JP2023062167A - アミドカップリングのためのカルボキシエステラーゼポリペプチド - Google Patents
アミドカップリングのためのカルボキシエステラーゼポリペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023062167A JP2023062167A JP2023026052A JP2023026052A JP2023062167A JP 2023062167 A JP2023062167 A JP 2023062167A JP 2023026052 A JP2023026052 A JP 2023026052A JP 2023026052 A JP2023026052 A JP 2023026052A JP 2023062167 A JP2023062167 A JP 2023062167A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- engineered
- carboxylesterase
- sequence
- polypeptide
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 title claims abstract description 318
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 title claims abstract description 312
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 303
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 300
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 298
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 title description 11
- 230000008878 coupling Effects 0.000 title description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 title description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 title description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 145
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 145
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 145
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 89
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 146
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 86
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 86
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 64
- -1 2-pyrazinylethyl ester Chemical class 0.000 claims description 58
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 57
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 31
- MTZQAGJQAFMTAQ-UHFFFAOYSA-N ethyl benzoate Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=CC=C1 MTZQAGJQAFMTAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N Clorprenaline hydrochloride Chemical compound O.Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=CC=C1Cl DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 25
- KDSNLYIMUZNERS-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropanamine Chemical compound CC(C)CN KDSNLYIMUZNERS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 230000009435 amidation Effects 0.000 claims description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 18
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 15
- CRZQGDNQQAALAY-UHFFFAOYSA-N Methyl benzeneacetate Chemical compound COC(=O)CC1=CC=CC=C1 CRZQGDNQQAALAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 13
- IFLXDVZKUJKDHB-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-benzamidocarbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NNC(=O)C1=CC=CC=C1 IFLXDVZKUJKDHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- UZOFELREXGAFOI-UHFFFAOYSA-N 4-methylpiperidine Chemical compound CC1CCNCC1 UZOFELREXGAFOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N butan-1-amine Chemical compound CCCCN HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- RQEUFEKYXDPUSK-SSDOTTSWSA-N (1R)-1-phenylethanamine Chemical compound C[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 RQEUFEKYXDPUSK-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 6
- FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N N-phenylacetamide Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC=C1 FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N tert-butylamine Chemical compound CC(C)(C)N YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N benzopyrrole Natural products C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- BAXKIBHBAJDALN-UHFFFAOYSA-N (4-methylpiperidin-1-yl)-phenylmethanone Chemical compound C1CC(C)CCN1C(=O)C1=CC=CC=C1 BAXKIBHBAJDALN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- SDINAAZVUJJEIG-UHFFFAOYSA-N 2-(4-methylpiperidin-2-yl)pyrazine Chemical compound C1C(C)CCNC1C1=CN=CC=N1 SDINAAZVUJJEIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001413 acetanilide Drugs 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NFEIEXKPJIIOLS-UHFFFAOYSA-N n-(2-methylpropyl)-1h-indole-4-carboxamide Chemical compound CC(C)CNC(=O)C1=CC=CC2=C1C=CN2 NFEIEXKPJIIOLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZABMXPJUCKVZSH-UHFFFAOYSA-N n-(2-methylpropyl)benzamide Chemical compound CC(C)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 ZABMXPJUCKVZSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FALTVGCCGMDSNZ-GFCCVEGCSA-N n-[(1r)-1-phenylethyl]benzamide Chemical compound N([C@H](C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)C1=CC=CC=C1 FALTVGCCGMDSNZ-GFCCVEGCSA-N 0.000 claims description 3
- FALTVGCCGMDSNZ-LBPRGKRZSA-N n-[(1s)-1-phenylethyl]benzamide Chemical compound N([C@@H](C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)C1=CC=CC=C1 FALTVGCCGMDSNZ-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 3
- QAEFPYYSYZEDPQ-JTQLQIEISA-N n-[(1s)-1-phenylethyl]pyrazin-2-amine Chemical compound N([C@@H](C)C=1C=CC=CC=1)C1=CN=CC=N1 QAEFPYYSYZEDPQ-JTQLQIEISA-N 0.000 claims description 3
- VLKWLCAFNMVMNL-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-2-hydroxybenzamide Chemical compound CC(C)(C)NC(=O)C1=CC=CC=C1O VLKWLCAFNMVMNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 244000246877 Thelepogon elegans Species 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 156
- 102220356672 c.201_202delCGinsTC Human genes 0.000 description 130
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 130
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 99
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 90
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 51
- 239000000047 product Substances 0.000 description 49
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 45
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 45
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 44
- 102000004308 Carboxylic Ester Hydrolases Human genes 0.000 description 43
- 108090000863 Carboxylic Ester Hydrolases Proteins 0.000 description 43
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 29
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 26
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 26
- 102220075964 rs796052478 Human genes 0.000 description 26
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 23
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 23
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 21
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 20
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 19
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 18
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 17
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 16
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 16
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 14
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 241000203780 Thermobifida fusca Species 0.000 description 13
- UFFBMTHBGFGIHF-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylaniline Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1N UFFBMTHBGFGIHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 12
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 12
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 12
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical group N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 10
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 10
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 9
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 9
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 9
- 125000004446 heteroarylalkyl group Chemical group 0.000 description 9
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 102220262235 rs1431688642 Human genes 0.000 description 8
- 102220007498 rs33929459 Human genes 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 7
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 7
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 7
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 7
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 7
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 7
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 7
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 7
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 125000004404 heteroalkyl group Chemical group 0.000 description 6
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 6
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 5
- 101000757144 Aspergillus niger Glucoamylase Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 5
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 5
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052717 sulfur Chemical group 0.000 description 5
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 description 5
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 4
- 102220612792 Calcyclin-binding protein_P66N_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102220559691 Differentially expressed in FDCP 8 homolog_A71R_mutation Human genes 0.000 description 4
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N N-methylisoleucine Chemical compound CCC(C)C(NC)C(O)=O KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102220474937 Putative homeobox protein Meis3-like 1_P63T_mutation Human genes 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical compound C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 230000002862 amidating effect Effects 0.000 description 4
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 150000003857 carboxamides Chemical class 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 102200133466 rs115923556 Human genes 0.000 description 4
- 102200082932 rs33929459 Human genes 0.000 description 4
- 102220005474 rs33939421 Human genes 0.000 description 4
- 102220005323 rs33946401 Human genes 0.000 description 4
- 102200118203 rs33947415 Human genes 0.000 description 4
- 102220308695 rs777211110 Human genes 0.000 description 4
- 102200006156 rs876658534 Human genes 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 4
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 4
- RQEUFEKYXDPUSK-ZETCQYMHSA-N (1S)-1-phenylethanamine Chemical compound C[C@H](N)C1=CC=CC=C1 RQEUFEKYXDPUSK-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 3
- SXGMVGOVILIERA-UHFFFAOYSA-N 2,3-diaminobutanoic acid Chemical compound CC(N)C(N)C(O)=O SXGMVGOVILIERA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JJDJLFDGCUYZMN-QMMMGPOBSA-N 3-chloro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC(Cl)=C1 JJDJLFDGCUYZMN-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 3
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 3
- 108010037870 Anthranilate Synthase Proteins 0.000 description 3
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N L-pipecolic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]1CCCC[NH2+]1 HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 3
- 102220500831 Phospholipid-transporting ATPase ABCA1_Y65S_mutation Human genes 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 3
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000006350 alkyl thio alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 3
- GFZWHAAOIVMHOI-UHFFFAOYSA-N azetidine-3-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CNC1 GFZWHAAOIVMHOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N benzopyrazine Natural products N1=CC=NC2=CC=CC=C21 XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 3
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 3
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 3
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 3
- 125000004447 heteroarylalkenyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000005312 heteroarylalkynyl group Chemical group 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 3
- HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N l-pipecolic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 125000001820 oxy group Chemical group [*:1]O[*:2] 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 3
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 102200025794 rs179363887 Human genes 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FQRURPFZTFUXEZ-MRVPVSSYSA-N (2s)-2,3,3,3-tetrafluoro-2-(n-fluoroanilino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@](F)(C(F)(F)F)N(F)C1=CC=CC=C1 FQRURPFZTFUXEZ-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 2
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- PECGVEGMRUZOML-AWEZNQCLSA-N (2s)-2-amino-3,3-diphenylpropanoic acid Chemical compound C=1C=CC=CC=1C([C@H](N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 PECGVEGMRUZOML-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 2
- GDMOHOYNMWWBAU-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-(3-bromophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC(Br)=C1 GDMOHOYNMWWBAU-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- BURBNIPKSRJAIQ-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-[3-(trifluoromethyl)phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 BURBNIPKSRJAIQ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- YTHDRUZHNYKZGF-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-azaniumyl-3-(3-nitrophenyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 YTHDRUZHNYKZGF-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- HBEDSQVIWPRPAY-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrobenzofuran Chemical compound C1=CC=C2OCCC2=C1 HBEDSQVIWPRPAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CRYOBSXYQNJFNR-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dimethylphenyl)acetamide Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1CC(N)=O CRYOBSXYQNJFNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MLLSSTJTARJLHK-UHFFFAOYSA-N 3-aminocyclopentane-1-carboxylic acid Chemical compound NC1CCC(C(O)=O)C1 MLLSSTJTARJLHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JZRBSTONIYRNRI-VIFPVBQESA-N 3-methylphenylalanine Chemical compound CC1=CC=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=C1 JZRBSTONIYRNRI-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 5-aminopentanoic acid Chemical compound [NH3+]CCCCC([O-])=O JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101100163849 Arabidopsis thaliana ARS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000690713 Aspergillus niger Alpha-glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 2
- 101000695691 Bacillus licheniformis Beta-lactamase Proteins 0.000 description 2
- 108010029675 Bacillus licheniformis alpha-amylase Proteins 0.000 description 2
- 101000755953 Bacillus subtilis (strain 168) Ribosome maturation factor RimP Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 2
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 101100369308 Geobacillus stearothermophilus nprS gene Proteins 0.000 description 2
- 101100080316 Geobacillus stearothermophilus nprT gene Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 2
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N N-methyl-L-valine Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(O)=O AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N Pyrazine Chemical compound C1=CN=CC=N1 KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 2
- 101100097319 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ala1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000131494 Shinella fusca Species 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220564083 Synphilin-1_P64W_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 125000002490 anilino group Chemical group [H]N(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000006757 chemical reactions by type Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N chlorothalonil Chemical compound ClC1=C(Cl)C(C#N)=C(Cl)C(C#N)=C1Cl CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 2
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 108010061330 glucan 1,4-alpha-maltohydrolase Proteins 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N isopropanol acetate Natural products CC(C)OC(C)=O JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940011051 isopropyl acetate Drugs 0.000 description 2
- AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N isoquinoline Chemical compound C1=NC=CC2=CC=CC=C21 AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M isovalerate Chemical compound CC(C)CC([O-])=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- VWHRYODZTDMVSS-QMMMGPOBSA-N m-fluoro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC(F)=C1 VWHRYODZTDMVSS-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- KQSSATDQUYCRGS-UHFFFAOYSA-N methyl glycinate Chemical compound COC(=O)CN KQSSATDQUYCRGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N phenanthridine Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=NC2=C1 RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N pipecolic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003386 piperidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 102220277134 rs776745497 Human genes 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005420 sulfonamido group Chemical class S(=O)(=O)(N*)* 0.000 description 2
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NMDDZEVVQDPECF-LURJTMIESA-N (2s)-2,7-diaminoheptanoic acid Chemical compound NCCCCC[C@H](N)C(O)=O NMDDZEVVQDPECF-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- WBZIGVCQRXJYQD-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-3-(1,3-thiazol-4-yl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CSC=N1 WBZIGVCQRXJYQD-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NHBKDLSKDKUGSB-VIFPVBQESA-N (2s)-2-amino-3-(2-methylphenyl)propanoic acid Chemical compound CC1=CC=CC=C1C[C@H](N)C(O)=O NHBKDLSKDKUGSB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- NRCSJHVDTAAISV-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-(3,4-dichlorophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 NRCSJHVDTAAISV-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ZHUOMTMPTNZOJE-VIFPVBQESA-N (2s)-2-amino-3-(3-cyanophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC(C#N)=C1 ZHUOMTMPTNZOJE-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- PEMUHKUIQHFMTH-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-(4-bromophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(Br)C=C1 PEMUHKUIQHFMTH-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KWIPUXXIFQQMKN-VIFPVBQESA-N (2s)-2-amino-3-(4-cyanophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(C#N)C=C1 KWIPUXXIFQQMKN-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- DQLHSFUMICQIMB-VIFPVBQESA-N (2s)-2-amino-3-(4-methylphenyl)propanoic acid Chemical compound CC1=CC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C=C1 DQLHSFUMICQIMB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- CRFFPDBJLGAGQL-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-[4-(trifluoromethyl)phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 CRFFPDBJLGAGQL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ADJZXDVMJPTFKT-JTQLQIEISA-N (2s)-2-azaniumyl-4-(1h-indol-3-yl)butanoate Chemical compound C1=CC=C2C(CC[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 ADJZXDVMJPTFKT-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- FMUMEWVNYMUECA-LURJTMIESA-N (2s)-2-azaniumyl-5-methylhexanoate Chemical compound CC(C)CC[C@H](N)C(O)=O FMUMEWVNYMUECA-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- HOZBSSWDEKVXNO-BXRBKJIMSA-N (2s)-2-azanylbutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O HOZBSSWDEKVXNO-BXRBKJIMSA-N 0.000 description 1
- XOZMVGJVSFVJGA-VIFPVBQESA-N (2s)-3-phenyl-2-(phosphonomethylamino)propanoic acid Chemical compound OP(=O)(O)CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 XOZMVGJVSFVJGA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2CNC(C(=O)O)CC2=C1 BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 1-butoxybutane Chemical compound CCCCOCCCC DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 10H-phenothiazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3SC2=C1 WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 10H-phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150097623 1B gene Proteins 0.000 description 1
- BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 1H-indazole Chemical compound C1=CC=C2C=NNC2=C1 BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HUHXLHLWASNVDB-UHFFFAOYSA-N 2-(oxan-2-yloxy)oxane Chemical class O1CCCCC1OC1OCCCC1 HUHXLHLWASNVDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEFLPVKMPDEMFW-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-(2,4-difluorophenyl)propanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(F)C=C1F UEFLPVKMPDEMFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OCDHPLVCNWBKJN-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-(2-cyanophenyl)propanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1C#N OCDHPLVCNWBKJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRAWYXDDKCVZTL-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-(3,4-difluorophenyl)propanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(F)C(F)=C1 PRAWYXDDKCVZTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-thiophen-2-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CS1 WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYCRCTMDYITATC-UHFFFAOYSA-N 2-fluorophenylalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1F NYCRCTMDYITATC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 2-methyltetrahydrofuran Chemical compound CC1CCCO1 JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLRSADZEDXVUPG-UHFFFAOYSA-N 2-naphthalen-1-ylpyridine Chemical compound N1=CC=CC=C1C1=CC=CC2=CC=CC=C12 VLRSADZEDXVUPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHMICKWLTGFITH-UHFFFAOYSA-N 2H-isoindole Chemical compound C1=CC=CC2=CNC=C21 VHMICKWLTGFITH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 2H-pyran Chemical compound C1OC=CC=C1 MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJJYCYZKUNRKFP-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-5-phenylpentanoate Chemical compound OC(=O)CC(N)CCC1=CC=CC=C1 CJJYCYZKUNRKFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BXRLWGXPSRYJDZ-UHFFFAOYSA-N 3-cyanoalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC#N BXRLWGXPSRYJDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IRZQDMYEJPNDEN-UHFFFAOYSA-N 3-phenyl-2-aminobutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C)C1=CC=CC=C1 IRZQDMYEJPNDEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 4-amino-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N)C=C1 CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 4-fluoro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(F)C=C1 XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- PZNQZSRPDOEBMS-QMMMGPOBSA-N 4-iodo-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(I)C=C1 PZNQZSRPDOEBMS-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GTVVZTAFGPQSPC-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenylalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 GTVVZTAFGPQSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000534414 Anotopterus nikparini Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 101000961203 Aspergillus awamori Glucoamylase Proteins 0.000 description 1
- 101900127796 Aspergillus oryzae Glucoamylase Proteins 0.000 description 1
- 101900318521 Aspergillus oryzae Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 101000775727 Bacillus amyloliquefaciens Alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 101900040182 Bacillus subtilis Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 102100030981 Beta-alanine-activating enzyme Human genes 0.000 description 1
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004072 C09CA03 - Valsartan Substances 0.000 description 1
- HAHXEAXSYFLCFN-UHFFFAOYSA-N CCNN(CC(=O)OC)NCC Chemical compound CCNN(CC(=O)OC)NCC HAHXEAXSYFLCFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 102100037633 Centrin-3 Human genes 0.000 description 1
- 239000005647 Chlorpropham Substances 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N Cysteine Chemical compound SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101100342470 Dictyostelium discoideum pkbA gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100385973 Escherichia coli (strain K12) cycA gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N Fenclonine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(Cl)C=C1 NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101150108358 GLAA gene Proteins 0.000 description 1
- 101000920847 Geobacillus stearothermophilus Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 101100001650 Geobacillus stearothermophilus amyM gene Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000773364 Homo sapiens Beta-alanine-activating enzyme Proteins 0.000 description 1
- 101000880522 Homo sapiens Centrin-3 Proteins 0.000 description 1
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRYCSMQKUKOKBP-UHFFFAOYSA-N Imidazolidine Chemical compound C1CNCN1 WRYCSMQKUKOKBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N L-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LOOZZTFGSTZNRX-VIFPVBQESA-N L-Homotyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC1=CC=C(O)C=C1 LOOZZTFGSTZNRX-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N L-alpha-aminobutyric acid Chemical compound CC[C@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- DGYHPLMPMRKMPD-UHFFFAOYSA-N L-propargyl glycine Natural products OC(=O)C(N)CC#C DGYHPLMPMRKMPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 description 1
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 1
- 241001468191 Lactobacillus kefiri Species 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710098556 Lipase A Proteins 0.000 description 1
- 101710099648 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102100026001 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 101150068888 MET3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- SBKRTALNRRAOJP-BWSIXKJUSA-N N-[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-4-amino-1-oxo-1-[[(3S,6S,9S,12S,15R,18R,21S)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-15-benzyl-3-[(1R)-1-hydroxyethyl]-12-(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxobutan-2-yl]-6-methylheptanamide (6S)-N-[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-4-amino-1-oxo-1-[[(3S,6S,9S,12S,15R,18R,21S)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-15-benzyl-3-[(1R)-1-hydroxyethyl]-12-(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxobutan-2-yl]-6-methyloctanamide sulfuric acid Polymers OS(O)(=O)=O.CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@@H](CCN)NC1=O)[C@@H](C)O.CC[C@H](C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@@H](CCN)NC1=O)[C@@H](C)O SBKRTALNRRAOJP-BWSIXKJUSA-N 0.000 description 1
- 101100022915 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028200 Ornithine transcarbamylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710113020 Ornithine transcarbamylase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100037214 Orotidine 5'-phosphate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010055012 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N Oxazole Chemical compound C1=COC=N1 ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002390 Pandanus odoratissimus Species 0.000 description 1
- 235000005311 Pandanus odoratissimus Nutrition 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100040402 Phlorizin hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical group CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N Pyrazole Chemical compound C=1C=NNC=1 WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101000968489 Rhizomucor miehei Lipase Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101900354623 Saccharomyces cerevisiae Galactokinase Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 101100022918 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) sua1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003436 Schotten-Baumann reaction Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 241000297434 Stenotarsus subtilis Species 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 241001129171 Tenagodrilus musculus Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241001313536 Thermothelomyces thermophila Species 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000186864 Weissella minor Species 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000004442 acylamino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000004183 alkoxy alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000005215 alkyl ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000004644 alkyl sulfinyl group Chemical class 0.000 description 1
- 125000004390 alkyl sulfonyl group Chemical class 0.000 description 1
- 125000004656 alkyl sulfonylamino group Chemical class 0.000 description 1
- WNNNWFKQCKFSDK-UHFFFAOYSA-N allylglycine Chemical compound OC(=O)C(N)CC=C WNNNWFKQCKFSDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011938 amidation process Methods 0.000 description 1
- 238000010976 amide bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000005428 anthryl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C3C(*)=C([H])C([H])=C([H])C3=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006615 aromatic heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000005018 aryl alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005015 aryl alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 238000011190 asparagine deamidation Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 125000004196 benzothienyl group Chemical group S1C(=CC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003739 carbamimidoyl group Chemical group C(N)(=N)* 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- CWJSHJJYOPWUGX-UHFFFAOYSA-N chlorpropham Chemical compound CC(C)OC(=O)NC1=CC=CC(Cl)=C1 CWJSHJJYOPWUGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- WCZVZNOTHYJIEI-UHFFFAOYSA-N cinnoline Chemical compound N1=NC=CC2=CC=CC=C21 WCZVZNOTHYJIEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000392 cycloalkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000000 cycloalkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001316 cycloalkyl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 101150005799 dagA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011188 deamidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 125000004663 dialkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- CKIDTYWBOZNDIH-UHFFFAOYSA-N diethylamino-[(dimethylamino)methyl]-dimethylazanium Chemical compound CCN(CC)[N+](C)(C)CN(C)C CKIDTYWBOZNDIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWHBCTLVWOCMPQ-UHFFFAOYSA-L disodium;2-[(3,5-diiodo-4-oxidophenyl)-(3,5-diiodo-4-oxocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]benzoate Chemical group [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C(C=1C=C(I)C([O-])=C(I)C=1)=C1C=C(I)C(=O)C(I)=C1 CWHBCTLVWOCMPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- ZIUDZKABRXGZFO-UHFFFAOYSA-N ethyl 1h-indole-4-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=CC2=C1C=CN2 ZIUDZKABRXGZFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- SZYQPTAROQANMV-UHFFFAOYSA-N ethyl pyrazine-2-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C1=CN=CC=N1 SZYQPTAROQANMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Substances NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 125000004438 haloalkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 125000005553 heteroaryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- MTNDZQHUAFNZQY-UHFFFAOYSA-N imidazoline Chemical compound C1CN=CN1 MTNDZQHUAFNZQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 description 1
- 125000003387 indolinyl group Chemical group N1(CCC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- HOBCFUWDNJPFHB-UHFFFAOYSA-N indolizine Chemical compound C1=CC=CN2C=CC=C21 HOBCFUWDNJPFHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003406 indolizinyl group Chemical group C=1(C=CN2C=CC=CC12)* 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 125000002346 iodo group Chemical group I* 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 1
- ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N isothiazole Chemical compound C=1C=NSC=1 ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N isoxazole Chemical compound C=1C=NOC=1 CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- VOBHXZCDAVEXEY-JSGCOSHPSA-N lisdexamfetamine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 VOBHXZCDAVEXEY-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 229960001451 lisdexamfetamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 125000006178 methyl benzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150105920 npr gene Proteins 0.000 description 1
- 101150017837 nprM gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 108090000021 oryzin Proteins 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 101150019841 penP gene Proteins 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N phencyclidine Chemical compound C1CCCCN1C1(C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950000688 phenothiazine Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Chemical group O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- LFSXCDWNBUNEEM-UHFFFAOYSA-N phthalazine Chemical compound C1=NN=CC2=CC=CC=C21 LFSXCDWNBUNEEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960003548 polymyxin b sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- LFULEKSKNZEWOE-UHFFFAOYSA-N propanil Chemical compound CCC(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 LFULEKSKNZEWOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 101150108007 prs gene Proteins 0.000 description 1
- 101150086435 prs1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150070305 prsA gene Proteins 0.000 description 1
- CPNGPNLZQNNVQM-UHFFFAOYSA-N pteridine Chemical compound N1=CN=CC2=NC=CN=C21 CPNGPNLZQNNVQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N pyridazine Chemical compound C1=CC=NN=C1 PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005344 pyridylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C(=N1)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 1
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N quinazoline Chemical compound N1=CN=CC2=CC=CC=C21 JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004621 quinuclidinyl group Chemical group N12C(CC(CC1)CC2)* 0.000 description 1
- 235000008001 rakum palm Nutrition 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005415 substituted alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005346 substituted cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003718 tetrahydrofuranyl group Chemical group 0.000 description 1
- IBBLKSWSCDAPIF-UHFFFAOYSA-N thiopyran Chemical compound S1C=CC=C=C1 IBBLKSWSCDAPIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O triethylammonium ion Chemical compound CC[NH+](CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- 125000000876 trifluoromethoxy group Chemical group FC(F)(F)O* 0.000 description 1
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 1
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 1
- SJSNUMAYCRRIOM-QFIPXVFZSA-N valsartan Chemical compound C1=CC(CN(C(=O)CCCC)[C@@H](C(C)C)C(O)=O)=CC=C1C1=CC=CC=C1C1=NN=N[N]1 SJSNUMAYCRRIOM-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- 229960004699 valsartan Drugs 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01001—Carboxylesterase (3.1.1.1)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】本発明は、天然に存在する野生型カルボキシエステラーゼ酵素と比較して改善された特性を有する操作されたカルボキシエステラーゼ酵素、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をアミド化反応において使用する方法を提供する。【解決手段】本発明は、天然に存在する野生型(WT)カルボキシエステラーゼ酵素と比較して改善された非ネイティブ特性を有する操作されたカルボキシエステラーゼ(E.C.3.1.1)、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をアミド化反応に適用する方法を提供する。【選択図】なし
Description
本出願は、2017年12月13日に出願された米国仮特許出願第62/598,189号(これは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる)の優先権を主張する。
配列表、表またはコンピュータープログラムの参照
37 C.F.R.§1.821に基づいて、ファイル名CX2-165US1_ST25.txtとしてEFS-Webを介して本明細書と共に同時に提出されたコンピュータ可読形式(CRF)の配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表の電子コピーは2018年12月7日に作成されたものであり、420Kバイトのファイルサイズである。
37 C.F.R.§1.821に基づいて、ファイル名CX2-165US1_ST25.txtとしてEFS-Webを介して本明細書と共に同時に提出されたコンピュータ可読形式(CRF)の配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表の電子コピーは2018年12月7日に作成されたものであり、420Kバイトのファイルサイズである。
発明の分野
本発明は、天然に存在する野生型(WT)カルボキシエステラーゼ酵素と比較して改善された非ネイティブ特性を有する操作されたカルボキシエステラーゼ(E.C.3.1.1)、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をアミド化反応に適用する方法を提供する。
本発明は、天然に存在する野生型(WT)カルボキシエステラーゼ酵素と比較して改善された非ネイティブ特性を有する操作されたカルボキシエステラーゼ(E.C.3.1.1)、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をアミド化反応に適用する方法を提供する。
アミド結合は、ポリマー(例えば、タンパク質、ナイロン)、殺虫剤(例えば、プロパニル、クロルプロファム)および医薬品(例えば、バルサルタン、リスデキサンフェタミン)を含む様々な合成分子における重要な機能部分である。新規薬物候補の探求において用いられる反応タイプの保有率に関する最近の調査には、これらの反応のすべての中でN-アシルアミド化がおよそ16%であることが掲載されていた(Roughley and Jordan,J.Med.Chem.,54:3451-3479[2011])。伝統的な化学的方法を使用して生成された場合、アミド結合形成は資源集約型変換である。アミド結合は、典型的には、カルボン酸およびアミンから合成される。しかしながら、周囲温度では、これら2つの官能基間の反応は自発的に起こらず、必要な水除去は高温(例えば、200℃)においてのみ起こる。これらの条件は、基質および生成物に有害である傾向がある。
より適切な条件下でアミド化が起こるためには、アミンにカップリングさせるために、カルボン酸の活性化が一般に必要とされる。カルボン酸活性化は、通常、活性化エステルもしくは無水物を形成するためにカップリング試薬を用いて、またはカルボン酸を対応する酸塩化物に変換することにより生じる(すなわち、ショッテン・バウマン反応による;El-Faham and Albericio,Chem.Rev.,111:6557-6602[2011]を参照のこと)。これらの反応は、原子非効率的合成経路を利用する過剰なまたは化学量論的濃度の高価なカップリング試薬を用いて実施される(Pattabiraman and Bode,Nature,480:471-479[2011]を参照のこと)。加えて、試薬およびその結果生じる廃棄物は非常に毒性であり、環境に優しくないものであり得る。これらの反応で形成された生成物分子当たり少なくとも1当量の廃棄物が生成され、非常に低い原子経済性がもたらされる。反応混合物からの廃棄物の除去は、面倒で費用のかかるプロセスである。したがって、様々な状況におけるアミド結合の生成のために、より効率的で環境に良い手段が当技術分野で必要とされている。
リパーゼは、脂肪酸エステルの加水分解のために商業規模で適用されており、エステルのアミド化に用いられている(Seem Faber,Biotransformations in Organic Chemistry,In Special Techniques,Springer-Verlag,New York,NY,[2011];およびKalkoteら、Asian J.Biochem.,2:279-283[2007])。典型的なカップリングアプローチのようにカルボン酸を活性化する必要がないので、酵素を使用したアミド結合の形成は、非常に原子経済的なプロセスである。それらは環境に良く、穏やかな条件下で起こり、現在利用可能な化学経路よりも安価であるので、これらの反応における酵素の使用は、大きな産業的価値を提供する。真核生物プロテアーゼおよびリパーゼはアミド結合を形成することができるが(Adolfssonら、Chem.Soc.Rev.,43:2714-2742[2014];Guzmanら、Elec.J.Biotech.,10(2)[2007];およびAsanoら、J.Biosci.Bioeng.,100(6):662-666[2005]を参照のこと)、典型的には、これらの酵素は、原核生物発現系においてほとんど発現されず、有機溶媒中では性能が劣り得る。対照的に、定向進化法により、本発明のカルボキシエステラーゼは、原核生物(大腸菌)発現系において容易に産生され、この反応タイプにより適切な有機溶媒レジームにおいて、耐性および実用性が増加する。
Roughley and Jordan,J.Med.Chem.,54:3451-3479[2011]
El-Faham and Albericio,Chem.Rev.,111:6557-6602[2011]
Pattabiraman and Bode,Nature,480:471-479[2011]
Seem Faber,Biotransformations in Organic Chemistry,In Special Techniques,Springer-Verlag,New York,NY,[2011]
Kalkoteら、Asian J.Biochem.,2:279-283[2007]
Adolfssonら、Chem.Soc.Rev.,43:2714-2742[2014]
Guzmanら、Elec.J.Biotech.,10(2)[2007]
Asanoら、J.Biosci.Bioeng.,100(6):662-666[2005]
本発明は、天然に存在する野生型(WT)カルボキシエステラーゼ酵素と比較して改善された非ネイティブ特性を有する操作されたカルボキシエステラーゼ(EC3.1.1)、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をアミド化反応に適用する方法を提供する。
本発明は、配列番号2と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、それらのポリペプチド配列中に少なくと
も1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされている操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438および470から選択される位置における置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、39/323、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、153、153/215、164/271、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224/268/372、249/284、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、372、372/376、373、376、377、405、420、427、428および429から選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、19
0H、190K、190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428Vおよび429Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271
T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428VおよびA429Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、位置282における置換を含み、位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、位置282における置換は、脂肪族、非極性、塩基性、極性または芳香族である。さらにいくつかのさらなる実施形態では、置換は、X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282TおよびX282Rから選択される。
も1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされている操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438および470から選択される位置における置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、39/323、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、153、153/215、164/271、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224/268/372、249/284、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、372、372/376、373、376、377、405、420、427、428および429から選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、19
0H、190K、190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428Vおよび429Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271
T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428VおよびA429Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、位置282における置換を含み、位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、位置282における置換は、脂肪族、非極性、塩基性、極性または芳香族である。さらにいくつかのさらなる実施形態では、置換は、X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282TおよびX282Rから選択される。
本発明は、配列番号8と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされている操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/
108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373および377から選択される位置における置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/2
80G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189I/320W/377I、189I/343V、
189I/377I、189L、189Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373Gおよび377Lから選択される少なくとも1つの置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M1
89I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M1
89Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373GおよびF377Lから選択される少なくとも1つの置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。
108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373および377から選択される位置における置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/2
80G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189I/320W/377I、189I/343V、
189I/377I、189L、189Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373Gおよび377Lから選択される少なくとも1つの置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M1
89I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M1
89Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373GおよびF377Lから選択される少なくとも1つの置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。
本発明はまた、配列番号138と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、それらのポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号138を参照して番号付けされている操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片を提供する。
本発明はまた、配列番号140と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号140を参照して番号付けされている操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片を提供する。
本発明はまた、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134および136から選択されるポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼを提供する。
本発明はさらに、配列番号2の野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼと比較して少なくとも1つの改善された特性を示す操作されたカルボキシエステラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、改善された特性は、改善されたアミド化活性、溶媒耐性、熱
安定性、pH安定性、位置立体選択性、立体選択性、基質範囲、および/または減少した基質もしくは生成物阻害、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼを産生する細菌宿主細胞への減少した毒性から選択される。いくつかのさらなる実施形態では、細菌宿主細胞は大腸菌を含む。さらにいくつかのさらなる実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、アセトン、アセトニトリル、トルエン、テトラヒドロフラン、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシドおよび/またはメチルエチルケトンから選択される少なくとも1つの溶媒に対して、改善された溶媒耐性を示す。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、アニリン、イソブチルアミン、n-ブチルアミン、t-ブチルアミン、N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド、4-メチルピペリジン、O-t-ブチルヒドロキシルアミン、ベンジルアミン、2,6-ジメチルアニリン、(S)-(-)-α-メチルベンジルアミン、(R)-(+)-α-メチルベンジルアミン、フェニル酢酸メチル、酢酸エチル、安息香酸エチル、2-ピラジニルエチルエステル、4-エチル-1H-インドールエステル、N,N-ジエチルグリシルメチルエステルから選択される少なくとも1つの基質に対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、アニリン、イソブチルアミン、n-ブチルアミン、t-ブチルアミン、N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド、4-メチルピペリジン、O-t-ブチルヒドロキシルアミン、ベンジルアミン、2,6-ジメチルアニリン、(S)-(-)-α-メチルベンジルアミン、(R)-(+)-α-メチルベンジルアミン、フェニル酢酸メチル、酢酸エチル、安息香酸エチル、2-ピラジニルエチルエステル、4-エチル-1H-インドールエステル、N,N-ジエチルグリシルメチルエステルから選択される少なくとも1つの基質または基質セットに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す。さらにいくつかのさらなる実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、アセトアニリド、N-n-ブチル-ベンジルアセトアミド、N-[(S)-1-フェニルエチル]-ピラジニルアミド、N-[(S)-1-フェニルエチル]-ベンズアミド、N-[(R)-1-フェニルエチル]-ベンズアミド、N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド、1-ベンゾイル-4-メチルピペリジン、2-ピラジニル-4-メチルピペリジン、N-イソブチル-ベンズアミド、N-t-ブチル-ベンズアミド、N-t-ブチルヒドロキシル-ベンズアミド、N-イソブチル-1H-インドール-4-アミド、N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-フェニルアセトアミド、N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-ベンジルアセトアミド、N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-2,6-ジメチルフェニルアセトアミド(すなわち、リドカイン)から選択される少なくとも1つの生成物の産生において、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す。いくつかの実施形態では、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼは、X343V、X372L、X320W/G、X214R、X282C、X271Y、X65Gから選択される少なくとも1つの置換を含み、置換は配列番号2を参照して番号付けされており、以下の概略図に示されているように、操作されたカルボキシエステラーゼは、安息香酸エチルおよび2,6-ジメチルアニリンからのN’,N’-(ジエチルアミノ)-N-2,6-ジメチルフェニルアセトアミドの形成のためのヒンダードアミンに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す。
安定性、pH安定性、位置立体選択性、立体選択性、基質範囲、および/または減少した基質もしくは生成物阻害、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼを産生する細菌宿主細胞への減少した毒性から選択される。いくつかのさらなる実施形態では、細菌宿主細胞は大腸菌を含む。さらにいくつかのさらなる実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、アセトン、アセトニトリル、トルエン、テトラヒドロフラン、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシドおよび/またはメチルエチルケトンから選択される少なくとも1つの溶媒に対して、改善された溶媒耐性を示す。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、アニリン、イソブチルアミン、n-ブチルアミン、t-ブチルアミン、N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド、4-メチルピペリジン、O-t-ブチルヒドロキシルアミン、ベンジルアミン、2,6-ジメチルアニリン、(S)-(-)-α-メチルベンジルアミン、(R)-(+)-α-メチルベンジルアミン、フェニル酢酸メチル、酢酸エチル、安息香酸エチル、2-ピラジニルエチルエステル、4-エチル-1H-インドールエステル、N,N-ジエチルグリシルメチルエステルから選択される少なくとも1つの基質に対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、アニリン、イソブチルアミン、n-ブチルアミン、t-ブチルアミン、N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド、4-メチルピペリジン、O-t-ブチルヒドロキシルアミン、ベンジルアミン、2,6-ジメチルアニリン、(S)-(-)-α-メチルベンジルアミン、(R)-(+)-α-メチルベンジルアミン、フェニル酢酸メチル、酢酸エチル、安息香酸エチル、2-ピラジニルエチルエステル、4-エチル-1H-インドールエステル、N,N-ジエチルグリシルメチルエステルから選択される少なくとも1つの基質または基質セットに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す。さらにいくつかのさらなる実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、アセトアニリド、N-n-ブチル-ベンジルアセトアミド、N-[(S)-1-フェニルエチル]-ピラジニルアミド、N-[(S)-1-フェニルエチル]-ベンズアミド、N-[(R)-1-フェニルエチル]-ベンズアミド、N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド、1-ベンゾイル-4-メチルピペリジン、2-ピラジニル-4-メチルピペリジン、N-イソブチル-ベンズアミド、N-t-ブチル-ベンズアミド、N-t-ブチルヒドロキシル-ベンズアミド、N-イソブチル-1H-インドール-4-アミド、N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-フェニルアセトアミド、N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-ベンジルアセトアミド、N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-2,6-ジメチルフェニルアセトアミド(すなわち、リドカイン)から選択される少なくとも1つの生成物の産生において、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す。いくつかの実施形態では、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼは、X343V、X372L、X320W/G、X214R、X282C、X271Y、X65Gから選択される少なくとも1つの置換を含み、置換は配列番号2を参照して番号付けされており、以下の概略図に示されているように、操作されたカルボキシエステラーゼは、安息香酸エチルおよび2,6-ジメチルアニリンからのN’,N’-(ジエチルアミノ)-N-2,6-ジメチルフェニルアセトアミドの形成のためのヒンダードアミンに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す。
さらにいくつかのさらなる実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、X2
68A、X63A/R、X189Q/I/E、X214R、X282G/C、X381LおよびX69Wから選択される少なくとも1つの置換を含み、置換は配列番号2を参照して番号付けされており、以下の概略図に示されているように、操作されたカルボキシエステラーゼは、安息香酸エチルおよび4-メチルピペリジンからの1-ベンゾイル-4-メチル-ピペリジンの形成のための第2級アミンに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す。
68A、X63A/R、X189Q/I/E、X214R、X282G/C、X381LおよびX69Wから選択される少なくとも1つの置換を含み、置換は配列番号2を参照して番号付けされており、以下の概略図に示されているように、操作されたカルボキシエステラーゼは、安息香酸エチルおよび4-メチルピペリジンからの1-ベンゾイル-4-メチル-ピペリジンの形成のための第2級アミンに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す。
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本明細書で提供される操作されたカルボキシエステラーゼは精製される。さらにいくつかのさらなる実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは固定される。本発明はまた、少なくとも1つの本明細書で提供される操作されたカルボキシエステラーゼを含む組成物を提供する。
本発明はまた、少なくとも1つの本明細書で提供される操作されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号2と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードし、操作されたカルボキシエステラーゼは、そのポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438および470から選択される位置における置換を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、39/323、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、153、153/215、164/271、174/282、183
、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224/268/372、249/284、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、372、372/376、373、376、377、405、420、427、428および429から選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、190H、190K、190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428Vおよび429Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G
、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428VおよびA429Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、位置282における置換を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、位置282における置換は、脂肪族、非極性、塩基性、極性または芳香族である。さらにいくつかのさらなる実施形態では、置換は、X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282TおよびX282Rから選択される。
、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224/268/372、249/284、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、372、372/376、373、376、377、405、420、427、428および429から選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、190H、190K、190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428Vおよび429Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G
、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428VおよびA429Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、位置282における置換を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、位置282における置換は、脂肪族、非極性、塩基性、極性または芳香族である。さらにいくつかのさらなる実施形態では、置換は、X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282TおよびX282Rから選択される。
本発明はまた、配列番号8と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、9
9%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが、そのポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされているポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285
、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373および377から選択される位置における少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/280G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/
189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189
I/320W/377I、189I/343V、189I/377I、189L、189Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373Gおよび377Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作され
たカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M189I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69
W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M189Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373GおよびF377Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。
9%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが、そのポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされているポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285
、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373および377から選択される位置における少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/280G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/
189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189
I/320W/377I、189I/343V、189I/377I、189L、189Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373Gおよび377Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作され
たカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M189I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69
W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M189Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373GおよびF377Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。
本発明はまた、少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137および/または139と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を提供する。
本発明はさらに、本明細書で提供される操作されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列はコドン最適化される。
本発明はまた、本明細書で提供される操作されたカルボキシエステラーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。加えて、本発明は、少なくとも1つの本明細書で提供される発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明はまた、少なくとも1つの本明細書で提供される操作されたカルボキシエステラーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。
本発明はまた、操作されたカルボキシエステラーゼを宿主細胞において産生する方法であって、少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼが産生されるように、適切な条件下で、少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、培養物および/または宿主細胞から少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼを回収することをさらに含む。いくつかのさらなる実施形態では、前記方法は、少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼを精製する工程をさらに含む。
本発明は、天然に存在する野生型(WT)カルボキシエステラーゼ酵素と比較して改善された非ネイティブ特性を有する操作されたカルボキシエステラーゼ(EC3.1.1)、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をアミド化反応に適用する方法を提供する。
酵素活性部位は、1つのアミノ酸変異を介していくつかの異なる化学反応を触媒することができることが観察されているので、酵素機能および酵素基質範囲の切り替えは実行可能である(Rauwerdink and Kazluaskas,ACS Cat.,5:6153-6176[2015]を参照のこと)。カルボキシエステラーゼの機能性および基質範囲を改善するために、野生型カルボキシエステラーゼを定向進化法に供した。アミンおよびカルボキシエステル基質ペアの多様なセットを使用したアミド結合の生成において、得られた変異体(variant)は改善された能力を有していた(以下のスキーム1を参照のこと)。操作されたカルボキシエステラーゼは、本明細書に記載される
ように、水性系において活性を有していただけではなく、有機共溶媒およびさらにはほぼ完全な有機溶媒濃度(例えば、約98%v/v)の存在下でも活性である。さらに、これらの操作されたカルボキシエステラーゼの固定は、アミド生成のための連続フロー操作を容易にし、最終的なアミド生成物の精製を支援し、アミド化操作の効率および全体的なコストを改善する。
ように、水性系において活性を有していただけではなく、有機共溶媒およびさらにはほぼ完全な有機溶媒濃度(例えば、約98%v/v)の存在下でも活性である。さらに、これらの操作されたカルボキシエステラーゼの固定は、アミド生成のための連続フロー操作を容易にし、最終的なアミド生成物の精製を支援し、アミド化操作の効率および全体的なコストを改善する。
本発明は、一般的なアミド結合の形成を実証する、対応するポリヌクレオチド配列および適用方法と共に、新規の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを提供する(以下のスキーム1を参照のこと)。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、天然に存在する野生型Thermobifida fusca(T.fusca)カルボキシエステラーゼ(配列番号2)と比較して、これらの酵素の機能性および活性の範囲を拡大する改変された特性を有する。改善されたカルボキシエステラーゼ特性としては、限定されないが、溶媒安定性、酵素活性、位置特異性、立体選択性、減少した宿主細胞毒性、熱安定性、pH安定性、基質範囲、および/または減少した基質もしくは生成物阻害が挙げられる。本発明はまた、非天然宿主生物(例えば、大腸菌)における所望のポリペプチドの発現を容易にするように改善されたポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるカルボキシエステラーゼポリペプチドは、天然に存在する野生型Geobacillus stearothermophilusカルボキシエステラーゼ(配列番号138)と比較して、これらの酵素の機能性および活性の範囲を拡大する改変された特性を有する。いくつかの場合では、これらのポリペプチドは、野生型Mycobacterium tuberculosisカルボキシエステラーゼ(配列番号140)と比べて増強されたカルボキシエステラーゼ酵素である。さらに、いくつかの実施形態では、本発明は、非天然宿主生物(例えば、大腸菌)における所望のポリペプチドの発現を容易にするように改善されたポリヌクレオチドを提供する。
提示されるカルボキシエステラーゼ変異体の改善された特性は、T.fuscaの参照カルボキシエステラーゼ配列または別の操作された参照アミド化ポリペプチド、例えば配列番号8の配列と比較して特定の残基位置における残基差異を含有する操作されたアミド化ポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、残基差異は、以下のアミノ酸位置の少なくとも1つに存在する:X39、X62、X63、X64、X65、X66、X68、X69、X70、X71、X77、X103、X104、X105、X107、X108、X109、X110、X111、X113、X114、X115、X117、X118、X119、X126、X147、X153、X164、X174、X181、X183、X184、X185、X186、X187、X188、X189、X190、X209、X210、X211、X212、X213、X214、X215、X216、X217、X224、X231、X249、X263、X268、X269、X270、X271、X276、X277、X278、X279、X280、X281、X282、X283、X284、X285、X286、X287、X311、X317、X320、X321、X323、X324、X331、X343、X345、X346、X349、X372、X373、X374、X376、X377、X381、X405、X416、X420、X427、X428、X429、X438、X445、X459およびX470。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作されたカルボキシエステラーゼは、同じ反応条件下で野生型ポリペプチドと比較して増加した熱安定性を示すことを特徴とする。操作されたカルボキシエステラーゼは、生成物の継続的な形成により示されるように、WTカルボキシエステラーゼよりも高温で長時間にわたってアミド化変換を媒介することができる(以下のスキーム1を参照のこと)。いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、高濃度の基質エステル(I)および/またはア
ミン(II)、例えば300mMイソブチルアミンの存在下で、活性を維持するか、または活性の増加を有する。いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、WTカルボキシエステラーゼと比較して、様々なpHレベル(例えば、pH9.0)の条件下で、活性を維持するか、または活性の増加を有する。いくつかの実施形態では、増加した熱安定性、pH安定性および/または基質安定性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号2および/または8の参照配列と少なくとも80%、82%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を含む。
ミン(II)、例えば300mMイソブチルアミンの存在下で、活性を維持するか、または活性の増加を有する。いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、WTカルボキシエステラーゼと比較して、様々なpHレベル(例えば、pH9.0)の条件下で、活性を維持するか、または活性の増加を有する。いくつかの実施形態では、増加した熱安定性、pH安定性および/または基質安定性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号2および/または8の参照配列と少なくとも80%、82%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、適切な反応条件下で野生型カルボキシエステラーゼ(配列番号2)または操作された参照カルボキシエステラーゼ(配列番号8)の活性と比べて少なくとも約1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、150倍、500倍またはそれを超える、生成物(複数可)への基質化合物(複数可)の変換に関する生体触媒活性改善が可能である(以下のスキーム1を参照のこと)。いくつかの実施形態では、酵素活性のこれらの改善は、熱安定性、立体選択性、立体特異性、位置特異性、溶媒安定性、pH安定性および/もしくは基質結合、または減少した基質および/もしくは生成物阻害の関連増加にわたる。
いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、様々な構造的に異なるカルボキシエステル(I)またはアミン(II)基質に対する活性を特徴とする。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号2のWTポリペプチドおよび/または配列番号8の操作されたポリペプチドよりも大きな速度で、エステル(N,N-ジエチルアミノグリシンメチルエステル、安息香酸エチル、酢酸エチル、ピラジン-2-カルボン酸エチルエステル、1H-インドール-4-カルボン酸エチルエステル、フェニル酢酸メチル)およびアミン(n-ブチルアミン、イソブチルアミン、アニリン、ベンジルアミン、2,6-ジメチルアニリン、t-ブチルアミン、N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド、4-メチルピペリジン、O-t-ブチルヒドロキシルアミン、2,6-ジメチルアニリン、または(S)-(-)-α-メチルベンジルアミン、(R)-(+)-α-メチルベンジルアミンの立体選択的変換)をそれらの対応するアミド生成物に生体触媒的に変換することができる。
いくつかの実施形態では、改善された操作された変異体ポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138または140に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるカルボキシエステラーゼ酵素は、天然に存在するT.fuscaカルボキシエステラーゼのアミノ酸配列(配列番号2)と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超えて同一の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を変異誘発することにより得られる。
本発明のいくつかのさらなる実施形態では、カルボキシエステラーゼポリペプチド変異体は、本明細書で提供されるように、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズしてこのようなポリヌクレオチドを生じるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドによりコー
ドされる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、コードされる操作されたカルボキシエステラーゼの発現に有用なプロモーターおよび/または他の調節エレメントを含み、特異的発現系に最適化されたコドンを利用し得る。
ドされる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、コードされる操作されたカルボキシエステラーゼの発現に有用なプロモーターおよび/または他の調節エレメントを含み、特異的発現系に最適化されたコドンを利用し得る。
いくつかの実施形態では、改善されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137および139から選択される配列を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドおよび/または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞はT.fuscaであるが、いくつかの代替的な実施形態では、それらは他の生物(例えば、大腸菌)である。宿主細胞は、操作されたカルボキシエステラーゼを産生するためのコードされるポリヌクレオチドの発現、および本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼの単離において使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、所望の生成物(複数可)への基質(複数可)の直接的な変換において使用される。
いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、本明細書で提供される操作されたカルボキシエステラーゼ酵素のいずれかを使用して(以下に示されている)反応スキーム1を行うための方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、対応するアミド生成物への基質の変換のための適切な反応条件下で、カルボキシエステル(I)およびアミン(II)基質を本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドと接触させるかまたはインキュベートし、それにより、基質を生成物化合物に変換することを含む。全細胞、細胞抽出物または精製カルボキシエステラーゼ酵素を用いて前記方法を行うかにかかわらず、単一のカルボキシエステラーゼ酵素が使用され得るか、またはあるいは少なくとも2つのカルボキシエステラーゼ酵素の混合物が使用される。
本発明の操作されたカルボキシエステラーゼは、カルボキシエステル(スキーム1、I)およびアミン(II)基質の多様なセットをそれらの対応するアミド生成物(III)に変換することができる。利用可能なカルボキシエステル基質の範囲は、式(I)のR1およびR2を考慮して詳述され得る。いくつかの実施形態では、R1およびR2の基の官能基は、水素原子からアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキル成分までの様々な成分を包含するが、ただし、R2は水素であり得ない。いくつかのさらなる実施形
態では、アミン(II)のR3およびR4位置の選択された官能基は、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる。いくつかのさらなる実施形態では、選択されたR1およびR2は連結されて3員環~10員環を形成し得るが、ただし、R3およびR4の基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルから別々に選択され、それらも連結されて3員環~10員環を形成し得;必要に応じて、R1またはR2は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルテザーを介して、R3またはR4に連結され得る。アミド化プロセスは、適切な反応条件下で、化合物(I)
(式中、R1およびR2は、上記で定義されるとおりである)、および式(II)の化合物
(式中、R3およびR4は、上記で定義されるとおりである)、およびアミド化活性を有する操作されたポリペプチドとして進行する。本明細書で提供される反応方法のいくつかの実施形態では、WT T.fuscaカルボキシエステラーゼ(配列番号2)または操作された参照ポリペプチド(例えば、配列番号8)、本明細書で提示されるカルボキシエステラーゼ誘導体は、一般式(III)に一致する第1級および第2級アミドを生成することができる。本明細書で提供される操作されたアミド化酵素(例えば、配列番号4~136の偶数番号配列識別子の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド)は、上記反応の生体触媒として使用される(スキーム1)。
定義
態では、アミン(II)のR3およびR4位置の選択された官能基は、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる。いくつかのさらなる実施形態では、選択されたR1およびR2は連結されて3員環~10員環を形成し得るが、ただし、R3およびR4の基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルから別々に選択され、それらも連結されて3員環~10員環を形成し得;必要に応じて、R1またはR2は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルテザーを介して、R3またはR4に連結され得る。アミド化プロセスは、適切な反応条件下で、化合物(I)
定義
本発明に関して、本明細書における説明で使用される科学技術用語は、特に明確な定義がない限り、当業者により一般的に理解されている意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。本明細書で言及される米国特許および公開米国特許出願はすべて、このような特許および特許出願に開示されているすべての配列を含めて、参照により明示的に組み込まれる。特に指示がない限り、本発明の実施は、当業者に公知の分子生物学、発酵、微生物学および関連分野で一般的に使用される従来の技術を伴う。本明細書で特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験
において使用し得るが、好ましい方法および材料が記載されている。実際、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されず、これらは、それらが使用される状況に応じて変動し得ることを意図する。本明細書で提供される見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。
において使用し得るが、好ましい方法および材料が記載されている。実際、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されず、これらは、それらが使用される状況に応じて変動し得ることを意図する。本明細書で提供される見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。
それにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。したがって、本明細書に開示されるあらゆる数値範囲は、このようなより広い数値範囲内に入るあらゆるより狭い数値範囲を、このようなより狭い数値範囲が本明細書にすべて明確に記載されているかのように包含することを意図する。本明細書に開示されるあらゆる最大(または最小)の数値限定は、あらゆるより低い(またはより高い)数値限定を、このようなより低い(またはより高い)数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように包含することも意図する。
本明細書で使用される場合、用語「含む(comprising)」およびその同語族は、それらの包括的な意味で使用される(すなわち、用語「含む(including)」およびその対応する同語族と同等である)。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数「a」、「an」および「the」は、文脈上明確な指示がない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば、「宿主細胞」への言及は、複数のこのような宿主細胞を含む。
特に指示がない限り、それぞれ、核酸は左から右に5’から3’方向で記載されており、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向で記載されている。
本明細書で提供される見出しは、全体として本明細書を参照することによりえられ得る本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、以下で定義される用語は、本明細書全体を参照することにより、より詳細に定義される。
本明細書で使用される場合、「カルボキシエステラーゼ」は、有機酸およびアルコールの形成をもたらすカルボキシエステルの加水分解に対して触媒活性を本来的に有する酵素として定義される。
本明細書で使用される場合、「アミド化」またはアミド合成は、アミド結合を生成してカルボキサミド(有機アミド)をもたらすプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さや翻訳後修飾(例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など)に関係なく、アミド結合により共有結合的に連結された少なくとも2つのアミノ酸のポリマーを表すために本明細書で互換的に使用される。D-およびL-アミノ酸ならびにD-およびL-アミノ酸との混合物は、この定義に含まれる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合的に互いに連結された2つまたはそれを超えるヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオシドから全体的に構成され得るか(すなわち、RNA)、2’デオキシリボヌクレオチドから全体的に構成され得るか(すなわち、DNA)、またはリボヌクレオシドおよび2’デオキシリボヌクレオシドとの混合物であり得る。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル連結を介して互いに連結されるが、ポリヌクレオチドは、1つまたはそれを超える非標準的な連結を含み得る。ポリヌクレオチドは一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含み得る。また、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基(すなわち、アデニン、グア
ニン、ウラシル、チミンおよびシトシン)から構成されるが、1つまたはそれを超える改変および/または合成核酸塩基(例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど)を含み得る。本発明の一実施形態では、このような改変核酸塩基または合成核酸塩基は、コード核酸塩基である。
ニン、ウラシル、チミンおよびシトシン)から構成されるが、1つまたはそれを超える改変および/または合成核酸塩基(例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど)を含み得る。本発明の一実施形態では、このような改変核酸塩基または合成核酸塩基は、コード核酸塩基である。
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸(例えば、遺伝子)の部分を指す。
本明細書で使用される場合、「天然に存在する」、「野生型」および「WT」は、天然に見出される形態を指す。例えば、天然に存在するまたは野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、生物中に存在する配列であって、天然の供給源から単離され得、人為的操作により意図的に改変されていない配列である。
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」または「操作された」または「組換え」は、(例えば、細胞、核酸またはポリペプチド)に関して本発明で使用される場合、他の方法では天然に存在しない様式で改変されているか、または合成材料からおよび/もしくは組換え技術を使用した操作により産生および/もしくは生成された以外はそれと同一である材料または前記材料の天然もしくはネイティブ形態に対応する材料を指す。非限定的な例としては、特に、ネイティブ(非組換え)形態の細胞に見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異なるレベルで発現されるネイティブ遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「配列同一性の割合」、「同一性率」および「同一率」は、ポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間の比較を指し、比較領域にわたって最適にアライメントされた2つの配列を比較することにより決定され、比較領域内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、2つの配列の最適なアライメントの参照配列と比較して、付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。この割合は、両配列において同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が存在するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとアライメントする位置の数を決定して一致位置の数を求め、一致位置の数を比較領域内の位置の総数で割り、結果に100を乗じて配列同一性の割合を求めることにより計算される。最適なアラインメントおよび配列同一性率の決定は、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムを使用して実施される(例えば、Altschulら、J.Mol.Biol.215:403-410[1990];およびAltschulら、Nucleic Acids Res.3389-3402[1977]を参照のこと)。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationウェブサイトを通じて公的に入手可能である。
簡潔に言えば、BLAST分析は、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントされる場合、いくつかの正の値の閾値スコアTと一致するかまたはそれを満たすクエリー配列内の短いワード長を特定することにより、高スコアの配列ペア(HSP)を最初に特定することを含む。Tは、隣接ワードスコア閾値と称される(Altschulら、前掲)。これらの初期隣接ワードヒットは、これらを含有するより長いHSPを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、累積アライメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長する。ヌクレオチド配列の場合、パラメータM(マッチング残基のペアの報酬スコア;常に>0)およびN(ミスマッチング残基のペナルティースコア;常に<0)を使用して、累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Xだけ低下するか;1つもしくはそれを超える負のスコア残基アライメントの蓄積により、累積スコアが0もしくはそれ未満になるか;
またはいずれかの配列の末端に到達したら、各方向へのワードヒットの伸長を中止する。BLASTアルゴリズムパラメータW、TおよびXは、アライメントの感度およびスピードを決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)は、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長(W)、10の期待値(E)およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する(例えば、Henikoff and Henikoff,Proc Natl
Acad Sci USA 89:10915[1989]を参照のこと)。
またはいずれかの配列の末端に到達したら、各方向へのワードヒットの伸長を中止する。BLASTアルゴリズムパラメータW、TおよびXは、アライメントの感度およびスピードを決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)は、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長(W)、10の期待値(E)およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する(例えば、Henikoff and Henikoff,Proc Natl
Acad Sci USA 89:10915[1989]を参照のこと)。
2つの配列の同一性率を提供する際にBLASTと同様に機能する多数の他のアルゴリズムが利用可能であり、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して(例えば、Smith and
Waterman,Adv.Appl.Math.2:482[1981]の局所相同性アルゴリズムにより;Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443[1970]の相同性アラインメントアルゴリズムにより;Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988]の類似性調査法により;ならびに/または、これらのアルゴリズムのコンピュータ制御による実行により[GCG Wisconsin Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA])または当技術分野で一般に公知の方法を使用した視覚的な検査により行われ得る。加えて、配列アラインメントおよび配列同一性率の決定は、提供されるデフォルトパラメータを使用してGCG Wisconsin Software package(Accelrys,Madison WI)中のBESTFITまたはGAPプログラムを用い得る。
Waterman,Adv.Appl.Math.2:482[1981]の局所相同性アルゴリズムにより;Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443[1970]の相同性アラインメントアルゴリズムにより;Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988]の類似性調査法により;ならびに/または、これらのアルゴリズムのコンピュータ制御による実行により[GCG Wisconsin Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA])または当技術分野で一般に公知の方法を使用した視覚的な検査により行われ得る。加えて、配列アラインメントおよび配列同一性率の決定は、提供されるデフォルトパラメータを使用してGCG Wisconsin Software package(Accelrys,Madison WI)中のBESTFITまたはGAPプログラムを用い得る。
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、別の配列が比較される規定の配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、核酸またはポリペプチドの少なくとも20ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基長、少なくとも25残基長、少なくとも50残基長または全長である。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、(1)2つの配列間で類似する配列(すなわち、完全な配列の部分)を含み得、(2)2つの配列で相違する配列をさらに含み得るので、2つの(またはそれを超える)ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、比較領域にわたって2つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することにより実施される。用語「参照配列」は、野生型配列に限定されるものではなく、操作または変更された配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、「参照配列」は、予め操作または変更されたアミノ酸配列であり得る。
本明細書で使用される場合、「比較領域」は、少なくとも約20個の連続ヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、配列は、少なくとも20個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得、比較領域中の配列の部分は、2つの配列の最適なアライメントのために、(付加または欠失を含まない)参照配列と比較して20パーセントまたはそれ未満の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。比較領域は、20個よりも長い連続残基であり得、必要に応じて30個、40個、50個、100個またはそれよりも長い領域を含む。
本明細書で使用される場合、「に対応する」、「を参照して」または「と比べて」は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合の指定した参照配列の残基の番号付けを指す。換言すれば、所定のポリマーの残基番号または残基位置は、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の番号位置によってではな
く、参照配列に対して指定される。例えば、操作されたカルボキシエステラーゼのアミノ酸配列などの所定のアミノ酸配列は、2つの配列間の残基一致を最適化するためにギャップを導入することにより、参照配列に対してアライメントされ得る。これらの場合では、ギャップは存在するが、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それがアライメントされている参照配列に対して行われる。本明細書で使用される場合、以下にさらに記載される「Xn」などの残基位置への言及は、特に具体的な指示がない限り、「に対応する残基」への言及と解釈されるべきである。したがって、例えば、「X94」は、ポリペプチド配列(例えば、配列番号2、4、10、26または42)の位置94の任意のアミノ酸を指す。
く、参照配列に対して指定される。例えば、操作されたカルボキシエステラーゼのアミノ酸配列などの所定のアミノ酸配列は、2つの配列間の残基一致を最適化するためにギャップを導入することにより、参照配列に対してアライメントされ得る。これらの場合では、ギャップは存在するが、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それがアライメントされている参照配列に対して行われる。本明細書で使用される場合、以下にさらに記載される「Xn」などの残基位置への言及は、特に具体的な指示がない限り、「に対応する残基」への言及と解釈されるべきである。したがって、例えば、「X94」は、ポリペプチド配列(例えば、配列番号2、4、10、26または42)の位置94の任意のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される場合、「立体選択性」は、化学反応または酵素反応において、ある立体異性体が別の立体異性体または別の立体異性体セットよりも優先的に形成されることを指す。立体選択性は、立体異性体の形成が別のものよりも促される場合には部分的であり得るか、またはそれは、1つの立体異性体のみが形成される場合には完全であり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性は、エナンチオ選択性(両エナンチオマーの合計における一方のエナンチオマーの比率(典型的には、割合として報告される)と称される。あるいは、それは、一般的に、式[主エナンチオマー-副エナンチオマー]/[主エナンチオマー+副エナンチオマー]にしたがってそれらから計算されるエナンチオマー過剰率(e.e.)として(典型的には割合として)当技術分野で報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、ジアステレオ選択性(2つのジアステレオマーの混合物における一方のジアステレオマーの比率(典型的には、割合として報告される))と称され、あるいは一般的にジアステレオマー過剰率(d.e.)として報告される。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率のタイプである。立体選択性は単一の立体異性体に限定されず、立体異性体のセットについて記載され得ることも理解すべきである。
本明細書で使用される場合、「高度に立体選択的」は、少なくとも約75%の立体異性体過剰率で、基質をその対応するキラルアミド生成物に変換することができる化学反応または酵素反応を指す。
本明細書で使用される場合、「酵素活性の増加」および「活性の増加」は、操作された酵素の改善された特性(これは、参照酵素と比較した、比活性(例えば、生成された生成物/時間/タンパク質の重量)の増加、または生成物への基質の変換率(例えば、指定量のカルボキシエステラーゼを使用して指定の期間における生成物への出発量の基質の変換率)の増加により表され得る)を指す。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に提供されている。Km、Vmaxまたはkcatの古典的な酵素特性を含む酵素活性に関する任意の特性が影響され得、これらの変化は酵素活性の増加をもたらし得る。カルボキシエステラーゼ活性は、基質または生成物濃度の変化など、カルボキシエステラーゼを測定するために使用される標準的なアッセイのいずれか1つにより測定され得る。酵素活性の比較は、本明細書にさらに詳細に記載されるように、酵素の規定の調製、セット条件下における規定のアッセイ、および1つまたはそれを超える規定の基質を使用して行われる。一般に、細胞中の酵素を比較する場合、細胞の数およびアッセイされるタンパク質の量を決定し、同一の発現系および同一の宿主細胞を使用して、宿主細胞により産生されて溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小化する。
本明細書で使用される場合、「変換」は、対応する生成物への基質の酵素的転換を指す。
本明細書で使用される場合、「変換率」は、指定条件下で一定期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、例えば、カルボキシエステラーゼポリペプチ
ドの「酵素活性」または「活性」は、生成物への基質の「変換率」として表され得る。
ドの「酵素活性」または「活性」は、生成物への基質の「変換率」として表され得る。
本明細書で使用される場合、「位置特異性」は、他の異性体も理論的に可能である場合に、1つの構造異性体のみが生成される化学反応を指す。
本明細書で使用される場合、「熱安定」または「熱的に安定」は、一定期間(例えば、0.5~24時間)にわたって一連の温度条件(例えば、40~80℃)に曝露した場合に、未処理酵素と比較して不活化に対して耐性であり、したがって、高温への曝露後に特定のレベルの残存活性(例えば、60%超~80%)を保持するポリペプチドを指すために互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「溶媒安定」は、様々な濃度(例えば、5~99%)の溶媒(例えば、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルtert-ブチルエーテルなど)への一定期間(例えば、0.5~24時間)の曝露後に、未処理酵素と比較して同様の活性(例えば、例えば、60%~80%超)を維持するポリペプチドの能力を指す。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸差異」または「残基差異」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸差異の位置は、一般に、本明細書では「Xn」(nは、残基差異が基づく参照配列における対応する位置を指す)と称される。例えば、「配列番号2と比較した位置X40の残基差異」は、配列番号2の位置40に対応するポリペプチド位置のアミノ酸残基の差異を指す。したがって、配列番号2の参照ポリペプチドが位置40にヒスチジンを有する場合、「配列番号2と比較した位置X40の残基差異」は、配列番号2の位置40に対応するポリペプチドの位置におけるヒスチジン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書におけるほとんどの例では、ある位置における特定のアミノ酸残基差異は、「XnY」(「Xn」は、上記のように対応する位置を指定し、「Y」は、操作されたポリペプチドに見出されるアミノ酸(すなわち、参照ポリペプチド中と異なる残基)の一文字識別子である)として示される。いくつかの場合では、本発明はまた、慣例的な表記「AnB」(Aは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「n」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Bは、操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である)により表される特定のアミノ酸差異を提供する。いくつかの場合では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比べて少なくとも1つのアミノ酸残基差異(これは、参照配列と比べて残基差異が存在する特定の位置のリストにより示される)を含み得る。いくつかの実施形態では、1つを超えるアミノ酸がポリペプチドの特定の残基位置において使用され得る場合、使用され得る様々なアミノ酸残基は、「/」により区切られる(例えば、X192A/G)。本発明は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換のいずれかまたは両方を含む少なくとも1つのアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を包含する。本発明の配列表に含まれる特定の組換え炭酸脱水酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、開始メチオニン(M)残基を含む(すなわち、Mは残基位置1を表す)。しかしながら、当業者は、例えば宿主細胞またはインビトロ翻訳系では、生物学的プロセシング機構によりこの開始メチオニン残基が除去されて、開始メチオニン残基を欠くが他の点では酵素の特性を保持する成熟タンパク質が生成され得ることを理解する。その結果として、用語「位置Xnにおける配列番号2と比べたアミノ酸残基差異」は、本明細書で使用される場合、開始メチオニンを欠くようにプロセシングされた参照配列内の位置「Xn」または対応する位置(例えば、位置(X-1)n)を指し得る。
本明細書で使用される場合、語句「保存的アミノ酸置換」は、類似側鎖を有する残基の互換性を指すので、典型的には、同じまたは類似の規定アミノ酸クラス内のアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を伴う。一例として限定されないが、いくつかの実施
形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンで置換され、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンで置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンで置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンで置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)で置換され、ならびに/または疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置換される。特に本明細書で提供される詳細な発明を考慮して、任意のアミノ酸または残基の適切な分類は当業者には明らかである。例示的な保存的置換は、表1に提供されている。
形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンで置換され、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンで置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンで置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンで置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)で置換され、ならびに/または疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置換される。特に本明細書で提供される詳細な発明を考慮して、任意のアミノ酸または残基の適切な分類は当業者には明らかである。例示的な保存的置換は、表1に提供されている。
本明細書で使用される場合、語句「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、規定のグループ内ではなく規定のグループ間のアミノ酸を使用し得、(a)置換(例えば、グリシンからプロリン)領域内のペプチド骨格の構造、(b)電荷もしくは疎水性または(c)側鎖のバルクに影響を与える。一例として限定されないが、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸、小型アミノ酸で置換された芳香族アミノ酸および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの1つまたはそれを超えるアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変を指す。欠失は、酵素活性を保持し、および/または操作された酵素の改善された特性を保持しつつ、1個もしくはそれを超えるアミノ酸、2個もしくはそれを超えるアミノ酸、5個もしくはそれを超えるアミノ酸、10個もしくはそれを超えるアミノ酸、15個もしくはそれを超えるアミノ酸または20個もしくはそれを超えるアミノ酸、ポリペプチドを構成する総アミノ酸数の最大10%または総アミノ酸数の最大20%の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および/または末端部分を対象とし得る。様々な実施形態では、欠失は連続セグメントを含み得る
か、または不連続であり得る。
か、または不連続であり得る。
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドへの1つまたはそれを超えるアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変を指す。いくつかの実施形態では、改善された操作されたカルボキシエステラーゼ酵素は、天然に存在するカルボキシエステラーゼポリペプチドへの1個またはそれを超えるアミノ酸の挿入、および操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドへの1個またはそれを超えるアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分にあり得るか、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に対するものであり得る。本明細書で使用される場合、挿入は、当技術分野で公知であるように融合タンパク質を含む。挿入は、天然に存在するポリペプチドにおける連続アミノ酸セグメントであり得るか、または1つもしくはそれを超えるアミノ酸により分離され得る。
用語「アミノ酸置換セット」または「置換セット」は、参照配列と比較したポリペプチド配列内の一群のアミノ酸置換を指す。置換セットは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個またはそれを超えるアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、置換セットは、実施例に提供されている表に含まれる変異体カルボキシエステラーゼのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。
本明細書で使用される場合、「断片」は、アミノ末端および/またはカルボキシ末端欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、全長カルボキシエステラーゼポリペプチド、例えば、配列番号4のポリペプチドの約80%、約90%、約95%、約98%または約99%を有し得る。いくつかの実施形態では、断片は、「生物学的に活性である」(すなわち、全長配列と同じ酵素活性を示す)。
本明細書で互換的に使用される「機能的断片」または「生物学的に活性な断片」は、アミノ末端および/もしくはカルボキシ末端欠失(複数可)ならびに/または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、それが比較されている配列(例えば、本発明の操作された全長T.fusca酵素)中の対応する位置と同一であるポリペプチドであって、全長ポリペプチドの活性の実質的にすべてを保持するポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、それに天然に付随する他の混入物、例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系(例えば、宿主細胞またはインビトロ合成)から回収または精製されたポリペプチドを包含する。改善されたカルボキシエステラーゼ酵素は、細胞内に存在し得るか、細胞培地中に存在し得るか、または様々な形態(例えば、溶解物または単離された調製物)で調製され得る。このようなものとして、いくつかの実施形態では、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が存在する優勢種である(すなわち、モル基準または重量基準で、それが、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である)組成物を指し、一般に、目的種が、モル%でまたは重量%で、存在する高分子種の少なくとも約50パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋な操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約60%もしくはそれよりも多く、約70%もしくはそれよりも多く、約80%もしくはそれよりも多く、約90%もしくはそれよりも多く、約91%もしくはそれよりも多く、および約92%もしくはそれよりも多くまたは約93%もしくはそれよりも多く、約94%もしくはそれよりも多く
、約95%もしくはそれよりも多く、約96%もしくはそれよりも多く、約97%もしくはそれよりも多く、および約98%もしくはそれよりも多く、または約99%もしくはそれよりも多く、モル%もしくは重量パーセントで構成する。溶媒種、小分子(<500ダルトン)および元素イオン種は、高分子種と見なされない。いくつかの実施形態では、単離された改善されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
、約95%もしくはそれよりも多く、約96%もしくはそれよりも多く、約97%もしくはそれよりも多く、および約98%もしくはそれよりも多く、または約99%もしくはそれよりも多く、モル%もしくは重量パーセントで構成する。溶媒種、小分子(<500ダルトン)および元素イオン種は、高分子種と見なされない。いくつかの実施形態では、単離された改善されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドに関して使用される際の用語「異種」は、生物(例えば、野生型生物)により通常は発現および分泌されない配列を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、天然に通常は見出されるものと互いに同じ関係で見出されないか、またはその発現レベルもしくは細胞もしくは構造内の他の核酸もしくは他の分子との物理的関係が天然に通常は見出されないように組換え操作された2つまたはそれを超える部分配列を含む配列を包含する。例えば、天然に見出されない様式で配置された関連のない遺伝子に由来する2つまたはそれを超える配列を有する異種核酸は、典型的には、組換え産生される(例えば、ベクターなどの発現カセットに挿入されたプロモーター配列に作動可能に連結された本発明の核酸オープンリーディングフレーム(ORF))。いくつかの実施形態では、「異種ポリヌクレオチド」は、実験室技術により宿主細胞中に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験室操作に供され、次いで宿主細胞中に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、「コドン最適化」は、コードされるタンパク質が目的の生物内で効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを、特定の生物において優先的に使用されるものに変更することを指す。いくつかの実施形態では、カルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化され得る。
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現に必要または有利なすべての成分を含むと本明細書で定義される。各制御配列は、目的のポリヌクレオチドにネイティブなものまたは外来のものでもあり得る。このような制御配列としては、限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を指令または調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対する相対位置に適切に配置される(すなわち、機能的な関係)構成として本明細書で定義される。
本明細書で使用される場合、「適切な反応条件」は、本発明のカルボキシエステラーゼポリペプチドが基質化合物を生成物化合物に変換(例えば、別の化合物へのある化合物の変換)することができる生体触媒反応溶液の条件(例えば、酵素負荷、基質負荷、温度、pH、緩衝液、共溶媒などの範囲)を指す。例示的な「適切な反応条件」は本開示に提供されており、実施例により例示されている。
本明細書で使用される場合、「化合物負荷」、「酵素負荷」または「補因子負荷」などの「負荷」は、反応開始時における反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
本明細書で使用される場合、生体触媒媒介プロセスの文脈における「基質」は、生体触媒が作用する化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、生体触媒媒介プロセスの文脈における「生成物」は、生体触媒の作用から生じる化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、「平衡」は、化学反応または酵素反応の順方向速度定数および逆方向速度定数により決定される、立体異性体の相互変換を含む化学反応または酵素反応(例えば、2つの種AおよびBの相互変換)において化学種の定常状態の濃度をもたらすプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、1~18個の炭素原子(両端の数を含む)、より好ましくは1~8個の炭素原子(両端の数を含む)、最も好ましくは1~6個の炭素原子(両端の数を含む)の直鎖状または分枝状のいずれかの飽和炭化水素基を指す。特定の数の炭素原子を有するアルキルは括弧内に示されている(例えば、(C1-C4)アルキルは、1~4個の炭素原子のアルキルを指す)。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、2~12個の炭素原子(両端の数を含む)の基であって、少なくとも1つの二重結合を含有するが、1つを超える二重結合を必要に応じて含有する直鎖状または分枝状のいずれかの基を指す。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、2~12個の炭素原子(両端の数を含む)の基であって、少なくとも1つの三重結合を含有するが、1つを超える三重結合を必要に応じて含有し、1つまたはそれを超える二重結合部分をさらに必要に応じて含有する直鎖状または分枝状のいずれかの基を指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」は、炭素原子の1個またはそれよりも多くがそれぞれ独立して、同じまたは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基で置き換えられた本明細書で定義されるアルキル、アルケニルおよびアルキニルを指す。炭素原子を置き換え得るヘテロ原子および/またはヘテロ原子基としては、限定されないが、-O-、-S-、-S-O-、-NRα-、-PH-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)NRα-、-S(O)2NRα-など(それらの組み合わせを含む)(各Rαは、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される)が挙げられる、
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、基-ORβ(Rβは、本明細書でも定義される必要に応じて置換されたアルキル基を含む上記で定義されるアルキル基である)を指す。
本明細書で使用される場合、「アリール」は、単環(例えば、フェニル)または複数の縮合環(例えば、ナフチルまたはアントリル)を有する6~12個の炭素原子(両端の数を含む)の不飽和芳香族炭素環式基を指す。例示的なアリールとしては、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「アミノ」は、基-NH2を指す。置換アミノは、基-NHRδ、NRδRδおよびNRδRδRδ(各Rδは、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから独立して選択される)を指す。典型的なアミノ基としては、限定されないが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル-オキシ-スルファミノなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「オキソ」は、=Oを指す。
本明細書で使用される場合、「オキシ」は、エーテルおよびエステルを含む、異なるオキシ基を形成するための様々な置換基を有し得る二価基-O-を指す。
本明細書で使用される場合、「カルボキシ」は、-COOHを指す。
本明細書で使用される場合、「カルボニル」は、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステルおよびケトンを含む、異なるカルボニル基を形成するための様々な置換基を有し得る-C(O)-を指す。
本明細書で使用される場合、「アルキルオキシカルボニル」は、-C(O)ORε(Rεは、必要に応じて置換され得る本明細書で定義されるアルキル基である)を指す。
本明細書で使用される場合、「アミノカルボニル」は、-C(O)NH2を指す。置換アミノカルボニルは、-C(O)NRδRδ(アミノ基NRδRδは、本明細書で定義されるとおりである)を指す。
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」および「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」は、-OHを指す。
本明細書で使用される場合、「シアノ」は、-CNを指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環内に、1~10個の炭素原子(両端の数を含む)と、酸素、窒素および硫黄から選択される1~4個のヘテロ原子(両端の数を含む)とを含む芳香族複素環基を指す。このようなヘテロアリール基は、単環(例えば、ピリジルまたはフリル)または複数の縮合環(例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル)を有し得る。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキル」は、ヘテロアリールで置換されたアルキル(すなわち、ヘテロアリール-アルキル基)であって、好ましくは、アルキル部分に1~6個の炭素原子(両端の数を含む)と、ヘテロアリール部分に5~12個の環原子(両端の数を含む)とを有するアルキルを指す。このようなヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルなどにより例示される。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルケニル」は、ヘテロアリールで置換されたアルケニル(すなわち、ヘテロアリール-アルケニル-基)であって、好ましくはアルケニル部分に2~6個の炭素原子(両端の数を含む)と、ヘテロアリール部分に5~12個の環原子(両端の数を含む)とを有するアルケニルを指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキニル」は、ヘテロアリールで置換されたアルキニル(すなわち、ヘテロアリール-アルキニル-基)であって、好ましくはアルキニル部分に2~6個の炭素原子(両端の数を含む)と、ヘテロアリール部分に5~12個の環原子(両端の数を含む)とを有するアルキニルを指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロ環」、「複素環(heterocyclic)」および互換的に「ヘテロシクロアルキル」は、単環または複数の縮合環と、2~10個の炭素環原子(両端の数を含む)と、環内に窒素、硫黄または酸素から選択される1~4個
のヘテロ環原子(両端の数を含む)とを有する飽和または不飽和基を指す。このような複素環基は、単環(例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル)または複数の縮合環(例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル)を有し得る。ヘテロ環の例としては、限定されないが、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどが挙げられる。
のヘテロ環原子(両端の数を含む)とを有する飽和または不飽和基を指す。このような複素環基は、単環(例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル)または複数の縮合環(例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル)を有し得る。ヘテロ環の例としては、限定されないが、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「員環」は、任意の環状構造を含むことを意味する。用語「員」の前の数字は、環を構成する骨格原子の数を示す。したがって、例えば、シクロヘキシル、ピリジン、ピランおよびチオピランは6員環であり、シクロペンチル、ピロール、フランおよびチオフェンは5員環である。
特に指定がない限り、前述の基において水素が占める位置は、限定されないが、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ(amidoximo)、ヒドロキサモイル(hydroxamoyl)、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、ヘテロ環、(ヘテロ環)オキシおよび(ヘテロ環)アルキルにより例示される置換基でさらに置換され得;好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。開放原子価がこれらの置換基上に存在する場合、それらは、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよび/またはヘテロ環基でさらに置換され得、これらの開放原子価が炭素上に存在する場合、それらは、ハロゲンならびに酸素、窒素または硫黄結合置換基でさらに置換され得、複数のこのような開放原子価が存在する場合、結合の直接形成により、または新たなヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素もしくは硫黄への結合の形成により、これらの基は結合して環を形成し得ることが理解される。置換基による水素の置き換えが、許容され得ない不安定性を本発明の分子に導入せず、他の点で化学的に妥当である限り、上記置換が行われ得ることがさらに理解される。
本明細書で使用される場合、「必要に応じた」および「必要に応じて」は、それに続いて記載される事象または状況が発生してもよいしまたは発生しなくてもよく、その記載が、事象または状況が発生する場合およびそれが発生しない場合を含むことを意味する。当業者は、1個またはそれを超える必要に応じた置換基を含有すると記載される任意の分子に関して、立体的に実用的な化合物および/または合成的に実行可能な化合物のみが含まれるものであることを意味することを理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「必要に応じて置換された」は、用語または一連の化学基におけるすべてのその後の修飾語句を指す。例えば、用語「必要に応じて置換されたアリールアルキル」では、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は置換されてもよいしまたは置換されなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」では、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール基は、他のものとは独立して、置換されてもよいしまたは置換されなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「保護基」は、分子中の反応性官能基に結合された場合に、官能基の反応性を遮蔽、低減または妨害する原子の基を指す。典型的には、保護基は、合成の過程で所望により選択的に除去され得る。保護基の例は当技術分野で周知である。保護基を有し得る官能基としては、限定されないが、ヒドロキシ、アミノおよびカルボキシ基が挙げられる。代表的なアミノ保護基としては、限定されないが、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル(「CBZ」)、tert-ブトキシカルボニル(「Boc」)、トリメチルシリル(「TMS」)、2-トリメチルシリル-エタンスルホニル(「SES」)、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(「FMOC」)、ニトロベラトリルオキシカルボニル(「NVOC」)などが挙げられる。代表的なヒドロキシル保護基としては、限定されないが、ヒドロキシル基がアシル化されているもの(例えば、メチルおよびエチルエステル、アセテートもしくはプロピオネート基またはグリコールエステル)またはアルキル化されているもの、例えばベンジルおよびトリチルエーテル、ならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル(例えば、TMSまたはTIPPS基)およびアリルエーテルが挙げられる。他の保護基は、本明細書に記述されている参考文献に見られ得る。
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド
本発明は、アミド化反応に有用なカルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチド(本明細書では「操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド」とも称される)を提供する。したがって、一態様では、本発明は、実施例3の表3.1に示されているように、基質化合物(複数可)を生成物化合物(複数可)に変換することができるカルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド前記ポリヌクレオチドを含む関連ベクターおよび宿主細胞、操作されたポリペプチドを作製するための方法、ならびに操作されたポリペプチドを使用するための方法であって、適切な反応条件を含む方法を提供する。
本発明の操作されたポリペプチドは、T.fuscaの野生型カルボキシエステラーゼポリペプチド(GenBankアクセッション番号WP_011292850.1;配列番号2)と比較して改善された酵素特性(例えば、立体選択性の増加)を有するように操作された天然に存在しないカルボキシエステラーゼである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される様々な操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、本明細書で提供される他の操作された参照カルボキシエステラーゼポリペプチドと比較して改善された酵素特性を示す。いくつかの実施形態では、本発明の操作されたポリペプチドは、G.stearothermophilusの野生型カルボキシエステラーゼポリペプチド(GenBankアクセッション番号WP_033015113;配列番号138)と比較して改善された酵素特性(例えば、増加した熱安定性)を有するように操作された天然に存在しないカルボキシエステラーゼである。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、M.tuberculosisの野生型カルボキシエステラーゼポリペプチド(GenBankアクセッション番号WP_003407276;配列番号140)と比較して改善された酵素特性(例えば、増加した熱安定性)を有するように操作
された天然に存在しないカルボキシエステラーゼである。
された天然に存在しないカルボキシエステラーゼである。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作されたカルボキシエステラーゼ変異体は、配列番号2、操作された参照カルボキシエステラーゼ(配列番号8)またはそれらの機能的断片と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたカルボキシエステラーゼは、ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかの実施形態では、カルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、本明細書で提供されるアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む(例えば、表8.1および11を参照のこと)。
本発明は、配列番号2と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、それらのポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされている操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438および470から選択される位置における置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、39/323、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、153、153/215、164/271、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224/268/372、249/284、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、372、372/37
6、373、376、377、405、420、427、428および429から選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、190H、190K、190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428Vおよび429Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115
H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428VおよびA429Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、位置282における置換を含み、位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、位置282における置換は、脂肪族、非極性、塩基性、極性または芳香族である。さらにいくつかのさらなる実施形態では、置換は、X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282TおよびX282Rから選択される。
6、373、376、377、405、420、427、428および429から選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、190H、190K、190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428Vおよび429Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115
H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428VおよびA429Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、位置282における置換を含み、位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、位置282における置換は、脂肪族、非極性、塩基性、極性または芳香族である。さらにいくつかのさらなる実施形態では、置換は、X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282TおよびX282Rから選択される。
本発明は、配列番号8と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされている操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/
215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377
、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381, 280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373および377から選択される位置における置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/280G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/
377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189I/320W/377I、189I/343V
、189I/377I、189L、189Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373Gおよび377Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、
P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M189I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G
、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M189Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373GおよびF377Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。
215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377
、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381, 280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373および377から選択される位置における置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/280G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/
377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189I/320W/377I、189I/343V
、189I/377I、189L、189Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373Gおよび377Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットは、P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、
P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M189I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G
、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M189Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373GおよびF377Lから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、機能的カルボキシエステラーゼ活性および/またはその操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドの改善された特性を保持する本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドのいずれかの断片を含む操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、カルボキシエステラーゼ活性を有する(例えば、適切な反応条件下で基質を生成物に変換することができる)ポリペプチド断片であって、本発明の操作されたポリペプチド、例えば配列番号2~136の偶数番号配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチドの全長アミノ酸配列の少なくとも約80%、90%、95%、98%または99%を含むポリペプチド断片を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは
、本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド配列、例えば配列番号2~136の偶数番号配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列のいずれか1つと比較して少なくとも1つの欠失、付加および/または置換を含むアミノ酸配列を含む。したがって、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドのそれぞれのおよびあらゆる実施形態について、アミノ酸配列は、カルボキシエステラーゼポリペプチドの1個もしくはそれを超えるアミノ酸、2個もしくはそれを超えるアミノ酸、3個もしくはそれを超えるアミノ酸、4個もしくはそれを超えるアミノ酸、5個もしくはそれを超えるアミノ酸、6個もしくはそれを超えるアミノ酸、8個もしくはそれを超えるアミノ酸、10個もしくはそれを超えるアミノ酸、15個もしくはそれを超えるアミノ酸または20個もしくはそれを超えるアミノ酸、総アミノ酸数の最大10%、総アミノ酸数の最大10%、総アミノ酸数の最大20%または総アミノ酸数の最大30%の欠失、付加および/または置換を含み得、本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼの関連する機能的活性および/または改善された特性は維持される。いくつかの実施形態では、欠失、付加および/または置換は、1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45、1~50、1~55または1~60個のアミノ酸残基の付加および/または置換を含み得る。いくつかの実施形態では、欠失、付加および/または置換の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、30、35、40、45、50、55または60個のアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、欠失、付加および/または置換は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24、25または30個のアミノ酸残基の欠失、付加および/または置換を含み得る。
、本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド配列、例えば配列番号2~136の偶数番号配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列のいずれか1つと比較して少なくとも1つの欠失、付加および/または置換を含むアミノ酸配列を含む。したがって、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドのそれぞれのおよびあらゆる実施形態について、アミノ酸配列は、カルボキシエステラーゼポリペプチドの1個もしくはそれを超えるアミノ酸、2個もしくはそれを超えるアミノ酸、3個もしくはそれを超えるアミノ酸、4個もしくはそれを超えるアミノ酸、5個もしくはそれを超えるアミノ酸、6個もしくはそれを超えるアミノ酸、8個もしくはそれを超えるアミノ酸、10個もしくはそれを超えるアミノ酸、15個もしくはそれを超えるアミノ酸または20個もしくはそれを超えるアミノ酸、総アミノ酸数の最大10%、総アミノ酸数の最大10%、総アミノ酸数の最大20%または総アミノ酸数の最大30%の欠失、付加および/または置換を含み得、本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼの関連する機能的活性および/または改善された特性は維持される。いくつかの実施形態では、欠失、付加および/または置換は、1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45、1~50、1~55または1~60個のアミノ酸残基の付加および/または置換を含み得る。いくつかの実施形態では、欠失、付加および/または置換の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、30、35、40、45、50、55または60個のアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、欠失、付加および/または置換は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24、25または30個のアミノ酸残基の欠失、付加および/または置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド配列、例えば配列番号2~136の偶数番号配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列のいずれか1つと比較して挿入を含むアミノ酸配列を有する操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド、を提供する。したがって、本発明のカルボキシエステラーゼポリペプチドのそれぞれのおよびあらゆる実施形態について、挿入は、1個もしくはそれを超えるアミノ酸、2個もしくはそれを超えるアミノ酸、3個もしくはそれを超えるアミノ酸、4個もしくはそれを超えるアミノ酸、5個もしくはそれを超えるアミノ酸、6個もしくはそれを超えるアミノ酸、8個もしくはそれを超えるアミノ酸、10個もしくはそれを超えるアミノ酸、15個もしくはそれを超えるアミノ酸または20個もしくはそれを超えるアミノ酸を含み得、本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼの関連する機能的活性および/または改善された特性は維持される。挿入は、カルボキシエステラーゼポリペプチドのアミノもしくはカルボキシ末端または内部部分へのものであり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが他のポリペプチド、例えば一例として限定されないが、抗体タグ(例えば、mycエピトープ)、精製配列(例えば、金属への結合のためのHisタグ)および細胞局在化シグナル(例えば、分泌シグナル)に融合された融合ポリペプチドの形態である。したがって、本明細書に記載される操作されたポリペプチドは、他のポリペプチドへの融合にかかわらず使用され得る。
本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、遺伝的にコードされるアミノ酸に限定されない。したがって、遺伝的にコードされるアミノ酸に加えて、本明細書に記載されるポリペプチドは、天然に存在するおよび/または合成非コードアミノ酸から全体的または部分的に構成され得る。本明細書に記載されるポリペプチドを
構成し得る一般に遭遇する特定の非コードアミノ酸としては、限定されないが、遺伝的にコードされるアミノ酸のD-立体異性体;2,3-ジアミノプロピオン酸(Dpr);α-アミノイソ酪酸(Aib);ε-アミノヘキサン酸(Aha);δ-アミノ吉草酸(Ava);N-メチルグリシンまたはサルコシン(MeGlyまたはSar);オルニチン(Orn);シトルリン(Cit);t-ブチルアラニン(Bua);t-ブチルグリシン(Bug);N-メチルイソロイシン(MeIle);フェニルグリシン(Phg);シクロヘキシルアラニン(Cha);ノルロイシン(Nle);ナフチルアラニン(Nal);2-クロロフェニルアラニン(Ocf);3-クロロフェニルアラニン(Mcf);4-クロロフェニルアラニン(Pcf);2-フルオロフェニルアラニン(Off);3-フルオロフェニルアラニン(Mff);4-フルオロフェニルアラニン(Pff);2-ブロモフェニルアラニン(Obf);3-ブロモフェニルアラニン(Mbf);4-ブロモフェニルアラニン(Pbf);2-メチルフェニルアラニン(Omf);3-メチルフェニルアラニン(Mmf);4-メチルフェニルアラニン(Pmf);2-ニトロフェニルアラニン(Onf);3-ニトロフェニルアラニン(Mnf);4-ニトロフェニルアラニン(Pnf);2-シアノフェニルアラニン(Ocf);3-シアノフェニルアラニン(Mcf);4-シアノフェニルアラニン(Pcf);2-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Otf);3-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Mtf);4-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Ptf);4-アミノフェニルアラニン(Paf);4-ヨードフェニルアラニン(Pif);4-アミノメチルフェニルアラニン(Pamf);2,4-ジクロロフェニルアラニン(Opef);3,4-ジクロロフェニルアラニン(Mpcf);2,4-ジフルオロフェニルアラニン(Opff);3,4-ジフルオロフェニルアラニン(Mpff);ピリド-2-イルアラニン(2pAla);ピリド-3-イルアラニン(3pAla);ピリド-4-イルアラニン(4pAla);ナフト-1-イルアラニン(1nAla);ナフト-2-イルアラニン(2nAla);チアゾリルアラニン(taAla);ベンゾチエニルアラニン(bAla);チエニルアラニン(tAla);フリルアラニン(fAla);ホモフェニルアラニン(hPhe);ホモチロシン(hTyr);ホモトリプトファン(hTrp);ペンタフルオロフェニルアラニン(5ff);スチリルアラニン(styrylkalanine)(sAla);アウスリルアラニン(authrylalanine)(aAla);3,3-ジフェニルアラニン(Dfa);3-アミノ-5-フェニルペンタン酸(Afp);ペニシラミン(Pen);1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸(Tic);β-2-チエニルアラニン(Thi);メチオニンスルホキシド(Mso);N(w)-ニトロアルギニン(nArg);ホモリジン(hLys);ホスホノメチルフェニルアラニン(pmPhe);ホスホセリン(pSer);ホスホトレオニン(pThr);ホモアスパラギン酸(hAsp);ホモグルタミン酸(hGlu);1-アミノシクロペンタ-(2または3)-エン-4カルボン酸;ピペコリン酸(PA)、アゼチジン-3-カルボン酸(ACA)、1-アミノシクロペンタン-3-カルボン酸;アリルグリシン(aOly);プロパルギルグリシン(pgGly);ホモアラニン(hAla);ノルバリン(nVal);ホモロイシン(hLeu)、ホモバリン(hVal);ホモイソロイシン(hIle);ホモアルギニン(hArg);N-アセチルリジン(AcLys);2,4-ジアミノ酪酸(Dbu);2,3-ジアミノ酪酸(Dab);N-メチルバリン(MeVal);ホモシステイン(hCys);ホモセリン(hSer);ヒドロキシプロリン(Hyp)およびホモプロリン(hPro)が挙げられる。本明細書に記載されるポリペプチドを構成し得るさらなる非コードアミノ酸は、当業者には明らかである。これらのアミノ酸は、L-またはD-配置のいずれかであり得る。
構成し得る一般に遭遇する特定の非コードアミノ酸としては、限定されないが、遺伝的にコードされるアミノ酸のD-立体異性体;2,3-ジアミノプロピオン酸(Dpr);α-アミノイソ酪酸(Aib);ε-アミノヘキサン酸(Aha);δ-アミノ吉草酸(Ava);N-メチルグリシンまたはサルコシン(MeGlyまたはSar);オルニチン(Orn);シトルリン(Cit);t-ブチルアラニン(Bua);t-ブチルグリシン(Bug);N-メチルイソロイシン(MeIle);フェニルグリシン(Phg);シクロヘキシルアラニン(Cha);ノルロイシン(Nle);ナフチルアラニン(Nal);2-クロロフェニルアラニン(Ocf);3-クロロフェニルアラニン(Mcf);4-クロロフェニルアラニン(Pcf);2-フルオロフェニルアラニン(Off);3-フルオロフェニルアラニン(Mff);4-フルオロフェニルアラニン(Pff);2-ブロモフェニルアラニン(Obf);3-ブロモフェニルアラニン(Mbf);4-ブロモフェニルアラニン(Pbf);2-メチルフェニルアラニン(Omf);3-メチルフェニルアラニン(Mmf);4-メチルフェニルアラニン(Pmf);2-ニトロフェニルアラニン(Onf);3-ニトロフェニルアラニン(Mnf);4-ニトロフェニルアラニン(Pnf);2-シアノフェニルアラニン(Ocf);3-シアノフェニルアラニン(Mcf);4-シアノフェニルアラニン(Pcf);2-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Otf);3-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Mtf);4-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Ptf);4-アミノフェニルアラニン(Paf);4-ヨードフェニルアラニン(Pif);4-アミノメチルフェニルアラニン(Pamf);2,4-ジクロロフェニルアラニン(Opef);3,4-ジクロロフェニルアラニン(Mpcf);2,4-ジフルオロフェニルアラニン(Opff);3,4-ジフルオロフェニルアラニン(Mpff);ピリド-2-イルアラニン(2pAla);ピリド-3-イルアラニン(3pAla);ピリド-4-イルアラニン(4pAla);ナフト-1-イルアラニン(1nAla);ナフト-2-イルアラニン(2nAla);チアゾリルアラニン(taAla);ベンゾチエニルアラニン(bAla);チエニルアラニン(tAla);フリルアラニン(fAla);ホモフェニルアラニン(hPhe);ホモチロシン(hTyr);ホモトリプトファン(hTrp);ペンタフルオロフェニルアラニン(5ff);スチリルアラニン(styrylkalanine)(sAla);アウスリルアラニン(authrylalanine)(aAla);3,3-ジフェニルアラニン(Dfa);3-アミノ-5-フェニルペンタン酸(Afp);ペニシラミン(Pen);1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸(Tic);β-2-チエニルアラニン(Thi);メチオニンスルホキシド(Mso);N(w)-ニトロアルギニン(nArg);ホモリジン(hLys);ホスホノメチルフェニルアラニン(pmPhe);ホスホセリン(pSer);ホスホトレオニン(pThr);ホモアスパラギン酸(hAsp);ホモグルタミン酸(hGlu);1-アミノシクロペンタ-(2または3)-エン-4カルボン酸;ピペコリン酸(PA)、アゼチジン-3-カルボン酸(ACA)、1-アミノシクロペンタン-3-カルボン酸;アリルグリシン(aOly);プロパルギルグリシン(pgGly);ホモアラニン(hAla);ノルバリン(nVal);ホモロイシン(hLeu)、ホモバリン(hVal);ホモイソロイシン(hIle);ホモアルギニン(hArg);N-アセチルリジン(AcLys);2,4-ジアミノ酪酸(Dbu);2,3-ジアミノ酪酸(Dab);N-メチルバリン(MeVal);ホモシステイン(hCys);ホモセリン(hSer);ヒドロキシプロリン(Hyp)およびホモプロリン(hPro)が挙げられる。本明細書に記載されるポリペプチドを構成し得るさらなる非コードアミノ酸は、当業者には明らかである。これらのアミノ酸は、L-またはD-配置のいずれかであり得る。
当業者は、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基もまた、本明細書に記載されるポリペプチドを含み得ることを認識する。この場合、芳香族カテゴリーに属するこのような保護アミノ酸の非限定的な例としては(括弧内に列挙されている保護基)、限定されないが、Arg(tos)、Cys(メチルベンジル)、Cys(ニトロピリジンスルフェニル
)、Glu(δ-ベンジルエステル)、Gln(キサンチル)、Asn(N-δ-キサンチル)、His(bom)、His(ベンジル)、His(tos)、Lys(fmoc)、Lys(tos)、Ser(O-ベンジル)、Thr(O-ベンジル)およびTyr(O-ベンジル)が挙げられる。
)、Glu(δ-ベンジルエステル)、Gln(キサンチル)、Asn(N-δ-キサンチル)、His(bom)、His(ベンジル)、His(tos)、Lys(fmoc)、Lys(tos)、Ser(O-ベンジル)、Thr(O-ベンジル)およびTyr(O-ベンジル)が挙げられる。
本明細書に記載されるポリペプチドを構成し得る構造的に拘束される非コードアミノ酸としては、限定されないが、N-メチルアミノ酸(L-配置);1-アミノシクロペンタ-(2または3)-エン-4-カルボン酸;ピペコリン酸;アゼチジン-3-カルボン酸;ホモプロリン(hPro);および1-アミノシクロペンタン-3-カルボン酸が挙げられる。
当業者には明らかであるように、前述の残基位置および各残基位置の特定のアミノ酸残基を個々にまたは様々な組み合わせで使用して、とりわけ、酵素活性、基質/生成物選好性、立体選択性、基質/生成物耐性、ならびに高温、溶媒および/またはpHなどの様々な条件下における安定性を含む所望の改善された特性を有するカルボキシエステラーゼポリペプチドを合成し得る。
本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、特定の工業関連条件下で、目的の生成物への目的の基質の効率的なアミド化のために配列番号2の定向進化により生成したものであり、参照カルボキシエステラーゼポリペプチドと比較して1つまたはそれを超える残基差異を有する。これらの残基差異は、様々な酵素特性の改善、特に活性の増加、溶媒耐性の増加、および宿主細胞(例えば、大腸菌)への毒性の低減に関連する。いくつかのさらなる実施形態では、変異体カルボキシエステラーゼはまた、立体選択性の増加、安定性の増加、および基質および/または生成物濃度の増加への耐性(例えば、生成物阻害の減少)を示した。したがって、いくつかの実施形態では、カルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼポリペプチド(例えば、配列番号2)の活性と比べて少なくとも約1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍またはそれよりも多く活性を増加させて、基質化合物(複数可)を生成物(複数可)に変換することができる。いくつかの実施形態では、カルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、約48時間、約36時間、約24時間またはさらにはより短い期間の反応時間に、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%または少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%の変換率で、基質を生成物に変換することができる。いくつかの実施形態では、カルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、少なくとも90%、95%、97%、98%、99%またはそれを超えるジアステレオマー過剰率で、基質を生成物に変換することができる。
いくつかの実施形態では、カルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、参照ポリペプチド(例えば、配列番号2)の基質耐性と比べて基質の存在に対する耐性を増加させて、基質を生成物に変換することができる。したがって、いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、約72時間、約48時間、約36時間、約24時間またはさらにはより短い期間の反応時間に、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約94%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%の変換率で、少なくと
も約1g/L、5g/L、10g/L、20g/L、約30g/L、約40g/L、約50g/L、約70g/L、約75g/L、約100g/Lの基質負荷濃度の存在下で、基質の基質を生成物に変換することができる。
も約1g/L、5g/L、10g/L、20g/L、約30g/L、約40g/L、約50g/L、約70g/L、約75g/L、約100g/Lの基質負荷濃度の存在下で、基質の基質を生成物に変換することができる。
ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、バッファー、共溶媒、pHおよび/または条件(温度および反応時間を含む)に関して、操作されたポリペプチドの上記改善された特性が決定され得るいくつかの適切な反応条件は、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、以下および実施例に記載されているアッセイ条件を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、固体支持体、例えば膜、樹脂、固体担体または他の固相材料上に提供され得る。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトなどの有機ポリマーから構成される。固体支持体はまた、無機物、例えばガラス、シリカ、制御細孔ガラス(CPG)、逆相シリカまたは金属、例えば金または白金であり得る。固体支持体の形状は、ビーズ、スフィア、粒子、顆粒、ゲル、膜または面の形態であり得る。面は、平面、実質的な平面または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤特性または非膨潤特性を有し得る。固体支持体は、ウェル、凹部または他の入れ物(container)、容器、フィーチャまたはロケーションの形態で形成され得る。
いくつかの実施形態では、カルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、それらが参照ポリペプチド(例えば、配列番号2)と比べて改善されたそれらの特性の少なくとも一部を保持するように、固体支持体上に結合または固定される。このような実施形態では、固定化ポリペプチドは、所望の生成物への基質化合物の生体触媒変換を容易にし得、反応の完了後、(例えば、ポリペプチドが固定されたビーズを保持することにより)容易に保持され、次いで、その後の反応において再利用またはリサイクルされる。このような固定化酵素プロセスは、さらなる効率およびコスト削減を可能にする。したがって、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを使用する方法はいずれも、固体支持体上に結合または固定された同じカルボキシエステラーゼポリペプチドを使用して行われ得ることがさらに企図される。
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、非共有結合的または共有結合的に結合され得る。固体支持体(例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど)への酵素のコンジュゲーションおよび固定のための様々な方法は、当技術分野で周知である。固体支持体(例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど)への酵素のコンジュゲーションおよび固定のための他の方法は、当技術分野で周知である(例えば、Yiら、Proc.Biochem.,42:895-898[2007];Martinら、Appl.Microbiol.Biotechnol.,76:843-851[2007];Koszelewskiら、J.Mol.Cat.B:Enz.,63:39-44[2010];Truppoら、Org.Proc.Res.Develop.,published online:dx.doi.org/10.1021/op200157c;およびMateoら、Biotechnol.Prog.,18:629-34[2002]などを参照のこと)。本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを固定するために有用な固体支持体としては、限定されないが、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン/DVBコポリマーまたはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂が挙げられる。本発明の操作されたカルボキシエステラーゼを固定するために有用な例示的な固体支持体としては、限定されないが、以下の異なるタイプのSEPABEAD:EC-EP、EC-HFA/S、EXA252、EXE119およびEXE120を含むキトサンビーズ、Eupergit CおよびSEPABEADs(Mitsubishi)が挙げら
れる。
れる。
いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、ポリペプチドが位置的に異なる場所に配置されたアレイの形態で提供され得る。いくつかの実施形態では、位置的に異なる場所は、96ウェルプレートなどの固体支持体中のウェルである。試薬のロボット送達が処理可能な様々な場所において、または検出方法および/もしくは機器により処理可能な様々な場所において、複数の支持体がアレイ上に配置され得る。このようなアレイは、ポリペプチドによる変換のために様々な基質化合物を試験するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたポリペプチドは、キットの形態で提供され得る。キット中のポリペプチドは個々に存在し得るか、または複数のポリペプチドとして存在し得る。キットは、酵素反応を行うための試薬と、ポリペプチドの活性を評価するための基質と、生成物を検出するための試薬とをさらに含み得る。キットはまた、試薬ディスペンサーと、キットの使用のための指示とを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、異なる処理可能な位置に複数の異なる操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを含むアレイを含み、異なるポリペプチドは、それぞれが少なくとも1つの異なる改善された酵素特性を有する参照配列の異なる変異体である。複数の操作されたポリペプチドを含むこのようなアレイおよびそれらの使用方法は公知である(例えば、国際公開第2009/008908号を参照のこと)。
操作されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチド
操作されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチド
別の態様では、本発明は、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。遺伝子発現を制御する1つまたはそれを超える異種調節配列にポリヌクレオチドを作動可能に連結して、前記ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製し得る。操作されたカルボキシエステラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するカルボキシエステラーゼポリペプチドを発現させ得る。
様々なアミノ酸に対応するコドンの知識により、タンパク質配列のアベイラビリティは、対象をコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの説明を提供する。同じアミノ酸が代替または同義コドンによりコードされる遺伝子コードの縮重は、非常に多数の核酸を作製することを可能にし、これらはすべて、本明細書に開示される改善されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を同定したら、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない方法で、1つまたはそれを超えるコドンの配列を単に改変することにより、任意の数の様々な核酸を作製し得る。これに関して、本発明は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより作製され得るポリヌクレオチドのそれぞれのおよびすべての可能なバリエーションを具体的に企図し、すべてのこのようなバリエーションは、実施例の表に示されているアミノ酸配列を含む本明細書に開示される任意のポリペプチドについて具体的に開示されるとみなされるべきである。様々な実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質が産生されている宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌において遺伝子を発現させるために使用され;酵母において使用される好ましいコドンは、酵母における発現に使用され、哺乳動物において使用される好ましいコドンは、哺乳動物細胞における発現に使用される。例として、配列番号1のポリヌクレオチドは、大腸菌における発現のためにコドン最適化されているが、T.fuscaの天然に存在するカルボキシエステラーゼを他の様式でコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、
40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134または136から選択されるアミノ酸配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする。
40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134または136から選択されるアミノ酸配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137および/または139と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を含むポリヌクレオチド配列から選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェント条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137および/または139を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、ヌクレオチドレベルで、操作されたカルボキシエステラーゼをコードする参照ポリヌクレオチドと約80%またはそれを超える配列同一性、約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%またはそれを超える配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチドは配列番号1を含み、いくつかの他の実施形態では、参照ポリヌクレオチド(reference polynucloeotide)は配列番号137を含む。いくつかのさらなる実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は配列番号139を含む。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼ配列は、実施例に記載されているように、有益であると同定された位置を含む配列を含む。
本発明はまた、少なくとも1つの本明細書で提供される操作されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号2と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードし、操作されたカルボキシエステラーゼは、そのポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、
117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438および470から選択される位置における置換を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、39/323、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、153、153/215、164/271、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224/268/372、249/284、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、372、372/376、373、376、377、405、420、427、428および429から選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、190H、190K、190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、
216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428Vおよび429Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284
T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428VおよびA429Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、位置282における置換を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、位置282における置換は、脂肪族、非極性、塩基性、極性または芳香族である。さらにいくつかのさらなる実施形態では、置換は、X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282TおよびX282Rから選択される。
117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438および470から選択される位置における置換を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、39/323、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、153、153/215、164/271、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224/268/372、249/284、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、372、372/376、373、376、377、405、420、427、428および429から選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、39M/323I、62H/117G、63A、63R、63T、63Y、64A、64E、64G、64I、64T、64V、64W、65G、65S、65T、65W、66N、68L、68P、69F、69G、69H、69L、69V、69W、69Y、70L、70R、70T、70W、71F、71G、71H/263R、71P、71R、71V、71Y、77S/184G、103P、103R、103T/147S、104P、104Q/429V、105L、107D/185W、107L、107P、107S、108G、108K、108Q、108R、108S、108W、109G/117M、110A、110H、110P、110S、111L、111M、111R、111S、111V、111W、113P、114A、114H、114Q、115H、115T、115V、117A、117F、118G/349V、118I、118N、118N/269T、119G、119P、119S、126C、153H/215P、153L、164R/271T、174D/282V、183P、184F、184G、184P、184S/249T、184Y、185A、185T、186C、186G、186P、186R、186T、187P、188E、188G、190H、190K、190L、190M、190Q、190R、190W、209E、209G、209P、209S、209V、210P、210T、210W、211I、211L、211R、211V、212A、212P、212R、212S、213C、213E、213L、213N、213P、213Q、213R/345G、213S、213T/271K、213V、214K、214L、214T、214V、215K、215M、215P、215R、215R/271R、215W、
216P、217G、217L、217P、217R、217R/231V、217S、217V、217W、224I/268S/372F、249V/284P、269N、269V、270I、270I/470M、270R、271A、271K、271L、271P、271Q/416V、271S、271T、276F、277M、278H、278S、279C、279E、279G、279L/280G/282M、279V、280E、280G、280S、281P、281V、281Y/374N、282A、282C、282Q、282R、282S、282T、282W、283C、283D、283K、283R/429V、283T、283V、283Y、284C、284T、284T/438T、284V、285L、285M、285P、286V、311I、317C、317P、320A、320F、320G、320G/323S、320S、320S/323S/372A、320S/372A/376G、320S/376G/377V、320W、321L、321S、323C、323I、323R、323Y、324A、372A/376A、372L、373G、376A、376G、376L、376M、377L、377W、377Y、405D、420G、427A、428Vおよび429Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、T39M/F323I、R62H/P117G、P63A、P63R、P63T、P63Y、P64A、P64E、P64G、P64I、P64T、P64V、P64W、Y65G、Y65S、Y65T、Y65W、P66N、A68L、A68P、I69F、I69G、I69H、I69L、I69V、I69W、I69Y、G70L、G70R、G70T、G70W、A71F、A71G、A71H/Q263R、A71P、A71R、A71V、A71Y、F77S/E184G、W103P、W103R、W103T/P147S、I104P、I104Q/A429V、H105L、G107D/S185W、G107L、G107P、G107S、A108G、A108K、A108Q、A108R、A108S、A108W、F109G/P117M、T110A、T110H、T110P、T110S、N111L、N111M、N111R、N111S、N111V、N111W、S113P、G114A、G114H、G114Q、S115H、S115T、S115V、P117A、P117F、V118G/A349V、V118I、V118N、V118N/A269T、Y119G、Y119P、Y119S、R126C、R153H/N215P、R153L、W164R/W271T、G174D/L282V、G183P、E184F、E184G、E184P、E184S/A249T、E184Y、S185A、S185T、A186C、A186G、A186P、A186R、A186T、G187P、A188E、A188G、S190H、S190K、S190L、S190M、S190Q、S190R、S190W、L209E、L209G、L209P、L209S、L209V、Q210P、Q210T、Q210W、S211I、S211L、S211R、S211V、G212A、G212P、G212R、G212S、A213C、A213E、A213L、A213N、A213P、A213Q、A213R/S345G、A213S、A213T/W271K、A213V、G214K、G214L、G214T、G214V、N215K、N215M、N215P、N215R、N215R/W271R、N215W、M216P、A217G、A217L、A217P、A217R、A217R/A231V、A217S、A217V、A217W、T224I/P268S/I372F、A249V/F284P、A269N、A269V、V270I、V270I/V470M、V270R、W271A、W271K、W271L、W271P、W271Q/A416V、W271S、W271T、A276F、G277M、G278H、G278S、S279C、S279E、S279G、S279L/V280G/L282M、S279V、V280E、V280G、V280S、L281P、L281V、L281Y/D374N、L282A、L282C、L282Q、L282R、L282S、L282T、L282W、P283C、P283D、P283K、P283R/A429V、P283T、P283V、P283Y、F284C、F284
T、F284T/P438T、F284V、A285L、A285M、A285P、P286V、L311I、T317C、T317P、Y320A、Y320F、Y320G、Y320G/F323S、Y320S、Y320S/F323S/I372A、Y320S/I372A/V376G、Y320S/V376G/F377V、Y320W、R321L、R321S、F323C、F323I、F323R、F323Y、L324A、I372A/V376A、I372L、T373G、V376A、V376G、V376L、V376M、F377L、F377W、F377Y、P405D、P420G、D427A、R428VおよびA429Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、位置282における置換を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、位置は配列番号2を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、位置282における置換は、脂肪族、非極性、塩基性、極性または芳香族である。さらにいくつかのさらなる実施形態では、置換は、X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282TおよびX282Rから選択される。
本発明はまた、配列番号8と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが、そのポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされているポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/2
82、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373および377から選択される位置における少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/280G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L
/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189
I/320W/377I、189I/343V、189I/377I、189L、189
Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373Gおよび377Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M189I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S
/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M189Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/
A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373GおよびF377Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。
82、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373および377から選択される位置における少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、63A、63A/189A、63A/215R/343V、63R、63R/65G/108G、63R/65G/108G/189L、63R/65G/108G/377I、63R/65G/282A/285L/320W/323I、63R/65G/320W/323I、63R/108G、63R/108G/282A/285L/377L、63R/108G/285L/377I、63R/108G/320W/323C、63R/377I、63T/215R、63Y、63Y/189L、63Y/212P/215R、63Y/212P/215R/268A/269N/343V、63Y/215P/269N、63Y/215R、63Y/215R/270I/271S、63Y/268A/269N/270I/429V、65G/320W、65G/320W/323I、65W/69L/372L、65W/69M/70A/281P/372L、65W/69W/70L/372L、65W/70L/372M、68P、68P/69L/189E/214R/271Y/280G、68P/69L/189E/214R/372L、68P/69L/189I/214R/215P/271Y、68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L、68P/69L/189Q/214R、68P/69L/189Q/271Y/280G/372L
/381L、68P/69L/215P、68P/69L/271Y、68P/69L/282C/287I、68P/69L/343V/372L、68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L、68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y、68P/69W/189E/343V/381L、68P/69W/189I/214R/215P、68P/69W/189I/214R/377Y/381L、68P/69W/189I/271Y、68P/69W/189I/372L、68P/69W/189I/381L、68P/69W/214R/215P/271Y、68P/69W/214R/343V、68P/69W/215P、68P/108G/377L、68P/184S、68P/184S/189E、68P/189I/271Y/372L、68P/189I/343V、68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L、68P/215P/271Y/343V/372L/381L、68P/215P/377L、68P/271Y/372L、68P/377L、69F/108G/270E/372L/377L、69F/189L、69F/215K、69F/215K/269L/270I/377L、69F/215R、69F/285L/373G、69L、69L/70L/331Q/372M、69L/189E/271Y/281P/282A、69L/189I、69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V、69L/189I/271Y/343V/381L、69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L、69L/189I/282A、69L/189Q/377Y、69L/215P/271Y/280G/281P/282C、69L/215P/271Y/282A、69L/215P/271Y/372L、69L/215P/343V/372L/381L、69L/215R/285P/317P、69L/271Y、69L/271Y/372L、69L/282C/343V/372L、69L/372L、69M/70A/372M、69W、69W/70L、69W/70L/372M、69W/70L/459R、69W/108S、69W/189E/214R/343V/372L、69W/189E/271Y/343V、69W/189E/372L、69W/189I、69W/189I/215P/343V、69W/189I/271Y、69W/189I/343V/381L、69W/189Q/372L/377Y、69W/212A/213L/215R/280G/281P、69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L、69W/214R/271Y/282A、69W/214R/271Y/343V、69W/215K/343V、69W/215P、69W/215R、69W/215R/323Y、69W/282A、69W/372M、69Y/108G/281P/285P、69Y/110A/215R/281P、69Y/189L/281P/373G、70L、70L/212P、108G、108G/189I/282A/285L/320W、108G/189L、108G/189L/320W、108G/189L/377I、108G/215K、108G/215P/377L、108G/269L/270E、108G/270E、108G/282A/285L/377L、108G/285L、108G/320W/323I、108G/377I、108G/377L、126C、126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G、126C/184S/213S/372L、126C/189I/285L/372L、126C/215P、126C/372L、181L/215P、189E/372L/377Y、189I、189I/214R/215P/271Y/282G、189I/215K、189I/215P/343V/372L、189I/215R/249T/277M、189I/270E/285L、189I/270E/372L、189I/280G/282A、189
I/320W/377I、189I/343V、189I/377I、189L、189
Q、189Q/214R、189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y、189Q/343V、189Q/343V/377Y、189Q/381L、213S/215P/320G、214R/215P/271Y、214R/215P/271Y/377Y、214R/271Y、214R/280G/282A/343V/377Y/381L、215K、215K/281P/285L/372L、215K/281P/373G、215K/285L/317P、215K/285L/445L、215K/323Y、215K/372L、215K/372L/377L、215K/373G、215P、215P/271Y/372L、215P/320G、215P/320G/372L、215P/372L、215P/372L/377L、215P/377L、215P/381L、215R、215R/249T/280G/281P/285L/372L、215R/280G/281P/285L/372L、215R/281P/285L/373G、215R/285P、215R/320G、215R/372L、215W、215W/285L/346S、215W/285P、215W/373G、249T/377L、269L/270E/281P/372L/377L、270E/377L、271Y、271Y/343V、271Y/343V/372L、271Y/343V/372L/381L、280G/285L/372L、281P/372L、282A/285L/320W/323I、285L/323I、320W、343V/372L、372L、372L/377L、372L/381L、372M、373Gおよび377Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、P63A、P63A/M189A、P63A/N215R/A343V、P63R、P63R/Y65G/A108G、P63R/Y65G/A108G/M189L、P63R/Y65G/A108G/F377I、P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I、P63R/Y65G/Y320W/F323I、P63R/A108G、P63R/A108G/T282A/A285L/F377L、P63R/A108G/A285L/F377I、P63R/A108G/Y320W/F323C、P63R/F377I、P63T/N215R、P63Y、P63Y/M189L、P63Y/G212P/N215R、P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V、P63Y/N215P/A269N、P63Y/N215R、P63Y/N215R/V270I/W271S、P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V、Y65G/Y320W、Y65G/Y320W/F323I、Y65W/I69L/I372L、Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L、Y65W/I69W/G70L/I372L、Y65W/G70L/I372M、A68P、A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G、A68P/I69L/M189E/G214R/I372L、A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L、A68P/I69L/M189Q/G214R、A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L、A68P/I69L/N215P、A68P/I69L/W271Y、A68P/I69L/T282C/V287I、A68P/I69L/A343V/I372L、A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L、A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y、A68P/I69W/M189E/A343V/A381L、A68P/I69W/M189I/G214R/N215P、A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L、A68P/I69W/M189I/W271Y、A68P/I69W/M189I/I372L、A68P/I69W/M189I/A381L、A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y、A68P/I69W/G214R/A343V、A68P/I69W/N215P、A68P/A108G/F377L、A68P/E184S、A68P/E184S
/M189E、A68P/M189I/W271Y/I372L、A68P/M189I/A343V、A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L、A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L、A68P/N215P/F377L、A68P/W271Y/I372L、A68P/F377L、I69F/A108G/V270E/I372L/F377L、I69F/M189L、I69F/N215K、I69F/N215K/A269L/V270I/F377L、I69F/N215R、I69F/A285L/T373G、I69L、I69L/G70L/P331Q/I372M、I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A、I69L/M189I、I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V、I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L、I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L、I69L/M189I/T282A、I69L/M189Q/F377Y、I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C、I69L/N215P/W271Y/T282A、I69L/N215P/W271Y/I372L、I69L/N215P/A343V/I372L/A381L、I69L/N215R/A285P/T317P、I69L/W271Y、I69L/W271Y/I372L、I69L/T282C/A343V/I372L、I69L/I372L、I69M/G70A/I372M、I69W、I69W/G70L、I69W/G70L/I372M、I69W/G70L/G459R、I69W/A108S、I69W/M189E/G214R/A343V/I372L、I69W/M189E/W271Y/A343V、I69W/M189E/I372L、I69W/M189I、I69W/M189I/N215P/A343V、I69W/M189I/W271Y、I69W/M189I/A343V/A381L、I69W/M189Q/I372L/F377Y、I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P、I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L、I69W/G214R/W271Y/T282A、I69W/G214R/W271Y/A343V、I69W/N215K/A343V、I69W/N215P、I69W/N215R、I69W/N215R/F323Y、I69W/T282A、I69W/I372M、I69Y/A108G/L281P/A285P、I69Y/T110A/N215R/L281P、I69Y/M189L/L281P/T373G、G70L、G70L/G212P、A108G、A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W、A108G/M189L、A108G/M189L/Y320W、A108G/M189L/F377I、A108G/N215K、A108G/N215P/F377L、A108G/A269L/V270E、A108G/V270E、A108G/T282A/A285L/F377L、A108G/A285L、A108G/Y320W/F323I、A108G/F377I、A108G/F377L、R126C、R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G、R126C/E184S/A213S/I372L、R126C/M189I/A285L/I372L、R126C/N215P、R126C/I372L、V181L/N215P、M189E/I372L/F377Y、M189I、M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G、M189I/N215K、M189I/N215P/A343V/I372L、M189I/N215R/A249T/G277M、M189I/V270E/A285L、M189I/V270E/I372L、M189I/V280G/T282A、M189I/Y320W/F377I、M189I/A343V、M189I/F377I、M189L、M189Q、M189Q/G214R、M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y、M189Q/A343V、M189Q/A343V/F377Y、M189Q/A381L、A213S/N215P/Y320G、G214R/N215P/W271Y、G214R/N215P/W271Y/F377Y、G214R/W271Y、G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L、N215K、N215K/L281P/
A285L/I372L、N215K/L281P/T373G、N215K/A285L/T317P、N215K/A285L/V445L、N215K/F323Y、N215K/I372L、N215K/I372L/F377L、N215K/T373G、N215P、N215P/W271Y/I372L、N215P/Y320G、N215P/Y320G/I372L、N215P/I372L、N215P/I372L/F377L、N215P/F377L、N215P/A381L、N215R、N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/V280G/L281P/A285L/I372L、N215R/L281P/A285L/T373G、N215R/A285P、N215R/Y320G、N215R/I372L、N215W、N215W/A285L/G346S、N215W/A285P、N215W/T373G、A249T/F377L、A269L/V270E/L281P/I372L/F377L、V270E/F377L、W271Y、W271Y/A343V、W271Y/A343V/I372L、W271Y/A343V/I372L/A381L、V280G/A285L/I372L、L281P/I372L、T282A/A285L/Y320W/F323I、A285L/F323I、Y320W、A343V/I372L、I372L、I372L/F377L、I372L/A381L、I372M、T373GおよびF377Lから選択される少なくとも1つの置換または置換セットを含む操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸位置は配列番号8を参照して番号付けされている。
改善されたカルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するために様々な方法で操作され得る。発現ベクターに応じて、ベクターへの挿入前における単離されたポリヌクレオチドの操作が望ましい場合または必要な場合がある。組換えDNA法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当技術分野で周知である。
細菌宿主細胞の場合、本発明の核酸構築物の転写を指令するための適切なプロモーターとしては、大腸菌lacオペロン、Streptomyces coelicolorアガラーゼ遺伝子(dagA)、Bacillus subtilisレバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、Bacillus licheniformisα-アミラーゼ遺伝子(amyL)、Bacillus stearothermophilusマルトース生成アミラーゼ遺伝子(amyM)、Bacillus amyloliquefaciensα-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、Bacillus licheniformisペニシリナーゼ遺伝子(penP)、Bacillus subtilis xylAおよびxylB遺伝子、ならびに原核生物β-ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター(例えば、Villa-Kamaroffら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727-3731[1978]を参照のこと)、ならびにtacプロモーター(例えば、DeBoerら、Proc.Natl Acad.Sci.USA 80:21-25[1983]を参照のこと)が挙げられる。さらなる適切なプロモーターは当業者に公知である。
糸状菌宿主細胞の場合、本発明の核酸構築物の転写を指令するための適切なプロモーターとしては、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus niger中性α-アミラーゼ、Aspergillus niger酸安定性α-アミラーゼ、Aspergillus nigerまたはAspergillus awamoriグルコアミラーゼ(glaA)、Rhizomucor mieheiリパーゼ、Aspergillus oryzaeアルカリ性プロテアーゼ、Aspergillus
oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼ、Aspergillus nidulansアセトアミダーゼおよびFusarium oxysporumトリプシン様プロテ
アーゼの遺伝子から得られるプロモーター(国際公開第96/00787号)、ならびにNA2-tpiプロモーター(Aspergillus niger中性α-アミラーゼの遺伝子由来のプロモーターとAspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド)、ならびにその変異体プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。
oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼ、Aspergillus nidulansアセトアミダーゼおよびFusarium oxysporumトリプシン様プロテ
アーゼの遺伝子から得られるプロモーター(国際公開第96/00787号)、ならびにNA2-tpiプロモーター(Aspergillus niger中性α-アミラーゼの遺伝子由来のプロモーターとAspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド)、ならびにその変異体プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。
酵母宿主では、有用なプロモーターとしては、限定されないが、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces
cerevisiaeガラクトキナーゼ(GAL1)、Saccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(ADH2/GAP)およびSaccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子由来のプロモーター、ならびに酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーター(例えば、Romanosら、Yeast8:423-488[1992]を参照のこと)が挙げられる。
cerevisiaeガラクトキナーゼ(GAL1)、Saccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(ADH2/GAP)およびSaccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子由来のプロモーター、ならびに酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーター(例えば、Romanosら、Yeast8:423-488[1992]を参照のこと)が挙げられる。
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列(宿主細胞により認識されて転写を終結させる配列)であり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞内で機能的である任意のターミネーターが本発明において使用され得る。
例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Aspergillus niger α-グルコシダーゼおよびFusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるものであり得る。
酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ、Saccharomyces cerevisiaeチトクロムC(CYC1)およびSaccharomyces cerevisiaeグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られるもの、ならびに当技術分野で公知の酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターであり得る(例えば、Romanosら、前掲を参照のこと)。
制御配列はまた、適切なリーダー配列(これは、宿主細胞による翻訳に重要なmRNAの非翻訳領域)であり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞内で機能的である任意のリーダー配列が使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Aspergillus
oryzae TAKAアミラーゼおよびAspergillus nidulansトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、Saccharomyces cerevisiae α-因子およびSaccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(ADH2/GAP)の遺伝子から得られる。
oryzae TAKAアミラーゼおよびAspergillus nidulansトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、Saccharomyces cerevisiae α-因子およびSaccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(ADH2/GAP)の遺伝子から得られる。
制御配列はまた、ポリアデニル化配列(核酸配列の3’末端に作動可能に連結される配列であって、ポリアデノシン残基を転写されたmRNAに付加するシグナルとして転写時に宿主細胞により認識される配列)であり得る。選択される宿主細胞内で機能的である任意のポリアデニル化配列が本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ
、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Fusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼおよびAspergillus niger α-グルコシダーゼの遺伝子由来のもの、ならびに当技術分野で公知の酵母宿主細胞のためのさらなる有用なポリアデニル化配列であり得る(例えば、Guo and Sherman,Mol.Cell.Biol.,l5:5983-5990[1995]を参照のこと)。
、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Fusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼおよびAspergillus niger α-グルコシダーゼの遺伝子由来のもの、ならびに当技術分野で公知の酵母宿主細胞のためのさらなる有用なポリアデニル化配列であり得る(例えば、Guo and Sherman,Mol.Cell.Biol.,l5:5983-5990[1995]を参照のこと)。
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域であり得、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向けさせる。核酸配列のコード配列の5’末端は、翻訳読み枠において、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を固有に含有し得る。あるいは、コード配列の5’末端は、このコード配列にとって外来であるシグナルペプチドコード領域を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含有しない場合、外来シグナルペプチドコード領域が必要とされ得る。
あるいは、ポリペプチドの分泌を増強するために、外来のシグナルペプチドコード領域で天然のシグナルペプチドコード領域を単に置き換え得る。しかしながら、発現したポリペプチドを、選択される宿主細胞の分泌経路に向けさせる任意のシグナルペプチドコード領域が本発明において使用され得る。
細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Bacillus NClB11837マルトース生成アミラーゼ、Bacillus stearothermophilus α-アミラーゼ、Bacillus licheniformisサブチリシン、Bacillus licheniformis β-ラクタマーゼ、Bacillus stearothermophilus中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)およびBacillus subtilis prsAの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域、ならびに当技術分野で公知のさらなるシグナルペプチドである(例えば、Simonenら、Microbiol.Rev.,57:109-137[1993]を参照のこと)。
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus niger中性アミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Humicola insolensセルラーゼおよびHumicola lanuginosaリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Saccharomyces cerevisiae α-因子およびSaccharomyces cerevisiaeインベルターゼの遺伝子由来のもの、ならびにさらなる有用なシグナルペプチドコード領域であり得る(例えば、Romanosら、1992、前掲を参照のこと)。
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド(またはいくつかの場合では、チモーゲン)として公知である。プロポリペプチドは、一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断により、成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、Bacillus subtilisアルカリ性プロテアーゼ(aprE)、Bacillus subtilis中性プロテアーゼ(nprT)、Saccharomyces cerevisiae α-因子、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼおよびMyceliophthora thermophilaラクター
ゼの遺伝子から得られ得る(国際公開第95/33836号)。
ゼの遺伝子から得られ得る(国際公開第95/33836号)。
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域が両方とも、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に配置され、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に配置される。
宿主細胞の成長に関連して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的な刺激に応答して、遺伝子の発現をオンまたはオフするものである。原核生物宿主細胞では、適切な調節配列は、lac、tacおよびtrpオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞では、適切な調節系としては、例として、ADH2システムまたはGAL1システムが挙げられる。糸状菌では、適切な調節配列としては、TAKA α-アミラーゼプロモーター、Aspergillus nigerグルコアミラーゼプロモーターおよびAspergillus oryzaeグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物の系では、これらとしては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合では、本発明のカルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする核酸配列が調節配列に作動可能に連結される。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明はまた、導入される宿主の種類に応じて、操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドと、1つまたはそれを超える発現調節領域、例えばプロモーターおよびターミネーターと、複製起点などとを含む組換え発現ベクターを対象とする。上記様々な核酸および制御配列を一緒に結合させて、1つまたはそれを超える便利な制限部位(これは、このような部位において、ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする)を含み得る組換え発現ベクターを産生し得る。あるいは、本発明の核酸配列は、該核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することにより発現させ得る。発現ベクターの作製では、コード配列は、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるようにベクター中に配置される。
組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に簡便に供され得る任意のベクターであって、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらし得る任意の適切なベクター(例えば、プラスミドまたはウイルス)であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存する。ベクターは、線状または閉環状プラスミドであり得る。
発現ベクターは自律複製ベクター(すなわち、染色体外の実体として存在するベクター)であって、その複製が染色体複製とは独立するベクター(例えば、プラスミド、染色体外因子、ミニ染色体または人工染色体)であり得る。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含有し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されるとゲノムに組み込まれて、それが組み込まれた染色体(複数可)と一緒に複製されるものであり得る。さらに、宿主細胞のゲノム中またはトランスポゾン中に導入される全DNAを一緒に含有する1つのベクターもしくはプラスミドまたは2つもしくはそれを超えるベクターもしくはプラスミドが使用され得る。
本発明の発現ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする1つまたはそれを超える選択マーカーを含有する。選択マーカーは、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性などを与える遺伝子で
あり得る。細菌選択マーカーの例は、Bacillus subtilisもしくはBacillus licheniformis由来のdal遺伝子、または抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1およびURA3である。
あり得る。細菌選択マーカーの例は、Bacillus subtilisもしくはBacillus licheniformis由来のdal遺伝子、または抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1およびURA3である。
糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーとしては、限定されないが、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸還元酵素)、pyrG(オロチジン-5’-リン酸脱炭酸酵素)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)およびtrpC(アントラニル酸シンターゼ)ならびにこれらの等価物が挙げられる。Aspergillus細胞において使用するための実施形態は、Aspergillus nidulansまたはAspergillus oryzaeのamdSおよびpyrG遺伝子、ならびにStreptomyces hygroscopicusのbar遺伝子を含む。
本発明の発現ベクターは、宿主細胞のゲノム中へのベクターの組み込みまたは細胞における、ゲノムとは独立したベクターの自律複製を可能にするエレメント(複数可)を含有し得る。宿主細胞のゲノム中への組み込みでは、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、または相同組換えもしくは非相同組換えによりゲノム中にベクターを組み込むためのベクターの任意の他のエレメントに依拠し得る。
あるいは、発現ベクターは、宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを指令するさらなる核酸配列を含有し得る。さらなる核酸配列は、ベクターが、宿主細胞のゲノム中に、染色体(複数可)の正確な位置(複数可)に組み込まれることを可能にする。正確な位置に組み込まれる可能性を増加させるために、組み込みエレメントは、相同組換えの確率を増強するために対応する標的配列と高度に相同な核酸を、好ましくは、100~10,000塩基対、好ましくは400~10,000塩基対、および最も好ましくは800~10,000塩基対などの十分な数で含有するべきである。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同な任意の配列であり得る。さらに、組み込みエレメントは、非コード核酸配列またはコード核酸配列であり得る。他方、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
自律複製のために、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において自律的に複製することを可能にする複製起点をさらに含み得る。細菌複製起点の非限定的な例は、P15A
oriまたはプラスミドpBR322、pUC19、pACYCl77の複製起点(P15A oriを有するプラスミド)、または大腸菌における複製を可能にするpACYC184およびBacillusにおける複製を可能にするpUB110、pE194もしくはpTA1060である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、2ミクロン複製起点、ARS1、ARS4、ARS1とCEN3の組み合わせおよびARS4とCEN6の組み合わせである。複製起点は、宿主細胞において機能性温度感受性にする変異を有するものであり得る(例えば、Ehrlich,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1433[1978]を参照のこと)。
oriまたはプラスミドpBR322、pUC19、pACYCl77の複製起点(P15A oriを有するプラスミド)、または大腸菌における複製を可能にするpACYC184およびBacillusにおける複製を可能にするpUB110、pE194もしくはpTA1060である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、2ミクロン複製起点、ARS1、ARS4、ARS1とCEN3の組み合わせおよびARS4とCEN6の組み合わせである。複製起点は、宿主細胞において機能性温度感受性にする変異を有するものであり得る(例えば、Ehrlich,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1433[1978]を参照のこと)。
遺伝子産物の産生を増加させるために、1コピーを超える本発明の核酸配列を宿主細胞に挿入し得る。核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも1つのさらなるコピーを宿主細胞のゲノムに組み込むことにより、または増幅可能な選択マーカー遺伝子を核酸配列と共に含めることにより得られ得、この場合、細胞を適切な選択可能な薬剤の存在下で培養することにより、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーおよびそれにより核酸配列のさらなるコピーを含有する細胞が選択され得る。
本発明において使用するための発現ベクターの多くは市販されている。適切な市販の発現ベクターとしては、限定されないが、CMVプロモーターと、哺乳動物宿主細胞における発現のためのhGHポリアデニル化部位と、pBR322複製起点と、大腸菌における増幅のためのアンピシリン耐性マーカーとを含む、p3xFLAG(商標)発現ベクター(Sigma-Aldrich)が挙げられる。他の市販の適切な発現ベクターとしては、限定されないが、pBluescriptII SK(-)およびpBK-CMVベクター(Stratagene)、ならびにpBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pREP4、pCEP4(Invitrogen)またはpPolyに由来するプラスミドが挙げられる(例えば、Latheら、Gene 57:193-201[1987]を参照のこと)。
当業者は、酵素の産生時に、特に、使用される細胞株および酵素の特定のアミノ酸配列に応じて、翻訳後修飾が起こり得ることを認識する。例えば、このような翻訳後修飾は、特定のリーダー配列の切断、様々なグリコシル化およびリン酸化パターンによる様々な糖部分の付加、脱アミド化、酸化、ジスルフィド結合スクランブル、異性化、C末端リジンクリッピングならびにN末端グルタミン環化を含み得る。本発明は、1つまたはそれを超える翻訳後修飾に供されたかまたはそれを受けた操作されたカルボキシエステラーゼ酵素の使用を包含する。したがって、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼは、例えば本明細書に記載される翻訳後修飾を受けたものを含む。
脱アミド化は、アスパラギン(N)をイソアスパラギン酸(イソアスパルテート)およびアスパラギン酸(アスパルテート)(D)におよそ3:1の比で主に変換する酵素反応である。したがって、この脱アミド化反応は、イソアスパルテートへのアスパルテート(D)の異性化に関する。アスパラギンの脱アミド化およびアスパルテートの異性化は両方とも、中間体スクシンイミドが関与する。かなり少ない程度であるが、脱アミド化は、グルタミン残基で同様に起こり得る。
酸化は、産生および保存中に(すなわち、酸化条件の存在下で)起こり得、活性酸素種により直接的に、または酸化ストレスの二次副産物との反応により間接的に誘導されるタンパク質の共有結合的改変をもたらす。酸化は、メチオニン残基で主に発生するが、トリプトファンおよび遊離システイン残基で起こり得る。
ジスルフィド結合スクランブルは、産生中および基本的な保存条件で起こり得る。特定の状況下では、ジスルフィド結合は壊れ得るか、または不正確に形成して不対システイン残基(-SH)をもたらし得る。これらの遊離(不対)スルフヒドリル(-SH)は、シャッフリングを促進し得る。
操作されたカルボキシエステラーゼ中のN末端グルタミン(Q)およびグルタメート(グルタミン酸)(E)は、環化を介してピログルタメート(pGlu)を形成する可能性がある。ほとんどのpGlu形成は製造で発生するが、それは、処理および保存条件のpHおよび温度に応じて、非酵素的に形成され得る。
C末端リジンクリッピングは、カルボキシペプチダーゼにより触媒される酵素反応であり、酵素で一般に観察される。このプロセスの変形は、組換え宿主細胞由来の酵素からのリジンの除去を含む。
本発明では、上記翻訳後修飾および一次アミノ酸配列の変化は、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素の活性の有意な変化をもたらさない。
カルボキシエステラーゼポリペプチドの発現のための宿主細胞
カルボキシエステラーゼポリペプチドの発現のための宿主細胞
別の態様では、本発明は、本発明の改善されたカルボキシエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、宿主細胞においてカルボキシエステラーゼ酵素を発現させるための1つまたはそれを超える制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによりコードされるカルボキシエステラーゼポリペプチドの発現において使用するための宿主細胞は当技術分野で周知であり、限定されないが、細菌細胞、例えば、大腸菌、Geobacillus stearothermophilus、Lactobacillus kefir、Lactobacillus brevis、Lactobacillus minor、Mycobacterium tuberculosis、StreptomycesおよびSalmonella typhimurium細胞;真菌細胞、例えば、酵母細胞(例えば、Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastoris(ATCCアクセッション番号201178));昆虫細胞、例えば、Drosophila S2細胞およびSpodoptera Sf9細胞;動物細胞、例えば、CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、293細胞およびBowes黒色腫細胞;ならびに植物細胞が挙げられる。上記宿主細胞に適切な培養培地および成長条件は、当技術分野で周知である。
カルボキシエステラーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法により細胞に導入され得る。技術としては、とりわけ、電気穿孔、微粒子銃粒子衝撃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するための様々な方法は、当業者には明らかである。
大腸菌W3110は、本発明において使用される宿主株であるが、本発明はこの特定の宿主株に限定されるものではない。改善されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを、lacIリプレッサーの制御下でlacプロモーターに作動可能に連結されたプラスミドpCK110900に作動可能に連結することにより、発現ベクターを作製した。発現ベクターはまた、P15a複製起点と、クロラムフェニコール耐性遺伝子とを含有していた。大腸菌W3110中に対象ポリヌクレオチドを含有する細胞は、細胞をクロラムフェニコール選択に供することにより単離され得る。
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを生成する方法。
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを生成する方法。
いくつかの実施形態では、本発明の改善されたカルボキシエステラーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作製するために、アミド化反応を触媒する天然に存在するカルボキシエステラーゼ酵素は、T.fuscaから得られるものである(またはそれに由来する)。いくつかの実施形態では、親ポリヌクレオチド配列を、特定の宿主細胞におけるカルボキシエステラーゼの発現を増強するようにコドン最適化する。例示として、Genbankデータベース(Genbankアクセッション番号WP_011292850.1)で入手可能なT.fuscaカルボキシエステラーゼ配列の公知のポリペプチド配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドから、T.fuscaの野生型カルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列を構築した。配列番号1として指定される親ポリヌクレオチド配列を、大腸菌における発現のためにコドン最適化し、コドン最適化ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、カルボキシエステラーゼ遺伝子の発現を、lacプロモーターおよびlacIリプレッサー遺伝子の制御下に置いた。大腸菌において活性カルボキシエステラーゼを発現するクローンを同定し、遺伝子を配列決定して、それらの同一性を確認した。配列番号1として指定されるコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、元の野生型カルボキシエステラーゼから進化させた操作したカルボキシエステラーゼのほとんどの実験およびライブラリー構築のための開始点として利用した親配列であった。
他の実施形態では、本発明の改善されたカルボキシエステラーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作製するために、アミド化反応を触媒する天然に存在するカルボキシエステラーゼ酵素は、G.stearothermophilusから得られるものである(またはそれに由来する)。いくつかの実施形態では、親ポリヌクレオチド配列を、特定の宿主細胞におけるカルボキシエステラーゼの発現を増強するようにコドン最適化する。例示として、Genbankデータベース(Genbankアクセッション番号WP_033015113)で入手可能なG.stearothermophilusカルボキシエステラーゼ配列の公知のポリペプチド配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドから、G.stearothermophilusの野生型カルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列を構築した。配列番号137として指定される親ポリヌクレオチド配列を、大腸菌における発現のためにコドン最適化し、コドン最適化ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、カルボキシエステラーゼ遺伝子の発現を、lacプロモーターおよびlacIリプレッサー遺伝子の制御下に置いた。大腸菌において活性カルボキシエステラーゼを発現するクローンを同定し、遺伝子を配列決定して、それらの同一性を確認した。配列番号137として指定されるポリヌクレオチド配列は、元の野生型カルボキシエステラーゼから進化させた操作したカルボキシエステラーゼのほとんどの実験およびライブラリー構築のための開始点として利用した親配列であった。
いくつかの実施形態では、本発明の改善されたカルボキシエステラーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作製するために、アミド化反応を触媒する天然に存在するカルボキシエステラーゼ酵素は、M.tuberculosisから得られるものであったかまたはそれに由来していた。いくつかの実施形態では、親ポリヌクレオチド配列を、特定の宿主細胞におけるカルボキシエステラーゼの発現を増強するようにコドン最適化した。例示として、Genbankデータベース(Genbankアクセッション番号WP_003407276)で入手可能なM.tuberculosisカルボキシエステラーゼ配列の公知のポリペプチド配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドから、M.tuberculosisの野生型カルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列を構築した。配列番号139として指定される親ポリヌクレオチド配列を、大腸菌における発現のためにコドン最適化し、コドン最適化ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、カルボキシエステラーゼ遺伝子の発現を、lacプロモーターおよびlacIリプレッサー遺伝子の制御下に置いた。大腸菌において活性カルボキシエステラーゼを発現するクローンを同定し、遺伝子を配列決定して、それらの同一性を確認した。配列番号139として指定されるコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載されるように、元の野生型カルボキシエステラーゼから進化させた操作したカルボキシエステラーゼのほとんどの実験およびライブラリー構築のための開始点として利用した親配列であった。
いくつかの実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、上記のように、天然に存在するカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチドまたは天然に存在するカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化バージョンを変異誘発および/または定向進化法に供することにより得られる。変異誘発は、ランダム変異誘発および部位特異的変異誘発を含む当技術分野で公知の技術のいずれかにしたがって実施され得る。定向進化は、シャッフリングを含む、改善されたプロモーター変異体についてスクリーニングするための当技術分野で公知の技術のいずれかを用いて実施され得る。変異誘発および定向進化法は当技術分野で周知である(例えば、米国特許第5,605,793号、米国特許第5,811,238号、米国特許第5,830,721号、米国特許第5,834,252号、米国特許第5,837,458号、米国特許第5,928,905号、米国特許第6,096,548号、米国特許第6,117,679号、米国特
許第6,132,970号、米国特許第6,165,793号、米国特許第6,180,406号、米国特許第6,251,674号、米国特許第6,265,201号、米国特許第6,277,638号、米国特許第6,287,861号、米国特許第6,287,862号、米国特許第6,291,242号、米国特許第6,297,053号、米国特許第6,303,344号、米国特許第6,309,883号、米国特許第6,319,713号、米国特許第6,319,714号、米国特許第6,323,030号、米国特許第6,326,204号、米国特許第6,335,160号、米国特許第6,335,198号、米国特許第6,344,356号、米国特許第6,352,859号、米国特許第6,355,484号、米国特許第6,358,740号、米国特許第6,358,742号、米国特許第6,365,377号、米国特許第6,365,408号、米国特許第6,368,861号、米国特許第6,372,497号、米国特許第6,337,186号、米国特許第6,376,246号、米国特許第6,379,964号、米国特許第6,387,702号、米国特許第6,391,552号、米国特許第6,391,640号、米国特許第6,395,547号、米国特許第6,406,855号、米国特許第6,406,910号、米国特許第6,413,745号、米国特許第6,413,774号、米国特許第6,420,175号、米国特許第6,423,542号、米国特許第6,426,224号、米国特許第6,436,675号、米国特許第6,444,468号、米国特許第6,455,253号、米国特許第6,479,652号、米国特許第6,482,647号、米国特許第6,483,011号、米国特許第6,484,105号、米国特許第6,489,146号、米国特許第6,500,617号、米国特許第6,500,639号、米国特許第6,506,602号、米国特許第6,506,603号、米国特許第6,518,065号、米国特許第6,519,065号、米国特許第6,521,453号、米国特許第6,528,311号、米国特許第6,537,746号、米国特許第6,573,098号、米国特許第6,576,467号、米国特許第6,579,678号、米国特許第6,586,182号、米国特許第6,602,986号、米国特許第6,605,430号、米国特許第6,613,514号、米国特許第6,653,072号、米国特許第6,686,515号、米国特許第6,703,240号、米国特許第6,716,631号、米国特許第6,825,001号、米国特許第6,902,922号、米国特許第6,917,882号、米国特許第6,946,296号、米国特許第6,961,664号、米国特許第6,995,017号、米国特許第7,024,312号、米国特許第7,058,515号、米国特許第7,105,297号、米国特許第7,148,054号、米国特許第7,220,566号、米国特許第7,288,375号、米国特許第7,384,387号、米国特許第7,421,347号、米国特許第7,430,477号、米国特許第7,462,469号、米国特許第7,534,564号、米国特許第7,620,500号、米国特許第7,620,502号、米国特許第7,629,170号、米国特許第7,702,464号、米国特許第7,747,391号、米国特許第7,747,393号、米国特許第7,751,986号、米国特許第7,776,598号、米国特許第7,783,428号、米国特許第7,795,030号、米国特許第7,853,410号、米国特許第7,868,138号、米国特許第7,783,428号、米国特許第7,873,477号、米国特許第7,873,499号、米国特許第7,904,249号、米国特許第7,957,912号、米国特許第7,981,614号、米国特許第8,014,961号、米国特許第8,029,988号、米国特許第8,048,674号、米国特許第8,058,001号、米国特許第8,076,138号、米国特許第8,108,150号、米国特許第8,170,806号、米国特許第8,224,580号、米国特許第8,377,681号、米国特許第8,383,346号、米国特許第8,457,903号、米国特許第8,504,498号、米国特許第8,589,085号、米国特許第8,762,066号、米国特許第8,768,871号、米国特許第9,593,326号、米国特許第9,665,694号、米国特許第9,684,771号およびすべての関連非米国対応特許;Lingら、Anal.Biochem.,254(2):157-78[1
997];Daleら、Meth.Mol.Biol.,57:369-74[1996];Smith,Ann.Rev.Genet.,19:423-462[1985];Botsteinら、Science,229:1193-1201[1985];Carter,Biochem.J.,237:1-7[1986];Kramerら、Cell,38:879-887[1984];Wellsら、Gene,34:315-323[1985];Minshullら、Curr. Op.Chem.Biol.,3:284-290[1999];Christiansら、Nat.Biotechnol.,17:259-264[1999];Crameriら、Nature,391:288-291[1998];Crameriら、Nat.Biotechnol.,15:436-438[1997];Zhangら、Proc. Nat.Acad.Sci.U.S.A.,94:4504-4509[1997];Crameriら、Nat.Biotechnol.,14:315-319[1996];Stemmer,Nature,370:389-391[1994];Stemmer,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:10747-10751[1994];国際公開第95/22625号;国際公開第97/0078号;国際公開第97/35966号;国際公開第98/27230号;国際公開第00/42651号;国際公開第01/75767号;および国際公開第2009/152336号を参照のこと)。様々な方法が当技術分野で使用されるので、本発明は特定の方法に限定されることを意図していない。
許第6,132,970号、米国特許第6,165,793号、米国特許第6,180,406号、米国特許第6,251,674号、米国特許第6,265,201号、米国特許第6,277,638号、米国特許第6,287,861号、米国特許第6,287,862号、米国特許第6,291,242号、米国特許第6,297,053号、米国特許第6,303,344号、米国特許第6,309,883号、米国特許第6,319,713号、米国特許第6,319,714号、米国特許第6,323,030号、米国特許第6,326,204号、米国特許第6,335,160号、米国特許第6,335,198号、米国特許第6,344,356号、米国特許第6,352,859号、米国特許第6,355,484号、米国特許第6,358,740号、米国特許第6,358,742号、米国特許第6,365,377号、米国特許第6,365,408号、米国特許第6,368,861号、米国特許第6,372,497号、米国特許第6,337,186号、米国特許第6,376,246号、米国特許第6,379,964号、米国特許第6,387,702号、米国特許第6,391,552号、米国特許第6,391,640号、米国特許第6,395,547号、米国特許第6,406,855号、米国特許第6,406,910号、米国特許第6,413,745号、米国特許第6,413,774号、米国特許第6,420,175号、米国特許第6,423,542号、米国特許第6,426,224号、米国特許第6,436,675号、米国特許第6,444,468号、米国特許第6,455,253号、米国特許第6,479,652号、米国特許第6,482,647号、米国特許第6,483,011号、米国特許第6,484,105号、米国特許第6,489,146号、米国特許第6,500,617号、米国特許第6,500,639号、米国特許第6,506,602号、米国特許第6,506,603号、米国特許第6,518,065号、米国特許第6,519,065号、米国特許第6,521,453号、米国特許第6,528,311号、米国特許第6,537,746号、米国特許第6,573,098号、米国特許第6,576,467号、米国特許第6,579,678号、米国特許第6,586,182号、米国特許第6,602,986号、米国特許第6,605,430号、米国特許第6,613,514号、米国特許第6,653,072号、米国特許第6,686,515号、米国特許第6,703,240号、米国特許第6,716,631号、米国特許第6,825,001号、米国特許第6,902,922号、米国特許第6,917,882号、米国特許第6,946,296号、米国特許第6,961,664号、米国特許第6,995,017号、米国特許第7,024,312号、米国特許第7,058,515号、米国特許第7,105,297号、米国特許第7,148,054号、米国特許第7,220,566号、米国特許第7,288,375号、米国特許第7,384,387号、米国特許第7,421,347号、米国特許第7,430,477号、米国特許第7,462,469号、米国特許第7,534,564号、米国特許第7,620,500号、米国特許第7,620,502号、米国特許第7,629,170号、米国特許第7,702,464号、米国特許第7,747,391号、米国特許第7,747,393号、米国特許第7,751,986号、米国特許第7,776,598号、米国特許第7,783,428号、米国特許第7,795,030号、米国特許第7,853,410号、米国特許第7,868,138号、米国特許第7,783,428号、米国特許第7,873,477号、米国特許第7,873,499号、米国特許第7,904,249号、米国特許第7,957,912号、米国特許第7,981,614号、米国特許第8,014,961号、米国特許第8,029,988号、米国特許第8,048,674号、米国特許第8,058,001号、米国特許第8,076,138号、米国特許第8,108,150号、米国特許第8,170,806号、米国特許第8,224,580号、米国特許第8,377,681号、米国特許第8,383,346号、米国特許第8,457,903号、米国特許第8,504,498号、米国特許第8,589,085号、米国特許第8,762,066号、米国特許第8,768,871号、米国特許第9,593,326号、米国特許第9,665,694号、米国特許第9,684,771号およびすべての関連非米国対応特許;Lingら、Anal.Biochem.,254(2):157-78[1
997];Daleら、Meth.Mol.Biol.,57:369-74[1996];Smith,Ann.Rev.Genet.,19:423-462[1985];Botsteinら、Science,229:1193-1201[1985];Carter,Biochem.J.,237:1-7[1986];Kramerら、Cell,38:879-887[1984];Wellsら、Gene,34:315-323[1985];Minshullら、Curr. Op.Chem.Biol.,3:284-290[1999];Christiansら、Nat.Biotechnol.,17:259-264[1999];Crameriら、Nature,391:288-291[1998];Crameriら、Nat.Biotechnol.,15:436-438[1997];Zhangら、Proc. Nat.Acad.Sci.U.S.A.,94:4504-4509[1997];Crameriら、Nat.Biotechnol.,14:315-319[1996];Stemmer,Nature,370:389-391[1994];Stemmer,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:10747-10751[1994];国際公開第95/22625号;国際公開第97/0078号;国際公開第97/35966号;国際公開第98/27230号;国際公開第00/42651号;国際公開第01/75767号;および国際公開第2009/152336号を参照のこと)。様々な方法が当技術分野で使用されるので、本発明は特定の方法に限定されることを意図していない。
所望の改善された酵素特性が熱安定性であるいくつかの実施形態では、酵素調製物を規定温度に供し、熱処理後に残存する酵素活性の量を測定した後に、酵素活性を測定し得る。次いで、カルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを単離し、配列決定してヌクレオチド配列の変化を同定し(存在する場合)、これを使用して酵素を宿主細胞で発現させる。
操作されたポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法にしたがって、標準的な固相法により調製され得る。いくつかの実施形態では、最大約100塩基の断片を個々に合成し、次いで、(例えば、酵素的ライゲーション法もしくは化学的ライゲーション法またはポリメラーゼ媒介法により)結合して、任意の所望の連続配列を形成し得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、(典型的には、自動合成方法で実施されるので、例えば、Beaucageら、Tet.Lett.,22:1859-69[1981]に記載されている古典的なホスホラミダイト法、またはMatthesら、EMBO J.,3:801-05[1984]に記載されている方法を使用した)化学合成により調製され得る。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを、合成し(例えば、自動DNAシンセサイザーで)、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクターにクローニングする。加えて、基本的に任意の核酸が、様々な商業的供給源のいずれかから入手され得る(例えば、The Midland Certified Reagent Company,Midland,TX、The Great American Gene Company,Ramona,CA、ExpressGen Inc.Chicago,IL、Operon Technologies Inc.,Alameda,CA、など)。
宿主細胞において発現された操作されたカルボキシエステラーゼ酵素は、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のための周知の技術のいずれか1つまたはそれよりも多くを使用して細胞およびまたは培養培地から回収され得る。大腸菌などの細菌からのタンパク質の溶解および高効率での抽出のための適切な溶液は、商品名CelLytic B(Sigma-Aldrich)で市販されている。
カルボキシエステラーゼポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技術として
は、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因に部分的に依存し、当業者には明らかである。
は、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因に部分的に依存し、当業者には明らかである。
いくつかの実施形態では、改善されたカルボキシエステラーゼ酵素を単離するために、親和性技術が使用される。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、カルボキシエステラーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用され得る。抗体の産生のために、カルボキシエステラーゼの注射により、限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む様々な宿主動物を免疫し得る。側鎖官能基により、または側鎖官能基に結合したリンカーにより、カルボキシエステラーゼポリペプチドをBSAなどの適切な担体に結合させ得る。免疫学的応答を増加させるために、宿主種に応じて、限定されないが、フロイント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニック(登録商標)ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG(Bacillus Calmette Guerin)およびCorynebacterium
parvumなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含む様々なアジュバントを使用し得る。
parvumなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含む様々なアジュバントを使用し得る。
カルボキシエステラーゼを調製し、酵素を発現する細胞の形態で、粗製抽出物として、または単離もしくは精製された調製物として使用し得る。カルボキシエステラーゼを凍結乾燥物として、粉末(例えば、アセトン粉末)の形態で、または酵素溶液として調製し得る。いくつかの実施形態では、カルボキシエステラーゼは、実質的に純粋な調製物の形態であり得る。
いくつかの実施形態では、カルボキシエステラーゼポリペプチドを固体基材に結合させ得る。基材は、固相、表面および/または膜であり得る。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトなどの有機ポリマーから構成される。固体支持体はまた、無機物、例えばガラス、シリカ、制御細孔ガラス(CPG)、逆相シリカまたは金属、例えば金または白金であり得る。基材の形状は、ビーズ、スフィア、粒子、顆粒、ゲル、膜または面の形態であり得る。面は、平面、実質的な平面または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤特性または非膨潤特性を有し得る。固体支持体は、ウェル、凹部または他の入れ物、容器、フィーチャまたはロケーションの形態で形成され得る。試薬のロボット送達が処理可能な様々な場所において、または検出方法および/もしくは機器により処理可能な様々な場所において、複数の支持体がアレイ上に配置され得る。
操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を使用する方法およびそれを用いて調製された化合物
操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を使用する方法およびそれを用いて調製された化合物
操作されたカルボキシエステラーゼ酵素および/もしくは必要に応じた補因子再生酵素をコードする遺伝子(複数可)で形質転換された全細胞またはそれらの細胞抽出物および/もしくは溶解物は、固体(例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など)または半固体(例えば、粗ペースト)を含む様々な形態で用いられ得る。
細胞抽出物または細胞溶解物は、沈殿(硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など)、続いて凍結乾燥前の脱塩手順(例えば、限外濾過、透析など)により部分的に精製され得る。細胞調製物はいずれも、例えばグルタルアルデヒドなどの公知の架橋剤を使用した架橋、または固相(例えば、Eupergit Cなど)への固定により安定化され得る。
固体反応物(例えば、酵素、塩など)は、粉末(例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など)、溶液、エマルジョン、懸濁液などを含む様々な異なる形態で反応に提供され得る。反応物は、当業者に公知の方法および装置を使用して、容易に凍結乾燥または噴霧乾燥され得る。例えば、タンパク質溶液を少量-80℃で凍結し、次いで、予冷凍結乾燥チャンバーに添加し、続いて真空を適用し得る。サンプルからの水の除去後、典型的には、温度を2時間で4℃に上昇させてから、真空を解除し、凍結乾燥サンプルを回収する。
アミド化反応において使用される反応物の量は、一般に、所望の生成物の量および同時に用いられるカルボキシエステラーゼ基質の量に応じて変動する。以下のガイドラインは、カルボキシエステラーゼおよび/またはアミンの量を決定するために使用され得る。一般に、エステルおよびアミン基質は、約50mg~約5gのカルボキシエステラーゼを使用して、約5~200グラム/リットルの濃度で用いられ得る。
当業者は、これらの量を変動させて、それらを所望の生産性レベルおよび生産規模に適合させる方法を容易に理解する。
反応物の添加順序は重要ではない。反応物は、溶媒(例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など)に同時に一緒に添加され得るか、またはあるいは反応物のいくつかは別々に添加され得、いくつかは異なる時点で一緒に添加され得る。例えば、カルボキシエステラーゼおよびカルボキシエステラーゼ基質は、最初に溶媒に添加され得る。
水性共溶媒系を使用する場合の混合効率の改善のために、最初に、カルボキシエステラーゼおよびアミンを水相に添加し、混合し得る。次いで、有機相を添加および混合し、続いて、カルボキシエステラーゼ基質を添加し得る。あるいは、水相への添加前に、有機相中でカルボキシエステラーゼ基質を予混合し得る。
本明細書に記載されるカルボキシエステラーゼ触媒アミド化反応を行うための適切な条件としては、限定されないが、実験的pHおよび温度で、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素および基質を接触させること、ならびに例えば本明細書で提供される実施例に記載されている方法を使用して生成物を検出することを含む、ルーチンな実験により容易に最適化され得る多種多様な条件が挙げられる。
カルボキシエステラーゼ触媒アミド化は、典型的には、約15℃~約75℃の範囲の温度で行われる。いくつかの実施形態では、反応は、約20℃~約55℃の範囲の温度で行われる。さらに他の実施形態では、それは、約20℃~約45℃の範囲の温度で行われる。反応はまた、周囲条件下で行われ得る。
アミド化反応は、一般に、基質のカップリングが本質的に完了するかまたはほぼ完了するまで、進行させることが可能である。アミド形成(生成物)は、基質および/または生成物を検出することにより、公知の方法を使用してモニタリングされ得る。適切な方法としては、限定されないが、ガスクロマトグラフィー、HPLCなどが挙げられる。反応混合物中で生成されたアミド生成物の変換収率は、一般に、約50%超であり、約60%超でもあり得、約70%超でもあり得、約80%超でもあり得、90%超でもあり得、多くの場合には約97%超である。
以下の代表的な実施例において、本発明の様々な特徴および実施形態を例証するが、これらは例示的なものであり、限定的なものではない。
以下の実験的開示では、以下の略語が適用される:ppm(百万分率);M(モル濃度);mM(ミリモル濃度)、uMおよびμM(マイクロモル濃度);nM(ナノモル濃度);mol(モル);gmおよびg(グラム);mg(ミリグラム);ugおよびμg(マイクログラム);Lおよびl(リットル);mlおよびmL(ミリリットル);cm(センチメートル);mm(ミリメートル);umおよびμm(マイクロメートル);sec.(秒);min(分);hおよびhr(時間);U(単位);MW(分子量);rpm(1分当たりの回転数);℃(摂氏度);RT(室温);MWD(複数波長検出器);CDS(コード配列);DNA(デオキシリボ核酸);RNA(リボ核酸);RP-HPLC(逆相高速液体クロマトグラフィー);FIOPC(陽性対照に対する改善倍率);HTP(ハイスループット);LB(ルリアブロス);TFA(トリフルオロ酢酸);MeCN(アセトニトリル);TEoA(トリエタノールアミン);THF(テトラヒドロフラン);Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO);Millipore(Millipore,Corp.,Billerica MA);Difco(Difco Laboratories,BD Diagnostic Systems,Detroit,MI);Daicel(Daicel,West Chester,PA);Genetix(Genetix USA,Inc.,Beaverton,OR);Molecular Devices(Molecular Devices,LLC,Sunnyvale,CA);Applied Biosystems(Applied Biosystems,part of Life Technologies,Corp.,Grand Island,NY),Agilent(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA);Thermo Scientific(part of Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA);Corning(Corning,Inc.,Palo Alto,CA);およびBio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA);Phenomenex(Phenomenex,Inc.,Torrence,CA);Epicentre(Epicentre,Madison,WI)。
実施例1
野生型カルボキシエステラーゼ遺伝子の取得および発現ベクターの構築
実施例1
野生型カルボキシエステラーゼ遺伝子の取得および発現ベクターの構築
この実施例では、以下の実施例における操作されたカルボキシエステラーゼをコードする遺伝子が由来する野生型カルボキシエステラーゼ(配列番号2、138および140)をコードするコドン最適化組換えポリヌクレオチドの取得、ならびにこのような操作に適切な発現ベクターおよび宿主細胞が記載されている。
それぞれT.fusca、G.stearothermophilusおよびM.tuberculosisの野生型カルボキシエステラーゼ(配列番号2、138および140)をコードする野生型遺伝子(配列番号1、137および139)のコドン最適化バージョンを、大腸菌における発現のために合成した。コドン最適化遺伝子を、lacプロモーターの制御下で発現ベクターpCK110900にクローニングした(例えば、米国特許第9,714,437号および米国特許出願公開第2006/0195947号(これらは両方とも、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。発現ベクターはまた、P15a複製起点と、クロラムフェニコール耐性遺伝子とを含有していた。これらの配列検証ベクターを、発現のために大腸菌W3110株に形質転換した。本発明の操作されたカルボキシエステラーゼ(配列番号2~136の偶数番号)をコードするポリヌクレオチド(配列番号1~135の奇数番号)も同様に、大腸菌W3110株の誘導体における発現のためにベクターpCK110900にクローニングした。当業者に一般に公知の定向進化技術を使用して、操作されたカルボキシエステラーゼのライブラリーを生成した。
実施例2
野生型カルボキシエステラーゼポリペプチドのHTP産生および分析
実施例2
野生型カルボキシエステラーゼポリペプチドのHTP産生および分析
(実施例1に記載されている)コドン最適化カルボキシエステラーゼ遺伝子を用いることによりHTP溶解物を調製し、次いで、これを大腸菌W3110に形質転換し、1%グルコースおよび30μg/mLクロラムフェニコール(CAM)を含有するルリアベルターニブロス(LB)寒天培地)上にプレーティングした。30℃で少なくとも16時間インキュベートした後、Q-botoboticコロニーピッカー(Genetix)を使用して、200μLのLB、1%グルコースおよび30μg/mL CAMを含有する96ウェルシャローウェルマイクロタイタープレートにコロニーを採取した。細胞を、200rpmで振盪しながら30℃で18~20時間成長させた。次いで、20μLのこれらの培養物を、次いで、ディープウェルプレート中の360μLのテリフィックブロス(TB)および30μg/mL CAMに移した。250rpmで振盪しながら30℃で2.5時間インキュベートした後(OD600 0.6~0.8)、イソプロピルチオグリコシド(IPTG)を1mMの最終濃度まで添加することにより、組換え遺伝子発現を誘導した。次いで、プレートを、250rpmで振盪しながら30℃で18~21時間インキュベートした。
細胞培養物を3500×gで20分間ペレット化し、培地を廃棄した。室温で2時間振盪することにより、細胞ペレットを、1g/Lリゾチーム、0.5g/L硫酸ポリミキシンBおよび0.5μLのOmniCleave(商標)エンドヌクレアーゼ(Epicentre)を含む200μLの0.2M TEoA、pH7.5に溶解させた。サンプルを3500×gで20分間遠心分離して細胞残屑を清澄化し、上清を使用して、実施例3および4に記載されている形質転換を行った。
実施例3
基質セット#1に対する野生型カルボキシエステラーゼの活性
実施例3
基質セット#1に対する野生型カルボキシエステラーゼの活性
実施例2に記載されているように、野生型カルボキシエステラーゼポリペプチドを生成した。基質セット#1(表3.1)に対するアミド化活性を分析するために、20μLの上清を、10μLのアニリン、10μLの酢酸エチル、100μLの0.1Mリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0の混合物に添加した。反応物を20℃でインキュベートし、300rpmで18時間振盪した。MeCNで2倍希釈することにより、サンプルをクエンチした。実施例12.1に記載されているRP-HPLCにより、反応物の分析を実施した。
実施例4
基質セット#2~7に対する野生型カルボキシエステラーゼの活性
基質セット#2~7に対する野生型カルボキシエステラーゼの活性
実施例2に記載されている方法にしたがって、野生型カルボキシエステラーゼポリペプチドを生成した。基質セット#2(表3.1を参照のこと)に対するアミド化活性を分析するために、100μLの上清を、10μLのフェニル酢酸メチル、10μLのn-ブチルアミン、10μLのジメチルスルホキシド(DMSO)および20μLの0.1Mリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0の混合物に添加した。反応物を室温でインキュベートし、300rpmで18時間振盪した。等容量のMeCNで希釈することにより、サンプルをクエンチした。実施例12.1に記載されている方法を使用してRP-HPLCにより、基質および生成物の分析を実施した。
基質セット#3~7(表3.1を参照のこと)に対するアミド化活性を分析するために、50%イソプロパノールを含むまたは含まない0.1Mリン酸カリウムバッファー、pH7.5中の75~100g/Lアミンおよび15g/L安息香酸エチルの120μLの混合物を、実施例2に記載されているように作製した100μLの上清に添加した。反応
物を55℃でインキュベートし、400rpmで18時間振盪した。MeCNで3倍希釈することにより、サンプルをクエンチし、次いで、4000×gで5~8分間遠心分離した。実施例12.2に記載されている方法を使用してRP-HPLCにより、得られた上清を分析した。基質セット#3を使用した1つの実験では、0.1Mリン酸カリウムバッファー、pH7.5中の5g/Lイソブチルアミンおよび15g/L安息香酸エチルの120μLの混合物を、実施例2に記載されているように作製した100μLの上清に添加した。これら基質セットのすべての結果は表4.1に提供されており、基質セットは「反応」番号(すなわち、「R1」、「R2」、「R3」など)により示されている。
実施例5
野生型カルボキシエステラーゼ振盪フラスコ粉末の作製
物を55℃でインキュベートし、400rpmで18時間振盪した。MeCNで3倍希釈することにより、サンプルをクエンチし、次いで、4000×gで5~8分間遠心分離した。実施例12.2に記載されている方法を使用してRP-HPLCにより、得られた上清を分析した。基質セット#3を使用した1つの実験では、0.1Mリン酸カリウムバッファー、pH7.5中の5g/Lイソブチルアミンおよび15g/L安息香酸エチルの120μLの混合物を、実施例2に記載されているように作製した100μLの上清に添加した。これら基質セットのすべての結果は表4.1に提供されており、基質セットは「反応」番号(すなわち、「R1」、「R2」、「R3」など)により示されている。
野生型カルボキシエステラーゼ振盪フラスコ粉末の作製
さらなる特性評価のために、振盪フラスコにおいて、野生型カルボキシエステラーゼ(配列番号:2、138および140)を産生した。WTカルボキシエステラーゼをコードするプラスミドを含有する大腸菌形質転換体を、1%グルコースおよび30μg/mLクロラムフェニコール(CAM)を含有するルリアベルターニブロス(LB)寒天培地上で成長させた。30℃で少なくとも16時間インキュベートした後、単一コロニーを6mLのLB、1%グルコースおよび30μg/mL CAMに採取した。細胞を、250rpmで振盪しながら30℃で18~20時間成長させた。次いで、この培養物を、0.2の最終OD600および250mLの最終容量でテリフィックブロス(TB)および30μg/mL CAMに移した。フラスコを、250rpmで振盪しながら25℃または30℃で2.5時間インキュベートした後(OD6000.6~0.8)、1mMの最終濃度までのイソプロピルチオグリコシド(IPTG)により、組換え遺伝子の発現を誘導した。次いで、フラスコを、250rpmで振盪しながら30℃で18~21時間インキュベートした。細胞を3500×gで20分間ペレット化し、上清を廃棄した。細胞ペレットを30mLの氷冷50mMリン酸ナトリウムpH7.5で3回洗浄し、12mLの同じバッファーに再懸濁し、18~20kpsiで細胞破砕機を使用して溶解させた。溶解物を10000×gで30分間清澄化し、清澄化上清を灰白色の粉末に凍結乾燥させた。
実施例6
野生型カルボキシエステラーゼポリペプチドの溶媒耐性評価
野生型カルボキシエステラーゼポリペプチドの溶媒耐性評価
この実施例では、野生型カルボキシエステラーゼの溶媒耐性を決定するために行った実験が記載されている。これらの実験では、基質セット#3および#5に対する活性を試験することにより、実施例5において調製した凍結乾燥振盪フラスコ粉末の有機溶媒耐性を決定した。0.1Mリン酸カリウムバッファー、pH7.5中に10g/L酵素粉末、30~34g/Lアミン、43g/Lエステルおよび10%DMSOまたは50%イソプロパノールまたは15~25%MeCNまたは25%THFを含む96ウェルプレート(反応容量220μL)中で、反応を行った。反応物を、400rpmで18~21時間振盪しながら50℃に加熱した。MeCNで3倍希釈することにより、反応をクエンチした。実施例12.2に記載されている方法を使用してRP-HPLCにより、反応サンプルを分析した。
実施例7
操作されたT.fuscaカルボキシエステラーゼポリペプチドライブラリーの生成および分析
操作されたT.fuscaカルボキシエステラーゼポリペプチドライブラリーの生成および分析
進化させたT.fuscaカルボキシエステラーゼ遺伝子を含有するプラスミドライブラリーを、実施例1に記載されている方法にしたがって大腸菌に形質転換し、実施例2に記載されている方法にしたがって作製した。細胞溶解物を使用して、実施例8および9に記載されている活性評価を行った。
実施例8
基質セット#3、8~12に対する操作されたT.fuscaカルボキシエステラーゼポリペプチドのアミド化活性
実施例8
基質セット#3、8~12に対する操作されたT.fuscaカルボキシエステラーゼポリペプチドのアミド化活性
実施例7にしたがって、T.fuscaカルボキシエステラーゼ変異体を生成した。基質セット#3(表3.1を参照のこと)に対するアミド化活性を分析するために、実施例7に記載されているように作製した20μLの上清を、3M安息香酸エチルを含む25μLのMeCN、110μLの0.2M TEoA中0.6Mイソブチルアミン(pHを9.5に調整)および65μLの0.2M TEoA、pH8.5の混合物に添加した。反応物を50℃でインキュベートし、300rpmで18時間振盪した。MeCNで4倍希釈することにより、サンプルをクエンチした。実施例12.2に記載されている方法を使用してRP-HPLCにより、反応物の分析を実施した。
基質セット#3、8~12(表3.1を参照のこと)に対するアミド化活性を評価するために、実施例7に記載されているように作製した20~50μLの上清を、2~3.2Mアミンを含む25μLのMeCN、110μLの0.2M TEoA中0.4~0.6Mエステル懸濁液(pHを8に調整)および35~65μLの0.2M TEoA、pH8.5~9.0の混合物に添加した。反応物を50℃でインキュベートし、300rpmで16~18時間振盪した。MeCNで4倍希釈することにより、サンプルをクエンチした。実施例13.3、13.4および13.5に記載されているようにRP-HPLCにより、反応物の分析を実施した。基質セット#8を使用した1つの実験では、実施例7に記載されているように作製した50μLの上清を、3Mグリシンメチルエステルを含む25μLのMeCN、110μLの0.2M TEoA中0.6Mアニリン(pHを8に調整)および35μLの0.2M TEoA、pH8.5の混合物に添加した。反応物を50℃でインキュベートし、300rpmで18時間振盪した。MeCNで4倍希釈することにより、サンプルをクエンチした。実施例12.3に記載されている方法を使用してRP-HPLCにより、反応物の分析を実施した。これらの変異体のアミノ酸置換は、配列番号2との比較で示されている。
実施例9
操作されたT.fuscaカルボキシエステラーゼポリペプチドの振盪フラスコ粉末の評価
操作されたT.fuscaカルボキシエステラーゼポリペプチドの振盪フラスコ粉末の評価
進化させたT.fuscaカルボキシエステラーゼの粉末を、実施例5に記載されている方法にしたがって、振盪フラスコ規模の量で調製した。基質セット#3に対する活性を試験することにより、凍結乾燥振盪フラスコ粉末のアミド化活性を評価した。最初に、トルエン中に10g/L酵素粉末、0.3Mイソブチルアミン、0.3M安息香酸エチルを含む1.0mLの反応混合物を調製し、続いて、20μLの0.2M TEoAバッファー、pH8.5を添加した。反応物を、500rpmで60時間振盪しながら50℃に加熱した。100μLの反応混合物を1.4mLのアセトンで希釈することにより、反応をクエンチした。表12.2に提供されている方法を使用してRP-HPLCにより、反応サンプルを分析した。
実施例10
コンビナトリアルT.fuscaカルボキシエステラーゼライブラリーの生成および分析
コンビナトリアルT.fuscaカルボキシエステラーゼライブラリーの生成および分析
T.fuscaカルボキシエステラーゼ変異体(配列番号8)のコンビナトリアルシャッフリングにより得られたプラスミドライブラリーを、実施例1に記載されている方法にしたがって大腸菌W3110に形質転換した。実施例2に記載されている方法にしたがって作製したHTP溶解物を使用して、実施例11に記載されている活性評価を行った。
実施例11
選択基質セット3、5、8、12~15に対する操作されたT.fuscaカルボキシエステラーゼポリペプチドの活性
実施例11
選択基質セット3、5、8、12~15に対する操作されたT.fuscaカルボキシエステラーゼポリペプチドの活性
コンビナトリアルライブラリーから生成したT.fuscaカルボキシエステラーゼ変異体を、基質セット#3、5、8および12~15(表3.1を参照のこと)に対するアミド化活性について分析した。基質セット#3(表3.1を参照のこと)に対するアミド化活性を分析するために、実施例7に記載されているように作製した10μLの上清を、3M安息香酸エチルを含む25μLのMeCN、110μLの0.2M TEoA中0.6Mイソブチルアミン(pHを8に調整)および75μLの0.2M TEoA、pH8.5の混合物に添加した。反応物を50℃でインキュベートし、300rpmで18時間振盪した。MeCNで4倍希釈することにより、サンプルをクエンチした。基質セット#5、8および12~15に対するアミド化活性について分析するために、実施例7に記載されているように20~50μLの上清を作製し、2~3.2Mアミンを含む25μLのMeCN、110μLの0.2M TEoA中0.4~0.6Mエステル懸濁液(pHを8に調整)および35~65μLの0.2M TEoA、pH8.5~9の混合物に添加した。反応物を50℃でインキュベートし、300rpmで16~18時間振盪した。MeCNで4倍希釈することにより、サンプルをクエンチした。実施例12.2(セット3)、12.3(セット8)、12.5(セット12および13)、12.6(セット14)および12.7(セット5および15)に記載されている方法を使用してRP-HPLCにより、反応物の分析を実施した。基質セット#8を使用した1つの実験では、実施例7に記載されているように作製した20μLの上清を、3Mグリシンメチルエステルを含む25μLのMeCN、110μLの0.2M TEoA中0.6Mアニリン(pHを9.5に調整)および65μLの0.2M TEoA、pH8.5の混合物に添加した。反応物を50℃でインキュベートし、300rpmで18時間振盪した。MeCNで4倍希釈することにより、サンプルをクエンチした。実施例12.3に記載されている方法を使用してRP-HPLCにより、反応物の分析を実施した。
実施例12
生成されたアミドおよび前駆体基質の分析的検出
生成されたアミドおよび前駆体基質の分析的検出
表12.1~12.7の分析方法を使用して、上記実施例に記載されているデータを収集した。本明細書で提供される方法はすべて、本発明を使用して産生されたT.fuscaカルボキシエステラーゼ変異体からの生成物の分析において使用される。しかしながら、本発明は、本明細書で提供されるおよび/または本明細書で提供される方法を使用して産生された生成物の分析について本明細書に記載される方法に限定されるものではない。実際、任意の適切な方法が本発明において使用される。市販の標準を用いた確認により、またはLC/MS/MS分析により、生成物ピーク溶出を確認した。
様々な特定の実施形態を例証および説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な変更を行い得ることが十分に理解されよう。 本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
配列番号2と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされている、操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
(項目2)
前記ポリペプチド配列中の前記少なくとも1つの置換または置換セットが、39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438および470から選択される位置における置換を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされている、項目1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目3)
配列番号8と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされている、操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
(項目4)
前記ポリペプチド配列中の前記少なくとも1つの置換または置換セットが、63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68
/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373および377から選択される位置における置換を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされている、項目3に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目5)
配列番号138と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90
%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号138を参照して番号付けされている、操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
(項目6)
配列番号140と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号140を参照して番号付けされている、操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
(項目7)
位置282におけるアミノ酸置換を含み、前記位置が配列番号2を参照して番号付けされている、項目1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目8)
位置282における前記アミノ酸が、脂肪族アミノ酸、非極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、極性アミノ酸および芳香族アミノ酸から選択される、項目7に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目9)
X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282TおよびX282Rから選択されるアミノ酸置換を含む、項目7に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目10)
前記ポリペプチド配列が、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134および136から選択される、項目1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目11)
配列番号2の野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼと比較して少なくとも1つの改善された特性を含む、項目1~4および7~10のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目12)
前記改善された特性が、改善されたアミド化活性、溶媒耐性、熱安定性、pH安定性、位置選択性、立体選択性、基質範囲、および/または減少した基質もしくは生成物阻害、ならびに前記操作されたカルボキシエステラーゼを産生する細菌宿主細胞への減少した毒性から選択される、項目11に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目13)
前記細菌宿主細胞が大腸菌を含む、項目12に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目14)
前記溶媒が、アセトン、アセトニトリル、トルエン、テトラヒドロフラン、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシドおよびメチルエチルケトンから選択される、項目12に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目15)
アニリン;イソブチルアミン;n-ブチルアミン;t-ブチルアミン;N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド;4-メチルピペリジン;O-t-ブチルヒドロキシルアミン;ベンジルアミン;2,6-ジメチルアニリン;(S)-(-)-α-メチルベンジルアミン;(R)-(+)-α-メチルベンジルアミン;フェニル酢酸メチル;酢酸エチル;安息香酸エチル;2-ピラジニルエチルエステル;4-エチル-1H-インドールエステル;およびN,N-ジエチルグリシルメチルエステルから選択される少なくとも1つの基質に対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、項目1~14のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目16)
アニリン;イソブチルアミン;n-ブチルアミン;t-ブチルアミン;N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド;4-メチルピペリジン;O-t-ブチルヒドロキシルアミン;ベンジルアミン;2,6-ジメチルアニリン;(S)-(-)-α-メチルベンジルアミン;(R)-(+)-α-メチルベンジルアミン;フェニル酢酸メチル;酢酸エチル;安息香酸エチル;2-ピラジニルエチルエステル;4-エチル-1H-インドールエステル;およびN,N-ジエチルグリシルメチルエステルから選択される少なくとも1つの基質または基質セットに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、項目1~15のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目17)
アセトアニリド;N-n-ブチル-ベンジルアセトアミド;N-[(S)-1-フェニルエチル]-ピラジニルアミド;N-[(S)-1-フェニルエチル]-ベンズアミド;N-[(R)-1-フェニルエチル]-ベンズアミド;N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド;1-ベンゾイル-4-メチルピペリジン;2-ピラジニル-4-メチルピペリジン;N-イソブチル-ベンズアミド;N-t-ブチル-ベンズアミド;N-t-ブチルヒドロキシル-ベンズアミド;N-イソブチル-1H-インドール-4-アミド;N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-フェニルアセトアミド;N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-ベンジルアセトアミド;およびN’,N’-(ジエチルアミノ)-N-2,6-ジメチルフェニルアセトアミドから選択される少なくとも1つの生成物の産生において、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、項目1~16のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目18)
X343V、X372L、X320W/G、X214R、X282C、X271Y、X65Gから選択される少なくとも1つの置換を含み、安息香酸エチル;および2,6-ジメチルアニリンからのN’,N’-(ジエチルアミノ)-N-2,6-ジメチルフェニルアセトアミドの形成のためのヒンダードアミンに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、項目1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目19)
X268A、X63A/R、X189Q/I/E、X214R、X282G/C、X381L、X69Wから選択される少なくとも1つの置換を含み、安息香酸エチルおよび4-メチルピペリジンからの1-ベンゾイル-4-メチル-ピペリジンの形成のための第2級アミンに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、項目1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目20)
精製されている、項目1~19のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目21)
固定されている、項目1~20のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目22)
少なくとも1つの項目1~21のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼを含む、組成物。
(項目23)
少なくとも1つの項目1~19のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼをコードする、ポリヌクレオチド配列。
(項目24)
配列番号2と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが、前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされている、ポリヌクレオチド配列。
(項目25)
前記コードされる少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼが、39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438および470から選択される位置における少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされている、項目24に記載のポリヌクレオチド配列。
(項目26)
配列番号8と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが、前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされている、ポリヌクレオチド配列。
(項目27)
前記コードされる操作されたカルボキシエステラーゼが、63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372
、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、3
72、372/377、372/381、373および377から選択される位置において前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされている、項目26に記載のポリヌクレオチド配列。
(項目28)
少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131,133、135、137および/または139と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を含む、ポリヌクレオチド配列。
(項目29)
制御配列に作動可能に連結されている、項目23~28のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
(項目30)
コドン最適化されている、項目23~29のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
(項目31)
少なくとも1つの項目23~30のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
(項目32)
少なくとも1つの項目31に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
(項目33)
少なくとも1つの項目23~30のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
(項目34)
大腸菌である、項目32および/または33に記載の宿主細胞。
(項目35)
操作されたカルボキシエステラーゼを宿主細胞において産生する方法であって、少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼが産生されるように、適切な条件下で、項目32~34のいずれかに記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
(項目36)
前記培養物および/または宿主細胞から少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼを回収することをさらに含む、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼを精製する工程をさらに含む、項目35および/または36に記載の方法。
(項目1)
配列番号2と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされている、操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
(項目2)
前記ポリペプチド配列中の前記少なくとも1つの置換または置換セットが、39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438および470から選択される位置における置換を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされている、項目1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目3)
配列番号8と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされている、操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
(項目4)
前記ポリペプチド配列中の前記少なくとも1つの置換または置換セットが、63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68
/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373および377から選択される位置における置換を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされている、項目3に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目5)
配列番号138と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90
%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号138を参照して番号付けされている、操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
(項目6)
配列番号140と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号140を参照して番号付けされている、操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
(項目7)
位置282におけるアミノ酸置換を含み、前記位置が配列番号2を参照して番号付けされている、項目1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目8)
位置282における前記アミノ酸が、脂肪族アミノ酸、非極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、極性アミノ酸および芳香族アミノ酸から選択される、項目7に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目9)
X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282TおよびX282Rから選択されるアミノ酸置換を含む、項目7に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目10)
前記ポリペプチド配列が、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134および136から選択される、項目1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目11)
配列番号2の野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼと比較して少なくとも1つの改善された特性を含む、項目1~4および7~10のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目12)
前記改善された特性が、改善されたアミド化活性、溶媒耐性、熱安定性、pH安定性、位置選択性、立体選択性、基質範囲、および/または減少した基質もしくは生成物阻害、ならびに前記操作されたカルボキシエステラーゼを産生する細菌宿主細胞への減少した毒性から選択される、項目11に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目13)
前記細菌宿主細胞が大腸菌を含む、項目12に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目14)
前記溶媒が、アセトン、アセトニトリル、トルエン、テトラヒドロフラン、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシドおよびメチルエチルケトンから選択される、項目12に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目15)
アニリン;イソブチルアミン;n-ブチルアミン;t-ブチルアミン;N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド;4-メチルピペリジン;O-t-ブチルヒドロキシルアミン;ベンジルアミン;2,6-ジメチルアニリン;(S)-(-)-α-メチルベンジルアミン;(R)-(+)-α-メチルベンジルアミン;フェニル酢酸メチル;酢酸エチル;安息香酸エチル;2-ピラジニルエチルエステル;4-エチル-1H-インドールエステル;およびN,N-ジエチルグリシルメチルエステルから選択される少なくとも1つの基質に対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、項目1~14のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目16)
アニリン;イソブチルアミン;n-ブチルアミン;t-ブチルアミン;N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド;4-メチルピペリジン;O-t-ブチルヒドロキシルアミン;ベンジルアミン;2,6-ジメチルアニリン;(S)-(-)-α-メチルベンジルアミン;(R)-(+)-α-メチルベンジルアミン;フェニル酢酸メチル;酢酸エチル;安息香酸エチル;2-ピラジニルエチルエステル;4-エチル-1H-インドールエステル;およびN,N-ジエチルグリシルメチルエステルから選択される少なくとも1つの基質または基質セットに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、項目1~15のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目17)
アセトアニリド;N-n-ブチル-ベンジルアセトアミド;N-[(S)-1-フェニルエチル]-ピラジニルアミド;N-[(S)-1-フェニルエチル]-ベンズアミド;N-[(R)-1-フェニルエチル]-ベンズアミド;N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド;1-ベンゾイル-4-メチルピペリジン;2-ピラジニル-4-メチルピペリジン;N-イソブチル-ベンズアミド;N-t-ブチル-ベンズアミド;N-t-ブチルヒドロキシル-ベンズアミド;N-イソブチル-1H-インドール-4-アミド;N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-フェニルアセトアミド;N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-ベンジルアセトアミド;およびN’,N’-(ジエチルアミノ)-N-2,6-ジメチルフェニルアセトアミドから選択される少なくとも1つの生成物の産生において、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、項目1~16のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目18)
X343V、X372L、X320W/G、X214R、X282C、X271Y、X65Gから選択される少なくとも1つの置換を含み、安息香酸エチル;および2,6-ジメチルアニリンからのN’,N’-(ジエチルアミノ)-N-2,6-ジメチルフェニルアセトアミドの形成のためのヒンダードアミンに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、項目1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目19)
X268A、X63A/R、X189Q/I/E、X214R、X282G/C、X381L、X69Wから選択される少なくとも1つの置換を含み、安息香酸エチルおよび4-メチルピペリジンからの1-ベンゾイル-4-メチル-ピペリジンの形成のための第2級アミンに対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、項目1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目20)
精製されている、項目1~19のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目21)
固定されている、項目1~20のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
(項目22)
少なくとも1つの項目1~21のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼを含む、組成物。
(項目23)
少なくとも1つの項目1~19のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼをコードする、ポリヌクレオチド配列。
(項目24)
配列番号2と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが、前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされている、ポリヌクレオチド配列。
(項目25)
前記コードされる少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼが、39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、282、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438および470から選択される位置における少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされている、項目24に記載のポリヌクレオチド配列。
(項目26)
配列番号8と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが、前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされている、ポリヌクレオチド配列。
(項目27)
前記コードされる操作されたカルボキシエステラーゼが、63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372
、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、3
72、372/377、372/381、373および377から選択される位置において前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされている、項目26に記載のポリヌクレオチド配列。
(項目28)
少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131,133、135、137および/または139と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を含む、ポリヌクレオチド配列。
(項目29)
制御配列に作動可能に連結されている、項目23~28のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
(項目30)
コドン最適化されている、項目23~29のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
(項目31)
少なくとも1つの項目23~30のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
(項目32)
少なくとも1つの項目31に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
(項目33)
少なくとも1つの項目23~30のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
(項目34)
大腸菌である、項目32および/または33に記載の宿主細胞。
(項目35)
操作されたカルボキシエステラーゼを宿主細胞において産生する方法であって、少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼが産生されるように、適切な条件下で、項目32~34のいずれかに記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
(項目36)
前記培養物および/または宿主細胞から少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼを回収することをさらに含む、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼを精製する工程をさらに含む、項目35および/または36に記載の方法。
Claims (25)
- 配列番号2と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼまたは前記その機能的断片が位置282における置換を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされており、
前記操作されたカルボキシエステラーゼまたは前記その機能的断片が、配列番号2の野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼと比較して少なくとも1つの改善された特性を含む、操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。 - 前記操作されたカルボキシエステラーゼまたは前記その機能的断片が、39、39/323、62、62/117、63、64、65、66、68、69、70、71、71/263、77、77/184、103、103/147、104、104/429、105、107、107/185、108、109、109/117、110、111、113、114、115、117、118、118/269、118/349、119、126、147、153、153/215、164、164/271、174、174/282、183、184、184/249、185、186、187、188、190、209、210、211、212、213、213/271、213/345、214、215、215/271、216、217、217/231、224、224/268/372、231、249、249/284、263、268、269、270、270/470、271、271/416、276、277、278、279、279/280/282、280、281、281/374、283、283/429、284、284/438、285、286、311、317、320、320/323、320/323/372、320/372/376、320/376/377、321、323、324、345、349、372、372/376、373、374、376、377、405、416、420、427、428、429、438および470から選択される位置における置換を含む前記ポリペプチド配列中の少なくとも1つの置換または置換セットをさらに含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号2を参照して番号付けされており、前記「/」が「および」を意味する、請求項1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- 位置282における前記置換が、脂肪族アミノ酸、非極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、極性アミノ酸および芳香族アミノ酸から選択されるアミノ酸である、請求項1または2に記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- X282T、X282G、X282A、X282V、X282M、X282C、X282W、X282Q、X282S、X282TおよびX282Rから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項1または2に記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- 前記ポリペプチド配列が、63、63/65/108、63/65/108/189、63/65/108/377、63/65/282/285/320/323、63/65/320/323、63/108、63/108/282/285/377、63/108/285/377、63/108/320/323、63/189、63/212/215、63/212/215/268/269/343、63/215、63/215/269、63/215/270/271、63/215/343、63/268/269/270/429、63/377、65/69/70/281/372、65/69/70/372、65/69/372、65/70/372、65/320、65/320/323、68、68/69/189/214、68/69/189/214/215、68/69/189/214/215/271、68/69/189/214/215/271/281/282/343/381、68/69/189/214/271/280、68/69/189/214/372、68/69/189/214/377/381、68/69/189/271、68/69/189/271/280/372/381、68/69/189/280/281/282/372/377、68/69/189/281/282/372/377/381、68/69/189/343/381、68/69/189/372、68/69/189/381、68/69/214/215/271、68/69/214/343、68/69/215、68/69/271、68/69/282/287、68/69/343/372、68/108/377、68/184、68/184/189、68/189/271/372、68/189/343、68/214/215/271/281/282/372、68/215/271/343/372/381、68/215/377、68/271/372、68/377、69、69/70、69/70/331/372、69/70/372、69/70/459、69/108、69/108/270/372/377、69/108/281/285、69/110/215/281、69/189、69/189/214/271/281/282/343、69/189/214/343/372、69/189/215/343、69/189/271、69/189/271/281/282、69/189/271/343、69/189/271/343/381、69/189/280/282/343/372/381、69/189/281/373、69/189/282、69/189/343/381、69/189/372、69/189/372/377、69/189/377、69/212/213/215/280/281、69/214/215/271/372/377/381、69/214/271/282、69/214/271/343、69/215、69/215/269/270/377、69/215/271/280/281/282、69/215/271/282、69/215/271/372、69/215/285/317、69/215/323、69/215/343、69/215/343/372/381、69/271、69/271/372、69/282、69/282/343/372、69/285/373、69/372、70、70/212、108、108/189、108/189/282/285/320、108/189/320、108/189/377、108/215、108/215/377、108/269/270、108/270、108/282/285/377、108/285、108/320/323、108/377、126、126/184/213/280/281/285/320、126/184/213/372、126/189/285/372、126/215、126/372、181/215、189、189/214、189/214/215/271/282、189/215、189/215/249/277、189/215/271/281/282/377、189/215/343/372、189/270/285、189/270/372、189/280/282、189/320/377、189/343、189/343/377、189/372/377、189/377、189/381、213/215/320、214/215/271、214/215/271/377、214/271、214/280/282/343/377/381、215、215/249/280/281/285/372、215/271/372、215/280/281/285/372、215/281/285/372、215/281/285/373、215/281/373、215/285、215/285/317、215/285/346、215/285/445、215/320、215/320/372、215/323、215/372、215/372/377、215/373、215/377、215/381、249/377、269/270/281/372/377、270/377、271、271/343、271/343/372、271/343/372/381、280/285/372、281/372、282/285/320/323、285/323、320、343/372、372、372/377、372/381、373および377から選択される位置における1つまたはそれより多くの置換を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号8を参照して番号付けされており、前記「/」が「および」を意味する、請求項1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- 前記ポリペプチド配列が、配列番号4、6、8、12、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132および134から選択される、請求項1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- 前記改善された特性が、改善されたアミド化活性である、請求項1~6のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- アニリン;イソブチルアミン;n-ブチルアミン;t-ブチルアミン;N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド;4-メチルピペリジン;O-t-ブチルヒドロキシルアミン;ベンジルアミン;2,6-ジメチルアニリン;(S)-(-)-α-メチルベンジルアミン;(R)-(+)-α-メチルベンジルアミン;フェニル酢酸メチル;酢酸エチル;安息香酸エチル;2-ピラジニルエチルエステル;4-エチル-1H-インドールエステル;およびN,N-ジエチルグリシルメチルエステルから選択される少なくとも1つの基質に対して、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、請求項1~7のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- アセトアニリド;N-n-ブチル-ベンジルアセトアミド;N-[(S)-1-フェニルエチル]-ピラジニルアミド;N-[(S)-1-フェニルエチル]-ベンズアミド;N-[(R)-1-フェニルエチル]-ベンズアミド;N’-t-ブトキシカルボニル-ベンズヒドラジド;1-ベンゾイル-4-メチルピペリジン;2-ピラジニル-4-メチルピペリジン;N-イソブチル-ベンズアミド;N-t-ブチル-ベンズアミド;N-t-ブチルヒドロキシル-ベンズアミド;N-イソブチル-1H-インドール-4-アミド;N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-フェニルアセトアミド;N’,N’-(ジエチルアミノ)-N-ベンジルアセトアミド;およびN’,N’-(ジエチルアミノ)-N-2,6-ジメチルフェニルアセトアミドから選択される少なくとも1つの生成物の産生において、野生型T.fuscaカルボキシエステラーゼよりも大きな活性を示す、請求項1~8のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- X343V、X372L、X320W/G、X214R、X271YおよびX65Gから選択される少なくとも1つの置換をさらに含み、前記「/」が「または」を意味する、請求項1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- X268A、X63A/R、X189Q/I/E、X214R、X381LおよびX69Wから選択される少なくとも1つの置換をさらに含み、前記「/」が「または」を意味する、請求項1に記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- 精製されている、請求項1~11のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- 固定されている、請求項1~12のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片。
- 少なくとも1つの請求項1~13のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片を含む、組成物。
- 少なくとも1つの請求項1~11のいずれかに記載の操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片をコードする、ポリヌクレオチド。
- 配列番号3、5、7、11、25、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131および133と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を含む、請求項15に記載のポリヌクレオチド。
- 制御配列に作動可能に連結されている、請求項15または16に記載のポリヌクレオチド。
- コドン最適化されている、請求項15~17のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つの請求項15~18のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- 少なくとも1つの請求項19に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 少なくとも1つの請求項15~18のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
- 大腸菌である、請求項20または21に記載の宿主細胞。
- 操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片を宿主細胞において産生する方法であって、少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片が産生されるように、培養培地の適切な条件下で、請求項20~22のいずれかに記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
- 前記培養物および/または宿主細胞から少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片を回収することをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能的断片を精製する工程をさらに含む、請求項23または24に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762598189P | 2017-12-13 | 2017-12-13 | |
US62/598,189 | 2017-12-13 | ||
JP2020532049A JP2021506252A (ja) | 2017-12-13 | 2018-12-12 | アミドカップリングのためのカルボキシエステラーゼポリペプチド |
PCT/US2018/065124 WO2019118557A1 (en) | 2017-12-13 | 2018-12-12 | Carboxyesterase polypeptides for amide coupling |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020532049A Division JP2021506252A (ja) | 2017-12-13 | 2018-12-12 | アミドカップリングのためのカルボキシエステラーゼポリペプチド |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023062167A true JP2023062167A (ja) | 2023-05-02 |
Family
ID=66735155
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020532049A Pending JP2021506252A (ja) | 2017-12-13 | 2018-12-12 | アミドカップリングのためのカルボキシエステラーゼポリペプチド |
JP2023026052A Pending JP2023062167A (ja) | 2017-12-13 | 2023-02-22 | アミドカップリングのためのカルボキシエステラーゼポリペプチド |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020532049A Pending JP2021506252A (ja) | 2017-12-13 | 2018-12-12 | アミドカップリングのためのカルボキシエステラーゼポリペプチド |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11015180B2 (ja) |
EP (1) | EP3724325A4 (ja) |
JP (2) | JP2021506252A (ja) |
KR (1) | KR20200098564A (ja) |
CN (1) | CN111699250B (ja) |
AU (1) | AU2018383752A1 (ja) |
CA (1) | CA3081950A1 (ja) |
IL (1) | IL274937A (ja) |
MX (1) | MX2020006222A (ja) |
SG (1) | SG11202004185PA (ja) |
WO (1) | WO2019118557A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20230159904A1 (en) * | 2020-04-10 | 2023-05-25 | Codexis, Inc | Carboxyesterase polypeptides for kinetic resolution |
Family Cites Families (72)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5834252A (en) | 1995-04-18 | 1998-11-10 | Glaxo Group Limited | End-complementary polymerase reaction |
US6117679A (en) | 1994-02-17 | 2000-09-12 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US6335160B1 (en) | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US6406855B1 (en) | 1994-02-17 | 2002-06-18 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US6309883B1 (en) | 1994-02-17 | 2001-10-30 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
US6395547B1 (en) | 1994-02-17 | 2002-05-28 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US20060257890A1 (en) | 1996-05-20 | 2006-11-16 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
US6995017B1 (en) | 1994-02-17 | 2006-02-07 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
US6165793A (en) | 1996-03-25 | 2000-12-26 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US5837458A (en) | 1994-02-17 | 1998-11-17 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
US5928905A (en) | 1995-04-18 | 1999-07-27 | Glaxo Group Limited | End-complementary polymerase reaction |
ATE206460T1 (de) | 1994-06-03 | 2001-10-15 | Novo Nordisk Biotech Inc | Gereinigte myceliophthora laccasen und nukleinsäuren dafür kodierend |
ATE294871T1 (de) | 1994-06-30 | 2005-05-15 | Novozymes Biotech Inc | Nicht-toxisches, nicht-toxigenes, nicht- pathogenes fusarium expressionssystem und darin zu verwendende promotoren und terminatoren |
FI104465B (fi) | 1995-06-14 | 2000-02-15 | Valio Oy | Proteiinihydrolysaatteja allergioiden hoitamiseksi tai estämiseksi, niiden valmistus ja käyttö |
US6506602B1 (en) | 1996-03-25 | 2003-01-14 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US6096548A (en) | 1996-03-25 | 2000-08-01 | Maxygen, Inc. | Method for directing evolution of a virus |
AU6029998A (en) | 1997-01-17 | 1998-08-07 | Regents Of The University Of Minnesota | Dna molecules and protein displaying improved triazine compound degrading ability |
EP1007732B1 (en) | 1997-01-17 | 2006-07-26 | Maxygen, Inc. | EVOLUTION OF procaryotic WHOLE CELLS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION |
US6326204B1 (en) | 1997-01-17 | 2001-12-04 | Maxygen, Inc. | Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination |
US7148054B2 (en) | 1997-01-17 | 2006-12-12 | Maxygen, Inc. | Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination |
DK1036198T3 (da) | 1997-12-08 | 2013-01-02 | California Inst Of Techn | Fremgangsmåde til fremstilling af polynukleotid- og polypeptidsekvenser |
AU3221699A (en) | 1998-04-02 | 1999-10-25 | Tellus Genetic Resources, Inc. | A method for obtaining a plant with a genetic lesion in a gene sequence |
US6500617B1 (en) | 1998-05-01 | 2002-12-31 | Maxygen, Inc. | Optimization of pest resistance genes using DNA shuffling |
US6337186B1 (en) | 1998-06-17 | 2002-01-08 | Maxygen, Inc. | Method for producing polynucleotides with desired properties |
US6365408B1 (en) | 1998-06-19 | 2002-04-02 | Maxygen, Inc. | Methods of evolving a polynucleotides by mutagenesis and recombination |
US6294328B1 (en) * | 1998-06-24 | 2001-09-25 | The Institute For Genomic Research | DNA sequences for strain analysis in Mycobacterium tuberculosis |
EP1104459A1 (en) | 1998-08-12 | 2001-06-06 | Maxygen, Inc. | Dna shuffling of monooxygenase genes for production of industrial chemicals |
US6500639B2 (en) | 1998-10-07 | 2002-12-31 | Maxygen, Inc. | DNA shuffling to produce nucleic acids for mycotoxin detoxification |
EP1129184A1 (en) | 1998-11-10 | 2001-09-05 | Maxygen, Inc. | Modified adp-glucose pyrophosphorylase for improvement and optimation of plant phenotypes |
EP2716753A1 (en) * | 1998-11-27 | 2014-04-09 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme variants |
JP4221100B2 (ja) | 1999-01-13 | 2009-02-12 | エルピーダメモリ株式会社 | 半導体装置 |
US6436675B1 (en) | 1999-09-28 | 2002-08-20 | Maxygen, Inc. | Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling |
US6368861B1 (en) | 1999-01-19 | 2002-04-09 | Maxygen, Inc. | Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination |
US6917882B2 (en) | 1999-01-19 | 2005-07-12 | Maxygen, Inc. | Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics |
US6376246B1 (en) | 1999-02-05 | 2002-04-23 | Maxygen, Inc. | Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination |
US20070065838A1 (en) | 1999-01-19 | 2007-03-22 | Maxygen, Inc. | Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination |
US8457903B1 (en) | 1999-01-19 | 2013-06-04 | Codexis Mayflower Holdings, Llc | Method and/or apparatus for determining codons |
US6961664B2 (en) | 1999-01-19 | 2005-11-01 | Maxygen | Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations |
US7873477B1 (en) | 2001-08-21 | 2011-01-18 | Codexis Mayflower Holdings, Llc | Method and system using systematically varied data libraries |
US7702464B1 (en) | 2001-08-21 | 2010-04-20 | Maxygen, Inc. | Method and apparatus for codon determining |
US7024312B1 (en) | 1999-01-19 | 2006-04-04 | Maxygen, Inc. | Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics |
DE60044223D1 (de) | 1999-01-19 | 2010-06-02 | Maxygen Inc | Durch oligonukleotide-vermittelte nukleinsäuren-rekombination |
JP2003524394A (ja) | 1999-02-11 | 2003-08-19 | マキシジェン, インコーポレイテッド | ハイスループット質量分析法 |
EP1165775A2 (en) | 1999-03-05 | 2002-01-02 | Maxygen, Inc. | Recombination of insertion modified nucleic acids |
US6703240B1 (en) | 1999-04-13 | 2004-03-09 | Maxygar, Inc. | Modified starch metabolism enzymes and encoding genes for improvement and optimization of plant phenotypes |
US7430477B2 (en) | 1999-10-12 | 2008-09-30 | Maxygen, Inc. | Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations |
US6519065B1 (en) | 1999-11-05 | 2003-02-11 | Jds Fitel Inc. | Chromatic dispersion compensation device |
US6686515B1 (en) | 1999-11-23 | 2004-02-03 | Maxygen, Inc. | Homologous recombination in plants |
CA2396320A1 (en) | 2000-01-11 | 2001-07-19 | Maxygen, Inc. | Integrated systems and methods for diversity generation and screening |
EP1272967A2 (en) | 2000-03-30 | 2003-01-08 | Maxygen, Inc. | In silico cross-over site selection |
DE60144145D1 (de) | 2000-04-03 | 2011-04-14 | Maxygen Inc | Subtilisin-variante |
US7747391B2 (en) | 2002-03-01 | 2010-06-29 | Maxygen, Inc. | Methods, systems, and software for identifying functional biomolecules |
DK2315145T3 (en) | 2002-03-01 | 2016-01-25 | Codexis Mayflower Holdings Llc | Methods, systems, and software for identifying the functional biomolecules |
US20050084907A1 (en) | 2002-03-01 | 2005-04-21 | Maxygen, Inc. | Methods, systems, and software for identifying functional biomolecules |
EP1488335A4 (en) | 2002-03-09 | 2006-11-15 | Maxygen Inc | OPTIMIZING CROSSOVER POINTS FOR THE ADJUSTED EVOLUTION |
EP1654354A1 (en) | 2003-08-11 | 2006-05-10 | Codexis, Inc. | Improved ketoreductase polypeptides and related polynucleotides |
US7749956B2 (en) * | 2005-01-07 | 2010-07-06 | Xencor, Inc. | Method of treatment using adiponectin variants |
EP1833845A2 (en) | 2005-01-07 | 2007-09-19 | Xencor | Adiponectin variants |
EP2013336B1 (en) * | 2006-04-28 | 2016-06-22 | B.R.A.I.N. Ag | A novel group of esterases for the production of fine and speciality chemicals |
US20090118130A1 (en) | 2007-02-12 | 2009-05-07 | Codexis, Inc. | Structure-activity relationships |
HUE034642T2 (en) | 2008-02-12 | 2018-02-28 | Codexis Inc | A method for selecting an optimized diverse population of variants |
US8768871B2 (en) | 2008-02-12 | 2014-07-01 | Codexis, Inc. | Method of generating an optimized, diverse population of variants |
HUE029228T2 (en) | 2008-06-13 | 2017-02-28 | Codexis Inc | A method for the synthesis of polynucleotide variants |
US20090312196A1 (en) | 2008-06-13 | 2009-12-17 | Codexis, Inc. | Method of synthesizing polynucleotide variants |
US8383346B2 (en) | 2008-06-13 | 2013-02-26 | Codexis, Inc. | Combined automated parallel synthesis of polynucleotide variants |
EP2145904A1 (de) * | 2008-07-18 | 2010-01-20 | Basf Se | Verfahren zur enzymkatalysierten Hydrolyse von Polyacrylsäureestern sowie dafür zu verwendende Esterasen |
CN101993861A (zh) * | 2009-08-31 | 2011-03-30 | 同济大学 | 羧酸酯酶的重组表达 |
WO2013003290A1 (en) | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Codexis, Inc. | Protein variant generation by region shuffling |
US20150133698A1 (en) | 2012-04-20 | 2015-05-14 | Codexis, Inc. | Production of fatty alcohols from engineered microorganisms |
BR112015018449B1 (pt) | 2013-01-31 | 2022-05-31 | Codexis, Inc | Método implementado por computador para identificar moléculas biológicas tendo uma atividade desejada, meio de armazenamento lido por computador, e, sistema de computação |
CN104109659A (zh) * | 2014-07-23 | 2014-10-22 | 云南师范大学 | 羧酸酯酶、其编码基因及其应用 |
-
2018
- 2018-12-12 JP JP2020532049A patent/JP2021506252A/ja active Pending
- 2018-12-12 AU AU2018383752A patent/AU2018383752A1/en active Pending
- 2018-12-12 WO PCT/US2018/065124 patent/WO2019118557A1/en unknown
- 2018-12-12 US US16/218,003 patent/US11015180B2/en active Active
- 2018-12-12 EP EP18887373.1A patent/EP3724325A4/en active Pending
- 2018-12-12 CN CN201880088558.6A patent/CN111699250B/zh active Active
- 2018-12-12 KR KR1020207019154A patent/KR20200098564A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-12-12 MX MX2020006222A patent/MX2020006222A/es unknown
- 2018-12-12 CA CA3081950A patent/CA3081950A1/en active Pending
- 2018-12-12 SG SG11202004185PA patent/SG11202004185PA/en unknown
-
2020
- 2020-05-26 IL IL274937A patent/IL274937A/en unknown
-
2021
- 2021-04-21 US US17/236,928 patent/US20210238565A1/en active Pending
-
2023
- 2023-02-22 JP JP2023026052A patent/JP2023062167A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3724325A4 (en) | 2021-11-24 |
KR20200098564A (ko) | 2020-08-20 |
JP2021506252A (ja) | 2021-02-22 |
CN111699250B (zh) | 2024-01-09 |
CN111699250A (zh) | 2020-09-22 |
RU2020122888A (ru) | 2022-01-13 |
MX2020006222A (es) | 2020-08-31 |
SG11202004185PA (en) | 2020-06-29 |
US20210238565A1 (en) | 2021-08-05 |
AU2018383752A1 (en) | 2020-05-21 |
CA3081950A1 (en) | 2019-06-20 |
WO2019118557A8 (en) | 2020-06-04 |
US20190177707A1 (en) | 2019-06-13 |
US11015180B2 (en) | 2021-05-25 |
IL274937A (en) | 2020-07-30 |
EP3724325A1 (en) | 2020-10-21 |
WO2019118557A1 (en) | 2019-06-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7212972B2 (ja) | 産業上の生体触媒作用のための操作されたトランスアミナーゼポリペプチド | |
CN107699548B (zh) | 用于化合物的羟基化的生物催化剂和方法 | |
US10844358B2 (en) | Polynucleotides encoding biocatalysts and methods for hydroxylation of chemical compounds | |
JP2016509841A (ja) | 工業的生体触媒作用のための操作されたトランスアミナーゼポリペプチド | |
US11236308B2 (en) | Ketoreductase polypeptides for the synthesis of chiral compounds | |
US11987818B2 (en) | Engineered imine reductases and methods for the reductive amination of ketone and amine compounds | |
JP2023062167A (ja) | アミドカップリングのためのカルボキシエステラーゼポリペプチド | |
WO2021207208A1 (en) | Carboxyesterase polypeptides for kinetic resolution | |
CA3179751A1 (en) | Engineered transaminase polypeptides | |
RU2797285C2 (ru) | Полипептиды карбоксиэстеразы для образования амидов в результате реакций сочетания | |
JP2023502779A (ja) | 化合物のヒドロキシル化のための生体触媒および方法 | |
CA3214975A1 (en) | Engineered cyclic gmp-amp synthase (cgas) variant enzymes | |
CN113396218A (zh) | 工程化转氨酶多肽 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230222 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240325 |