶制品经历定义的温度并且测量热处理后剩余的酶活性的量之后测量酶活性。然后将包含编码羧酸酯酶的多核苷酸的克隆分离、测序以鉴定核苷酸序列改变(如果有的话)、并且用于在宿主细胞中表达酶。
当已知工程化多肽的序列时，根据已知的合成方法可以通过标准固相方法制备编码酶的多核苷酸。在一些实施方案中，上至约100个碱基的片段可以被单独地合成，然后连接(例如，通过酶促或化学连接方法或聚合酶介导的方法)以形成任何期望的连续序列。例如，本发明的多核苷酸和寡核苷酸可以通过化学合成来制备(例如，使用由Beaucage等,Tet.Lett.,22:1859-69[1981]描述的经典亚磷酰胺方法或由Matthes等,EMBO J.,3:801-05[1984]描述的方法，因为它通常以自动化合成方法实施)。根据亚磷酰胺方法，寡核苷酸被合成(例如，在自动的DNA合成仪中)、纯化、退火、连接并且克隆到适当载体中。此外，基本上任何核酸可以从多种商业来源(例如，The Midland Certified Reagent Company,Midland,TX、The Great American Gene Company,Ramona,CA、ExpressGen Inc.Chicago,IL、Operon Technologies Inc.,Alameda,CA以及许多其他商业来源)中的任一个获得。
可以使用任何一种或更多种用于蛋白质纯化的熟知技术将宿主细胞中表达的工程化羧酸酯酶从细胞和/或培养基回收，所述用于蛋白质纯化的熟知技术除了其他以外包括，溶菌酶处理、声波处理(sonication)、过滤、盐析、超速离心和色谱法。用于裂解和从细菌诸如大肠杆菌高效提取蛋白质的合适的溶液以商标名CelLytic B(Sigma-Aldrich)商购可得。
用于分离羧酸酯酶多肽的色谱技术，包括除其他之外反相色谱、高效液相色谱(HPLC)、离子交换色谱、凝胶电泳和亲和色谱。用于纯化特定的酶的条件将部分地取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性、分子量、分子形状等因素，并且对本领域技术人员将是明显的。
在一些实施方案中，亲和技术可以被用于分离改进的羧酸酯酶。对于亲和色谱纯化，可以使用与羧酸酯酶多肽特异性结合的任何抗体。为了产生抗体，可以通过注射羧酸酯酶来免疫多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。羧酸酯酶多肽可以通过侧链官能团或附接至侧链官能团的接头的手段附接至合适的载体诸如BSA。根据宿主物种，多种佐剂可以被用于增加免疫学响应，包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、二硝基苯酚和可能有用的人类佐剂诸如BCG(卡介苗)和短小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。
羧酸酯酶可以以表达酶的细胞的形式、作为粗提取物或作为分离的或纯化的制品来制备和使用。羧酸酯酶可以被制备为呈粉末形式(例如，丙酮粉末)的冻干物或被制备为酶溶液。在一些实施方案中，羧酸酯酶可以呈基本上纯的制品的形式。
在一些实施方案中，羧酸酯酶多肽可以被附接至固体基底。基底可以是固相、表面和/或膜。固体支持物可以由有机聚合物诸如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯和聚丙烯酰胺以及其共聚物和接枝物制成。固体支持物还可以是无机的，诸如玻璃、二氧化硅、可控孔隙玻璃(CPG)、反相二氧化硅或金属诸如金或铂。基底的构型可以呈珠、球、微粒(particle)、颗粒(granule)、凝胶、膜或表面的形式。表面可以是平面的、基本上平面的或非平面的。固体支持物可以是多孔的或无孔的，并且可以具有溶胀或非溶胀特征。固体支持物可以被配置为孔、凹陷或其他容器(container)、容器(vessel)、特征或位置的形式。多于一种支持物可以被配置在阵列上的多个位置处，所述多个位置是试剂的自动递送或通过检测方法和/或仪器可寻址的。
使用工程化羧酸酯酶的方法以及用其制备的化合物
转化了编码工程化羧酸酯酶和/或任选的辅因子再生酶的一个或更多个基因的完整细胞，或其细胞提取物和/或其裂解物可以以多种不同形式使用，包括固体(例如，冻干的、喷雾干燥的等)或半固体(例如，粗制糊状物)。
细胞提取物或细胞裂解物可以通过沉淀(硫酸铵、聚乙烯亚胺、热处理等)部分地纯化，随后在冻干之前进行脱盐程序(例如，超滤、透析等)。任何细胞制品可以通过使用已知的交联剂诸如例如戊二醛交联或固定至固相(例如，Eupergit C等)而被稳定。
固体反应物(例如，酶、盐等)可以以多种不同形式包括粉末(例如，冻干的、喷雾干燥的等)、溶液、乳液、悬浮液等提供至反应。使用本领域普通技术人员已知的方法和设备，可以容易地将反应物冻干或喷雾干燥。例如，蛋白质溶液可以在-80℃以小等分试样冷冻，然后添加至预冷的冻干室，随后施加真空。在从样品去除水之后，在释放真空和回收冻干的样品之前，通常将温度升至4℃持续2小时。
在酰胺化反应中使用的反应物的量通常将根据期望的产物的量以及伴随的使用的羧酸酯酶底物的量而变化。以下指导可以被用于确定羧酸酯酶和/或胺的量。通常，酯和胺底物可以以约5克/升至200克/升的浓度使用，使用从约50mg至约5g的羧酸酯酶。
本领域普通技术人员将容易地理解如何改变这些量以将它们定制到期望的生产率和生产规模的水平。
反应物的添加顺序不是至关重要的。反应物可以一起同时添加至溶剂(例如，单相溶剂、双相水性共溶剂系统等)中，或者可选地，一些反应物可以单独添加，并且一些可以在不同的时间点一起添加。例如，羧酸酯酶和羧酸酯酶底物可以首先添加至溶剂。
在使用水性共溶剂体系时，为了改进混合效率，可以首先将羧酸酯酶和胺添加并且混合到水相中。然后可以添加并且混合有机相，随后添加羧酸酯酶底物。可选地，羧酸酯酶底物可以在添加到水相中之前在有机相中预混合。
用于进行本文描述的羧酸酯酶催化的酰胺化反应的合适的条件包括可以容易地通过常规实验优化的许多条件，所述常规实验包括但不局限于，在实验pH和温度将工程化羧酸酯酶与底物接触，并且例如使用在本文所提供的实施例中描述的方法检测产物。
羧酸酯酶催化的酰胺化通常在从约15℃至约75℃的范围中的温度进行。对于一些实施方案，反应在从约20℃至约55℃的范围中的温度进行。在仍然其他实施方案中，反应在从约20℃至约45℃的范围中的温度进行。反应也可在环境(ambient)条件下进行。
通常允许酰胺化反应进行直到获得基本上完全或接近完全的底物偶联。酰胺形成(产物)可以使用已知的方法通过检测底物和/或产物来监测。合适的方法包括但不限于气相色谱、HPLC等。反应混合物中产生的酰胺产物的转化得率通常大于约50％，也可以大于约60％，也可以大于约70％，也可以大于约80％，也可以大于约90％，以及经常大于约97％。
实施例
本发明的多种特征和实施方案在以下代表性实施例中进行了说明，这些代表性实施例意图是说明性而非限制性的。
在下文的实验公开内容中，适用以下缩写：ppm(百万分率)；M(摩尔/升)；mM(毫摩尔/升)、uM和μM(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol(摩尔)；gm和g(克)；mg(毫克)；ug和μg(微克)；L和l(升)；ml和mL(毫升)；cm(厘米)；mm(毫米)；um和μm(微米)；sec.(秒)；min(s)(分钟)；h(s)和hr(s)(小时)；U(单位)；MW(分子量)；rpm(转/分钟)；℃(摄氏度)；RT(室温)；MWD(多波长检测器)；CDS(编码序列)；DNA (脱氧核糖核酸)；RNA(核糖核酸)；RP-HPLC(反相高效液相色谱)；FIOP(超过阳性对照的改进倍数)；HTP(高通量)；LB(Luria肉汤)；TFA(三氟乙酸)；MeCN(乙腈)；TEoA(三乙醇胺)；THF(四氢呋喃)；Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)；Millipore(Millipore,Corp.,Billerica MA)；Difco(DifcoLaboratories,BD Diagnostic Systems,Detroit,MI)；Daicel(Daicel,West Chester,PA)；Genetix(Genetix USA,Inc.,Beaverton,OR)；Molecular Devices(MolecularDevices,LLC,Sunnyvale,CA)；Applied Biosystems(Applied Biosystems是LifeTechnologies,Corp.,Grand Island,NY的一部分)、Agilent(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)；Thermo Scientific(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA的一部分)；Corning(Corning,Inc.,Palo Alto,CA)；和Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)；Phenomenex(Phenomenex,Inc.,Torrence,CA)；Epicentre(Epicentre,Madison,WI)。
实施例1
野生型羧酸酯酶基因获得和表达载体的构建
本实施例描述了以下实施例中编码工程化羧酸酯酶的基因所衍生自的经密码子优化的编码野生型羧酸酯酶(SEQ ID NO:2、138和140)的重组多核苷酸的获得以及适用于这样的工程化的表达载体和宿主细胞。
合成分别编码褐色嗜热裂孢菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌和结核分枝杆菌的野生型羧酸酯酶(SEQ ID NO:2、138和140)的野生型基因的经密码子优化的形式(SEQ ID NO:1、137和139)用于在大肠杆菌中表达。将经密码子优化的基因克隆到表达载体pCK110900中(参见，例如，美国专利第9,714,437号和美国专利申请公布第2006/0195947号，二者通过引用以其整体并且出于所有目的并入本文)，处在lac启动子的控制下。表达载体还包含P15A复制起点和氯霉素抗性基因。将这些经序列验证的载体转化到大肠杆菌W3110菌株中用于表达。将编码本发明的工程化羧酸酯酶(偶数编号的SEQ ID NO:2-136)的多核苷酸(奇数编号的SEQ ID NO:1-135)同样克隆到载体pCK110900中用于在大肠杆菌的一种衍生物W3110菌株中表达。使用本领域技术人员通常已知的定向演化技术产生工程化羧酸酯酶的文库。
实施例2
野生型羧酸酯酶多肽的HTP产生和分析
HTP裂解物通过以下制备：获取经密码子优化的羧酸酯酶基因(实施例1中描述的)，然后将其转化到大肠杆菌W3110中并且铺板在包含1％葡萄糖和30μg/mL氯霉素(CAM)的Luria-Bertani(LB)琼脂培养基上。在30℃孵育至少16h后，使用Q-botobotic菌落挑选仪(Genetix)将菌落挑选到包含200μL LB、1％葡萄糖和30μg/mLCAM的96-孔浅孔微量滴定板中。细胞在30℃以200rpm摇动生长18h-20h。然后，将20μL的这些培养物转移到深孔板中的360μL的Terrific肉汤(TB)和30μg/mL CAM。在30℃以250rpm摇动孵育2.5h(OD600 0.6-0.8)后，通过添加最终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组基因表达。然后在30℃以250rpm摇动将板孵育18h-21h。
将细胞培养物以3500×g沉淀20min，并且弃去培养基。将细胞沉淀在200μL的具有1g/L溶菌酶、0.5g/L硫酸多粘菌素B和0.5μLOmniCleaveTM核酸内切酶(Epicentre)的0.2MTEoA,pH 7.5中通过在RT摇动2h裂解。将样品以3500×g离心20min以使细胞碎片澄清，并且将上清液用于进行实施例3和4中描述的转化。
实施例3
野生型羧酸酯酶对底物集#1的活性
如实施例2中描述地产生了野生型羧酸酯酶多肽。为了分析对底物集#1(表3.1)的酰胺化活性，将20μL上清液添加至10μL苯胺、10μL乙酸乙酯、100μL的0.1M磷酸钠缓冲液,pH7.0的混合物。将反应在20℃孵育并且以300rpm摇动18h。样品通过在MeCN中稀释2倍而猝灭。如在表12.1中描述的，通过RP-HPLC进行反应的分析。
表3.1用于评价羧酸酯酶酰胺化活性的底物集
实施例4
野生型羧酸酯酶对底物集#2-7的活性
根据实施例2中描述的方法产生野生型羧酸酯酶多肽。为了分析对底物集#2(参见表3.1)的酰胺化活性，将100μL上清液添加至10μL苯乙酸甲酯、10μL正丁胺、10μL二甲基亚砜(DMSO)和20μL的0.1M磷酸钠缓冲液,pH 7.0的混合物。将反应在RT孵育并且以300rpm摇动18h。样品通过用等体积的MeCN稀释而猝灭。使用表12.1中描述的方法，通过RP-HPLC进行底物和产物的分析。
为了分析对底物集#3-7(参见表3.1)的酰胺化活性，将0.1M磷酸钾缓冲液,pH 7.5中75g/L-100g/L胺和15g/L苯甲酸乙酯、具有或不具有50％异丙醇的120μL混合物添加至如实施例2中描述地产生的100μL上清液。将反应在55℃孵育并且以400rpm摇动18h。样品通过在MeCN中稀释3倍而猝灭，并且然后以4000×g离心5min-8min。使用表12.2中描述的方法，通过RP-HPLC分析所得上清液。在使用底物集#3的一项实验中，将0.1M磷酸钾缓冲液,pH7.5中5g/L异丁胺和15g/L苯甲酸乙酯的120μL混合物添加至如实施例2中描述地产生的100μL上清液。所有这些底物集的结果在表4.1中提供，其中底物集由“反应”编号表示(即，“R1”、“R2”、“R3”等)。
实施例5
野生型羧酸酯酶摇瓶粉末的产生
在摇瓶中产生野生型羧酸酯酶(SEQ ID NO:2、138和140)用于进一步表征。使包含编码WT羧酸酯酶的质粒的大肠杆菌转化子在包含1％葡萄糖和30μg/mL氯霉素(CAM)的Luria-Bertani(LB)琼脂培养基上生长。在30℃孵育至少16h后，将单个菌落挑取到6mL的LB、1％葡萄糖和30μg/mL CAM中。将细胞在30℃以250rpm摇动生长18h-20h。然后将该培养物转移到Terrific肉汤(TB)和30μg/mL CAM中，最终OD600为0.2并且最终体积为250mL。将瓶在25℃或30℃以250rpm摇动孵育2.5h(OD6000.6-0.8)后，通过最终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组基因表达。然后将瓶在30℃以250rpm摇动孵育18h-21h。将细胞以3500×g沉淀20min，并且弃去上清液。将细胞沉淀在30mL冰冷的50mM磷酸钠pH 7.5中洗涤3×，重悬于12mL的相同缓冲液中，并且使用细胞破碎仪以18kpsi-20kpsi裂解。以10000×g使裂解物澄清30min，并且将澄清的上清液冻干成灰白色粉末。
实施例6
野生型羧酸酯酶多肽的溶剂耐受性评价
在本实施例中，描述了为确定野生型羧酸酯酶的溶剂耐受性而进行的实验。在这些实验中，通过测试对底物集#3和#5的活性，确定了实施例5中制备的冻干摇瓶粉末对有机溶剂的耐受性。反应在具有0.1M磷酸钾缓冲液,pH 7.5中的10g/L酶粉末、30g/L-34g/L胺、43g/L酯和10％ DMSO或50％异丙醇或15％-25％ MeCN或25％ THF的96孔板(反应体积220μL)中进行。将反应加热至50℃，以400rpm摇动18h-21h。反应通过在MeCN中稀释3倍而猝灭。使用表12.2中描述的方法，通过RP-HPLC分析反应样品。
实施例7
工程化的褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶多肽文库的产生和分析
根据实施例1中描述的方法在大肠杆菌中转化包含演化的褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶基因的质粒文库并且遵循实施例2中描述的方法产生。使用细胞裂解物进行实施例8和9中描述的活性评估。
实施例8
工程化的褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶多肽对底物集#3、8-12的酰胺化活性
根据实施例7产生褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶变体。为了分析对底物集#3(参见表3.1)的酰胺化活性，将20μL如实施例7中描述地产生的上清液添加至25μL具有3M苯甲酸乙酯的MeCN、110μL在0.2M TEoA(pH调节至9.5)中的0.6M异丁胺和65μL 0.2M TEoA,pH 8.5的混合物。将反应在50℃孵育并且以300rpm摇动18h。样品通过在MeCN中稀释4倍而猝灭。使用表12.2中描述的方法，通过RP-HPLC进行反应的分析。
为了评价对底物集#3、8-12(参见表3.1)的酰胺化活性，将20μL-50μL如实施例7中描述地产生的上清液添加至25μL具有2M-3.2M胺的MeCN、110μL在0.2M TEoA(pH调节至8)中的0.4M-0.6M酯悬浮液和35μL-65μL 0.2M TEoA,pH 8.5-9.0的混合物。将反应在50℃孵育并且以300rpm摇动16h-18h。样品通过在MeCN中稀释4倍而猝灭。如在表12.3、12.4和12.5中描述的，通过RP-HPLC进行反应的分析。在使用底物集#8的一项实验中，将50μL如实施例7中描述地产生的上清液添加至25μL具有3M甘氨酸甲酯的MeCN、110μL在0.2M TEoA(pH调节至8)中的0.6M苯胺、和35μL 0.2M TEoA,pH 8.5的混合物。反应在50℃孵育并且以300rpm摇动18h。样品通过在MeCN中稀释4倍而猝灭。使用表12.3中描述的方法，通过RP-HPLC进行反应的分析。这些变体的氨基酸取代是相对于SEQ ID NO:2表示的。
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实施例9
工程化的褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶多肽的摇瓶粉末的评价
遵循实施例5中描述的方法，以摇瓶规模的量制备演化的褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶的粉末。冻干摇瓶粉末的酰胺化活性通过测试它们对底物集#3的活性来评估。首先，用10g/L酶粉末、0.3M异丁胺、甲苯中的0.3M苯甲酸乙酯，随后添加20μL的0.2M TEoA缓冲液,pH 8.5来制备1.0mL反应混合物。将反应加热至50℃，以500rpm摇动60h。反应通过将100μL反应混合物稀释到1.4mL丙酮中而猝灭。使用表12.2中提供的方法，通过RP-HPLC分析反应样品。
/>
实施例10
组合的褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶文库的产生和分析
根据实施例1中描述的方法，将通过对褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶变体(SEQ ID NO:8)进行组合改组获得的质粒文库转化到大肠杆菌W3110中。将根据实施例2中描述的方法产生的HTP裂解物用于进行实施例11中描述的活性评估。
实施例11
工程化的褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶多肽对选择的底物集3、5、8、12-15的活性
分析了从组合文库产生的褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶变体对底物集#3、5、8和12-15(参见表3.1)的酰胺化活性。为了分析对底物集#3(参见表3.1)的酰胺化活性，10μL上清液如实施例7中描述地产生并且添加至25μL具有3M苯甲酸乙酯的MeCN、110μL于0.2M TEoA(pH调节至8)中的0.6M异丁胺和75μL 0.2M TEoA,pH 8.5的混合物。将反应在50℃孵育并且以300rpm摇动18h。样品通过在MeCN中稀释4倍而猝灭。为了分析对底物集#5、8和12-15的酰胺化活性，20μL-50μL上清液如实施例7中描述地产生并且添加至25μL具有2M-3.2M胺的MeCN、110μL在0.2MTEoA(pH调节至8)中的0.4M-0.6M酯悬浮液和35μL-65μL 0.2M TEoA,pH 8.5-9的混合物。将反应在50℃孵育并且以300rpm摇动16h-18h。样品通过在MeCN中稀释4倍而猝灭。使用表12.2(集合3)、12.3(集合8)、12.5(集合12和13)、12.6(集合14)和12.7(集合5和15)中描述的方法，通过RP-HPLC进行反应的分析。在使用底物集#8的一项实验中，将20μL如实施例7中描述地产生的上清液添加至25μL具有3M甘氨酸甲酯的MeCN、110μL在0.2M TEoA(pH调节至9.5)中的0.6M苯胺、和65μL 0.2M TEoA,pH 8.5的混合物。将反应在50℃孵育并且以300rpm摇动18h。样品通过在MeCN中稀释4倍而猝灭。使用表12.3中描述的方法，通过RP-HPLC进行反应的分析。
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实施例12
产生的酰胺和前体底物的分析检测
上文的实施例中描述的数据使用表12.1至12.7中的分析方法收集。本文提供的方法全部可用于分析使用本发明产生的来自褐色嗜热裂孢菌羧酸酯酶变体的产物。然而，并不意图本发明受限于本文描述的用于分析本文提供的和/或使用本文提供的方法产生的产物的方法。事实上，任何合适的方法可用于本发明中。通过用商购可得的标准物证实或通过LC/MS/MS分析证实产物峰洗脱。
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虽然已经说明和描述了多种具体的实施方案，但是将理解可以进行多种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
序列表
<110> 科德克希思公司
<120> 用于酰胺偶联的羧酸酯酶多肽
<130> CX2-165US1
<160> 140
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
<400> 1
atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60
gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120
ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180
ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240
gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300
atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360
ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420
attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480
gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540
gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600
cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660
gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720
gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780
gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840
ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900
attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960
cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020
cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080
ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140
gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200
gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260
ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320
ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380
ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440
gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491
<210> 2
<211> 497
<212> PRT
<213> 褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)
<400> 2
Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys
1 5 10 15
Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro
20 25 30
Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp
35 40 45
Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro
50 55 60
Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly
65 70 75 80
Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val
85 90 95
Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly
100 105 110
Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly
115 120 125
Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala
130 135 140
Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala
145 150 155 160
Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro
165 170 175
Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys
180 185 190
Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile
195 200 205
Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr
210 215 220
Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala
225 230 235 240
Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln
245 250 255
Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly
260 265 270
Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile
275 280 285
Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly
290 295 300
Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr
305 310 315 320
Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp
325 330 335
Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala
340 345 350
Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu
355 360 365
Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile
370 375 380
Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe
385 390 395 400
Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala
405 410 415
Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu
420 425 430
Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala
435 440 445
Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn
450 455 460
Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met
465 470 475 480
Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro
485 490 495
Leu
<210> 3
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
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<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
<400> 22
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1 5 10 15
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20 25 30
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<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
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<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
<400> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
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<400> 29
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<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
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<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
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<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
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<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
<400> 126
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<220>
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Leu
<210> 133
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
<400> 133
atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60
gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120
ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180
ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240
gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300
atggtgtgga ttcatggtgg tgggtttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360
ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420
attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480
gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540
gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600
cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcccgatggc agtcgctgca 660
gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720
gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780
gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840
ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900
attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960
cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020
cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080
ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcattaccg accaggtgtt gcgtattccg 1140
gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200
gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260
ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320
ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380
ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440
gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491
<210> 134
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
<400> 134
Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys
1 5 10 15
Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro
20 25 30
Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp
35 40 45
Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro
50 55 60
Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly
65 70 75 80
Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val
85 90 95
Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Thr Asn Gly
100 105 110
Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly
115 120 125
Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala
130 135 140
Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala
145 150 155 160
Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro
165 170 175
Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys
180 185 190
Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile
195 200 205
Leu Gln Ser Gly Ala Gly Pro Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr
210 215 220
Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala
225 230 235 240
Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln
245 250 255
Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly
260 265 270
Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile
275 280 285
Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly
290 295 300
Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr
305 310 315 320
Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp
325 330 335
Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala
340 345 350
Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu
355 360 365
Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Leu Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile
370 375 380
Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe
385 390 395 400
Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala
405 410 415
Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu
420 425 430
Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala
435 440 445
Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn
450 455 460
Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met
465 470 475 480
Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro
485 490 495
Leu
<210> 135
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
<400> 135
atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60
gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120
ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180
ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240
gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300
atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360
ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420
attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480
gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540
gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600
cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660
gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720
gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780
gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840
ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900
attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960
cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020
cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080
ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atccttaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140
gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200
gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260
ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320
ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380
ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440
gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491
<210> 136
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
<400> 136
Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys
1 5 10 15
Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro
20 25 30
Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp
35 40 45
Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro
50 55 60
Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly
65 70 75 80
Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val
85 90 95
Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly
100 105 110
Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly
115 120 125
Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala
130 135 140
Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala
145 150 155 160
Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro
165 170 175
Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys
180 185 190
Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile
195 200 205
Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr
210 215 220
Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala
225 230 235 240
Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln
245 250 255
Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly
260 265 270
Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile
275 280 285
Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly
290 295 300
Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr
305 310 315 320
Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp
325 330 335
Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala
340 345 350
Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu
355 360 365
Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile
370 375 380
Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe
385 390 395 400
Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala
405 410 415
Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu
420 425 430
Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala
435 440 445
Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn
450 455 460
Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met
465 470 475 480
Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro
485 490 495
Leu
<210> 137
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
<400> 137
atggaacgta cggttgtgga aactcgttat ggtcgtttac gcggagaaat gaatgaaggt 60
gtgtttgtct ggaaaggtat tccttacgct aaagcccctg taggagagcg tcgctttctg 120
ccaccagaac caccagatgc atgggatggt gttcgtgagg cgaccagctt tggtccagtt 180
gttatgcagc cgagtgatcc aatcttcagc ggtctgttag gtcgcatgtc cgaagcgcca 240
agtgaagatg gtctgtacct gaacatttgg agcccagcgg cagatggtaa gaaacgtcca 300
gtactgttct ggattcatgg tggtgcgttc ctgttcggta gtggtagtag tccatggtac 360
gatggtactg cgtttgccaa acacggtgat gttgtggtgg tgacgatcaa ctatcgtatg 420
aacgtattcg gctttctgca tttgggggat tctttcggag aagcgtatgc gcaagccggc 480
aacctgggta ttctggatca ggtggcagca ttacgctggg tgaaggagaa cattgccgca 540
ttcggaggcg acccggacaa catcacaatc ttcggcgagt cagcgggcgc ggcatcggtt 600
ggtgttcttc tgagtttacc agaagcaagt ggtctgtttc gtcgtgcaat gttgcaaagc 660
ggtagtggta gtctgttact gcgttcgccg gagactgcga tggcaatgac cgagcgtatt 720
ctggacaaag caggtattcg tccaggtgat cgtgaacgtc tgcttagtat tccggcggaa 780
gagctcttgc gtgcagcgtt gagtttaggt ccaggcgtta tgtatggtcc ggttgttgat 840
ggtcgtgtgc tgcgccgtca tccaattgaa gcactccgtt atggtgccgc aagtggcatt 900
cccattctga ttggcgtgac caaggacgag tacaatctgt ttaccttaac tgacccgagt 960
tggactaagc tgggtgagaa agaactgctg gaccgcatca atcgcgaagt tggtccagtt 1020
ccagaggaag caatccgcta ctacaaggaa accgcggaac caagtgcacc aacttggcag 1080
acttggctgc gcatcatgac ctatcgtgtc tttgtggagg gtatgttgcg taccgcggat 1140
gcacaggcag cacaaggagc cgatgtgtac atgtaccgct tcgactacga aacgccagtg 1200
tttggcggcc aattgaaagc ttgtcatgca ttggaactgc cgtttgtgtt ccacaacctg 1260
catcaacctg gagtggctaa cttcgttggt aatcgccctg agcgtgaagc gattgcaaac 1320
gagatgcatt acgcgtggtt gagctttgcg cgcaccggtg acccgaatgg tgctcatctg 1380
ccggaagcat ggccggcata caccaatgaa cgtaaagcag cgtttgtgtt tagcgcggcc 1440
tctcatgttg aagacgatcc ctttgggcgc gaacgtgcgg cgtggcaagg tcgc 1494
<210> 138
<211> 498
<212> PRT
<213>嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)
<400> 138
Met Glu Arg Thr Val Val Glu Thr Arg Tyr Gly Arg Leu Arg Gly Glu
1 5 10 15
Met Asn Glu Gly Val Phe Val Trp Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Ala
20 25 30
Pro Val Gly Glu Arg Arg Phe Leu Pro Pro Glu Pro Pro Asp Ala Trp
35 40 45
Asp Gly Val Arg Glu Ala Thr Ser Phe Gly Pro Val Val Met Gln Pro
50 55 60
Ser Asp Pro Ile Phe Ser Gly Leu Leu Gly Arg Met Ser Glu Ala Pro
65 70 75 80
Ser Glu Asp Gly Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Ser Pro Ala Ala Asp Gly
85 90 95
Lys Lys Arg Pro Val Leu Phe Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Leu Phe
100 105 110
Gly Ser Gly Ser Ser Pro Trp Tyr Asp Gly Thr Ala Phe Ala Lys His
115 120 125
Gly Asp Val Val Val Val Thr Ile Asn Tyr Arg Met Asn Val Phe Gly
130 135 140
Phe Leu His Leu Gly Asp Ser Phe Gly Glu Ala Tyr Ala Gln Ala Gly
145 150 155 160
Asn Leu Gly Ile Leu Asp Gln Val Ala Ala Leu Arg Trp Val Lys Glu
165 170 175
Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asp Asn Ile Thr Ile Phe Gly
180 185 190
Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Gly Val Leu Leu Ser Leu Pro Glu
195 200 205
Ala Ser Gly Leu Phe Arg Arg Ala Met Leu Gln Ser Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Leu Leu Leu Arg Ser Pro Glu Thr Ala Met Ala Met Thr Glu Arg Ile
225 230 235 240
Leu Asp Lys Ala Gly Ile Arg Pro Gly Asp Arg Glu Arg Leu Leu Ser
245 250 255
Ile Pro Ala Glu Glu Leu Leu Arg Ala Ala Leu Ser Leu Gly Pro Gly
260 265 270
Val Met Tyr Gly Pro Val Val Asp Gly Arg Val Leu Arg Arg His Pro
275 280 285
Ile Glu Ala Leu Arg Tyr Gly Ala Ala Ser Gly Ile Pro Ile Leu Ile
290 295 300
Gly Val Thr Lys Asp Glu Tyr Asn Leu Phe Thr Leu Thr Asp Pro Ser
305 310 315 320
Trp Thr Lys Leu Gly Glu Lys Glu Leu Leu Asp Arg Ile Asn Arg Glu
325 330 335
Val Gly Pro Val Pro Glu Glu Ala Ile Arg Tyr Tyr Lys Glu Thr Ala
340 345 350
Glu Pro Ser Ala Pro Thr Trp Gln Thr Trp Leu Arg Ile Met Thr Tyr
355 360 365
Arg Val Phe Val Glu Gly Met Leu Arg Thr Ala Asp Ala Gln Ala Ala
370 375 380
Gln Gly Ala Asp Val Tyr Met Tyr Arg Phe Asp Tyr Glu Thr Pro Val
385 390 395 400
Phe Gly Gly Gln Leu Lys Ala Cys His Ala Leu Glu Leu Pro Phe Val
405 410 415
Phe His Asn Leu His Gln Pro Gly Val Ala Asn Phe Val Gly Asn Arg
420 425 430
Pro Glu Arg Glu Ala Ile Ala Asn Glu Met His Tyr Ala Trp Leu Ser
435 440 445
Phe Ala Arg Thr Gly Asp Pro Asn Gly Ala His Leu Pro Glu Ala Trp
450 455 460
Pro Ala Tyr Thr Asn Glu Arg Lys Ala Ala Phe Val Phe Ser Ala Ala
465 470 475 480
Ser His Val Glu Asp Asp Pro Phe Gly Arg Glu Arg Ala Ala Trp Gln
485 490 495
Gly Arg
<210> 139
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的酯酶的变体
<400> 139
atgaccgaac caaccgtggc acgtcccgac attgatcctg tcctcaagat gctcctggat 60
acctttcccg ttacctttac cgctgcagat ggtgttgaag tagcccgcgc acgcttacgt 120
cagcttaaga cccctcctga attgctgccg gaactgcgca tcgaagaacg cactgtgggg 180
tatgatggac tgactgacat tccagttcgt gtgtactggc caccagttgt tcgtgataac 240
ctgccggtcg ttgtttacta tcacgggggt ggttggagtt taggcggctt agatacccat 300
gacccagttg cacgtgcaca cgctgtaggc gcacaagcga tcgtcgtgtc ggtggactac 360
cgcctggcac cggaacatcc gtatccagcc ggcattgatg attcttgggc ggcactgcgt 420
tgggttggtg agaacgcagc ggaattgggt ggtgatccga gtcgtattgc agttgcgggc 480
gatagtgcgg gcggcaacat ttccgctgtg atggcacagc tggcacgtga tgttggtggt 540
ccgccactgg tgtttcaact gctctggtat ccaacgacta tggctgattt gtcgctgccg 600
agctttaccg agaatgctga tgcaccaatc ctggatcgtg atgtgattga cgcgtttctc 660
gcgtggtatg tacctggctt ggacatctcc gatcatacga tgctgcctac tactttggcc 720
cctggcaatg cggatctgag cggtttaccg ccagcgttca ttggtaccgc tgaacatgac 780
cctttacgcg acgacggagc gtgttatgcg gagttgctga ccgcagctgg tgtgagcgtc 840
gaactctcaa atgaacccac catggttcat ggctatgtga actttgcctt agtggttccg 900
gcggcggcag aagcaaccgg acgtggactg gccgccctga aacgtgcgct gcacgct 957
<210> 140
<211> 319
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 140
Met Thr Glu Pro Thr Val Ala Arg Pro Asp Ile Asp Pro Val Leu Lys
1 5 10 15
Met Leu Leu Asp Thr Phe Pro Val Thr Phe Thr Ala Ala Asp Gly Val
20 25 30
Glu Val Ala Arg Ala Arg Leu Arg Gln Leu Lys Thr Pro Pro Glu Leu
35 40 45
Leu Pro Glu Leu Arg Ile Glu Glu Arg Thr Val Gly Tyr Asp Gly Leu
50 55 60
Thr Asp Ile Pro Val Arg Val Tyr Trp Pro Pro Val Val Arg Asp Asn
65 70 75 80
Leu Pro Val Val Val Tyr Tyr His Gly Gly Gly Trp Ser Leu Gly Gly
85 90 95
Leu Asp Thr His Asp Pro Val Ala Arg Ala His Ala Val Gly Ala Gln
100 105 110
Ala Ile Val Val Ser Val Asp Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Pro Tyr
115 120 125
Pro Ala Gly Ile Asp Asp Ser Trp Ala Ala Leu Arg Trp Val Gly Glu
130 135 140
Asn Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asp Pro Ser Arg Ile Ala Val Ala Gly
145 150 155 160
Asp Ser Ala Gly Gly Asn Ile Ser Ala Val Met Ala Gln Leu Ala Arg
165 170 175
Asp Val Gly Gly Pro Pro Leu Val Phe Gln Leu Leu Trp Tyr Pro Thr
180 185 190
Thr Met Ala Asp Leu Ser Leu Pro Ser Phe Thr Glu Asn Ala Asp Ala
195 200 205
Pro Ile Leu Asp Arg Asp Val Ile Asp Ala Phe Leu Ala Trp Tyr Val
210 215 220
Pro Gly Leu Asp Ile Ser Asp His Thr Met Leu Pro Thr Thr Leu Ala
225 230 235 240
Pro Gly Asn Ala Asp Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ala Phe Ile Gly Thr
245 250 255
Ala Glu His Asp Pro Leu Arg Asp Asp Gly Ala Cys Tyr Ala Glu Leu
260 265 270
Leu Thr Ala Ala Gly Val Ser Val Glu Leu Ser Asn Glu Pro Thr Met
275 280 285
Val His Gly Tyr Val Asn Phe Ala Leu Val Val Pro Ala Ala Ala Glu
290 295 300
Ala Thr Gly Arg Gly Leu Ala Ala Leu Lys Arg Ala Leu His Ala
305 310 315

Claims (29)

1.一种工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQ ID NO:2之间的氨基酸差异为L282A/C/T和选自以下的1-9个取代：P63A/R/T/Y、Y65G/W、A68P、I69F/L/M/W/Y、G70A/L、A108G/S、T110A、R126C、V181L、E184S、M189A/E/I/L/Q、G212A/P、A213L/S、G214R、N215K/P/R/W、A249T、P268A、A269L/N、V270E/I、W271S/Y、G277M、V280G、L281P、A285L/P、V287I、T317P、Y320G/W、F323C/I/Y、P331Q、A343V、G346S、I372L/M、T373G、F377I/L/Y、A381L、A429V、V445L和G459R，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2来编号。
2.如权利要求1所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQID NO:2之间的氨基酸差异为L282A和选自以下的1-7个取代：P63R、Y65G、A68P、I69L/W、A108G、M189E/I、G214R、N215P、W271Y、V280G、L281P、A285L、Y320W、F323I、A343V、I372L、F377L/Y和A381L。
3.如权利要求1所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQID NO:2之间的氨基酸差异为L282C和选自以下的2-7个取代：A68P、I69L、M189I/Q、N215P、W271Y、V280G、L281P、V287I、A343V、I372L、F377Y和A381L。
4.如权利要求1所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQID NO:2之间的氨基酸差异为L282T和选自以下的1-7个取代：P63A/R/T/Y、Y65G/W、A68P、I69F/L/M/W/Y、G70A/L、A108G/S、T110A、R126C、V181L、E184S、M189A/E/I/L/Q、G212A/P、A213L/S、G214R、N215K/P/R/W、A249T、P268A、A269L/N、V270E/I、W271S/Y、G277M、V280G、L281P、A285L/P、T317P、Y320G/W、F323C/I/Y、P331Q、A343V、G346S、I372L/M、T373G、F377I/L/Y、A381L、A429V、V445L和G459R。
5.如权利要求1所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQID NO:2之间的氨基酸差异为I69F/L/M/W/Y、L282T和选自以下的1-6个取代：Y65W、A68P、G70A/L、A108G/S、T110A、M189E/I/L/Q、G212A、A213L、G214R、N215K/P/R、A269L、V270E/I/Y、V280G、L281P、A285L/P、T317P、F323Y、P331Q、A343V、I372L/M、T373G、F377L/Y、A381L和G459R。
6.如权利要求1所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQID NO:2之间的氨基酸差异为I69L、L282T、I372L/M和选自以下的1-5个取代：Y65W、A68P、G70L、M189E/Q、G214R、N215P、W271Y、V280G、P331Q、A343V和A381L。
7.如权利要求1所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQID NO:2之间的氨基酸差异为A108G/S、L282T和选自以下的1-4个取代：P63R、Y65G、A68P、I69F/W/Y、M189L、N215K/P、A269L、V270E、L281P、A285L/P、Y320W、F323C/I、I372L和F377I/L。
8.如权利要求1所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQID NO:2之间的氨基酸差异为M189A/E/I/L/Q、L282T和选自以下的1-6个取代：P63A/R/Y、Y65G、A68P、I69F/L/W/Y、A108G、R126C、E184S、G214R、N215K/P/R、A249T、V270E、W271Y、G277M、V280G、L281P、A285L、Y320W、A343V、I372L、T373G、F377I/Y和A381L。
9.如权利要求1所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQID NO:2之间的氨基酸差异为N215K/P/R/W、L282T和选自以下的1-6个取代：P63A/T/Y、A68P、I69F/L/W/Y、A108G、T110A、R126C、V181L、M189I、G212A/P、A213L/S、G214R、A249T、P268A、A269N/L、V270I、W271Y/S、G277M、V280G、L281P、A285L/P、T317P、Y320G、F323Y、A343V、G346S、I372L、T373G、F377L/Y、A381L和V445L。
10.如权利要求1所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQID NO:2之间的氨基酸差异为I69L、L282C和选自以下的2-6个取代：A68P、M189I、N215P、W271Y、V280G、L281P、V287I、A343V、I372L、F377Y和A381L。
11.如权利要求1所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQID NO:2之间的氨基酸差异为I69L/W、L282A和选自以下的1-5个取代：A68P、M189E/I、G214R、N215P、W271Y、V280G、L281P、A343V、I372L和F377Y。
12.如权利要求1所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶的多肽序列与SEQID NO:2之间的氨基酸差异为I69L/W、M189I/E、L281P、L282A和选自以下的1-4个取代：A68P、G214R、W271Y、V280G、A343V、I372L和F377Y。
13.一种工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶是由表8.1中的变体编号2-4、8-10、55、110和240以及表11.1中的变体编号241-446所表示的工程化羧酸酯酶变体中的任一个。
14.如权利要求1-13中任一项所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶是纯化的。
15.如权利要求1-13中任一项所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶是被固定的。
16.如权利要求14所述的工程化羧酸酯酶，其中所述工程化羧酸酯酶是被固定的。
17.一种组合物，所述组合物包含至少一种如权利要求1-16中任一项所述的工程化羧酸酯酶。
18.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码至少一种如权利要求1-13中任一项所述的工程化羧酸酯酶。
19.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码至少一种工程化羧酸酯酶，所述多核苷酸序列为SEQ ID NO:3、5、7、11、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133。
20.如权利要求18-19中任一项所述的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可操作地连接至控制序列。
21.如权利要求18-19中任一项所述的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列是经密码子优化的。
22.如权利要求20所述的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列是经密码子优化的。
23.一种表达载体，所述表达载体包括至少一种如权利要求18-22中任一项所述的多核苷酸序列。
24.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括至少一种如权利要求23所述的表达载体。
25.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括至少一种如权利要求18-22中任一项所述的多核苷酸序列。
26.如权利要求24或25所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
27.一种在宿主细胞中产生工程化羧酸酯酶的方法，所述方法包括在合适的条件下培养如权利要求24-26中任一项所述的宿主细胞，使得产生至少一种工程化羧酸酯酶。
28.如权利要求27所述的方法，所述方法还包括从培养物和/或所述宿主细胞回收至少一种工程化羧酸酯酶。
29.如权利要求27或28所述的方法，所述方法还包括纯化所述至少一种工程化羧酸酯酶的步骤。
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