RU2797285C2

RU2797285C2 - Полипептиды карбоксиэстеразы для образования амидов в результате реакций сочетания

Info

Publication number: RU2797285C2
Application number: RU2020122888A
Authority: RU
Inventors: Рама ВОЛАРДИ; Дэвид Энтвистл; Кристофер Майкл МИКЛИЧ; Весна МИТЧЕЛЛ; Никки Деллас; Сиюнь Чжан; Антуанетт Серо; Брент ДОРР; Дуглас Э. ФУЭРСТ
Original assignee: Кодексис, Инк.
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2018-12-12
Publication date: 2023-06-01

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой сконструированные ферменты карбоксиэстеразы, обладающие улучшенными свойствами по сравнению со встречающимися в природе ферментами карбоксиэстеразы дикого типа, а также полинуклеотиды, кодирующие сконструированные ферменты карбоксиэстеразы, клетки-хозяева, способные экспрессировать сконструированные ферменты карбоксиэстеразы, и способы применения сконструированных ферментов карбоксиэстеразы для реакций амидирования. Изобретение позволяет получить карбоксиэстеразу с увеличенной способностью к амидированию по сравнению с карбоксиэстеразой дикого типа T. fusca с SEQ ID NO: 2. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил., 15 табл., 12 пр.

Description

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным № 62/598189, поданной 13 декабря 2017 г., которая таким образом включена посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ТАБЛИЦУ ИЛИ КОМПЬЮТЕРНУЮ ПРОГРАММУ

[0002] Список последовательностей, одновременно предоставленный в соответствии с §1.821 37 CFR в машиночитаемой форме (CRF) через EFS-Web в виде имени файла, CX2-l65USl_ST25.txt, включен сюда посредством ссылки. Электронная копия списка последовательностей была создана 7 декабря 2018 г., при этом размер файла составляет 420 Кбайт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Настоящим изобретением предоставляются сконструированные карбоксиэстеразы (ЕС 3.1.1), обладающие улучшенными неприродными свойствами по сравнению со встречающимися в природе ферментами карбоксиэстеразами дикого типа (WT), а также полинуклеотиды, кодирующие сконструированные ферменты карбоксиэстеразы, клетки-хозяева, способные экспрессировать сконструированные ферменты карбоксиэстеразы, и способы применения сконструированных ферментов карбоксиэстеразы для реакций амидирования.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Амидные связи являются ключевыми функциональными частями в различных синтетических молекулах, включая полимеры (например, белки, найлон), пестициды (например, пропанил, хлорпрофам) и фармацевтические препараты (например, валсартан, лиздексамфетамин). Недавний обзор преобладания типов реакций, использованных при поиске новых лекарственных средств-кандидатов, показал, что N-ациламидирование составляет приблизительно 16% среди всех этих реакций (Roughley and Jordan, J. Med. Chem., 54: 3451-3479 [2011]). При получении, используя традиционные химические способы, образование амидной связи является ресурсоемким превращением. Амидные связи обычно синтезируются из карбоновых кислот и аминов. Однако реакция между этими двумя функциональными группами не происходит самопроизвольно при температурах окружающей среды, при этом необходимое удаление воды происходит только при высоких температурах (например, 200^οC). Эти условия, как правило, причиняют ущерб подложкам и продуктам.

[0005] Чтобы амидирование происходило в более подходящих условиях, требуется, как правило, активация карбоновой кислоты для присоединения к амину. Активация карбоновой кислоты обычно происходит с помощью реагента реакции сочетания с образованием активированного эфира или ангидрида или путем превращения карбоновой кислоты в соответствующий хлорангидрид (т.е. посредством реакции Шоттена-Бауманна; смотрите El-Faham and Albericio, Chem. Rev., 111: 6557-6602 [2011]). Эти реакции проводятся со сверхвысокими или стехиометрическими концентрациями дорогих реагентов реакции сочетания, в которых используются неэффективные по использованию атомов пути синтеза (смотрите Pattabiraman and Bode, Nature, 480: 471-479 [2011]). Кроме того, реагенты, а также образующиеся отходы могут быть высокотоксичными и вредными для окружающей среды. По крайней мере один эквивалент отходов образуется на каждую молекулу продукта, образующуюся в этих реакциях, что приводит к очень низкой экономии атомов. Удаление отходов из реакционной смеси является длительным и дорогостоящим процессом. Таким образом, в данной области техники необходимы более эффективные и экологически чистые способы для образования амидных связей в различных условиях.

[0006] Липазы нашли применение в промышленном масштабе для гидролиза эфиров жирных кислот и использовались для амидирования сложных эфиров (Seem Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, In Special Techniques, Springer-Verlag, New York, NY, [2011]; и Kalkote, et al., Asian J. Biochem., 2: 279-283 [2007]). Образование амидных связей с использованием ферментов представляет собой очень экономически эффективный по использованию атомов процесс, поскольку нет необходимости активировать карбоновую кислоту, как при обычных подходах к реакциям сочетания. Использование ферментов в этих реакциях обеспечивает большую промышленную ценность, поскольку они безопасны для окружающей среды, происходят в мягких условиях и являются менее дорогостоящими, чем доступные в настоящее время химические пути. Хотя эукариотические протеазы и липазы способны к образованию амидных связей (смотрите Adolfsson et al., Chem. Soc. Rev., 43: 2714-2742 [2014]; Guzman, et al., Elec. J. Biotech., 10(2) [2007]; и Asano et al., J. Biosci. Bioeng., 100(6):662-666 [2005]), эти ферменты обычно плохо экспрессируются в прокариотических экспрессионных системах и могут работать хуже в органических растворителях. Напротив, с помощью направленной эволюции карбоксиэстеразы по настоящему изобретению легко продуцировались в прокариотических (E.coli) экспрессионных системах и обладали повышенной устойчивостью и полезностью в режимах с использованием органическим растворителем, более подходящих для этого типа реакции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0007] На фиг. 1 показано совмещение полинуклеотидной последовательности, кодирующей оптимизированный в отношении частоты использования кодонов в E.coli фермент карбоксиэстеразу дикого типа, Thermobifida fusca (T. fusca) (SEQ ID NO:1) с каждой из полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют сконструированные последовательности карбоксиэстераз, представленных в поданном с этой заявкой списке последовательностей (SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133 и 135). Все эти раскрытые полинуклеотидные последовательности на 98,9-99,9% идентичны друг другу.

[0008] На фиг. 2 показано совмещение полипептидной последовательности, полученной для фермента карбоксиэстеразы дикого типа, Thermobifida fusca (T. fusca) (SEQ ID NO:2), с каждой из сконструированных полипептидных последовательностей карбоксиэстераз, представленных в поданном с этой заявкой списке последовательностей (SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, и 136). Все эти раскрытые полипептидные последовательности на 98,6-99,8% идентичны друг другу.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Настоящим изобретением предоставляются сконструированные карбоксиэстеразы (ЕС 3.1.1), обладающие улучшенными неприродными свойствами по сравнению со встречающимися в природе ферментами карбоксиэстеразами дикого типа (WT), а также полинуклеотиды, кодирующие сконструированные ферменты карбоксиэстеразы, клетки-хозяева, способные экспрессировать сконструированные ферменты карбоксиэстеразы, и способы применения сконструированных ферментов карбоксиэстераз для реакций амидирования.

[0010] Настоящим изобретением предоставляются сконструированные карбоксиэстеразы, включающие полипептидные последовательности, которые на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентичны SEQ ID NO:2, или их функциональный фрагмент, причем сконструированные карбоксиэстеразы содержат по крайней мере одну замену или совокупность замен в своих полипептидных последовательностях, и причем положения аминокислот в полипептидных последовательностей пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены в положениях, выбранных из 39, 39/323, 62, 62/117, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 71/263, 77, 77/184, 103, 103/147, 104, 104/429, 105, 107, 107/185, 108, 109, 109/117, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 118/269, 118/349, 119, 126, 147, 153, 153/215, 164, 164/271, 174, 174/282, 183, 184, 184/249, 185, 186, 187, 188, 190, 209, 210, 211, 212, 213, 213/271, 213/345, 214, 215, 215/271, 216, 217, 217/231, 224, 224/268/372, 231, 249, 249/284, 263, 268, 269, 270, 270/470, 271, 271/416, 276, 277, 278, 279, 279/280/282, 280, 281, 281/374, 282, 283, 283/429, 284, 284/438, 285, 286, 311, 317, 320, 320/323, 320/323/372, 320/372/376, 320/376/377, 321, 323, 324, 345, 349, 372, 372/376, 373, 374, 376, 377, 405, 416, 420, 427, 428, 429, 438 и 470, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены, выбранные из: 39/323, 62/117, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 71/263, 77/184, 103, 103/147, 104, 104/429, 105, 107, 107/185, 108, 109/117, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 118/269, 118/349, 119, 126, 153, 153/215, 164/271, 174/282, 183, 184, 184/249, 185, 186, 187, 188, 190, 209, 210, 211, 212, 213, 213/271, 213/345, 214, 215, 215/271, 216, 217, 217/231, 224/268/372, 249/284, 269, 270, 270/470, 271, 271/416, 276, 277, 278, 279, 279/280/282, 280, 281, 281/374, 282, 283, 283/429, 284, 284/438, 285, 286, 311, 317, 320, 320/323, 320/323/372, 320/372/376, 320/376/377, 321, 323, 324, 372, 372/376, 373, 376, 377, 405, 420, 427, 428 и 429, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены, выбранные из: 39M/323I, 62H/117G, 63A, 63R, 63T, 63Y, 64A, 64E, 64G, 64I, 64T, 64V, 64W, 65G, 65S, 65T, 65W, 66N, 68L, 68P, 69F, 69G, 69H, 69L, 69V, 69W, 69Y, 70L, 70R, 70T, 70W, 71F, 71G, 71H/263R, 71P, 71R, 71V, 71Y, 77S/184G, 103P, 103R, 103T/147S, 104P, 104Q/429V, 105L, 107D/185W, 107L, 107P, 107S, 108G, 108K, 108Q, 108R, 108S, 108W, 109G/117M, 110A, 110H, 110P, 110S, 111L, 111M, 111R, 111S, 111V, 111W, 113P, 114A, 114H, 114Q, 115H, 115T, 115V, 117A, 117F, 118G/349V, 118I, 118N, 118N/269T, 119G, 119P, 119S, 126C, 153H/215P, 153L, 164R/271T, 174D/282V, 183P, 184F, 184G, 184P, 184S/249T, 184Y, 185A, 185T, 186C, 186G, 186P, 186R, 186T, 187P, 188E, 188G, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190W, 209E, 209G, 209P, 209S, 209V, 210P, 210T, 210W, 211I, 211L, 211R, 211V, 212A, 212P, 212R, 212S, 213C, 213E, 213L, 213N, 213P, 213Q, 213R/345G, 213S, 213T/271K, 213V, 214K, 214L, 214T, 214V, 215K, 215M, 215P, 215R, 215R/271R, 215W, 216P, 217G, 217L, 217P, 217R, 217R/231V, 217S, 217V, 217W, 224I/268S/372F, 249V/284P, 269N, 269V, 270I, 270I/470M, 270R, 271A, 271K, 271L, 271P, 271Q/416V, 271S, 271T, 276F, 277M, 278H, 278S, 279C, 279E, 279G, 279L/280G/282M, 279V, 280E, 280G, 280S, 281P, 281V, 281Y/374N, 282A, 282C, 282Q, 282R, 282S, 282T, 282W, 283C, 283D, 283K, 283R/429V, 283T, 283V, 283Y, 284C, 284T, 284T/438T, 284V, 285L, 285M, 285P, 286V, 311I, 317C, 317P, 320A, 320F, 320G, 320G/323S, 320S, 320S/323S/372A, 320S/372A/376G, 320S/376G/377V, 320W, 321L, 321S, 323C, 323I, 323R, 323Y, 324A, 372A/376A, 372L, 373G, 376A, 376G, 376L, 376M, 377L, 377W, 377Y, 405D, 420G, 427A, 428V и 429L, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены, выбранные из: T39M/F323I, R62H/P117G, P63A, P63R, P63T, P63Y, P64A, P64E, P64G, P64I, P64T, P64V, P64W, Y65G, Y65S, Y65T, Y65W, P66N, A68L, A68P, I69F, I69G, I69H, I69L, I69V, I69W, I69Y, G70L, G70R, G70T, G70W, A71F, A71G, A71H/Q263R, A71P, A71R, A71V, A71Y, F77S/E184G, W103P, W103R, W103T/P147S, I104P, I104Q/A429V, H105L, G107D/S185W, G107L, G107P, G107S, A108G, A108K, A108Q, A108R, A108S, A108W, F109G/P117M, T110A, T110H, T110P, T110S, N111L, N111M, N111R, N111S, N111V, N111W, S113P, G114A, G114H, G114Q, S115H, S115T, S115V, P117A, P117F, V118G/A349V, V118I, V118N, V118N/A269T, Y119G, Y119P, Y119S, R126C, R153H/N215P, R153L, W164R/W271T, G174D/L282V, G183P, E184F, E184G, E184P, E184S/A249T, E184Y, S185A, S185T, A186C, A186G, A186P, A186R, A186T, G187P, A188E, A188G, S190H, S190K, S190L, S190M, S190Q, S190R, S190W, L209E, L209G, L209P, L209S, L209V, Q210P, Q210T, Q210W, S211I, S211L, S211R, S211V, G212A, G212P, G212R, G212S, A213C, A213E, A213L, A213N, A213P, A213Q, A213R/S345G, A213S, A213T/W271K, A213V, G214K, G214L, G214T, G214V, N215K, N215M, N215P, N215R, N215R/W271R, N215W, M216P, A217G, A217L, A217P, A217R, A217R/A231V, A217S, A217V, A217W, T224I/P268S/I372F, A249V/F284P, A269N, A269V, V270I, V270I/V470M, V270R, W271A, W271K, W271L, W271P, W271Q/A416V, W271S, W271T, A276F, G277M, G278H, G278S, S279C, S279E, S279G, S279L/V280G/L282M, S279V, V280E, V280G, V280S, L281P, L281V, L281Y/D374N, L282A, L282C, L282Q, L282R, L282S, L282T, L282W, P283C, P283D, P283K, P283R/A429V, P283T, P283V, P283Y, F284C, F284T, F284T/P438T, F284V, A285L, A285M, A285P, P286V, L311I, T317C, T317P, Y320A, Y320F, Y320G, Y320G/F323S, Y320S, Y320S/F323S/I372A, Y320S/I372A/V376G, Y320S/V376G/F377V, Y320W, R321L, R321S, F323C, F323I, F323R, F323Y, L324A, I372A/V376A, I372L, T373G, V376A, V376G, V376L, V376M, F377L, F377W, F377Y, P405D, P420G, D427A, R428V и A429L, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы содержат замену в положении 282, причем положение пронумеровано согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления замена в положении 282 является заменой на алифатическую, неполярную, основную, полярную или ароматическую аминокислоту. В еще одних дополнительных вариантах осуществления замена выбрана из: X282T, X282G, X282A, X282V, X282M, X282C, X282W, X282Q, X282S, X282T и X282R.

[0011] Настоящим изобретением также предоставляются сконструированные карбоксиэстеразы, включающие полипептидные последовательности, которые на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентичны SEQ ID NO:8, или их функциональный фрагмент, причем сконструированные карбоксиэстеразы содержат по крайней мере одну замену или совокупность замен в своих полипептидных последовательностях, и причем положения аминокислот в полипептидных последовательностях пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены в положениях, выбранных из 63, 63/65/108, 63/65/108/189, 63/65/108/377, 63/65/282/285/320/323, 63/65/320/323, 63/108, 63/108/282/285/377, 63/108/285/377, 63/108/320/323, 63/189, 63/212/215, 63/212/215/268/269/343, 63/215, 63/215/269, 63/215/270/271, 63/215/343, 63/268/269/270/429, 63/377, 65/69/70/281/372, 65/69/70/372, 65/69/372, 65/70/372, 65/320, 65/320/323, 68, 68/69/189/214, 68/69/189/214/215, 68/69/189/214/215/271, 68/69/189/214/215/271/281/282/343/381, 68/69/189/214/271/280, 68/69/189/214/372, 68/69/189/214/377/381, 68/69/189/271, 68/69/189/271/280/372/381, 68/69/189/280/281/282/372/377, 68/69/189/281/282/372/377/381, 68/69/189/343/381, 68/69/189/372, 68/69/189/381, 68/69/214/215/271, 68/69/214/343, 68/69/215, 68/69/271, 68/69/282/287, 68/69/343/372, 68/108/377, 68/184, 68/184/189, 68/189/271/372, 68/189/343, 68/214/215/271/281/282/372, 68/215/271/343/372/381, 68/215/377, 68/271/372, 68/377, 69, 69/70, 69/70/331/372, 69/70/372, 69/70/459, 69/108, 69/108/270/372/377, 69/108/281/285, 69/110/215/281, 69/189, 69/189/214/271/281/282/343, 69/189/214/343/372, 69/189/215/343, 69/189/271, 69/189/271/281/282, 69/189/271/343, 69/189/271/343/381, 69/189/280/282/343/372/381, 69/189/281/373, 69/189/282, 69/189/343/381, 69/189/372, 69/189/372/377, 69/189/377, 69/212/213/215/280/281, 69/214/215/271/372/377/381, 69/214/271/282, 69/214/271/343, 69/215, 69/215/269/270/377, 69/215/271/280/281/282, 69/215/271/282, 69/215/271/372, 69/215/285/317, 69/215/323, 69/215/343, 69/215/343/372/381, 69/271, 69/271/372, 69/282, 69/282/343/372, 69/285/373, 69/372, 70, 70/212, 108, 108/189, 108/189/282/285/320, 108/189/320, 108/189/377, 108/215, 108/215/377, 108/269/270, 108/270, 108/282/285/377, 108/285, 108/320/323, 108/377, 126, 126/184/213/280/281/285/320, 126/184/213/372, 126/189/285/372, 126/215, 126/372, 181/215, 189, 189/214, 189/214/215/271/282, 189/215, 189/215/249/277, 189/215/271/281/282/377, 189/215/343/372, 189/270/285, 189/270/372, 189/280/282, 189/320/377, 189/343, 189/343/377, 189/372/377, 189/377, 189/381, 213/215/320, 214/215/271, 214/215/271/377, 214/271, 214/280/282/343/377/381, 215, 215/249/280/281/285/372, 215/271/372, 215/280/281/285/372, 215/281/285/372, 215/281/285/373, 215/281/373, 215/285, 215/285/317, 215/285/346, 215/285/445, 215/320, 215/320/372, 215/323, 215/372, 215/372/377, 215/373, 215/377, 215/381, 249/377, 269/270/281/372/377, 270/377, 271, 271/343, 271/343/372, 271/343/372/381, 280/285/372, 281/372, 282/285/320/323, 285/323, 320, 343/372, 372, 372/377, 372/381, 373 и 377, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает по крайней мере одну замену, выбранную из: 63A, 63A/189A, 63A/215R/343V, 63R, 63R/65G/108G, 63R/65G/108G/189L, 63R/65G/108G/377I, 63R/65G/282A/285L/320W/323I, 63R/65G/320W/323I, 63R/108G, 63R/108G/282A/285L/377L, 63R/108G/285L/377I, 63R/108G/320W/323C, 63R/377I, 63T/215R, 63Y, 63Y/189L, 63Y/212P/215R, 63Y/212P/215R/268A/269N/343V, 63Y/215P/269N, 63Y/215R, 63Y/215R/270I/271S, 63Y/268A/269N/270I/429V, 65G/320W, 65G/320W/323I, 65W/69L/372L, 65W/69M/70A/281P/372L, 65W/69W/70L/372L, 65W/70L/372M, 68P, 68P/69L/189E/214R/271Y/280G, 68P/69L/189E/214R/372L, 68P/69L/189I/214R/215P/271Y, 68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L, 68P/69L/189Q/214R, 68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L, 68P/69L/215P, 68P/69L/271Y, 68P/69L/282C/287I, 68P/69L/343V/372L, 68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L, 68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y, 68P/69W/189E/343V/381L, 68P/69W/189I/214R/215P, 68P/69W/189I/214R/377Y/381L, 68P/69W/189I/271Y, 68P/69W/189I/372L, 68P/69W/189I/381L, 68P/69W/214R/215P/271Y, 68P/69W/214R/343V, 68P/69W/215P, 68P/108G/377L, 68P/184S, 68P/184S/189E, 68P/189I/271Y/372L, 68P/189I/343V, 68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L, 68P/215P/271Y/343V/372L/381L, 68P/215P/377L, 68P/271Y/372L, 68P/377L, 69F/108G/270E/372L/377L, 69F/189L, 69F/215K, 69F/215K/269L/270I/377L, 69F/215R, 69F/285L/373G, 69L, 69L/70L/331Q/372M, 69L/189E/271Y/281P/282A, 69L/189I, 69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V, 69L/189I/271Y/343V/381L, 69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L, 69L/189I/282A, 69L/189Q/377Y, 69L/215P/271Y/280G/281P/282C, 69L/215P/271Y/282A, 69L/215P/271Y/372L, 69L/215P/343V/372L/381L, 69L/215R/285P/317P, 69L/271Y, 69L/271Y/372L, 69L/282C/343V/372L, 69L/372L, 69M/70A/372M, 69W, 69W/70L, 69W/70L/372M, 69W/70L/459R, 69W/108S, 69W/189E/214R/343V/372L, 69W/189E/271Y/343V, 69W/189E/372L, 69W/189I, 69W/189I/215P/343V, 69W/189I/271Y, 69W/189I/343V/381L, 69W/189Q/372L/377Y, 69W/212A/213L/215R/280G/281P, 69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L, 69W/214R/271Y/282A, 69W/214R/271Y/343V, 69W/215K/343V, 69W/215P, 69W/215R, 69W/215R/323Y, 69W/282A, 69W/372M, 69Y/108G/281P/285P, 69Y/110A/215R/281P, 69Y/189L/281P/373G, 70L, 70L/212P, 108G, 108G/189I/282A/285L/320W, 108G/189L, 108G/189L/320W, 108G/189L/377I, 108G/215K, 108G/215P/377L, 108G/269L/270E, 108G/270E, 108G/282A/285L/377L, 108G/285L, 108G/320W/323I, 108G/377I, 108G/377L, 126C, 126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G, 126C/184S/213S/372L, 126C/189I/285L/372L, 126C/215P, 126C/372L, 181L/215P, 189E/372L/377Y, 189I, 189I/214R/215P/271Y/282G, 189I/215K, 189I/215P/343V/372L, 189I/215R/249T/277M, 189I/270E/285L, 189I/270E/372L, 189I/280G/282A, 189I/320W/377I, 189I/343V, 189I/377I, 189L, 189Q, 189Q/214R, 189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y, 189Q/343V, 189Q/343V/377Y, 189Q/381L, 213S/215P/320G, 214R/215P/271Y, 214R/215P/271Y/377Y, 214R/271Y, 214R/280G/282A/343V/377Y/381L, 215K, 215K/281P/285L/372L, 215K/281P/373G, 215K/285L/317P, 215K/285L/445L, 215K/323Y, 215K/372L, 215K/372L/377L, 215K/373G, 215P, 215P/271Y/372L, 215P/320G, 215P/320G/372L, 215P/372L, 215P/372L/377L, 215P/377L, 215P/381L, 215R, 215R/249T/280G/281P/285L/372L, 215R/280G/281P/285L/372L, 215R/281P/285L/373G, 215R/285P, 215R/320G, 215R/372L, 215W, 215W/285L/346S, 215W/285P, 215W/373G, 249T/377L, 269L/270E/281P/372L/377L, 270E/377L, 271Y, 271Y/343V, 271Y/343V/372L, 271Y/343V/372L/381L, 280G/285L/372L, 281P/372L, 282A/285L/320W/323I, 285L/323I, 320W, 343V/372L, 372L, 372L/377L, 372L/381L, 372M, 373G и 377L, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает по крайней мере одну замену, выбранную из: P63A, P63A/M189A, P63A/N215R/A343V, P63R, P63R/Y65G/A108G, P63R/Y65G/A108G/M189L, P63R/Y65G/A108G/F377I, P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I, P63R/Y65G/Y320W/F323I, P63R/A108G, P63R/A108G/T282A/A285L/F377L, P63R/A108G/A285L/F377I, P63R/A108G/Y320W/F323C, P63R/F377I, P63T/N215R, P63Y, P63Y/M189L, P63Y/G212P/N215R, P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V, P63Y/N215P/A269N, P63Y/N215R, P63Y/N215R/V270I/W271S, P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V, Y65G/Y320W, Y65G/Y320W/F323I, Y65W/I69L/I372L, Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L, Y65W/I69W/G70L/I372L, Y65W/G70L/I372M, A68P, A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G, A68P/I69L/M189E/G214R/I372L, A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y, A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L, A68P/I69L/M189Q/G214R, A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L, A68P/I69L/N215P, A68P/I69L/W271Y, A68P/I69L/T282C/V287I, A68P/I69L/A343V/I372L, A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L, A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y, A68P/I69W/M189E/A343V/A381L, A68P/I69W/M189I/G214R/N215P, A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L, A68P/I69W/M189I/W271Y, A68P/I69W/M189I/I372L, A68P/I69W/M189I/A381L, A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y, A68P/I69W/G214R/A343V, A68P/I69W/N215P, A68P/A108G/F377L, A68P/E184S, A68P/E184S/M189E, A68P/M189I/W271Y/I372L, A68P/M189I/A343V, A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L, A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L, A68P/N215P/F377L, A68P/W271Y/I372L, A68P/F377L, I69F/A108G/V270E/I372L/F377L, I69F/M189L, I69F/N215K, I69F/N215K/A269L/V270I/F377L, I69F/N215R, I69F/A285L/T373G, I69L, I69L/G70L/P331Q/I372M, I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A, I69L/M189I, I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V, I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L, I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L, I69L/M189I/T282A, I69L/M189Q/F377Y, I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C, I69L/N215P/W271Y/T282A, I69L/N215P/W271Y/I372L, I69L/N215P/A343V/I372L/A381L, I69L/N215R/A285P/T317P, I69L/W271Y, I69L/W271Y/I372L, I69L/T282C/A343V/I372L, I69L/I372L, I69M/G70A/I372M, I69W, I69W/G70L, I69W/G70L/I372M, I69W/G70L/G459R, I69W/A108S, I69W/M189E/G214R/A343V/I372L, I69W/M189E/W271Y/A343V, I69W/M189E/I372L, I69W/M189I, I69W/M189I/N215P/A343V, I69W/M189I/W271Y, I69W/M189I/A343V/A381L, I69W/M189Q/I372L/F377Y, I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P, I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L, I69W/G214R/W271Y/T282A, I69W/G214R/W271Y/A343V, I69W/N215K/A343V, I69W/N215P, I69W/N215R, I69W/N215R/F323Y, I69W/T282A, I69W/I372M, I69Y/A108G/L281P/A285P, I69Y/T110A/N215R/L281P, I69Y/M189L/L281P/T373G, G70L, G70L/G212P, A108G, A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W, A108G/M189L, A108G/M189L/Y320W, A108G/M189L/F377I, A108G/N215K, A108G/N215P/F377L, A108G/A269L/V270E, A108G/V270E, A108G/T282A/A285L/F377L, A108G/A285L, A108G/Y320W/F323I, A108G/F377I, A108G/F377L, R126C, R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G, R126C/E184S/A213S/I372L, R126C/M189I/A285L/I372L, R126C/N215P, R126C/I372L, V181L/N215P, M189E/I372L/F377Y, M189I, M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G, M189I/N215K, M189I/N215P/A343V/I372L, M189I/N215R/A249T/G277M, M189I/V270E/A285L, M189I/V270E/I372L, M189I/V280G/T282A, M189I/Y320W/F377I, M189I/A343V, M189I/F377I, M189L, M189Q, M189Q/G214R, M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y, M189Q/A343V, M189Q/A343V/F377Y, M189Q/A381L, A213S/N215P/Y320G, G214R/N215P/W271Y, G214R/N215P/W271Y/F377Y, G214R/W271Y, G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L, N215K, N215K/L281P/A285L/I372L, N215K/L281P/T373G, N215K/A285L/T317P, N215K/A285L/V445L, N215K/F323Y, N215K/I372L, N215K/I372L/F377L, N215K/T373G, N215P, N215P/W271Y/I372L, N215P/Y320G, N215P/Y320G/I372L, N215P/I372L, N215P/I372L/F377L, N215P/F377L, N215P/A381L, N215R, N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L, N215R/V280G/L281P/A285L/I372L, N215R/L281P/A285L/T373G, N215R/A285P, N215R/Y320G, N215R/I372L, N215W, N215W/A285L/G346S, N215W/A285P, N215W/T373G, A249T/F377L, A269L/V270E/L281P/I372L/F377L, V270E/F377L, W271Y, W271Y/A343V, W271Y/A343V/I372L, W271Y/A343V/I372L/A381L, V280G/A285L/I372L, L281P/I372L, T282A/A285L/Y320W/F323I, A285L/F323I, Y320W, A343V/I372L, I372L, I372L/F377L, I372L/A381L, I372M, T373G и F377L, причем положения аминокислот в полипептидных последовательностей пронумерованы согласно SEQ ID NO:8.

[0012] Настоящим изобретением также предоставляются сконструированные карбоксиэстеразы, включающие полипептидные последовательности, которые на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентичны SEQ ID NO:138, или их функциональный фрагмент, причем сконструированные карбоксиэстеразы содержат по крайней мере одну замену или совокупность замен в своих полипептидных последовательностях, и причем положения аминокислот в полипептидных последовательностях пронумерованы согласно SEQ ID NO:138.

[0013] Настоящим изобретением также предоставляются сконструированные карбоксиэстеразы, включающие полипептидные последовательности, которые на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентичны SEQ ID NO:140, или их функциональный фрагмент, причем сконструированные карбоксиэстеразы содержат по крайней мере одну замену или совокупность замен в своих полипептидных последовательностях, и причем положения аминокислот в полипептидных последовательностей пронумерованы согласно SEQ ID NO:140.

[0014] Настоящим изобретением также предоставляются сконструированные карбоксиэстеразы, включающие полипептидные последовательности, выбранные из: SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 и 136.

[0015] Настоящим изобретением также предоставляются сконструированные карбоксиэстеразы, проявляющие по крайней мере одно улучшенное свойство по сравнению с карбоксиэстеразой T. fusca дикого типа с SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления улучшенное свойство выбрано из: увеличенной способностью к амидированию, устойчивости к растворителю, термостойкости, устойчивости к pH, региостереоизбирательности, стереоизбирательности, объема субстратов и/или уменьшенного ингибирования субстратом или продуктом и пониженной токсичности для бактериальных клеток-хозяев, продуцирующих сконструированную карбоксиэстеразу. В некоторых дополнительных вариантах осуществления бактериальные клетки-хозяева включают E.coli. В еще одних дополнительных вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы проявляют увеличенную толерантность к по крайней мере одному растворителю, выбранному из: ацетона, ацетонитрила, толуола, тетрагидрофурана, изопропанола, изопропилацетата, диметилсульфоксида и/или метилэтилкетона. В некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы проявляют большую активность, чем карбоксиэстераза T. fusca дикого типа на по крайней мере одном субстрате, выбранном из: анилина, изобутиламина, н-бутиламина, трет-бутиламина, N’-трет-бутоксикарбонилбензгидразида, 4-метилпиперидина О-трет-бутилгидроксиламина, бензиламина, 2,6-диметиланилина, (S)-(-)-α-метилбензиламина, (R)-(+)-α-метилбензиламина, метилфенилацетата, этилацетата, этилбензоата, 2-пиразинил-этилового эфира, эфира 4-этил-1H-индола, N, N-диэтилглицил-метилового эфира. В некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы проявляют большую активность, чем карбоксиэстераза T. fusca дикого типа на по крайней мере одном субстрате или комбинации субстратов, выбранной из анилина, изобутиламина, н-бутиламина, трет-бутиламина, N’-трет-бутоксикарбонилбензгидразида, 4-метилпиперидина О-трет-бутилгидроксиламина, бензиламина, 2,6-диметиланилина, (S)-(-)-α-метилбензиламина, (R)-(+)-α-метилбензиламина, метилфенилацетата, этилацетата, этилбензоата, 2-пиразинил-этилового эфира, эфира 4-этил-1H-индола, N, N-диэтилглицил-метилового эфира. Кроме того, в некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы проявляют большую способность, чем карбоксиэстераза T. fusca дикого типа, к продукции по крайней мере одного продукта, выбранного из: ацетанилида, N-н-бутилбензилацетамида, N-[(S)-1-фенилэтил]-пиразиниламида, N-[(S)-1-фенилэтил]-бензамида, N-[(R)-1-фенилэтил]-бензамида, N’-трет-бутоксикарбонил-бензгидразида, 1-бензоил-4-метилпиперидина, 2-пиразинил-4-метилпиперидина, N-изобутилбензамида, N-трет-бутилбензамида, N-трет-бутилгидроксилбензамида, N-изобутил-1H-индол-4-амида, N’,N’-(диэтиламино)-N-фенилацетамида, N’,N’-(диэтиламино)-N-бензилацетамида, N’,N’-(диэтиламино)-N-2,6-диметилфенилацетамида (т.е. лидокаина). В некоторых вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы по настоящему изобретению содержат по крайней мере одну замену, выбранную из: X343V, X372L, X320W/G, X214R, X282C, X271Y, X65G, причем замены пронумерованы согласно SEQ ID NO:2, и причем сконструированная карбоксиэстераза проявляет большую активность, чем карбоксиэстераза T. fusca дикого типа на стерически затрудненном амине, в отношении образования N’,N’-(диэтиламино)-N-2,6-диметилфенилацетамида из этилбензоата и 2,6-диметиланилина, как показано на следующей схеме:

[0016] Кроме того, в некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы содержат по крайней мере одну замену, выбранную из: X268A, X63A/R, X189Q/I/E, X214R, X282G/C, X381L и X69W, причем замены пронумерованы согласно SEQ ID NO:2, и причем сконструированная карбоксиэстераза проявляет большую активность, чем карбоксиэстераза T. fusca дикого типа на вторичном амине, в отношении образования 1-бензоил-4-метилпиперидина из этилбензоата и 4-метилпиперидина, как показано на следующей схеме:

[0017] Кроме того, в некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы, предоставленные здесь, являются очищенными. Кроме того, в некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы являются иммобилизованными. Настоящим изобретением также предоставляются композиции, содержащие по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, предоставленную здесь.

[0018] Настоящим изобретением также предоставляются полинуклеотидные последовательности, кодирующие по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, предоставленную здесь. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, включающую полипептидную последовательность, которая на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO:2, или ее функциональный фрагмент, причем сконструированная карбоксиэстераза содержит по крайней мере одну замену или совокупность замен в своей полипептидной последовательности, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую замены в положениях, выбранных из: 39, 39/323, 62, 62/117, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 71/263, 77, 77/184, 103, 103/147, 104, 104/429, 105, 107, 107/185, 108, 109, 109/117, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 118/269, 118/349, 119, 126, 147, 153, 153/215, 164, 164/271, 174, 174/282, 183, 184, 184/249, 185, 186, 187, 188, 190, 209, 210, 211, 212, 213, 213/271, 213/345, 214, 215, 215/271, 216, 217, 217/231, 224, 224/268/372, 231, 249, 249/284, 263, 268, 269, 270, 270/470, 271, 271/416, 276, 277, 278, 279, 279/280/282, 280, 281, 281/374, 282, 283, 283/429, 284, 284/438, 285, 286, 311, 317, 320, 320/323, 320/323/372, 320/372/376, 320/376/377, 321, 323, 324, 345, 349, 372, 372/376, 373, 374, 376, 377, 405, 416, 420, 427, 428, 429, 438 и 470, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую по крайней мере одну замену или совокупность замен, выбранную из: 39/323, 62/117, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 71/263, 77/184, 103, 103/147, 104, 104/429, 105, 107, 107/185, 108, 109/117, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 118/269, 118/349, 119, 126, 153, 153/215, 164/271, 174/282, 183, 184, 184/249, 185, 186, 187, 188, 190, 209, 210, 211, 212, 213, 213/271, 213/345, 214, 215, 215/271, 216, 217, 217/231, 224/268/372, 249/284, 269, 270, 270/470, 271, 271/416, 276, 277, 278, 279, 279/280/282, 280, 281, 281/374, 282, 283, 283/429, 284, 284/438, 285, 286, 311, 317, 320, 320/323, 320/323/372, 320/372/376, 320/376/377, 321, 323, 324, 372, 372/376, 373, 376, 377, 405, 420, 427, 428 и 429, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую по крайней мере одну замену или совокупность замен, выбранную из: 39M/323I, 62H/117G, 63A, 63R, 63T, 63Y, 64A, 64E, 64G, 64I, 64T, 64V, 64W, 65G, 65S, 65T, 65W, 66N, 68L, 68P, 69F, 69G, 69H, 69L, 69V, 69W, 69Y, 70L, 70R, 70T, 70W, 71F, 71G, 71H/263R, 71P, 71R, 71V, 71Y, 77S/184G, 103P, 103R, 103T/147S, 104P, 104Q/429V, 105L, 107D/185W, 107L, 107P, 107S, 108G, 108K, 108Q, 108R, 108S, 108W, 109G/117M, 110A, 110H, 110P, 110S, 111L, 111M, 111R, 111S, 111V, 111W, 113P, 114A, 114H, 114Q, 115H, 115T, 115V, 117A, 117F, 118G/349V, 118I, 118N, 118N/269T, 119G, 119P, 119S, 126C, 153H/215P, 153L, 164R/271T, 174D/282V, 183P, 184F, 184G, 184P, 184S/249T, 184Y, 185A, 185T, 186C, 186G, 186P, 186R, 186T, 187P, 188E, 188G, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190W, 209E, 209G, 209P, 209S, 209V, 210P, 210T, 210W, 211I, 211L, 211R, 211V, 212A, 212P, 212R, 212S, 213C, 213E, 213L, 213N, 213P, 213Q, 213R/345G, 213S, 213T/271K, 213V, 214K, 214L, 214T, 214V, 215K, 215M, 215P, 215R, 215R/271R, 215W, 216P, 217G, 217L, 217P, 217R, 217R/231V, 217S, 217V, 217W, 224I/268S/372F, 249V/284P, 269N, 269V, 270I, 270I/470M, 270R, 271A, 271K, 271L, 271P, 271Q/416V, 271S, 271T, 276F, 277M, 278H, 278S, 279C, 279E, 279G, 279L/280G/282M, 279V, 280E, 280G, 280S, 281P, 281V, 281Y/374N, 282A, 282C, 282Q, 282R, 282S, 282T, 282W, 283C, 283D, 283K, 283R/429V, 283T, 283V, 283Y, 284C, 284T, 284T/438T, 284V, 285L, 285M, 285P, 286V, 311I, 317C, 317P, 320A, 320F, 320G, 320G/323S, 320S, 320S/323S/372A, 320S/372A/376G, 320S/376G/377V, 320W, 321L, 321S, 323C, 323I, 323R, 323Y, 324A, 372A/376A, 372L, 373G, 376A, 376G, 376L, 376M, 377L, 377W, 377Y, 405D, 420G, 427A, 428V и 429L, причем положения аминокислот пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую по крайней мере одну замену или совокупность замен, выбранную из: T39M/F323I, R62H/P117G, P63A, P63R, P63T, P63Y, P64A, P64E, P64G, P64I, P64T, P64V, P64W, Y65G, Y65S, Y65T, Y65W, P66N, A68L, A68P, I69F, I69G, I69H, I69L, I69V, I69W, I69Y, G70L, G70R, G70T, G70W, A71F, A71G, A71H/Q263R, A71P, A71R, A71V, A71Y, F77S/E184G, W103P, W103R, W103T/P147S, I104P, I104Q/A429V, H105L, G107D/S185W, G107L, G107P, G107S, A108G, A108K, A108Q, A108R, A108S, A108W, F109G/P117M, T110A, T110H, T110P, T110S, N111L, N111M, N111R, N111S, N111V, N111W, S113P, G114A, G114H, G114Q, S115H, S115T, S115V, P117A, P117F, V118G/A349V, V118I, V118N, V118N/A269T, Y119G, Y119P, Y119S, R126C, R153H/N215P, R153L, W164R/W271T, G174D/L282V, G183P, E184F, E184G, E184P, E184S/A249T, E184Y, S185A, S185T, A186C, A186G, A186P, A186R, A186T, G187P, A188E, A188G, S190H, S190K, S190L, S190M, S190Q, S190R, S190W, L209E, L209G, L209P, L209S, L209V, Q210P, Q210T, Q210W, S211I, S211L, S211R, S211V, G212A, G212P, G212R, G212S, A213C, A213E, A213L, A213N, A213P, A213Q, A213R/S345G, A213S, A213T/W271K, A213V, G214K, G214L, G214T, G214V, N215K, N215M, N215P, N215R, N215R/W271R, N215W, M216P, A217G, A217L, A217P, A217R, A217R/A231V, A217S, A217V, A217W, T224I/P268S/I372F, A249V/F284P, A269N, A269V, V270I, V270I/V470M, V270R, W271A, W271K, W271L, W271P, W271Q/A416V, W271S, W271T, A276F, G277M, G278H, G278S, S279C, S279E, S279G, S279L/V280G/L282M, S279V, V280E, V280G, V280S, L281P, L281V, L281Y/D374N, L282A, L282C, L282Q, L282R, L282S, L282T, L282W, P283C, P283D, P283K, P283R/A429V, P283T, P283V, P283Y, F284C, F284T, F284T/P438T, F284V, A285L, A285M, A285P, P286V, L311I, T317C, T317P, Y320A, Y320F, Y320G, Y320G/F323S, Y320S, Y320S/F323S/I372A, Y320S/I372A/V376G, Y320S/V376G/F377V, Y320W, R321L, R321S, F323C, F323I, F323R, F323Y, L324A, I372A/V376A, I372L, T373G, V376A, V376G, V376L, V376M, F377L, F377W, F377Y, P405D, P420G, D427A, R428V и A429L, причем аминокислоты пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую замену в положении 282, причем положение пронумеровано согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления замена в положении 282 является заменой на алифатическую, неполярную, основную, полярную или ароматическую аминокислоту. Кроме того, в некоторых дополнительных вариантах осуществления замена выбрана из X282T, X282G, X282A, X282V, X282M, X282C, X282W, X282Q, X282S, X282T и X282R.

[0019] Настоящим изобретением также предоставляются полинуклеотидные последовательности, кодирующие по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, включающую полипептидную последовательность, которая на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO:8, или ее функциональный фрагмент, причем сконструированная карбоксиэстераза содержит по крайней мере одну замену или совокупность замен в своей полипептидной последовательности, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют сконструированные карбоксиэстеразы, содержащие по крайней мере одну замену или совокупность замен в положениях, выбранных из: 63, 63/65/108, 63/65/108/189, 63/65/108/377, 63/65/282/285/320/323, 63/65/320/323, 63/108, 63/108/282/285/377, 63/108/285/377, 63/108/320/323, 63/189, 63/212/215, 63/212/215/268/269/343, 63/215, 63/215/269, 63/215/270/271, 63/215/343, 63/268/269/270/429, 63/377, 65/69/70/281/372, 65/69/70/372, 65/69/372, 65/70/372, 65/320, 65/320/323, 68, 68/69/189/214, 68/69/189/214/215, 68/69/189/214/215/271, 68/69/189/214/215/271/281/282/343/381, 68/69/189/214/271/280, 68/69/189/214/372, 68/69/189/214/377/381, 68/69/189/271, 68/69/189/271/280/372/381, 68/69/189/280/281/282/372/377, 68/69/189/281/282/372/377/381, 68/69/189/343/381, 68/69/189/372, 68/69/189/381, 68/69/214/215/271, 68/69/214/343, 68/69/215, 68/69/271, 68/69/282/287, 68/69/343/372, 68/108/377, 68/184, 68/184/189, 68/189/271/372, 68/189/343, 68/214/215/271/281/282/372, 68/215/271/343/372/381, 68/215/377, 68/271/372, 68/377, 69, 69/70, 69/70/331/372, 69/70/372, 69/70/459, 69/108, 69/108/270/372/377, 69/108/281/285, 69/110/215/281, 69/189, 69/189/214/271/281/282/343, 69/189/214/343/372, 69/189/215/343, 69/189/271, 69/189/271/281/282, 69/189/271/343, 69/189/271/343/381, 69/189/280/282/343/372/381, 69/189/281/373, 69/189/282, 69/189/343/381, 69/189/372, 69/189/372/377, 69/189/377, 69/212/213/215/280/281, 69/214/215/271/372/377/381, 69/214/271/282, 69/214/271/343, 69/215, 69/215/269/270/377, 69/215/271/280/281/282, 69/215/271/282, 69/215/271/372, 69/215/285/317, 69/215/323, 69/215/343, 69/215/343/372/381, 69/271, 69/271/372, 69/282, 69/282/343/372, 69/285/373, 69/372, 70, 70/212, 108, 108/189, 108/189/282/285/320, 108/189/320, 108/189/377, 108/215, 108/215/377, 108/269/270, 108/270, 108/282/285/377, 108/285, 108/320/323, 108/377, 126, 126/184/213/280/281/285/320, 126/184/213/372, 126/189/285/372, 126/215, 126/372, 181/215, 189, 189/214, 189/214/215/271/282, 189/215, 189/215/249/277, 189/215/271/281/282/377, 189/215/343/372, 189/270/285, 189/270/372, 189/280/282, 189/320/377, 189/343, 189/343/377, 189/372/377, 189/377, 189/381, 213/215/320, 214/215/271, 214/215/271/377, 214/271, 214/280/282/343/377/381, 215, 215/249/280/281/285/372, 215/271/372, 215/280/281/285/372, 215/281/285/372, 215/281/285/373, 215/281/373, 215/285, 215/285/317, 215/285/346, 215/285/445, 215/320, 215/320/372, 215/323, 215/372, 215/372/377, 215/373, 215/377, 215/381, 249/377, 269/270/281/372/377, 270/377, 271, 271/343, 271/343/372, 271/343/372/381, 280/285/372, 281/372, 282/285/320/323, 285/323, 320, 343/372, 372, 372/377, 372/381, 373 и 377, причем положения аминокислот пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую по крайней мере одну замену или совокупность замен, выбранную из: 63A, 63A/189A, 63A/215R/343V, 63R, 63R/65G/108G, 63R/65G/108G/189L, 63R/65G/108G/377I, 63R/65G/282A/285L/320W/323I, 63R/65G/320W/323I, 63R/108G, 63R/108G/282A/285L/377L, 63R/108G/285L/377I, 63R/108G/320W/323C, 63R/377I, 63T/215R, 63Y, 63Y/189L, 63Y/212P/215R, 63Y/212P/215R/268A/269N/343V, 63Y/215P/269N, 63Y/215R, 63Y/215R/270I/271S, 63Y/268A/269N/270I/429V, 65G/320W, 65G/320W/323I, 65W/69L/372L, 65W/69M/70A/281P/372L, 65W/69W/70L/372L, 65W/70L/372M, 68P, 68P/69L/189E/214R/271Y/280G, 68P/69L/189E/214R/372L, 68P/69L/189I/214R/215P/271Y, 68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L, 68P/69L/189Q/214R, 68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L, 68P/69L/215P, 68P/69L/271Y, 68P/69L/282C/287I, 68P/69L/343V/372L, 68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L, 68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y, 68P/69W/189E/343V/381L, 68P/69W/189I/214R/215P, 68P/69W/189I/214R/377Y/381L, 68P/69W/189I/271Y, 68P/69W/189I/372L, 68P/69W/189I/381L, 68P/69W/214R/215P/271Y, 68P/69W/214R/343V, 68P/69W/215P, 68P/108G/377L, 68P/184S, 68P/184S/189E, 68P/189I/271Y/372L, 68P/189I/343V, 68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L, 68P/215P/271Y/343V/372L/381L, 68P/215P/377L, 68P/271Y/372L, 68P/377L, 69F/108G/270E/372L/377L, 69F/189L, 69F/215K, 69F/215K/269L/270I/377L, 69F/215R, 69F/285L/373G, 69L, 69L/70L/331Q/372M, 69L/189E/271Y/281P/282A, 69L/189I, 69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V, 69L/189I/271Y/343V/381L, 69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L, 69L/189I/282A, 69L/189Q/377Y, 69L/215P/271Y/280G/281P/282C, 69L/215P/271Y/282A, 69L/215P/271Y/372L, 69L/215P/343V/372L/381L, 69L/215R/285P/317P, 69L/271Y, 69L/271Y/372L, 69L/282C/343V/372L, 69L/372L, 69M/70A/372M, 69W, 69W/70L, 69W/70L/372M, 69W/70L/459R, 69W/108S, 69W/189E/214R/343V/372L, 69W/189E/271Y/343V, 69W/189E/372L, 69W/189I, 69W/189I/215P/343V, 69W/189I/271Y, 69W/189I/343V/381L, 69W/189Q/372L/377Y, 69W/212A/213L/215R/280G/281P, 69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L, 69W/214R/271Y/282A, 69W/214R/271Y/343V, 69W/215K/343V, 69W/215P, 69W/215R, 69W/215R/323Y, 69W/282A, 69W/372M, 69Y/108G/281P/285P, 69Y/110A/215R/281P, 69Y/189L/281P/373G, 70L, 70L/212P, 108G, 108G/189I/282A/285L/320W, 108G/189L, 108G/189L/320W, 108G/189L/377I, 108G/215K, 108G/215P/377L, 108G/269L/270E, 108G/270E, 108G/282A/285L/377L, 108G/285L, 108G/320W/323I, 108G/377I, 108G/377L, 126C, 126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G, 126C/184S/213S/372L, 126C/189I/285L/372L, 126C/215P, 126C/372L, 181L/215P, 189E/372L/377Y, 189I, 189I/214R/215P/271Y/282G, 189I/215K, 189I/215P/343V/372L, 189I/215R/249T/277M, 189I/270E/285L, 189I/270E/372L, 189I/280G/282A, 189I/320W/377I, 189I/343V, 189I/377I, 189L, 189Q, 189Q/214R, 189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y, 189Q/343V, 189Q/343V/377Y, 189Q/381L, 213S/215P/320G, 214R/215P/271Y, 214R/215P/271Y/377Y, 214R/271Y, 214R/280G/282A/343V/377Y/381L, 215K, 215K/281P/285L/372L, 215K/281P/373G, 215K/285L/317P, 215K/285L/445L, 215K/323Y, 215K/372L, 215K/372L/377L, 215K/373G, 215P, 215P/271Y/372L, 215P/320G, 215P/320G/372L, 215P/372L, 215P/372L/377L, 215P/377L, 215P/381L, 215R, 215R/249T/280G/281P/285L/372L, 215R/280G/281P/285L/372L, 215R/281P/285L/373G, 215R/285P, 215R/320G, 215R/372L, 215W, 215W/285L/346S, 215W/285P, 215W/373G, 249T/377L, 269L/270E/281P/372L/377L, 270E/377L, 271Y, 271Y/343V, 271Y/343V/372L, 271Y/343V/372L/381L, 280G/285L/372L, 281P/372L, 282A/285L/320W/323I, 285L/323I, 320W, 343V/372L, 372L, 372L/377L, 372L/381L, 372M, 373G и 377L, причем положения аминокислот пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую по крайней мере одну замену или совокупность замен, выбранную из: P63A, P63A/M189A, P63A/N215R/A343V, P63R, P63R/Y65G/A108G, P63R/Y65G/A108G/M189L, P63R/Y65G/A108G/F377I, P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I, P63R/Y65G/Y320W/F323I, P63R/A108G, P63R/A108G/T282A/A285L/F377L, P63R/A108G/A285L/F377I, P63R/A108G/Y320W/F323C, P63R/F377I, P63T/N215R, P63Y, P63Y/M189L, P63Y/G212P/N215R, P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V, P63Y/N215P/A269N, P63Y/N215R, P63Y/N215R/V270I/W271S, P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V, Y65G/Y320W, Y65G/Y320W/F323I, Y65W/I69L/I372L, Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L, Y65W/I69W/G70L/I372L, Y65W/G70L/I372M, A68P, A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G, A68P/I69L/M189E/G214R/I372L, A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y, A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L, A68P/I69L/M189Q/G214R, A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L, A68P/I69L/N215P, A68P/I69L/W271Y, A68P/I69L/T282C/V287I, A68P/I69L/A343V/I372L, A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L, A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y, A68P/I69W/M189E/A343V/A381L, A68P/I69W/M189I/G214R/N215P, A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L, A68P/I69W/M189I/W271Y, A68P/I69W/M189I/I372L, A68P/I69W/M189I/A381L, A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y, A68P/I69W/G214R/A343V, A68P/I69W/N215P, A68P/A108G/F377L, A68P/E184S, A68P/E184S/M189E, A68P/M189I/W271Y/I372L, A68P/M189I/A343V, A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L, A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L, A68P/N215P/F377L, A68P/W271Y/I372L, A68P/F377L, I69F/A108G/V270E/I372L/F377L, I69F/M189L, I69F/N215K, I69F/N215K/A269L/V270I/F377L, I69F/N215R, I69F/A285L/T373G, I69L, I69L/G70L/P331Q/I372M, I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A, I69L/M189I, I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V, I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L, I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L, I69L/M189I/T282A, I69L/M189Q/F377Y, I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C, I69L/N215P/W271Y/T282A, I69L/N215P/W271Y/I372L, I69L/N215P/A343V/I372L/A381L, I69L/N215R/A285P/T317P, I69L/W271Y, I69L/W271Y/I372L, I69L/T282C/A343V/I372L, I69L/I372L, I69M/G70A/I372M, I69W, I69W/G70L, I69W/G70L/I372M, I69W/G70L/G459R, I69W/A108S, I69W/M189E/G214R/A343V/I372L, I69W/M189E/W271Y/A343V, I69W/M189E/I372L, I69W/M189I, I69W/M189I/N215P/A343V, I69W/M189I/W271Y, I69W/M189I/A343V/A381L, I69W/M189Q/I372L/F377Y, I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P, I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L, I69W/G214R/W271Y/T282A, I69W/G214R/W271Y/A343V, I69W/N215K/A343V, I69W/N215P, I69W/N215R, I69W/N215R/F323Y, I69W/T282A, I69W/I372M, I69Y/A108G/L281P/A285P, I69Y/T110A/N215R/L281P, I69Y/M189L/L281P/T373G, G70L, G70L/G212P, A108G, A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W, A108G/M189L, A108G/M189L/Y320W, A108G/M189L/F377I, A108G/N215K, A108G/N215P/F377L, A108G/A269L/V270E, A108G/V270E, A108G/T282A/A285L/F377L, A108G/A285L, A108G/Y320W/F323I, A108G/F377I, A108G/F377L, R126C, R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G, R126C/E184S/A213S/I372L, R126C/M189I/A285L/I372L, R126C/N215P, R126C/I372L, V181L/N215P, M189E/I372L/F377Y, M189I, M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G, M189I/N215K, M189I/N215P/A343V/I372L, M189I/N215R/A249T/G277M, M189I/V270E/A285L, M189I/V270E/I372L, M189I/V280G/T282A, M189I/Y320W/F377I, M189I/A343V, M189I/F377I, M189L, M189Q, M189Q/G214R, M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y, M189Q/A343V, M189Q/A343V/F377Y, M189Q/A381L, A213S/N215P/Y320G, G214R/N215P/W271Y, G214R/N215P/W271Y/F377Y, G214R/W271Y, G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L, N215K, N215K/L281P/A285L/I372L, N215K/L281P/T373G, N215K/A285L/T317P, N215K/A285L/V445L, N215K/F323Y, N215K/I372L, N215K/I372L/F377L, N215K/T373G, N215P, N215P/W271Y/I372L, N215P/Y320G, N215P/Y320G/I372L, N215P/I372L, N215P/I372L/F377L, N215P/F377L, N215P/A381L, N215R, N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L, N215R/V280G/L281P/A285L/I372L, N215R/L281P/A285L/T373G, N215R/A285P, N215R/Y320G, N215R/I372L, N215W, N215W/A285L/G346S, N215W/A285P, N215W/T373G, A249T/F377L, A269L/V270E/L281P/I372L/F377L, V270E/F377L, W271Y, W271Y/A343V, W271Y/A343V/I372L, W271Y/A343V/I372L/A381L, V280G/A285L/I372L, L281P/I372L, T282A/A285L/Y320W/F323I, A285L/F323I, Y320W, A343V/I372L, I372L, I372L/F377L, I372L/A381L, I372M, T373G и F377L, причем положения аминокислот пронумерованы согласно SEQ ID NO:8.

[0020] Настоящим изобретением также предоставляются полинуклеотидные последовательности, кодирующие по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу или ее функциональный фрагмент, при этом полинуклеотидная последовательность на по крайней мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131,133, 135, 137 и/или 139.

[0021] Настоящим изобретением предоставляются, кроме того, полинуклеотидные последовательности, кодирующие сконструированные карбоксиэстеразы, предоставленные здесь, причем полинуклеотидная последовательность функционально связана с контролирующей последовательностью. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности оптимизированы в отношении частоты использования кодонов.

[0022] Настоящим изобретением также предоставляются экспрессионные векторы, содержащие по крайней мере одну полинуклеотидную последовательность, кодирующую сконструированную карбоксиэстеразу, предоставленную здесь. Кроме того, настоящим изобретением предоставляются клетки-хозяева, содержащие по крайней мере один экспрессионный вектор, предоставленный здесь. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением также предоставляются клетки-хозяева, содержащие по крайней мере одну полинуклеотидную последовательность, кодирующую по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, предоставленную здесь.

[0023] Настоящим изобретением также предоставляются способы получения сконструированной карбоксиэстеразы в клетке-хозяине, включающие культивирование клетки-хозяина, содержащей экспрессионный вектор, содержащий по крайней мере один полинуклеотид, кодирующий по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, в подходящих условиях, так что продуцируется по крайней мере одна сконструированная карбоксиэстераза. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают выделение по крайней мере одной сконструированной карбоксиэстеразы из культуры и/или клетки-хозяина. В некоторых дополнительных вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию очистки по крайней мере одной сконструированной карбоксиэстеразы.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0024] Настоящим изобретением предоставляются сконструированные карбоксиэстеразы (ЕС 3.1.1), обладающие улучшенными неприродными свойствами по сравнению со встречающимися в природе ферментами карбоксиэстеразами дикого типа (WT), а также полинуклеотиды, кодирующие сконструированные ферменты карбоксиэстеразы, клетки-хозяева, способные экспрессировать сконструированные ферменты карбоксиэстеразы, и способы применения сконструированных ферментов карбоксиэстераз для реакций амидирования.

[0025] Переключение функции фермента и объема субстратов для фермента осуществимо, поскольку было обнаружено, что активные центры фермента способны катализировать несколько различных химических реакций при помощи одной аминокислотной мутации (смотрите Rauwerdink and Kazluaskas, ACS Cat., 5: 6153-6176 [2015]). Для увеличения функциональности карбоксиэстеразы и объема субстратов карбоксиэстеразы дикого типа подвергали направленной эволюции. Полученные варианты обладали улучшенными способностями к образованию амидных связей с использованием разнообразного множества пар аминов и эфиров карбоновых кислот в качестве субстратов (смотрите схему 1 ниже). Сконструированные карбоксиэстеразы обладали активностью не только в водных системах, но также были активными в присутствии органических сорастворителей и даже почти абсолютных концентрациях органического растворителя (например, ~98% в объемном отношении), как здесь описано. Кроме того, иммобилизация этих сконструированных карбоксиэстераз облегчает непрерывные поточные операции для получения амидов, помогает в очистке конечного продукта в виде амида, а также повышает эффективность и уменьшают общую стоимость операций амидирования.

[0026] Настоящим изобретением предоставляются новые сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы вместе с соответствующими им полинуклеотидными последовательностями и способами применения, которые демонстрируют общее образование амидной связи (смотрите схему 1 ниже). В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды обладают модифицированными свойствами, которые расширяют функциональность и объем активности этих ферментов по сравнению со встречающейся в природе карбоксиэстеразой Thermobifida fusca (T. fusca) дикого типа (SEQ ID NO:2). Улучшенные свойства карбоксиэстеразы включают, но без ограничения этим: устойчивость к растворителю, ферментативную активность, региоспецифичность, стереоизбирательность, пониженную токсичность для клеток-хозяев, термостойкость, устойчивость к рН, объем субстратов и/или пониженное ингибирование субстратом или продуктом. Настоящим изобретением также предоставляются полинуклеотиды, которые были улучшены для облегчения экспрессии желаемых полипептидов в неприродных организмах-хозяевах (например, E.coli).

[0027] В некоторых вариантах осуществления полипептиды карбоксиэстеразы, предоставленные здесь, обладают модифицированными свойствами, которые расширяют функциональность и объем активности этих ферментов по сравнению со встречающейся в природе карбоксиэстеразой Geobacillus stearothermophilus дикого типа (SEQ ID NO:138). В некоторых случаях эти полипептиды представляют собой ферменты карбоксиэстеразы, которые усилены по сравнению с карбоксиэстеразой Mycobacterium tuberculosis дикого типа (SEQ ID NO:140). Кроме того, в некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются полинуклеотиды, которые были улучшены для облегчения экспрессии желаемых полипептидов в неприродных организмах-хозяевах (например, E.coli).

[0028] Улучшенные свойства предоставленных вариантов карбоксиэстеразы связаны с сконструированными способными к амидированию полипептидами, включающими отличия остатков в конкретных положениях остатков по сравнению с эталонной последовательностью карбоксиэстеразы T. fusca или другим указанным сконструированным полипептидом, способными к амидированию, таким как последовательность SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления отличия остатков присутствуют в по крайней мере одном из следующих положений аминокислот: X39, X62, X63, X64, X65, X66, X68, X69, X70, X71, X77, X103, X104, X105, X107, X108, X109, X110, X111, X113, X114, X115, X117, X118, X119, X126, X147, X153, X164, X174, X181, X183, X184, X185, X186, X187, X188, X189, X190, X209, X210, X211, X212, X213, X214, X215, X216, X217, X224, X231, X249, X263, X268, X269, X270, X271, X276, X277, X278, X279, X280, X281, X282, X283, X284, X285, X286, X287, X311, X317, X320, X321, X323, X324, X331, X343, X345, X346, X349, X372, X373, X374, X376, X377, X381, X405, X416, X420, X427, X428, X429, X438, X445, X459 и X470.

[0029] В некоторых вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы, предоставленные здесь, характеризуются как проявляющие повышенную термостойкость по сравнению с полипептидом дикого типа в тех же условиях реакции. Сконструированные карбоксиэстеразы способны опосредовать превращение в виде амидирования (смотрите схему 1 ниже), на что указывает продолжающееся образование продуктов при более высоких температурах и в течение более длительного времени, чем в случае карбоксиэстеразы WT. В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы сохраняют или имеют повышенную активность в присутствии более высоких концентраций сложного эфира (I) и/или амина (II), например 300 мМ изобутиламина, в качестве субстратов. В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы сохраняют или имеют повышенную активность в условиях с различными уровнями рН (например, рН 9,0) по сравнению с карбоксиэстеразой WT. В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды с повышенной термостойкостью, устойчивостью к рН и/или допустимым уровнем субстрата включают и аминокислотную последовательность, которая на по крайней мере 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична эталонной последовательности SEQ ID NO:2 и/или 8.

[0030] В некоторых вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы способны к увеличениям биокаталитической активности по превращению субстратного соединения(ей) в продукт(ы) (смотрите схему 1 ниже) в по крайней мере приблизительно 1,2 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 150 раз, 500 раз или более относительно активности карбоксиэстеразы дикого типа (SEQ ID NO:2) или эталонной сконструированной карбоксиэстеразы (SEQ ID NO:8) в подходящих условиях реакции. В некоторых вариантах осуществления эти увеличения ферментативной активности распространяются на связанные с этим увеличения термостойкости, стереоизбирательности, стереоспецифичности, региоспецифичности, устойчивости к растворителю, устойчивости к рН и/или связывания субстрата или уменьшения ингибирования субстратом и/или продуктом.

[0031] В некоторых вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы характеризуются активностью на различных структурно различных субстратах в виде эфиров карбонов кислот (I) или аминов (II). В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды способны к биокаталитическому превращению сложных эфиров (метилового эфира N, N-диэтиламиноглицина, этилбензоата, этилацетата, этилового эфира пиразин-2-карбоновой кислоты, этилового эфира 1H-индол-4-карбоновой кислоты, метилфенилацетата) и аминов (н-бутиламина, изобутиламина, анилина, бензиламина, 2,6-диметиланилина, трет-бутиламина, N’-трет-бутоксикарбонилбензгидразида, 4-метилпиперидина, O-трет-бутилгидроксиламина, 2,6-диметиланилина) или стереоизбирательному превращение (S)-(-)-α-метилбензиламина, (R)-(+)-α-метилбензиламина в соответствующий продукт в виде амида с большей скоростью, чем полипептиды WT с SEQ ID NO:2 и/или сконструированный полипептид с SEQ ID NO:8

[0032] В некоторых вариантах осуществления улучшенный сконструированный вариант полипептида включает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88. 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138 или 140. В некоторых вариантах осуществления ферменты карбоксиэстеразы, предоставленные здесь, получают путем мутагенеза гена, кодирующего сконструированный полипептид карбоксиэстеразу, который на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичен аминокислотной последовательности встречающейся в природе карбоксиэстеразы T. fusca (SEQ ID NO:2).

[0033] В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения варианты полипептида карбоксиэстеразы кодируются полинуклеотидами или полинуклеотидами, которые гибридизуются с извлечением таких полинуклеотидов в очень жестких условиях, как здесь предусмотрено. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды включают промоторы и/или другие регуляторные элементы, применимые для экспрессии кодируемой сконструированной карбоксиэстеразы, и могут использовать кодоны, оптимизированные для специфических экспрессионных систем.

[0034] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие улучшенные ферменты карбоксиэстеразы, включают последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137 и 139.

[0035] В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются клетки-хозяева, содержащие полинуклеотиды и/или экспрессионные векторы, предоставленные здесь. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева представляют собой T. fusca, тогда как в некоторых альтернативных вариантах осуществления они представляют собой другие организмы (например, E.coli). Клетки-хозяева используются для экспрессии закодированных полинуклеотидов для получения сконструированных карбоксиэстераз и выделения сконструированных карбоксиэстераз, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева используются для непосредственного превращения субстрата(ов) в желаемый продукт(ы).

[0036] В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы проведения схемы 1 реакции (представленной ниже) с использованием любого из сконструированных ферментов карбоксиэстераз, предоставленных здесь. В некоторых вариантах осуществления способы включают контактирование или инкубацию субстратов в виде эфира карбоновой кислоты (I) и амина (II) со сконструированным полипептидом карбоксиэстеразой по настоящему изобретению в условиях реакции, подходящих для превращения субстратов в соответствующий продукт в виде амида, превращая тем самым субстраты в конечные соединения. Независимо от того, проводится ли этот способ с целыми клетками, клеточными экстрактами или очищенными ферментами карбоксиэстеразами, может использоваться один фермент карбоксиэстераза, или, альтернативно, находят применение смеси по крайней мере двух ферментов карбоксиэстераз.

Схема 1

[0037] Сконструированные карбоксиэстеразы по настоящему изобретению способны превращать разные комбинации субстратов в виде эфиров карбоновых кислот (в схеме 1, I) и аминов (II) в соответствующие им продукты в виде амидов (III). Объем доступных субстратов в виде эфиров карбоновых кислот может быть подробно рассмотрен с учетом R¹ и R² в формуле (I). В некоторых вариантах осуществления функциональность групп в R¹ и R² охватывает различные компоненты, от атома водорода до компонента в виде алкила, алкенила, алкинила, алкокси, карбокси, гетероалкила, гетероалкенила, гетероалкинила, карбоксиалкила, аминоалкила, галогеналкила, алкитиоалкила циклоалкила, арила, арилалкила, гетероциклоалкила, гетероарила и гетероарилалка, за исключением того, что R² не может быть водородом. В некоторых дополнительных вариантах осуществления выбранная функциональность в положениях R³ и R⁴ амина (II) состоит из атома водорода, алкила, алкенила, алкинила, алкокси, карбокси, гетероалкила, гетероалкенила, гетероалкинила, карбоксиалкила, аминоалкила, галогеналкила, алкитиоалкила, циклоалкила, арила, арилалкила, гетероциклоалкила, гетероарила и гетероарилалкила. В некоторых дополнительных вариантах осуществления выбранные R¹ и R² могут быть связаны с образованием 3-членного-10-членного кольца с оговоркой, что группы в R³ и R⁴ отдельно выбираются из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, карбокси, гетероалкила, гетероалкенила, гетероалкинила, карбоксиалкила, аминоалкила, галогеналкила, алкитиоалкила, циклоалкила, арила, арилалкила, гетероциклоалкила, гетероарила, гетероарилалкила, и могут также быть связаны с образованием 3-членного-10-членного кольца; и, необязательно, R¹ или R² могут быть связаны через привязь в виде алкила, алкенила, алкинила, алкокси, карбокси, гетероалкила, гетероалкенила, гетероалкинила, карбоксиалкила, аминоалкила, галогеналкила, алкитиоалкила, циклоалкила, арила, арилалкила, гетероциклоалкила, гетероарила или гетероарилалкила с R³ и R⁴. Процесс амидирования протекает в виде соединения (I),

где R¹ и R², имеют значения, определенные выше, и соединения формулы (II),

где R³ и R⁴ имеют значения, определенные выше, и сконструированного полипептида, обладающего способностью к амидированию, в подходящих условиях реакции. В некоторых вариантах осуществления способов реакции, предоставленных здесь, карбоксиэстераза T. fusca дикого типа (SEQ ID NO:2) или эталонный сконструированный полипептид (например, SEQ ID NO:8), производные карбоксиэстеразы, представленные здесь, способны образовывать первичные и вторичные амиды, соответствующие общей формуле (III). Предоставленные здесь сконструированные ферменты, способные к амидированию, (например, сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы с четными идентификаторами последовательностей SEQ ID NO:4-136) находят применение в качестве биокатализаторов вышеуказанной реакции (схема 1).

Определения

[0038] В связи с настоящим изобретением технические и научные термины, используемые здесь в описаниях, будут иметь значения, в которых они обычно понимаются специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники, если специально не определено иначе. Соответственно, подразумевается, что следующие термины имеют следующие значения. Все патенты США и опубликованные заявки на патенты США, включая все последовательности, раскрытые в таких патентах и заявках на патенты, упомянутые здесь, прямо включены посредством ссылки. Если не указано иное, осуществление на практике настоящего изобретения включает традиционные методы, обычно используемые в молекулярной биологии, ферментации, микробиологии и смежных областях, которые известны специалистам в данной области техники. Если здесь не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, в котором они обычно понимаются специалистом со средним уровнем компетентности в области техники, к которой относится это изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые здесь описаны, могут использоваться при осуществлении на практике или проверке настоящего изобретения, описаны предпочтительные способы и материалы. Действительно, подразумевается, что настоящее изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными здесь, поскольку они могут варьироваться в зависимости от контекста, в котором они используются. Заголовки, представленные здесь, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения.

[0039] Тем не менее, для облегчения понимания настоящего изобретения ниже определен ряд терминов. Диапазоны числовых значений включают числа, определяющие диапазон. Таким образом, подразумевается, что каждый числовой диапазон, раскрытый здесь, охватывает каждый более узкий числовой диапазон, который попадает в такой более широкий числовой диапазон, как если бы такие более узкие числовые диапазоны были все указаны здесь в прямой форме. Также подразумевается, что каждое максимальное (или минимальное) ограничение числового значения, раскрытое здесь, включает каждое более низкое (или более высокое) числовое ограничение, как если бы такие более низкие (или более высокие) числовые ограничения были в прямой форме указаны здесь.

[0040] Используемый здесь термин «содержащий» («включающий») и слова одного с ним корня используются в их инклюзивном смысле (т.е. эквивалентны термину «включающий» и словам одного с ним корня).

[0041] Как используется здесь и в прилагаемой формуле изобретения, единственное число «а», «an» и «the» включает ссылку на множественное число, если контекст явно не предписывает иное. Таким образом, например, ссылка на «клетку-хозяина» включает множество таких клеток-хозяев.

[0042] Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записываются слева направо в направлении 5'-3', а аминокислотные последовательности записываются слева направо в направлении от N-конца к C-концу, соответственно.

[0043] Представленные здесь заголовки не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения, которые могут иметься при ссылке на описание в целом. Соответственно, термины, определенные ниже, более полно определяются при ссылке на описание в целом.

[0044] Используемый здесь термин «карбоксиэстеразы» определяется как ферменты, которые по природе обладают каталитической активностью в отношении гидролиза эфиров карбоновых кислот, что приводит к образованию органической кислоты и спирта.

[0045] Используемый здесь термин «амидирование» или синтез амида относится к процессу образования амидной связи, в результате чего образуется карбоксамид (органический амид).

[0046] Используемые здесь термины «белок», «полипептид» и «пептид» используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из по крайней мере двух аминокислот, ковалентно связанных амидной связью, независимо от длины или посттрансляционной модификации (например, гликозилирования, фосфорилирования, липидирования, миристилирования, убиквитинирования и т.д.). В это определение включены D- и L-аминокислоты и смеси D- и L-аминокислот.

[0047] Используемый здесь термин «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» относится к двум или более нуклеозидам, которые ковалентно связаны друг с другом. Полинуклеотид может полностью состоять из рибонуклеозидов (т.е. РНК), полностью состоять из 2'-дезоксирибонуклеозидов (т.е. ДНК) или смесей рибо- и 2'-дезоксирибонуклеозидов. Хотя нуклеозиды обычно связаны друг с другом с помощью стандартных фосфодиэфирных связей, полинуклеотиды могут включать одну или более нестандартных связей. Полинуклеотид может быть одноцепочечным или двухцепочечным или может включать как одноцепочечные, так и двухцепочечные участки. Более того, хотя полинуклеотид обычно состоит из встречающихся в природе кодирующих нуклеиновых оснований (т.е. аденина, гуанина, урацила, тимина и цитозина), он может включать одно или более модифицированных и/или синтетических нуклеиновых оснований (например, инозин, ксантин, гипоксантин и т.д.). В одном варианте осуществления настоящего изобретения такие модифицированные или синтетические нуклеиновые основания будут кодирующими нуклеиновыми основаниями.

[0048] Используемый здесь термин «кодирующая последовательность» относится к той части нуклеиновой кислоты (например, гену), которая кодирует аминокислотную последовательность белка.

[0049] Используемый здесь термин «встречающийся в природе», «дикий тип» и «WT» относится к форме, встречающейся в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, встречающаяся в природе или дикого типа, представляет собой последовательность, присутствующую в организме, которая может быть выделена из источника в природе и которая не была преднамеренно модифицирована в результате осуществляемой человеком манипуляции.

[0050] Используемый здесь термин «не встречающийся в природе», «сконструированный» или «рекомбинантный» при использовании в настоящем изобретении (в отношении, например, клетки, нуклеиновой кислоты или полипептида) относится к материалу или материалу, соответствующему природной или нативной форме материала, который был модифицирован таким образом, что иначе он бы не существовал в природе, или является идентичным ему, но произведен или получен из синтетических материалов и/или в результате манипулирования с использованием рекомбинантных методов. Неограничивающие примеры включают, помимо прочего, рекомбинантные клетки, экспрессирующие гены, которые не обнаруживаются в природной (нерекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют нативные гены, которые иным образом экспрессируются на другом уровне.

[0051] Используемый здесь термин «процент идентичности последовательностей», «процент идентичности» и «процент идентичности» относятся к сравнениям между полинуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями и определяются путем сравнения двух оптимально совмещенных последовательностей в окне сравнения, причем часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пропуски) по сравнению с эталонной последовательностью для оптимального совмещения двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения числа положений, в которых либо идентичное основание нуклеиновой кислоты, либо идентичный аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, или основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток совмещают с пропуском для получения числа совпадающих положений, деления числа совпавших положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. Определение оптимального совмещения и процента идентичности последовательностей выполняют с использованием алгоритмов BLAST и BLAST2.0 (смотрите, например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 [1990]; и Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 3389-3402 [1977]). Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST общедоступно через веб-сайт Национального центра биотехнологической информации.

[0052] Вкратце, анализы BLAST включают сначала идентификацию пар последовательностей с высокой оценкой (HSP) путем идентификации коротких слов по длине в последовательности запроса, которые либо соответствуют, либо удовлетворяют некоторому положительному значению порогового показателя T после совмещения со словом той же длины в последовательности базы данных. T упоминается как порог показателя сходства слов (Altschul, et al., выше). Эти начальные выявления совпадения слов действуют в качестве затравок для начала поиска, чтобы найти более длинные HSP, содержащие их. Совпадения слов затем расширяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличен совокупный показатель совмещения. Совокупные показатели рассчитываются с использованием для нуклеотидных последовательностей параметров M (вознаграждающего очка за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафного очка за несовпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей для расчета совокупного показателя используется матрица замен. Расширение совпадений слов в каждом направлении останавливают, когда совокупный показатель совмещения падает на величину X от своего максимального достигнутого значения; совокупный показатель уменьшается до нуля или ниже из-за накопления одного или более совмещений остатков с отрицательным показателем; или достигнут конец любой последовательности. Параметры W, T и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость совмещения. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину слова (W), равную 11, ожидание (E), равное 10, M=5, N = -4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует в качестве значений по умолчанию длину слова (W), равную 3, ожидание (E), равное 10, и матрицу замен BLOSUM62 (смотрите, например, Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915 [1989]).

[0053] В данной области техники доступны и известны многочисленные другие алгоритмы, которые функционируют аналогично BLAST в предоставлении процента идентичности двух последовательностей. Оптимальное совмещение последовательностей для сравнения может быть проведено с использованием любого подходящего метода, известного в данной области техники (например, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith и (Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 [1981]); с помощью алгоритма совмещения на основе гомологии Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443 [1970]), с помощью метода поиска сходства Pearson и Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]); и/или с помощью внедрений этих алгоритмов с использованием компьютерной техники [GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ GCG Wisconsin]) или путем визуального осмотра с использованием методов, широко известных в данной области техники. Кроме того, для определения совмещения последовательностей и процента идентичности последовательностей могут использоваться программы BESTFIT или GAP в пакете программного обеспечения GCG Wisconsin (Accelrys, Madison WI) с использованием предоставленных параметров по умолчанию.

[0054] Как здесь используется, «эталонная последовательность» относится к определенной последовательности, с которой сравнивается другая последовательность. Эталонная последовательность может быть подмножеством большей последовательности, например, сегментом полноразмерного гена или полипептидной последовательности. Как правило, длина эталонной последовательности составляет по крайней мере 20 нуклеотидов или аминокислотных остатков, по крайней мере 25 остатков, по крайней мере 50 остатков или равна всей длине нуклеиновой кислоты или полипептида. Поскольку каждый из двух полинуклеотидов или полипептидов может (1) включать последовательность (т.е. часть полной последовательности), которая является сходной между двумя последовательностями, и (2) может включать, кроме того, последовательность, которая отличается между двумя последовательностями, сравнения последовательностей между двумя (или более) полинуклеотидами или полипептидами обычно выполняют путем сравнения последовательностей двух полинуклеотидов в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных участков сходства последовательностей. Термин «эталонная последовательность», как подразумевается, не ограничивается последовательностями дикого типа и может включать сконструированные или измененные последовательности. Например, в некоторых вариантах осуществления «эталонная последовательность» может представлять собой предварительно сконструированную или измененную аминокислотную последовательность.

[0055] Используемый здесь термин «окно сравнения» относится к концептуальному сегменту из по крайней мере приблизительно 20 следующих друг за другом положений нуклеотидов или аминокислотных остатков, причем последовательность может сравниваться с эталонной последовательностью из по крайней мере из 20 следующих друг за другом нуклеотидов или аминокислот, и причем часть последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пропуски) 20 процентов или меньше по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавления или делеции) для оптимального совмещения двух последовательностей. Окно сравнения может быть длиннее, чем 20 следующих друг за другом остатков, и включает необязательно 30, 40, 50, 100 остатков или является более длинным окном.

[0056] Используемый здесь термин «соответствующий…», «согласно…» или «применительно к…» при использовании в контексте нумерации данной аминокислотной или полинуклеотидной последовательности относится к нумерации остатков в указанной эталонной последовательности, когда данная аминокислотная или полинуклеотидная последовательность сравнивается с эталонной последовательностью. Другими словами, номер остатка или положение остатка данного полимера обозначается относительно эталонной последовательности, а не по фактическому числовому положению остатка в данной аминокислотной или полинуклеотидной последовательности. Например, данная аминокислотная последовательность, такая как последовательность сконструированной карбоксиэстеразы, может быть совмещена с эталонной последовательностью путем введения пропусков для оптимизации совпадения остатков между двумя последовательностями. В этих случаях, несмотря на наличие пропусков, нумерация остатка в данной аминокислотной или полинуклеотидной последовательности осуществляется относительно эталонной последовательности, с которой она была совмещена. Как здесь используется, ссылка на положение остатка, например «Xn», как дополнительно описано ниже, должна толковаться как ссылка на «остаток, соответствующий…», если специально не указано иное. Так, например, «X94» относится к любой аминокислоте в положении 94 в полипептидной последовательности (например, SEQ ID NO:2, 4, 10, 26 или 42).

[0057] Используемый здесь термин «стереоизбирательность» относится к преимущественному образованию в химической или ферментативной реакции одного стереоизомера относительно другого стереоизомера или другой совокупности стереоизомеров. Стереоизбирательность может быть частичной, когда образование одного стереоизомера предпочтительнее другого, или она может быть полной, когда образуется только один стереоизомер. Когда стереоизомеры являются энантиомерами, стереоизбирательность называется энантиоизбирательностью, долей (обычно указываемой в процентах) одного энантиомера в смеси обоих энантиомеров. В данной области техники она часто альтернативно указывается (обычно в процентах) в виде энантиомерного избытка (ee), рассчитываемого из нее по формуле [основной энантиомер - неосновной энантиомер]/[основной энантиомер+неосновной энантиомер]. Когда стереоизомеры представляют собой диастереоизомеры, стереоизбирательность называется диастереоизбирательность, доля (обычно указываемая в процентах) одного диастереомера в смеси двух диастереомеров часто альтернативно указывается в виде диастереомерного избытка (де). Энантиомерный избыток и диастереомерный избыток являются типами стереомерного избытка. Также следует понимать, что стереоизбирательность не ограничивается отдельными стереоизомерами и может быть описана для совокупностей стереоизомеров.

[0058] Используемый здесь термин «очень стереоизбирательная» относится к химической или ферментативной реакции, которая способна превращать субстрат в соответствующий ему продукт в виде хирального амида с составляющим по крайней мере приблизительно 75% стереомерным избытком.

[0059] Как здесь используется, «повышенная ферментативная активность» и «повышенная активность» относится к улучшенному свойству сконструированного фермента, которое может быть в виде увеличения удельной активности (например, произведенного продукта/время/вес белка) или увеличения процента превращения субстрата в продукт (например, процента превращения исходного количества субстрата в продукт в течение определенного периода времени с использованием определенного количества карбоксиэстеразы) по сравнению с эталонным ферментом. Примерные способы определения ферментативной активности представлены в разделе «Примеры». Может быть затронуто любое свойство, относящееся к ферментативной активности, включая классические свойства фермента K_m, V_max или k_cat, изменения которых могут привести к увеличению ферментативной активности. Карбоксиэстеразная активность может быть определена с помощью любого из стандартных анализов, используемых для измерения карбоксиэстераз, таких как изменение концентрации субстрата или продукта. Сравнение ферментативных активностей проводят с использованием определенного препарата фермента, определенного анализа в заданных условиях и одного или более определенных субстратов, как дополнительно подробно здесь описано. Как правило, когда сравнивают ферменты в клеточных лизатах, определяют количество клеток и количество анализируемого белка, а также используют идентичные экспрессионные системы и идентичные клетки-хозяева для минимизации вариаций в количестве фермента, продуцируемого клетками-хозяевами и присутствующего в лизатах.

[0060] Используемый здесь термин «превращение» относится к ферментативному превращению субстрата в соответствующий продукт.

[0061] Используемый здесь термин «процент превращения» относится к проценту субстрата, который превращается в продукт в течение определенного периода времени при определенных условиях. Так, например, «ферментативная активность» или «активность» полипептида карбоксиэстеразы может быть представлена в виде «процента превращения» субстрата в продукт.

[0062] Используемый здесь термин «региоспецифичность» относится к химическим реакциям, в которых один структурный изомер образуется исключительно тогда, когда другие изомеры также теоретически возможны.

[0063] Используемые здесь термины «термостойкий» или «теплоустойчивый» используются взаимозаменяемо для обозначения полипептида, который устойчив к инактивации при воздействии ряда температурных условий (например, 40-80^οС) в течение некоторого периода времени (например, 0,5-24 часа) по сравнению с необработанным ферментом, таким образом сохраняя некоторый уровень остаточной активности (например, более 60-80%) после воздействия повышенных температур.

[0064] Используемый здесь термин «устойчивый к растворителю» относится к способности полипептида сохранять схожую активность (например, более чем, например, от 60% до 80%) после воздействия различных концентраций (например, 5-99%) растворителя (например, изопропилового спирта, тетрагидрофурана, 2-метилтетрагидрофурана, ацетона, толуола, бутилацетата, метил-трет-бутилового эфира и т.д.) в течение некоторого периода времени (например, 0,5-24 часов) по сравнению с необработанным ферментом.

[0065] Используемый здесь термин «отличие аминокислот» или «отличие остатков» относится к отличию аминокислотного остатка в положении полипептидной последовательности от аминокислотного остатка в соответствующем положении в эталонной последовательности. Положения отличий аминокислот, как правило, обозначаются здесь как «Xn», где n относится к соответствующему положению в эталонной последовательности, на которой основано отличие остатка. Например, «отличие остатка в положении X40 по сравнению с SEQ ID NO:2» относится к отличию аминокислотного остатка в положении полипептида, соответствующем положению 40 в SEQ ID NO:2. Таким образом, если эталонный полипептид с SEQ ID NO:2 имеет гистидин в положении 40, тогда «отличие остатка в положении X40 по сравнению с SEQ ID NO:2» относится к аминокислотной замене любого остатка, отличного от гистидина, в положении полипептида, соответствующем положению 40 в SEQ ID NO:2. В большинстве случаев здесь отличие конкретного аминокислотного остатка в положении указывается как «XnY», где «Xn» определяет соответствующее положение, как описано выше, а «Y» представляет собой однобуквенный идентификатор аминокислоты, находящейся в сконструированном полипептиде (т.е. другой остаток, чем в эталонном полипептиде). В некоторых случаях настоящим изобретением также предоставляются отличия конкретных аминокислот, указываемые с помощью общепринятых обозначений «AnB», где A представляет собой однобуквенный идентификатор остатка в эталонной последовательности, «n» является номером положения остатка в эталонной последовательности, а B представляет собой однобуквенный идентификатор замены остатка в последовательности сконструированного полипептида. В некоторых случаях полипептид по настоящему изобретению может включать по крайней мере одно отличие аминокислотного остатка от эталонной последовательности, которое указывается с помощью перечня определенных положений, в которых существуют отличия остатков от эталонной последовательности. В некоторых вариантах осуществления, в которых более чем одна аминокислота может быть использована в определенном положении остатка полипептида, различные аминокислотные остатки, которые могут использоваться, разделены «/» (например, X192A/G). Настоящее изобретение включает сконструированные полипептидные последовательности, включающие по крайней мере одно отличие аминокислоты, которое включает либо/или как консервативную, либо/так и неконсервативную аминокислотную замену. Аминокислотные последовательности конкретных рекомбинантных полипептидов карбоангидраз, включенные в список последовательностей настоящего изобретения, включают инициирующий остаток метионина (М) (т.е. М представляет остаток в положении 1). Однако специалист в данной области техники понимает, что этот инициирующий остаток метионина может быть удален с помощью биологического аппарата процессинга, такого как клетка-хозяин или система трансляции in vitro, для получения зрелого белка, в котором отсутствует инициирующий остаток метионина, но в остальном свойства фермента сохраняются. Следовательно, используемый здесь термин «отличие аминокислотного остатка от SEQ ID NO:2 в положении Xn» может относиться к положению «Xn» или к соответствующему положению (например, положению (X-1)n) в эталонной последовательности, которая была подвергнута процессингу таким образом, чтобы не было инициирующего метионина.

[0066] Используемое здесь выражение «консервативные аминокислотные замены» относится к взаимозаменяемости остатков, имеющих сходные боковые цепи, и, таким образом, обычно включает замену аминокислоты в полипептиде аминокислотами внутри одного и того же или схожего определенного класса аминокислот. В качестве примера, а не ограничения, в некоторых вариантах осуществления аминокислота с алифатической боковой цепью заменяется другой алифатической аминокислотой (например, аланином, валином, лейцином и изолейцином); аминокислота с гидроксильной боковой цепью заменяется другой аминокислотой с гидроксильной боковой цепью (например, серином и треонином); аминокислота, имеющая ароматические боковые цепи, заменяется другой аминокислотой, имеющей ароматическую боковую цепь (например, фенилаланином, тирозином, триптофаном и гистидином); аминокислота с основной боковой цепью заменяется другой аминокислотой с основной боковой цепью (например, лизином и аргинином); аминокислота с кислотной боковой цепью заменяется другой аминокислотой с кислотной боковой цепью (например, аспарагиновой кислотой или глютаминовой кислотой); и/или гидрофобная или гидрофильная аминокислота заменяется другой гидрофобной или гидрофильной аминокислотой, соответственно. Соответствующая классификация любой аминокислоты или остатка будет очевидна для специалистов в данной области техники, особенно в свете подробного описания изобретения, представленного здесь. Приведенные в качестве примера консервативные замены представлены в таблице 1.

Таблица 1. Приведенные в качестве примера консервативные аминокислотные замены
Остаток	Возможные консервативные замены
A, L, V, I	Другие алифатические (A, L, V, I) Другие неполярные (A, L, V, I, G, M)
G, M	Другие неполярные (A, L, V, I, G, M)
D, E	Другие кислотные (D, E)
K, R	Другие основные (K, R)
P	Ни одна
N, Q, S, T	Другие полярные
H, Y, W, F	Другие ароматические (H, Y, W, F)
C	Ни одна

[0067] Используемое здесь выражение «неконсервативная замена» относится к замене аминокислоты в полипептиде аминокислотой со значительно отличающими свойствами боковой цепи. В случае неконсервативных замен могут использоваться аминокислоты между определенными группами, а не внутри их, и это влияет на (a) структуру пептидного остова в области замены (например, пролин вместо глицина), (b) заряд или гидрофобность или (c) основную часть боковой цепи. В качестве примера, а не ограничения, примерная неконсервативная замена может представлять собой кислотную аминокислоту, замененную основной или алифатической аминокислотой; ароматическую аминокислоту, замененную небольшой аминокислотой; и гидрофильную аминокислоту, замененную гидрофобной аминокислотой.

[0068] Используемый здесь термин «делеция» относится к модификации полипептида путем удаления одной или более аминокислот из эталонного полипептида. Делеции могут включать удаление 1 или более аминокислот, 2 или более аминокислот, 5 или более аминокислот, 10 или более аминокислот, 15 или более аминокислот или 20 или более аминокислот, до 10% от общего количества аминокислот или до 20% от общего количества аминокислот, составляющих полипептид, при сохранении ферментативной активности и/или при сохранении улучшенных свойств сконструированного фермента. Делеции могут быть направлены на внутренние части и/или концевые части полипептида. В различных вариантах осуществления делеция может включать непрерывный сегмент или может быть прерывистой.

[0069] Используемый здесь термин «вставка» относится к модификации полипептида путем добавления одной или более аминокислот к эталонному полипептиду. В некоторых вариантах осуществления улучшенные сконструированные ферменты карбоксиэстеразы содержат вставки одной или более аминокислот во встречающийся в природе полипептид карбоксиэстеразу, а также вставки одной или более аминокислот в сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы. Вставки могут быть во внутренних частях полипептида или на C- или N-конце. Используемые здесь термин «вставки» включает слитые белки, как известно в данной области техники. Вставка может представлять собой непрерывный сегмент аминокислот или отделяться одной или более аминокислотами во встречающемся в природе полипептиде.

[0070] Термин «совокупность аминокислотных замен» или «совокупность замен» относится к группе аминокислотных замен в полипептидной последовательности по сравнению с эталонной последовательностью. Совокупность замен может содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления совокупность замен относится к совокупности аминокислотных замен, которая присутствуют в любом из вариантов карбоксиэстераз, включенных в таблицы, представленные в разделе «Примеры».

[0071] Используемый здесь термин «фрагмент» относится к полипептиду, который имеет N-концевую и/или C-концевую делецию, но в котором оставшаяся аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям в последовательности. Фрагменты могут, как правило, содержать приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98% или приблизительно 99% полноразмерного полипептида карбоксиэстеразы, например, полипептида с SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления фрагмент является «биологически активным» (т.е. он проявляет ту же ферментативную активность, что и полноразмерная последовательность).

[0072] Термины «функциональный фрагмент» или «биологически активный фрагмент», используемые взаимозаменяемо, здесь относятся к полипептиду, который имеет N-концевую и/или C-концевую делецию(и) и/или внутренние делеции, но в котором оставшаяся аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям в последовательности, с которой он сравнивается (например, сконструированным полноразмерным ферментом T. fusca по настоящему изобретению), и который сохраняет по существу всю активность полноразмерного полипептида.

[0073] Используемый здесь термин «выделенный полипептид» относится к полипептиду, который по существу отделен от других примесей, которые сопровождают его в природе (например, белка, липидов и полинуклеотидов). Термин охватывает полипептиды, которые были отделены или очищены от встречающейся в природе среды или системы экспрессии для них (например, клетки-хозяина или системы синтеза in vitro). Улучшенные ферменты карбоксиэстеразы могут присутствовать в клетке, присутствовать в клеточной среде или могут быть получены в различных формах, таких как лизаты или выделенные препараты. Как таковые, в некоторых вариантах осуществления, сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы по настоящему изобретению могут представлять собой выделенный полипептид.

[0074] Используемый здесь термин «по существу чистый полипептид» относится к композиции, в которой тип полипептида является преобладающим присутствующим типом (т.е. в молярном или весовом отношении он более часто встречается, чем любые другие отдельные макромолекулярные частицы в композиции), и, как правило, представляет собой по существу очищенную композицию, когда целевой тип включают по крайней мере приблизительно 50 процентов от присутствующих макромолекулярных частиц в молях или вес.%. Как правило, по существу чистая, содержащая сконструированный полипептид карбоксиэстеразу композиция будет содержать приблизительно 60% или более, приблизительно 70% или более, приблизительно 80% или более, приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более или приблизительно 99% от всех макромолекулярных частиц в молях или вес.%, присутствующих в композиции. Разновидности растворителей, небольшие молекулы (<500 Дальтон) и элементарные ионы не считаются макромолекулами. В некоторых вариантах осуществления выделенный улучшенный полипептид карбоксиэстераза представляет собой по существу чистую полипептидную композицию.

[0075] Используемый здесь термин «гетерологичный» применительно к нуклеиновой кислоте или полипептиду относится к последовательности, которая обычно не экспрессируется и не секретируется организмом (например, организмом дикого типа). В некоторых вариантах осуществления термин охватывает последовательность, которая включает две или более подпоследовательности, которые не обнаруживаются в тех же отношениях друг с другом, в которых они обычно встречаются в природе, или рекомбинантно сконструирована таким образом, что уровень ее экспрессии или физическая связь с другими нуклеиновыми кислотами или другими молекулами в клетке или структуре, как правило, не встречается в природе. Например, обычно рекомбинантно получают гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую две или более последовательностей из неродственных генов, размещенным не встречающимся в природе образом (например, открытую рамку считывания (ORF) нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, функционально связанную с промоторной последовательностью, вставленной в экспрессионную кассету, такую как вектор). В некоторых вариантах осуществления «гетерологичный полинуклеотид» относится к любому полинуклеотиду, который вводится в клетку-хозяина с помощью лабораторных методов, и включает полинуклеотиды, которые удаляют из клетки-хозяина, подвергают лабораторным манипуляциям, и затем повторно вводят в клетку-хозяина.

[0076] Используемый здесь термин «оптимизированный в отношении частоты использования кодонов» относится к заменам кодонов полинуклеотида, кодирующего белок, кодонами, которые преимущественно используются в конкретном организме, так что кодируемый белок эффективно экспрессируется в представляющем интерес организме. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие ферменты карбоксиэстеразы, могут быть оптимизированы в отношении частоты использования кодонов для оптимальной продукции из организма-хозяина, выбранного для экспрессии.

[0077] Используемый здесь термин «контролирующая последовательность» согласно определению здесь включает все компоненты, которые необходимы или полезны для экспрессии полинуклеотида и/или полипептида по настоящему изобретению. Каждая контролирующая последовательность может быть природной или чужеродной для представляющего интерес полинуклеотида. Такие контролирующие последовательности включают, но без ограничения этим, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промотор, сигнальную пептидную последовательность и терминатор транскрипции.

[0078] Используемый здесь термин «функционально связанный» определяется здесь как конфигурация, в которой контролирующая последовательность размещена надлежащим образом (т.е. находится в функциональной связи) в положении относительно представляющего интерес полинуклеотида, так что контролирующая последовательность управляет или регулирует экспрессией(ю) полинуклеотида и/или полипептида, представляющего интерес.

[0079] Как здесь используются, «подходящие условия реакции» относятся к тем условиям в биокаталитическом реакционном растворе (например, диапазонам загрузки фермента, загрузки субстрата, температуры, pH, буферов, сорастворителей и т.д.), при которых полипептид карбоксиэстераза по настоящему изобретению способен превращать субстратное соединение в соединение продукта (например, превращать одно соединение в другое соединение). Примерные «подходящие условия реакции» представлены в настоящем изобретении и проиллюстрированы примерами.

[0080] Используемый здесь термин «загрузка», такой как «загрузка соединения», «загрузка фермента» или «загрузка субстрата», относится к концентрации или количеству компонента в реакционной смеси в начале реакции.

[0081] Используемый здесь термин «субстрат» в связи с процессом, опосредуемым биокатализатором, относится к соединению или молекуле, на которое воздействует биокатализатор.

[0082] Используемый здесь термин «продукт» в связи с процессом, опосредуемым биокатализатором, относится к соединению или молекуле, возникающему в результате действия биокатализатора.

[0083] Используемый здесь термин «равновесие» относится к процессу, приводящему к равновесной концентрации химических частиц в химической или ферментативной реакции (например, взаимопревращению двух видов A и B), включая взаимопревращение стереоизомеров, что определяется по константе скорости прямой реакции и константе скорости обратной реакции: химической или ферментативной реакции.

[0084] Используемый здесь термин «алкил» относится к насыщенным углеводородным группам с 1-18 атомами углерода, включительно, либо с прямой, либо с разветвленной цепью, более предпочтительно с 1-8 атомами углерода, включительно, и наиболее предпочтительно с 1-6 атомами углерода, включительно. Алкил с указанным числом атомов углерода указывается в скобках (например, (C1-C4 алкил относится к алкилу с 1-4 атомами углерода).

[0085] Используемый здесь термин «алкенил» относится к группам с 2-12 атомами углерода, включительно, либо с прямой, либо с разветвленной цепью, содержащим по крайней мере одну двойную связь, но необязательно содержащим более одной двойной связи.

[0086] Используемый здесь термин «алкинил» относится к группам с 2-12 атомами углерода, включительно, либо с прямой, либо с разветвленной цепью, содержащим по крайней мере одну тройную связь, но необязательно содержащим более одной тройной связи, и дополнительно необязательно содержащим один или более фрагментов с двойной связью.

[0087] Используемый здесь термин «гетероалкил», «гетероалкенил» и гетероалкинил» относится к алкилу, алкенилу и алкинилу, определенному здесь, в котором один или более атомов углерода каждый независимо замещен одинаковыми или разными гетероатомами или гетероатомными группами. Гетероатомы и/или гетероатомные группы, которые могут замещать атомы углерода, включают, но без ограничения этим, -O-, -S-, -S-O-, -NRα-, -PH-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O) NRα-, -S(O)2NRα- и т.п., включая их комбинации, причем каждый Rα независимо выбран из водорода, алкила, гетероалкила, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, и гетероарила.

[0088] Используемый здесь термин «алкокси» относится к группе -ORβ, где Rβ представляет собой алкильную группу, определенную выше, включая необязательно замещенные алкильные группы, также определенные здесь.

[0089] Используемый здесь термин «арил» относится к ненасыщенной ароматической карбоциклической группе с 6-12 атомами углерода, содержащей одно кольцо (например, фенил) или более конденсированных колец (например, нафтил или антрил). Приведенные в качестве примера арилы включают фенил, пиридил, нафтил и т.п.

[0090] Используемый здесь термин «амино» относится к группе -NH2. Замещенный амино относится к группе NHRδ, NRδRδ и NRδRδRδ, где каждый Rδ независимо выбран из замещенного или незамещенного алкила, циклоалкила, циклогетероалкила, алкокси, арила, гетероарила, гетероарилалкила, ацила, алкоксикарбонила, сульфанила, тионила, сульфонила и т.п. Типичные аминогруппы включают, но без ограничения этим, диметиламино, диэтиламино, триметиламмоний, триэтиламмоний, метилсульфониламино, фуранил-окси-сульфамино и т.п.

[0091] Используемый здесь термин «оксо» относится к =О.

[0092] Используемый здесь термин «окси» относится к двухвалентной группе -O-, которая может иметь различные заместители для образования различных оксигрупп, включая простые и сложные эфиры.

[0093] Используемый здесь термин «карбокси» относится к -COOH.

[0094] Используемый здесь термин «карбонил» относится к -C(O)-, который может иметь множество заместителей для образования различных карбонильных групп, включая кислоты, галогенангидриды кислот, альдегиды, амиды, сложные эфиры и кетоны.

[0095] Используемый здесь термин алкилоксикарбонил» относится к -C(O)ORε, где Rε представляет собой алкильную группу, определенную здесь, которая может быть необязательно замещенной.

[0096] Используемый здесь термин «аминокарбонил» относится к -C(O)NH2. Замещенный аминокарбонил относится к C(O)NRδRδ, где аминогруппа NRδRδ имеет значение, определенное здесь.

[0097] Используемый здесь термин «галоген» и «галоген» относится к фтору, хлору, брому и йоду.

[0098] Используемый здесь термин «гидрокси» относится к -ОН.

[0099] Используемый здесь термин «циано» относится к -CN.

[0100] Используемый здесь термин «гетероарил» относится к ароматической гетероциклической группе с 1-10 атомами углерода, включительно, и 1-4 гетероатомами, включительно, выбранными из кислорода, азота и серы, внутри кольца. Такие гетероарильные группы могут иметь одно кольцо (например, пиридил или фурил) или более конденсированных колец (например, индолизинил или бензотиенил).

[0101] Используемый здесь термин «гетероарилалкил» относится к алкилу, замещенному гетероарилом, (т.е. гетероарилалкильным группам), предпочтительно имеющему от 1 до 6 атомов углерода, включительно, в алкильной части и от 5 до 12 атомов, включительно, в кольце в гетероарильной части. Примерами таких гетероарилалкильных групп являются пиридилметил и т.п.

[0102] Используемый здесь термин «гетероарилалкенил» относится к алкенилу, замещенному гетероарилом, (т.е. гетероарилалкенильным группам), предпочтительно имеющему от 2 до 6 атомов углерода, включительно, в алкенильной части и от 5 до 12 атомов в кольце, включительно, в гетероарильной части.

[0103] Используемый здесь термин «гетероарилалкинил» относится к алкинилу, замещенному гетероарилом, (т.е. гетероарилалкинильным группам), предпочтительно имеющему от 2 до 6 атомов углерода, включительно, в алкинильной части и от 5 до 12 атомов в кольце, включительно, в гетероарильной части.

[0104] Используемый здесь термин «гетероцикл», «гетероциклический» и взаимозаменяемо «гетероциклоалкил» относится к насыщенной или ненасыщенной группе, имеющей одно или множественные конденсированные кольца, от 2 до 10 атомов углерода в кольце, включительно, и от 1 до 4 гетероатомов, включительно, выбранных из азота, серы или кислорода, внутри кольца. Такие гетероциклические группы могут иметь одно кольцо (например, пиперидинил или тетрагидрофурил) или множественные конденсированные кольца (например, индолинил, дигидробензофуран или хинуклидинил). Примеры гетероциклов включают, но без ограничения этим, фуран, тиофен, тиазол, оксазол, пиррол, имидазол, пиразол, пиридин, пиразин, пиримидин, пиридазин, индолизин, изоиндол, индол, индазол, пурин, хинолизин, изохинолин, хинолин, фталазин, нафтилпиридин, хиноксалин, хиназолин, циннолин, птеридин, карбазол, карболин, фенантридин, акридин, фенантролин, изотиазол, феназин, изоксазол, феноксазин, фенотиазин, имидазолидин, имидазолин, пиперидин, пиперазин, пирролидин, индолин и т.п.

[0105] Используемый здесь термин «членное кольцо» предназначен для охвата любой циклической структуры. Число, предшествующее термину «членный», обозначает число атомов скелета, которые составляют кольцо. Так, например, циклогексил, пиридин, пиран и тиопиран являются 6-членными кольцами, а циклопентил, пиррол, фуран и тиофен являются 5-членными кольцами.

[0106] Если не указано иное, положения, занимаемые водородом в вышеуказанных группах, могут быть дополнительно замещены заместителями, например, но без ограничения этим, гидрокси, оксо, нитро, метокси, этокси, алкокси, замещенным алкокси, трифторметокси, галогеналкокси, фтором, хлором, бромом, йодом, галогеном, метилом, этилом, пропилом, бутилом, алкилом, алкенилом, алкинилом, замещенным алкилом, трифторметилом, галогеналкилом, гидроксиалкилом, алкоксиалкилом, тио, алкилтио, ацилом, карбокси, алкоксикарбонилом, карбоксамидо, замещенным карбоксамидо, алкилсульфонилом алкилтионилом, алкилсульфониламино, сульфонамидо, замещенным сульфонамидо, циано, амино, замещенным амино, алкиламино, диалкиламино, аминоалкилом, ациламино, амидино, амидоксимо, гидроксамоилом, фенилом, арилом, замещенным арилом, арилокси, арилалкилом, арилалкенилом, арилалкинилом, пиридилом, имидазолилом, гетероарилом, замещенным гетероарилом, гетероарилокси, гетероарилалкилом, гетероарилалкенилом, гетероарилалкинилом, циклопропилом, циклобутилом, циклопентилом, циклогексилом, циклоалкилом, циклоалкенилом, циклоалкилалкилом, замещенным циклоалкилом, циклоалкилокси, пирролидинилом, пиперидинилом, морфолино, гетероциклом, (гетероцикл)окси и (гетероцикл)алкилом; и предпочтительными гетероатомами являются кислород, азот и сера. Понятно, что, когда у этих заместителей есть свободные валентности, они могут быть дополнительно замещены алкильными, циклоалкильными, арильными, гетероарильными и/или гетероциклическими группами, что, когда эти свободные валентности есть у углерода, они могут быть дополнительно замещены галогеном и связанными с кислородом, азотом или серой заместителями, и, когда существует множество таких свободных валентностей, эти группы могут быть соединены с образованием кольца либо путем прямого образования связи, либо путем образования связей с новым гетероатомом, предпочтительно кислородом, азотом или серой. Кроме того, следует понимать, что вышеуказанные замены могут быть осуществлены при условии, что замена водорода заместителем не приводит к неприемлемой нестабильности молекул по настоящему изобретению и является химически обоснованной в других отношениях.

[0107] Используемый здесь термин «необязательный» и «необязательно» означает, что описанное событие или обстоятельство впоследствии может возникнуть или может не возникнуть, и что настоящее описание включает случаи, когда событие или обстоятельство возникает, и случаи, когда оно не возникает. Специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники будет понятно, что в отношении любой молекулы, описанной как содержащая один или более необязательных заместителей, подразумеваются включение только стерически осуществимых и/или синтетически возможных соединений.

[0108] Используемый здесь термин «необязательно замещенный» относится ко всем последующим модификаторам в термине или ряде химических групп. Например, в случае термина «необязательно замещенный арилалкил», «алкильная» часть и «арильная» часть молекулы могут быть или могут не быть замещенными, а в случае ряда «необязательно замещенный алкил, циклоалкил, арил и гетероарил» алкильная, циклоалкильная, арильная и гетероарильная группы, независимо от других, могут быть или могут не быть замещенными.

[0109] Используемый здесь термин «защитная группа» относится к группе атомов, которые маскируют, уменьшают или препятствует реакционную способность(и) функциональной группы при присоединении к реакционноспособной функциональной группе в молекуле. Как правило, защитная группа может быть селективно удалена по желанию в ходе синтеза. Примеры защитных групп хорошо известны в данной области техники. Функциональные группы, которые могут иметь защитную группу, включают, но без ограничения этим, гидрокси, амино и карбоксигруппы. Репрезентативные аминозащитные группы включают, но без ограничения этим, формил, ацетил, трифторацетил, бензил, бензилоксикарбонил («CBZ»), трет-бутоксикарбонил («Boc»), триметилсилил («TMS»), 2-триметилсилилэтансульфонил («SES»), тритил и замещенные тритильные группы, аллилоксикарбонил, 9-флуоренилметилоксикарбонил («FMOC»), нитро-вератрилоксикарбонил («NVOC») и т.п. Репрезентативные защитные группы для гидроксильной группы включают, но без ограничения этим, группы, в которых гидроксильная группа является либо ацилированной (например, метиловые и этиловые эфиры, ацетатные или пропионатные группы или гликолевые эфиры), либо алкилированной, например бензиловые и тритиловые эфиры, а также алкиловые эфиры, тетрагидропираниловые эфиры, триалкилсилиловые эфиры (например, группы TMS или TIPPS) и аллиловые эфиры. Другие защитные группы можно найти в ссылках, отмеченных здесь.

Сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы

[0110] Настоящим изобретением предоставляются сконструированные полипептиды, обладающие карбоксиэстеразной активностью, (также называемые здесь «сконструированными полипептидами карбоксиэстеразами»), применимые для реакций амидирования. Соответственно, в одном аспекте настоящим изобретением предоставляются сконструированные полипептиды, обладающие карбоксиэстеразной активностью, которые способны превращать субстратное соединение(я) в соединение(я) продукта, как показано в таблице 3.1 в примере 3. Кроме того, настоящим изобретением предоставляются полинуклеотиды, кодирующие сконструированные полипептиды, связанные с ними векторы и клетки-хозяева, содержащие полинуклеотиды, способы получения сконструированных полипептидов и способы применения сконструированных полипептидов, включая подходящие условия реакции.

[0111] Сконструированные полипептиды по настоящему изобретению представляют собой не встречающиеся в природе карбоксиэстеразы, сконструированные для обладания улучшенными ферментативными свойствами (например, повышенной стереоизбирательностью) по сравнению с полипептидом карбоксиэстеразой T. fusca дикого типа (№ доступа в GenBank: WP_0l 1292850.1; SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления различные сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы, предоставленные здесь, проявляют улучшенные ферментативные свойства по сравнению с другими сконструированными эталонными полипептидами карбоксиэстеразами, предоставленными здесь. В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды по настоящему изобретению представляют собой не встречающиеся в природе карбоксиэстеразы, сконструированные для обладания улучшенными ферментативными свойствами (например, повышенной термостойкостью) по сравнению с полипептидом карбоксиэстеразой дикого типа G. stearothermophilus (№ доступа в GenBank: WP_0330155113); SEQ ID NO:138). В некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные полипептиды представляют собой не встречающиеся в природе карбоксиэстеразы, сконструированные для обладания улучшенными ферментативными свойствами (например, повышенной термостойкостью) по сравнению с полипептидом карбоксиэстеразой дикого типа M. tuberculosis (№ доступа в GenBank: WP_003407276; SEQ ID NO:140).

[0112] В некоторых вариантах осуществления сконструированные варианты карбоксиэстеразы, предоставленные здесь, включают полипептидные последовательности, которые на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичны SEQ ID NO:2, эталонной сконструированной карбоксиэстеразе (SEQ ID NO:8), или их функциональный фрагмент, причем сконструированная карбоксиэстераза содержит по крайней мере одну замену или совокупность замен в полипептидной последовательности, и причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие карбоксиэстеразной активностью, включают полипептиды, имеющие замены аминокислот, приведенные здесь (смотрите, например, таблицы 8.1 и 11.).

[0113] Настоящим изобретением предоставляются сконструированные карбоксиэстеразы, включающие полипептидные последовательности, которые на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичны SEQ ID NO:2, или их функциональный фрагмент, причем сконструированные карбоксиэстеразы содержат по крайней мере одну замену или совокупность замен в своих полипептидных последовательностях, и причем положения аминокислот в полипептидных последовательностях пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены в положениях, выбранных из: 39, 39/323, 62, 62/117, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 71/263, 77, 77/184, 103, 103/147, 104, 104/429, 105, 107, 107/185, 108, 109, 109/117, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 118/269, 118/349, 119, 126, 147, 153, 153/215, 164, 164/271, 174, 174/282, 183, 184, 184/249, 185, 186, 187, 188, 190, 209, 210, 211, 212, 213, 213/271, 213/345, 214, 215, 215/271, 216, 217, 217/231, 224, 224/268/372, 231, 249, 249/284, 263, 268, 269, 270, 270/470, 271, 271/416, 276, 277, 278, 279, 279/280/282, 280, 281, 281/374, 282, 283, 283/429, 284, 284/438, 285, 286, 311, 317, 320, 320/323, 320/323/372, 320/372/376, 320/376/377, 321, 323, 324, 345, 349, 372, 372/376, 373, 374, 376, 377, 405, 416, 420, 427, 428, 429, 438 и 470, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены, выбранные из: 39/323, 62/117, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 71/263, 77/184, 103, 103/147, 104, 104/429, 105, 107, 107/185, 108, 109/117, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 118/269, 118/349, 119, 126, 153, 153/215, 164/271, 174/282, 183, 184, 184/249, 185, 186, 187, 188, 190, 209, 210, 211, 212, 213, 213/271, 213/345, 214, 215, 215/271, 216, 217, 217/231, 224/268/372, 249/284, 269, 270, 270/470, 271, 271/416, 276, 277, 278, 279, 279/280/282, 280, 281, 281/374, 282, 283, 283/429, 284, 284/438, 285, 286, 311, 317, 320, 320/323, 320/323/372, 320/372/376, 320/376/377, 321, 323, 324, 372, 372/376, 373, 376, 377, 405, 420, 427, 428 и 429, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены, выбранные из: 39M/323I, 62H/117G, 63A, 63R, 63T, 63Y, 64A, 64E, 64G, 64I, 64T, 64V, 64W, 65G, 65S, 65T, 65W, 66N, 68L, 68P, 69F, 69G, 69H, 69L, 69V, 69W, 69Y, 70L, 70R, 70T, 70W, 71F, 71G, 71H/263R, 71P, 71R, 71V, 71Y, 77S/184G, 103P, 103R, 103T/147S, 104P, 104Q/429V, 105L, 107D/185W, 107L, 107P, 107S, 108G, 108K, 108Q, 108R, 108S, 108W, 109G/117M, 110A, 110H, 110P, 110S, 111L, 111M, 111R, 111S, 111V, 111W, 113P, 114A, 114H, 114Q, 115H, 115T, 115V, 117A, 117F, 118G/349V, 118I, 118N, 118N/269T, 119G, 119P, 119S, 126C, 153H/215P, 153L, 164R/271T, 174D/282V, 183P, 184F, 184G, 184P, 184S/249T, 184Y, 185A, 185T, 186C, 186G, 186P, 186R, 186T, 187P, 188E, 188G, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190W, 209E, 209G, 209P, 209S, 209V, 210P, 210T, 210W, 211I, 211L, 211R, 211V, 212A, 212P, 212R, 212S, 213C, 213E, 213L, 213N, 213P, 213Q, 213R/345G, 213S, 213T/271K, 213V, 214K, 214L, 214T, 214V, 215K, 215M, 215P, 215R, 215R/271R, 215W, 216P, 217G, 217L, 217P, 217R, 217R/231V, 217S, 217V, 217W, 224I/268S/372F, 249V/284P, 269N, 269V, 270I, 270I/470M, 270R, 271A, 271K, 271L, 271P, 271Q/416V, 271S, 271T, 276F, 277M, 278H, 278S, 279C, 279E, 279G, 279L/280G/282M, 279V, 280E, 280G, 280S, 281P, 281V, 281Y/374N, 282A, 282C, 282Q, 282R, 282S, 282T, 282W, 283C, 283D, 283K, 283R/429V, 283T, 283V, 283Y, 284C, 284T, 284T/438T, 284V, 285L, 285M, 285P, 286V, 311I, 317C, 317P, 320A, 320F, 320G, 320G/323S, 320S, 320S/323S/372A, 320S/372A/376G, 320S/376G/377V, 320W, 321L, 321S, 323C, 323I, 323R, 323Y, 324A, 372A/376A, 372L, 373G, 376A, 376G, 376L, 376M, 377L, 377W, 377Y, 405D, 420G, 427A, 428V и 429L, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены, выбранные из: T39M/F323I, R62H/P117G, P63A, P63R, P63T, P63Y, P64A, P64E, P64G, P64I, P64T, P64V, P64W, Y65G, Y65S, Y65T, Y65W, P66N, A68L, A68P, I69F, I69G, I69H, I69L, I69V, I69W, I69Y, G70L, G70R, G70T, G70W, A71F, A71G, A71H/Q263R, A71P, A71R, A71V, A71Y, F77S/E184G, W103P, W103R, W103T/P147S, I104P, I104Q/A429V, H105L, G107D/S185W, G107L, G107P, G107S, A108G, A108K, A108Q, A108R, A108S, A108W, F109G/P117M, T110A, T110H, T110P, T110S, N111L, N111M, N111R, N111S, N111V, N111W, S113P, G114A, G114H, G114Q, S115H, S115T, S115V, P117A, P117F, V118G/A349V, V118I, V118N, V118N/A269T, Y119G, Y119P, Y119S, R126C, R153H/N215P, R153L, W164R/W271T, G174D/L282V, G183P, E184F, E184G, E184P, E184S/A249T, E184Y, S185A, S185T, A186C, A186G, A186P, A186R, A186T, G187P, A188E, A188G, S190H, S190K, S190L, S190M, S190Q, S190R, S190W, L209E, L209G, L209P, L209S, L209V, Q210P, Q210T, Q210W, S211I, S211L, S211R, S211V, G212A, G212P, G212R, G212S, A213C, A213E, A213L, A213N, A213P, A213Q, A213R/S345G, A213S, A213T/W271K, A213V, G214K, G214L, G214T, G214V, N215K, N215M, N215P, N215R, N215R/W271R, N215W, M216P, A217G, A217L, A217P, A217R, A217R/A231V, A217S, A217V, A217W, T224I/P268S/I372F, A249V/F284P, A269N, A269V, V270I, V270I/V470M, V270R, W271A, W271K, W271L, W271P, W271Q/A416V, W271S, W271T, A276F, G277M, G278H, G278S, S279C, S279E, S279G, S279L/V280G/L282M, S279V, V280E, V280G, V280S, L281P, L281V, L281Y/D374N, L282A, L282C, L282Q, L282R, L282S, L282T, L282W, P283C, P283D, P283K, P283R/A429V, P283T, P283V, P283Y, F284C, F284T, F284T/P438T, F284V, A285L, A285M, A285P, P286V, L311I, T317C, T317P, Y320A, Y320F, Y320G, Y320G/F323S, Y320S, Y320S/F323S/I372A, Y320S/I372A/V376G, Y320S/V376G/F377V, Y320W, R321L, R321S, F323C, F323I, F323R, F323Y, L324A, I372A/V376A, I372L, T373G, V376A, V376G, V376L, V376M, F377L, F377W, F377Y, P405D, P420G, D427A, R428V и A429L, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы содержат замену в положении 282, причем это положение пронумеровано согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления замена в положении 282 является заменой на алифатическую, неполярную, основную, полярную или ароматическую аминокислоту. Кроме того, в некоторых дополнительных вариантах осуществления замена выбрана из: X282T, X282G, X282A, X282V, X282M, X282C, X282W, X282Q, X282S, X282T и X282R.

[0114] Настоящим изобретением также предоставляются сконструированные карбоксиэстеразы, включающие полипептидные последовательности, которые на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности SEQ ID NO:8, или их функциональный фрагмент, причем сконструированные карбоксиэстеразы содержат по крайней мере одну замену или совокупность замен в полипептидных последовательностях, причем положения аминокислот в полипептидных последовательностях пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены в положениях, выбранных из: 63, 63/65/108, 63/65/108/189, 63/65/108/377, 63/65/282/285/320/323, 63/65/320/323, 63/108, 63/108/282/285/377, 63/108/285/377, 63/108/320/323, 63/189, 63/212/215, 63/212/215/268/269/343, 63/215, 63/215/269, 63/215/270/271, 63/215/343, 63/268/269/270/429, 63/377, 65/69/70/281/372, 65/69/70/372, 65/69/372, 65/70/372, 65/320, 65/320/323, 68, 68/69/189/214, 68/69/189/214/215, 68/69/189/214/215/271, 68/69/189/214/215/271/281/282/343/381, 68/69/189/214/271/280, 68/69/189/214/372, 68/69/189/214/377/381, 68/69/189/271, 68/69/189/271/280/372/381, 68/69/189/280/281/282/372/377, 68/69/189/281/282/372/377/381, 68/69/189/343/381, 68/69/189/372, 68/69/189/381, 68/69/214/215/271, 68/69/214/343, 68/69/215, 68/69/271, 68/69/282/287, 68/69/343/372, 68/108/377, 68/184, 68/184/189, 68/189/271/372, 68/189/343, 68/214/215/271/281/282/372, 68/215/271/343/372/381, 68/215/377, 68/271/372, 68/377, 69, 69/70, 69/70/331/372, 69/70/372, 69/70/459, 69/108, 69/108/270/372/377, 69/108/281/285, 69/110/215/281, 69/189, 69/189/214/271/281/282/343, 69/189/214/343/372, 69/189/215/343, 69/189/271, 69/189/271/281/282, 69/189/271/343, 69/189/271/343/381, 69/189/280/282/343/372/381, 69/189/281/373, 69/189/282, 69/189/343/381, 69/189/372, 69/189/372/377, 69/189/377, 69/212/213/215/280/281, 69/214/215/271/372/377/381, 69/214/271/282, 69/214/271/343, 69/215, 69/215/269/270/377, 69/215/271/280/281/282, 69/215/271/282, 69/215/271/372, 69/215/285/317, 69/215/323, 69/215/343, 69/215/343/372/381, 69/271, 69/271/372, 69/282, 69/282/343/372, 69/285/373, 69/372, 70, 70/212, 108, 108/189, 108/189/282/285/320, 108/189/320, 108/189/377, 108/215, 108/215/377, 108/269/270, 108/270, 108/282/285/377, 108/285, 108/320/323, 108/377, 126, 126/184/213/280/281/285/320, 126/184/213/372, 126/189/285/372, 126/215, 126/372, 181/215, 189, 189/214, 189/214/215/271/282, 189/215, 189/215/249/277, 189/215/271/281/282/377, 189/215/343/372, 189/270/285, 189/270/372, 189/280/282, 189/320/377, 189/343, 189/343/377, 189/372/377, 189/377, 189/381, 213/215/320, 214/215/271, 214/215/271/377, 214/271, 214/280/282/343/377/381, 215, 215/249/280/281/285/372, 215/271/372, 215/280/281/285/372, 215/281/285/372, 215/281/285/373, 215/281/373, 215/285, 215/285/317, 215/285/346, 215/285/445, 215/320, 215/320/372, 215/323, 215/372, 215/372/377, 215/373, 215/377, 215/381, 249/377, 269/270/281/372/377, 270/377, 271, 271/343, 271/343/372, 271/343/372/381, 280/285/372, 281/372, 282/285/320/323, 285/323, 320, 343/372, 372, 372/377, 372/381, 373 и 377, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены, выбранные из 63A, 63A/189A, 63A/215R/343V, 63R, 63R/65G/108G, 63R/65G/108G/189L, 63R/65G/108G/377I, 63R/65G/282A/285L/320W/323I, 63R/65G/320W/323I, 63R/108G, 63R/108G/282A/285L/377L, 63R/108G/285L/377I, 63R/108G/320W/323C, 63R/377I, 63T/215R, 63Y, 63Y/189L, 63Y/212P/215R, 63Y/212P/215R/268A/269N/343V, 63Y/215P/269N, 63Y/215R, 63Y/215R/270I/271S, 63Y/268A/269N/270I/429V, 65G/320W, 65G/320W/323I, 65W/69L/372L, 65W/69M/70A/281P/372L, 65W/69W/70L/372L, 65W/70L/372M, 68P, 68P/69L/189E/214R/271Y/280G, 68P/69L/189E/214R/372L, 68P/69L/189I/214R/215P/271Y, 68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L, 68P/69L/189Q/214R, 68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L, 68P/69L/215P, 68P/69L/271Y, 68P/69L/282C/287I, 68P/69L/343V/372L, 68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L, 68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y, 68P/69W/189E/343V/381L, 68P/69W/189I/214R/215P, 68P/69W/189I/214R/377Y/381L, 68P/69W/189I/271Y, 68P/69W/189I/372L, 68P/69W/189I/381L, 68P/69W/214R/215P/271Y, 68P/69W/214R/343V, 68P/69W/215P, 68P/108G/377L, 68P/184S, 68P/184S/189E, 68P/189I/271Y/372L, 68P/189I/343V, 68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L, 68P/215P/271Y/343V/372L/381L, 68P/215P/377L, 68P/271Y/372L, 68P/377L, 69F/108G/270E/372L/377L, 69F/189L, 69F/215K, 69F/215K/269L/270I/377L, 69F/215R, 69F/285L/373G, 69L, 69L/70L/331Q/372M, 69L/189E/271Y/281P/282A, 69L/189I, 69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V, 69L/189I/271Y/343V/381L, 69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L, 69L/189I/282A, 69L/189Q/377Y, 69L/215P/271Y/280G/281P/282C, 69L/215P/271Y/282A, 69L/215P/271Y/372L, 69L/215P/343V/372L/381L, 69L/215R/285P/317P, 69L/271Y, 69L/271Y/372L, 69L/282C/343V/372L, 69L/372L, 69M/70A/372M, 69W, 69W/70L, 69W/70L/372M, 69W/70L/459R, 69W/108S, 69W/189E/214R/343V/372L, 69W/189E/271Y/343V, 69W/189E/372L, 69W/189I, 69W/189I/215P/343V, 69W/189I/271Y, 69W/189I/343V/381L, 69W/189Q/372L/377Y, 69W/212A/213L/215R/280G/281P, 69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L, 69W/214R/271Y/282A, 69W/214R/271Y/343V, 69W/215K/343V, 69W/215P, 69W/215R, 69W/215R/323Y, 69W/282A, 69W/372M, 69Y/108G/281P/285P, 69Y/110A/215R/281P, 69Y/189L/281P/373G, 70L, 70L/212P, 108G, 108G/189I/282A/285L/320W, 108G/189L, 108G/189L/320W, 108G/189L/377I, 108G/215K, 108G/215P/377L, 108G/269L/270E, 108G/270E, 108G/282A/285L/377L, 108G/285L, 108G/320W/323I, 108G/377I, 108G/377L, 126C, 126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G, 126C/184S/213S/372L, 126C/189I/285L/372L, 126C/215P, 126C/372L, 181L/215P, 189E/372L/377Y, 189I, 189I/214R/215P/271Y/282G, 189I/215K, 189I/215P/343V/372L, 189I/215R/249T/277M, 189I/270E/285L, 189I/270E/372L, 189I/280G/282A, 189I/320W/377I, 189I/343V, 189I/377I, 189L, 189Q, 189Q/214R, 189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y, 189Q/343V, 189Q/343V/377Y, 189Q/381L, 213S/215P/320G, 214R/215P/271Y, 214R/215P/271Y/377Y, 214R/271Y, 214R/280G/282A/343V/377Y/381L, 215K, 215K/281P/285L/372L, 215K/281P/373G, 215K/285L/317P, 215K/285L/445L, 215K/323Y, 215K/372L, 215K/372L/377L, 215K/373G, 215P, 215P/271Y/372L, 215P/320G, 215P/320G/372L, 215P/372L, 215P/372L/377L, 215P/377L, 215P/381L, 215R, 215R/249T/280G/281P/285L/372L, 215R/280G/281P/285L/372L, 215R/281P/285L/373G, 215R/285P, 215R/320G, 215R/372L, 215W, 215W/285L/346S, 215W/285P, 215W/373G, 249T/377L, 269L/270E/281P/372L/377L, 270E/377L, 271Y, 271Y/343V, 271Y/343V/372L, 271Y/343V/372L/381L, 280G/285L/372L, 281P/372L, 282A/285L/320W/323I, 285L/323I, 320W, 343V/372L, 372L, 372L/377L, 372L/381L, 372M, 373G и 377L, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления по крайней мере одна замена или совокупность замен в полипептидной последовательности включает замены, выбранные из: P63A, P63A/M189A, P63A/N215R/A343V, P63R, P63R/Y65G/A108G, P63R/Y65G/A108G/M189L, P63R/Y65G/A108G/F377I, P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I, P63R/Y65G/Y320W/F323I, P63R/A108G, P63R/A108G/T282A/A285L/F377L, P63R/A108G/A285L/F377I, P63R/A108G/Y320W/F323C, P63R/F377I, P63T/N215R, P63Y, P63Y/M189L, P63Y/G212P/N215R, P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V, P63Y/N215P/A269N, P63Y/N215R, P63Y/N215R/V270I/W271S, P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V, Y65G/Y320W, Y65G/Y320W/F323I, Y65W/I69L/I372L, Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L, Y65W/I69W/G70L/I372L, Y65W/G70L/I372M, A68P, A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G, A68P/I69L/M189E/G214R/I372L, A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y, A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L, A68P/I69L/M189Q/G214R, A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L, A68P/I69L/N215P, A68P/I69L/W271Y, A68P/I69L/T282C/V287I, A68P/I69L/A343V/I372L, A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L, A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y, A68P/I69W/M189E/A343V/A381L, A68P/I69W/M189I/G214R/N215P, A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L, A68P/I69W/M189I/W271Y, A68P/I69W/M189I/I372L, A68P/I69W/M189I/A381L, A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y, A68P/I69W/G214R/A343V, A68P/I69W/N215P, A68P/A108G/F377L, A68P/E184S, A68P/E184S/M189E, A68P/M189I/W271Y/I372L, A68P/M189I/A343V, A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L, A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L, A68P/N215P/F377L, A68P/W271Y/I372L, A68P/F377L, I69F/A108G/V270E/I372L/F377L, I69F/M189L, I69F/N215K, I69F/N215K/A269L/V270I/F377L, I69F/N215R, I69F/A285L/T373G, I69L, I69L/G70L/P331Q/I372M, I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A, I69L/M189I, I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V, I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L, I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L, I69L/M189I/T282A, I69L/M189Q/F377Y, I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C, I69L/N215P/W271Y/T282A, I69L/N215P/W271Y/I372L, I69L/N215P/A343V/I372L/A381L, I69L/N215R/A285P/T317P, I69L/W271Y, I69L/W271Y/I372L, I69L/T282C/A343V/I372L, I69L/I372L, I69M/G70A/I372M, I69W, I69W/G70L, I69W/G70L/I372M, I69W/G70L/G459R, I69W/A108S, I69W/M189E/G214R/A343V/I372L, I69W/M189E/W271Y/A343V, I69W/M189E/I372L, I69W/M189I, I69W/M189I/N215P/A343V, I69W/M189I/W271Y, I69W/M189I/A343V/A381L, I69W/M189Q/I372L/F377Y, I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P, I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L, I69W/G214R/W271Y/T282A, I69W/G214R/W271Y/A343V, I69W/N215K/A343V, I69W/N215P, I69W/N215R, I69W/N215R/F323Y, I69W/T282A, I69W/I372M, I69Y/A108G/L281P/A285P, I69Y/T110A/N215R/L281P, I69Y/M189L/L281P/T373G, G70L, G70L/G212P, A108G, A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W, A108G/M189L, A108G/M189L/Y320W, A108G/M189L/F377I, A108G/N215K, A108G/N215P/F377L, A108G/A269L/V270E, A108G/V270E, A108G/T282A/A285L/F377L, A108G/A285L, A108G/Y320W/F323I, A108G/F377I, A108G/F377L, R126C, R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G, R126C/E184S/A213S/I372L, R126C/M189I/A285L/I372L, R126C/N215P, R126C/I372L, V181L/N215P, M189E/I372L/F377Y, M189I, M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G, M189I/N215K, M189I/N215P/A343V/I372L, M189I/N215R/A249T/G277M, M189I/V270E/A285L, M189I/V270E/I372L, M189I/V280G/T282A, M189I/Y320W/F377I, M189I/A343V, M189I/F377I, M189L, M189Q, M189Q/G214R, M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y, M189Q/A343V, M189Q/A343V/F377Y, M189Q/A381L, A213S/N215P/Y320G, G214R/N215P/W271Y, G214R/N215P/W271Y/F377Y, G214R/W271Y, G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L, N215K, N215K/L281P/A285L/I372L, N215K/L281P/T373G, N215K/A285L/T317P, N215K/A285L/V445L, N215K/F323Y, N215K/I372L, N215K/I372L/F377L, N215K/T373G, N215P, N215P/W271Y/I372L, N215P/Y320G, N215P/Y320G/I372L, N215P/I372L, N215P/I372L/F377L, N215P/F377L, N215P/A381L, N215R, N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L, N215R/V280G/L281P/A285L/I372L, N215R/L281P/A285L/T373G, N215R/A285P, N215R/Y320G, N215R/I372L, N215W, N215W/A285L/G346S, N215W/A285P, N215W/T373G, A249T/F377L, A269L/V270E/L281P/I372L/F377L, V270E/F377L, W271Y, W271Y/A343V, W271Y/A343V/I372L, W271Y/A343V/I372L/A381L, V280G/A285L/I372L, L281P/I372L, T282A/A285L/Y320W/F323I, A285L/F323I, Y320W, A343V/I372L, I372L, I372L/F377L, I372L/A381L, I372M, T373G и F377L, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:8.

[0115] В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением также предоставляются сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы, которые включают фрагмент любого из сконструированных полипептидов карбоксиэстераз, описанных здесь, который сохраняет функциональную карбоксиэстеразную активность и/или улучшенное свойство этого сконструированного полипептида карбоксиэстеразы. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляется фрагмент полипептида, обладающий карбоксиэстеразной активностью (например, способный превращать субстрат в продукт при подходящих условиях реакции), причем фрагмент включает по крайней мере приблизительно 80%, 90%, 95%, 98%, или 99% полноразмерной аминокислотной последовательности сконструированного полипептида по настоящему изобретению, такого как примерный сконструированный полипептид с четными идентификаторами последовательностей SEQ ID NO:2-136.

[0116] В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид карбоксиэстераза по настоящему изобретению включает аминокислотную последовательность, содержащую по крайней мере одну делецию, добавление и/или замену по сравнению с любой из описанных здесь сконструированных полипептидных последовательностей карбоксиэстераз, таких как примерные сконструированные полипептидные последовательности с идентификаторами последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-136. Таким образом, для каждого и всякого варианта сконструированных полипептидов карбоксиэстераз по настоящему изобретению, аминокислотная последовательность может содержать делеции, добавления и/или замены одной или более аминокислот, 2 или более аминокислот, 3 или более аминокислот, 4 или более аминокислот, 5 или более аминокислот, 6 или более аминокислот, 8 или более аминокислот, 10 или более аминокислот, 15 или более аминокислот или 20 или более аминокислот, до 10% от общего числа аминокислот, до 10% от общего числа аминокислот, до 20% от общего числа аминокислот или до 30% от общего числа аминокислот полипептидов карбоксиэстераз, причем сохраняется связанная функциональная активность и/или улучшенные свойства сконструированной карбоксиэстеразы, описанной здесь. В некоторых вариантах осуществления делеции, добавления и/или замены могут включать 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10 1-15, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 1-55 или 1-60 добавлений и/или замен аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления число делеций, добавлений и/или замен может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления делеции, добавления и/или замены могут включать делеции, добавления и/или замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 30 аминокислотных остатков.

[0117] В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются сконструированный полипептид карбоксиэстераза, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую вставку по сравнению с любой из описанных здесь сконструированных полипептидных последовательностей карбоксиэстераз, таких как примерные сконструированные полипептидные последовательности с идентификаторами последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-136. Таким образом, для каждого и всякого варианта полипептидов карбоксиэстераз по настоящему изобретению вставки могут включать одну или более аминокислот, 2 или более аминокислот, 3 или более аминокислот, 4 или более аминокислоты, 5 или более аминокислот, 6 или более аминокислот, 8 или более аминокислот, 10 или более аминокислот, 15 или более аминокислот или 20 или более аминокислот, причем сохраняется связанная функциональная активность и/или улучшенные свойства описанной здесь сконструированной карбоксиэстеразы. Вставки могут быть на N- или C-конце или во внутренних частях полипептида карбоксиэстеразы.

[0118] В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению находятся в форме слитых полипептидов, в которых сконструированные полипептиды слиты с другими полипептидами, такими как, в качестве примера, но не ограничения, метки антител (например, myc-эпитоп) последовательности для очистки (например, His-метки для связывания с металлами) и сигналы клеточной локализации (например, сигналы секреции). Таким образом, сконструированные полипептиды, описанные здесь, могут использоваться с или без слияний с другими полипептидами.

[0119] Описанные здесь сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы не ограничиваются генетически кодируемыми аминокислотами. Таким образом, в дополнение к генетически кодируемым аминокислотам описанные здесь полипептиды могут состоять, либо полностью, либо частично, из встречающихся в природе и/или синтетических некодируемых аминокислот. Некоторые обычно встречающиеся некодируемые аминокислоты, из которых могут состоять описанные здесь полипептиды, включают, но без ограничения этим: D-стереоизомеры генетически кодируемых аминокислот; 2,3-диаминопропионовую кислоту (Dpr); α-аминоизомасляную кислоту (Aib); ε-аминогексановую кислоту (Aha); δ-аминовалериановую кислоту (Ava); N-метилглицин или саркозин (MeGly или Sar); орнитин (Orn); цитруллин (Cit); трет-бутилаланин (Bua); трет-бутилглицин (Bug); N-метилизолейцин (Melle); фенилглицин (Phg); циклогексилаланин (Cha); норлейцин (Nle); нафтилаланин (Nal); 2-хлорфенилаланин (Ocf); 3-хлорфенилаланин (Mcf); 4-хлорфенилаланин (Pcf); 2-фторфенилаланин (Off); 3-фторфенилаланин (Mff); 4-фторфенилаланин (Pff); 2-бромфенилаланин (Obf); 3-бромфенилаланин (Mbf); 4-бромфенилаланин (Pbf); 2-метилфенилаланин (Omf); 3-метилфенилаланин (Mmf); 4-метилфенилаланин (Pmf); 2-нитрофенилаланин (Onf); 3-нитрофенилаланин (Mnf); 4-нитрофенилаланин (Pnf); 2-цианофенилаланин (Ocf); 3-цианофенилаланин (Mcf); 4-цианофенилаланин (Pcf); 2-трифторметилфенилаланин (Otf); 3-трифторметилфенилаланин (Mtf); 4-трифторметилфенилаланин (Ptf); 4-аминофенилаланин (Paf); 4-йодфенилаланин (Pif); 4-аминометилфенилаланин (Pamf); 2,4-дихлорфенилаланин (Opef); 3,4-дихлорфенилаланин (Mpcf); 2,4-дифторфенилаланин (Opff); 3,4-дифторфенилаланин (Mpff); пирид-2-илаланин (2pAla); пирид-3-илаланин (3pAla); пирид-4-илаланин (4pAla); нафт-1-илаланин (1nAla); нафт-2-илаланин (2nAla); тиазолилаланин (taAla); бензотиенилаланин (bAla); тиенилаланин (tAla); фурилаланин (fAlaа); гомофенилаланин (hPhe); гомотирозин (hTyr); гомотриптофан (hTrp); пентафторфенилаланин (5ff); стирилкаланин (sAla); аутрилаланин (aAla); 3,3-дифенилаланин (Dfa); 3-амино-5-фенипентановую кислоту (Afp); пеницилламин (Pen); 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту (Tic); β-2-тиенилаланин (Thi); метионин сульфоксид (Mso); N(w)-нитроаргинин (nArg); гомолизин (hLys); фосфонометилфенилаланин (pmPhe); фосфосерин (pSer); фосфотреонин (pThr); гомоаспарагиновую кислоту (hAsp); гомоглютаминовую кислоту (hGlu); 1-аминоциклопент-(2 или 3)-ен-4-карбоновую кислоту; пипеколиновую кислоту (PA), азетидин-3-карбоновую кислоту (ACA); 1-аминоциклопентан-3-карбоновую кислоту; аллилглицин (aOly); пропаргилглицин (pgGly); гомоаланин (hAla); норвалин (nVal); гомолейцин (hLeu), гомовалин (hVal); гомоизолейцин (hIle); гомоаргинин (hArg); N-ацетиллизин (AcLys); 2,4-диаминомасляную кислоту (Dbu); 2,3-диаминомасляную кислоту (Dab); N-метилвалин (MeVal); гомоцистеин (hCys); гомосерин (hSer); гидроксипролин (Hyp) и гомопролин (hPro). Дополнительные некодируемые аминокислоты, из которых могут состоять описанные здесь полипептиды, будут очевидны для специалистов в данной области техники. Эти аминокислоты могут находиться или в L-, или в D-конфигурации.

[0120] Специалистам в данной области техники будет понятно, что аминокислоты или остатки, несущие защитные группы боковой цепи, также могут включаться в описанные здесь полипептиды. Неограничивающие примеры таких защищенных аминокислот, которые в данном случае относятся к ароматической категории, включают (защитные группы указаны в скобках), но без ограничения этим: Arg(tos), Cys(метилбензил), Cys(нитропиридин-сульфенил), Glu(δ-бензиловый эфир), Gln(ксантил), Asn(N-δ-ксантил), His(bom), His(бензил), His(tos), Lys(fmoc), Lys(tos), Ser(O-бензил), Thr (O-бензил) и Tyr(O-бензил).

[0121] Некодируемые аминокислоты, которые являются конформационно ограниченными, из которых могут состоять описанные здесь полипептиды, включают, но без ограничения этими, N-метиламинокислоты (L-конфигурацию); 1-аминоциклопент-(2 или 3)-ен-4-карбоновую кислоту; пипеколиновую кислоту; азетидин-3-карбоновую кислоту; гомопролин (hPro) и 1-аминоциклопентан-3-карбоновую кислоту.

[0122] Как будет очевидно специалисту в данной области техники, вышеуказанные положения остатков и конкретные аминокислотные остатки для каждого положения остатков могут использоваться по отдельности или в различных комбинациях для синтеза полипептидов карбоксиэстераз, обладающих желаемыми улучшенными свойствами, включая, среди прочего, ферментативную активность, предпочтение субстрата/продукта, стереоизбирательность, толерантность к субстрату/продукту и стабильность в различных условиях, таких как повышенная температура, растворитель и/или рН.

[0123] Сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы по настоящему изобретению были получены с помощью направленной эволюции SEQ ID NO:2 для эффективного амидирования представляющих интерес субстратов до представляющих интерес продуктов при определенных промышленно соответствующих условиях и имеют одно или более отличий остатков от эталонного полипептида карбоксиэстеразы. Эти отличия остатков связаны с улучшениями различных свойств ферментов, в частности, с повышенной активностью, повышенной устойчивостью к растворителям и пониженной токсичностью для клеток-хозяев (например, E.coli). В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианты карбоксиэстераз также проявляют повышенную стереоизбирательность, повышенную стабильность и устойчивость к повышенной концентрации субстрата и/или продукта (например, пониженное ингибирование продуктом). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие карбоксиэстеразной активностью, способны превращать субстратное соединение(я) в продукт(ы) с активностью, которая увеличена в по крайней мере приблизительно 1,2 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 100 раз, 200 раз, 500 раз, 1000 раз или более по сравнению с активностью полипептида карбоксиэстеразы T. fusca дикого типа (например, SEQ ID NO:2) в подходящих условиях реакции. В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие карбоксиэстеразной активностью, способны превращать субстрат в продукт с процентом превращения, составляющим по крайней мере приблизительно 40%, по крайней мере приблизительно 50%, по крайней мере приблизительно 60%, по крайней мере приблизительно 70%, по крайней мере приблизительно 80% или по крайней мере приблизительно 90%, по крайней мере приблизительно 91%, по крайней мере приблизительно 92%, по крайней мере приблизительно 93%, по крайней мере приблизительно 94%, по крайней мере приблизительно 95%, по крайней мере приблизительно 96%, по крайней мере приблизительно 97%, по крайней мере приблизительно 98% или по крайней мере приблизительно 99% в течение времени реакции, равного приблизительно 48 ч, приблизительно 36 ч, приблизительно 24 ч, или даже более короткого промежутка времени при подходящих условиях реакции. В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие карбоксиэстеразной активностью, способны превращать субстрат в диастереомерный избыток продукта, составляющий по крайней мере 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или более, в подходящих условиях реакции.

[0124] В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие карбоксиэстеразной активностью, способны превращать субстрат в продукт с повышенной толерантностью к присутствию субстрата по сравнению с толерантностью к субстрату эталонного полипептида (например, SEQ ID NO:2) при подходящих условиях реакции. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды способны превращать субстрат в продукт в присутствии концентрации загрузки субстрата, составляющей по крайней мере приблизительно 1 г/л, 5 г/л, 10 г/л, 20 г/л, приблизительно 30 г/л, приблизительно 40 г/л, приблизительно 50 г/л, приблизительно 70 г/л, приблизительно 75 г/л, приблизительно 100 г/л, с процентом превращения, составляющим по крайней мере приблизительно 40%, по крайней мере приблизительно 50%, по крайней мере приблизительно 60%, по крайней мере приблизительно 70%, по крайней мере приблизительно 80%, по крайней мере приблизительно 90%, по крайней мере приблизительно 91%, по крайней мере приблизительно 92%, по крайней мере приблизительно 93%, по крайней мере приблизительно 94%, по крайней мере приблизительно 95%, по крайней мере приблизительно 96%, по крайней мере приблизительно 97%, по крайней мере приблизительно 98% или по крайней мере приблизительно 99%, в течение времени реакции, равного приблизительно 72 ч, приблизительно 48 ч, приблизительно 36 ч, приблизительно 24 ч, или даже более короткого промежутка времени при подходящих условиях реакции.

[0125] Здесь предоставлены некоторые подходящие условия реакции, при которых могут определяться вышеописанные улучшенные свойства сконструированных полипептидов, в отношении концентраций или количеств полипептида, субстрата, буфера, сорастворителя, pH и/или условий, включая температуру и время реакции. В некоторых вариантах осуществления подходящие условия реакции включают условия анализа, описанные ниже и в разделе «Примеры».

[0126] В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды могут быть предоставлены на твердой подложке, такой как мембрана, смола, твердый носитель или другой твердофазный материал. Твердая подложка может состоять из органических полимеров, таких как полистирол, полиэтилен, полипропилен, полифторэтилен, полиэтиленокси и полиакриламид, а также их сополимеров и привитых компонентов сополимера. Твердая подложка также может быть неорганической, такой как стекло, диоксид кремния, стекло с регулируемым размером пор (CPG), диоксид кремния с обращенной фазой или металл, такой как золото или платина. Конфигурация твердой подложки может быть в форме шариков, сфер, частиц, гранул, геля, мембраны или поверхности. Поверхности могут быть плоскими, практически плоскими или неплоскими. Твердые подложки могут быть пористыми или непористыми и могут иметь характеристики набухаемости или ненабухаемости. Твердая подложка может быть выполнена в форме лунки, углубления или другого контейнера, сосуда, элемента или места.

[0127] В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие карбоксиэстеразной активностью, связаны или иммобилизованы на твердой подложке так, что они сохраняют по крайней мере часть своих улучшенных свойств по сравнению с эталонным полипептидом (например, SEQ ID NO:2). В таких вариантах осуществления иммобилизованные полипептиды могут способствовать биокаталитическому превращению субстратного соединения в желаемый продукт и, после завершения реакции, легко удерживаются (например, удерживая шарики, на которых иммобилизован полипептид), а затем повторно используют или повторно используют в последующих реакциях. Такие способы с иммобилизованными ферментами обеспечивают дальнейшую эффективность и снижение затрат. Соответственно, дополнительно предполагается, что любой из способов применения сконструированных полипептидов карбоксиэстераз по настоящему изобретению может быть осуществлен с использованием тех же полипептидов карбоксиэстераз, связанных или иммобилизованных на твердой подложке.

[0128] Сконструированный полипептид карбоксиэстераза может быть связан нековалентно или ковалентно. Различные способы конъюгирования и иммобилизации ферментов на твердых подложках (например, смолах, мембранах, шариках, стекле и т.д.) хорошо известны в данной области техники. Другие способы конъюгирования и иммобилизации ферментов на твердых носителях (например, смолах, мембранах, шариках, стекле и т.д.) хорошо известны в данной области техники (смотрите, например, Yi et al., Proc. Biochem., 42: 895-898 [2007]; Martin et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 76: 843-851 [2007]; Koszelewski et al., J. Mol. Cat. B: Enz., 63: 39-44 [2010]; Truppo et al., Org. Proc. Res. Develop., опубликовано на сайте: dx.doi.org/10.1021/op200157c; and Mateo et al., Biotechnol. Prog., 18:629-34 [2002], и т.д.). Твердые подложки, применимые для иммобилизации сконструированных полипептидов карбоксиэстераз по настоящему изобретению, включают, но без ограничения этим, шарики или смолы, содержащие полиметакрилат с эпоксидными функциональными группами, полиметакрилат с аминоэпоксидными функциональными группами, сополимер стирола и DVB или полиметакрилат с октадецильными функциональными группами. Приведенные в качестве примера твердые подложки, применимые для иммобилизации сконструированных карбоксиэстераз по настоящему изобретению, включают, но без ограничения этим, гранулированные формы хитозана, Eupergit C и SEPABEAD (Mitsubishi), в том числе следующие различные типы SEPABEAD: SEPABEAD: EC-EP, EC-HFA/S, EXA252, EXE119 и EXE120.

[0129] В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды карбоксиэстеразы могут быть предоставлены в форме чипа, в котором полипептиды расположены в позиционно отличающихся местах. В некоторых вариантах осуществления позиционно отличающиеся места представляют собой лунки в твердой подложке, такой как 96-луночный планшет. Множество подложек может быть сконфигурировано в чипе в различных местах, адресуемых для роботизированной доставки реагентов, или в соответствии со способами детектирования и/или средствами измерения. Такие чипы могут использоваться для тестирования различных субстратных соединений на превращение полипептидами.

[0130] В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, описанные здесь, могут быть предоставлены в форме наборов. Полипептиды в наборах могут присутствовать по отдельности или в виде множества полипептидов. Наборы могут включать, кроме того, реагенты для проведения ферментативных реакций, субстраты для оценки активности полипептидов, а также реагенты для детектирования продуктов. Наборы могут также включать дозаторы реагентов и инструкции по их использованию. В некоторых вариантах осуществления наборы по настоящему изобретению включают чипы, содержащие множество различных сконструированных полипептидов карбоксиэстераз в различных адресуемых положениях, причем различные полипептиды представляют собой различные варианты эталонной последовательности, каждый из которых обладает по крайней мере одним отличным улучшенным ферментативным свойством. Такие чипы, содержащие множество сконструированных полипептидов, и способы их применения известны (смотрите, например, WO 2009/008908A2).

Полинуклеотиды, кодирующие сконструированные карбоксиэстеразы.

[0131] В другом аспекте настоящим изобретением предоставляются полинуклеотиды, кодирующие сконструированные ферменты карбоксиэстеразы. Полинуклеотиды могут быть функционально связаны с одной или более гетерологичных регуляторных последовательностей, которые контролируют экспрессию генов, для создания рекомбинантного полинуклеотида, способного экспрессировать полипептид. Экспрессионные конструкции, содержащие гетерологичный полинуклеотид, кодирующий сконструированную карбоксиэстеразу, могут быть введены в соответствующие клетки-хозяева для экспрессии соответствующего полипептида карбоксиэстеразы.

[0132] Благодаря знанию кодонов, соответствующих различным аминокислотам, наличие последовательности белка обеспечивает описание всех полинуклеотидов, способных кодировать субъект. Вырожденность генетического кода, когда одни и те же аминокислоты кодируются альтернативными или синонимичными кодонами, позволяет получать чрезвычайно большое число нуклеиновых кислот, все из которых кодируют улучшенные ферменты карбоксиэстеразы, раскрытые здесь. Таким образом, идентифицировав конкретную аминокислотную последовательность, специалисты в данной области техники могут получить какое-либо число различных нуклеиновых кислот, просто модифицируя последовательность одного или более кодонов таким образом, который не изменяет аминокислотную последовательность белка. В этом отношении в настоящем изобретении, в частности, предусматривается каждая и всякая возможная вариация полинуклеотидов, которая может быть получена путем выбора комбинаций на основе возможных выборов кодонов, и все такие вариации должны рассматриваться как конкретно раскрытые для любого раскрытого здесь полипептида, включая аминокислотные последовательности, представленные в таблицах в разделе «Примеры». В различных вариантах осуществления кодоны предпочтительно выбирают так, чтобы они соответствовали клетке-хозяину, в которой продуцируется белок. Например, предпочтительные кодоны, используемые в бактериях, используются для экспрессии гена в бактериях; предпочтительные кодоны, используемые в дрожжах, используются для экспрессии в дрожжах; и предпочтительные кодоны, используемые у млекопитающих, используются для экспрессии в клетках млекопитающих. Например, полинуклеотид SEQ ID NO:1 был оптимизирован в отношении частоты использования кодонов для экспрессии в E.coli, но в остальном кодирует встречающуюся в природе карбоксиэстеразу T. fusca.

[0133] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует сконструированный полипептид карбоксиэстеразу, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104,106, 108, 110, 112, 114, 116,118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 или 136.

[0134] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие сконструированные карбоксиэстеразы или их функциональный фрагмент, выбирают из полинуклеотидных последовательностей, которые на по крайней мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичны SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137 и/или 139.

[0135] В некоторых вариантах полинуклеотиды способны гибридизоваться в очень жестких условиях с полинуклеотидом, включающим SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137 и/или 139.

[0136] В некоторых вариантах полинуклеотиды кодируют описанные здесь полипептиды, но идентичны на приблизительно 80% или более, приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более, на уровне нуклеотидов, эталонному полинуклеотиду, кодирующему сконструированную карбоксиэстеразу. В некоторых вариантах осуществления эталонный полинуклеотид включает SEQ ID NO:1, в то время как в некоторых других вариантах осуществления эталонный полинуклеотид включает SEQ ID NO:137. В некоторых дополнительных вариантах осуществления эталонная полинуклеотидная последовательность включает SEQ ID NO:139. В некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные последовательности карбоксиэстераз включают последовательности, которые содержат положения, идентифицированные как полезные, как описано в разделе «Примеры».

[0137] Настоящим изобретением также предоставляются полинуклеотидные последовательности, кодирующие по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, предоставленную здесь. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, включающую полипептидную последовательность, которая на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO:2, или ее функциональный фрагмент, причем сконструированная карбоксиэстераза содержит по крайней мере одну замену или совокупность замен в своей полипептидной последовательности, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую замены в положениях, выбранных из: 39, 39/323, 62, 62/117, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 71/263, 77, 77/184, 103, 103/147, 104, 104/429, 105, 107, 107/185, 108, 109, 109/117, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 118/269, 118/349, 119, 126, 147, 153, 153/215, 164, 164/271, 174, 174/282, 183, 184, 184/249, 185, 186, 187, 188, 190, 209, 210, 211, 212, 213, 213/271, 213/345, 214, 215, 215/271, 216, 217, 217/231, 224, 224/268/372, 231, 249, 249/284, 263, 268, 269, 270, 270/470, 271, 271/416, 276, 277, 278, 279, 279/280/282, 280, 281, 281/374, 282, 283, 283/429, 284, 284/438, 285, 286, 311, 317, 320, 320/323, 320/323/372, 320/372/376, 320/376/377, 321, 323, 324, 345, 349, 372, 372/376, 373, 374, 376, 377, 405, 416, 420, 427, 428, 429, 438 и 470, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую по крайней мере одну замену или совокупность замен, выбранную из: 39/323, 62/117, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 71/263, 77/184, 103, 103/147, 104, 104/429, 105, 107, 107/185, 108, 109/117, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 118/269, 118/349, 119, 126, 153, 153/215, 164/271, 174/282, 183, 184, 184/249, 185, 186, 187, 188, 190, 209, 210, 211, 212, 213, 213/271, 213/345, 214, 215, 215/271, 216, 217, 217/231, 224/268/372, 249/284, 269, 270, 270/470, 271, 271/416, 276, 277, 278, 279, 279/280/282, 280, 281, 281/374, 282, 283, 283/429, 284, 284/438, 285, 286, 311, 317, 320, 320/323, 320/323/372, 320/372/376, 320/376/377, 321, 323, 324, 372, 372/376, 373, 376, 377, 405, 420, 427, 428 и 429, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую по крайней мере одну замену или совокупность замен, выбранную из: 39M/323I, 62H/117G, 63A, 63R, 63T, 63Y, 64A, 64E, 64G, 64I, 64T, 64V, 64W, 65G, 65S, 65T, 65W, 66N, 68L, 68P, 69F, 69G, 69H, 69L, 69V, 69W, 69Y, 70L, 70R, 70T, 70W, 71F, 71G, 71H/263R, 71P, 71R, 71V, 71Y, 77S/184G, 103P, 103R, 103T/147S, 104P, 104Q/429V, 105L, 107D/185W, 107L, 107P, 107S, 108G, 108K, 108Q, 108R, 108S, 108W, 109G/117M, 110A, 110H, 110P, 110S, 111L, 111M, 111R, 111S, 111V, 111W, 113P, 114A, 114H, 114Q, 115H, 115T, 115V, 117A, 117F, 118G/349V, 118I, 118N, 118N/269T, 119G, 119P, 119S, 126C, 153H/215P, 153L, 164R/271T, 174D/282V, 183P, 184F, 184G, 184P, 184S/249T, 184Y, 185A, 185T, 186C, 186G, 186P, 186R, 186T, 187P, 188E, 188G, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190W, 209E, 209G, 209P, 209S, 209V, 210P, 210T, 210W, 211I, 211L, 211R, 211V, 212A, 212P, 212R, 212S, 213C, 213E, 213L, 213N, 213P, 213Q, 213R/345G, 213S, 213T/271K, 213V, 214K, 214L, 214T, 214V, 215K, 215M, 215P, 215R, 215R/271R, 215W, 216P, 217G, 217L, 217P, 217R, 217R/231V, 217S, 217V, 217W, 224I/268S/372F, 249V/284P, 269N, 269V, 270I, 270I/470M, 270R, 271A, 271K, 271L, 271P, 271Q/416V, 271S, 271T, 276F, 277M, 278H, 278S, 279C, 279E, 279G, 279L/280G/282M, 279V, 280E, 280G, 280S, 281P, 281V, 281Y/374N, 282A, 282C, 282Q, 282R, 282S, 282T, 282W, 283C, 283D, 283K, 283R/429V, 283T, 283V, 283Y, 284C, 284T, 284T/438T, 284V, 285L, 285M, 285P, 286V, 311I, 317C, 317P, 320A, 320F, 320G, 320G/323S, 320S, 320S/323S/372A, 320S/372A/376G, 320S/376G/377V, 320W, 321L, 321S, 323C, 323I, 323R, 323Y, 324A, 372A/376A, 372L, 373G, 376A, 376G, 376L, 376M, 377L, 377W, 377Y, 405D, 420G, 427A, 428V и 429L, причем положения аминокислот пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую по крайней мере одну замену или совокупность замен, выбранную из: T39M/F323I, R62H/P117G, P63A, P63R, P63T, P63Y, P64A, P64E, P64G, P64I, P64T, P64V, P64W, Y65G, Y65S, Y65T, Y65W, P66N, A68L, A68P, I69F, I69G, I69H, I69L, I69V, I69W, I69Y, G70L, G70R, G70T, G70W, A71F, A71G, A71H/Q263R, A71P, A71R, A71V, A71Y, F77S/E184G, W103P, W103R, W103T/P147S, I104P, I104Q/A429V, H105L, G107D/S185W, G107L, G107P, G107S, A108G, A108K, A108Q, A108R, A108S, A108W, F109G/P117M, T110A, T110H, T110P, T110S, N111L, N111M, N111R, N111S, N111V, N111W, S113P, G114A, G114H, G114Q, S115H, S115T, S115V, P117A, P117F, V118G/A349V, V118I, V118N, V118N/A269T, Y119G, Y119P, Y119S, R126C, R153H/N215P, R153L, W164R/W271T, G174D/L282V, G183P, E184F, E184G, E184P, E184S/A249T, E184Y, S185A, S185T, A186C, A186G, A186P, A186R, A186T, G187P, A188E, A188G, S190H, S190K, S190L, S190M, S190Q, S190R, S190W, L209E, L209G, L209P, L209S, L209V, Q210P, Q210T, Q210W, S211I, S211L, S211R, S211V, G212A, G212P, G212R, G212S, A213C, A213E, A213L, A213N, A213P, A213Q, A213R/S345G, A213S, A213T/W271K, A213V, G214K, G214L, G214T, G214V, N215K, N215M, N215P, N215R, N215R/W271R, N215W, M216P, A217G, A217L, A217P, A217R, A217R/A231V, A217S, A217V, A217W, T224I/P268S/I372F, A249V/F284P, A269N, A269V, V270I, V270I/V470M, V270R, W271A, W271K, W271L, W271P, W271Q/A416V, W271S, W271T, A276F, G277M, G278H, G278S, S279C, S279E, S279G, S279L/V280G/L282M, S279V, V280E, V280G, V280S, L281P, L281V, L281Y/D374N, L282A, L282C, L282Q, L282R, L282S, L282T, L282W, P283C, P283D, P283K, P283R/A429V, P283T, P283V, P283Y, F284C, F284T, F284T/P438T, F284V, A285L, A285M, A285P, P286V, L311I, T317C, T317P, Y320A, Y320F, Y320G, Y320G/F323S, Y320S, Y320S/F323S/I372A, Y320S/I372A/V376G, Y320S/V376G/F377V, Y320W, R321L, R321S, F323C, F323I, F323R, F323Y, L324A, I372A/V376A, I372L, T373G, V376A, V376G, V376L, V376M, F377L, F377W, F377Y, P405D, P420G, D427A, R428V и A429L, причем аминокислоты пронумерованы согласно SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую замену в положении 282, причем положение пронумеровано согласно SEQ ID NO:2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления замена в положении 282 является заменой на алифатическую, неполярную, основную, полярную или ароматическую аминокислоту. Кроме того, в некоторых дополнительных вариантах осуществления замена выбрана из X282T, X282G, X282A, X282V, X282M, X282C, X282W, X282Q, X282S, X282T и X282R.

[0138] Настоящим изобретением также предоставляются полинуклеотидные последовательности, кодирующие по крайней мере одну сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую полипептидную последовательность, которая на по крайней мере 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO:8, или ее функциональный фрагмент, причем сконструированная карбоксиэстераза содержит по крайней мере одну замену или совокупность замен в ее полипептидной последовательности, причем положения аминокислот в полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности кодируют сконструированные карбоксиэстеразы, содержащие по крайней мере одну замену или совокупность замен в положениях, выбранных из: 63, 63/65/108, 63/65/108/189, 63/65/108/377, 63/65/282/285/320/323, 63/65/320/323, 63/108, 63/108/282/285/377, 63/108/285/377, 63/108/320/323, 63/189, 63/212/215, 63/212/215/268/269/343, 63/215, 63/215/269, 63/215/270/271, 63/215/343, 63/268/269/270/429, 63/377, 65/69/70/281/372, 65/69/70/372, 65/69/372, 65/70/372, 65/320, 65/320/323, 68, 68/69/189/214, 68/69/189/214/215, 68/69/189/214/215/271, 68/69/189/214/215/271/281/282/343/381, 68/69/189/214/271/280, 68/69/189/214/372, 68/69/189/214/377/381, 68/69/189/271, 68/69/189/271/280/372/381, 68/69/189/280/281/282/372/377, 68/69/189/281/282/372/377/381, 68/69/189/343/381, 68/69/189/372, 68/69/189/381, 68/69/214/215/271, 68/69/214/343, 68/69/215, 68/69/271, 68/69/282/287, 68/69/343/372, 68/108/377, 68/184, 68/184/189, 68/189/271/372, 68/189/343, 68/214/215/271/281/282/372, 68/215/271/343/372/381, 68/215/377, 68/271/372, 68/377, 69, 69/70, 69/70/331/372, 69/70/372, 69/70/459, 69/108, 69/108/270/372/377, 69/108/281/285, 69/110/215/281, 69/189, 69/189/214/271/281/282/343, 69/189/214/343/372, 69/189/215/343, 69/189/271, 69/189/271/281/282, 69/189/271/343, 69/189/271/343/381, 69/189/280/282/343/372/381, 69/189/281/373, 69/189/282, 69/189/343/381, 69/189/372, 69/189/372/377, 69/189/377, 69/212/213/215/280/281, 69/214/215/271/372/377/381, 69/214/271/282, 69/214/271/343, 69/215, 69/215/269/270/377, 69/215/271/280/281/282, 69/215/271/282, 69/215/271/372, 69/215/285/317, 69/215/323, 69/215/343, 69/215/343/372/381, 69/271, 69/271/372, 69/282, 69/282/343/372, 69/285/373, 69/372, 70, 70/212, 108, 108/189, 108/189/282/285/320, 108/189/320, 108/189/377, 108/215, 108/215/377, 108/269/270, 108/270, 108/282/285/377, 108/285, 108/320/323, 108/377, 126, 126/184/213/280/281/285/320, 126/184/213/372, 126/189/285/372, 126/215, 126/372, 181/215, 189, 189/214, 189/214/215/271/282, 189/215, 189/215/249/277, 189/215/271/281/282/377, 189/215/343/372, 189/270/285, 189/270/372, 189/280/282, 189/320/377, 189/343, 189/343/377, 189/372/377, 189/377, 189/381, 213/215/320, 214/215/271, 214/215/271/377, 214/271, 214/280/282/343/377/381, 215, 215/249/280/281/285/372, 215/271/372, 215/280/281/285/372, 215/281/285/372, 215/281/285/373, 215/281/373, 215/285, 215/285/317, 215/285/346, 215/285/445, 215/320, 215/320/372, 215/323, 215/372, 215/372/377, 215/373, 215/377, 215/381, 249/377, 269/270/281/372/377, 270/377, 271, 271/343, 271/343/372, 271/343/372/381, 280/285/372, 281/372, 282/285/320/323, 285/323, 320, 343/372, 372, 372/377, 372/381, 373 и 377, причем положения аминокислот пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую по крайней мере одну замену или совокупность замен, выбранную из: 63A, 63A/189A, 63A/215R/343V, 63R, 63R/65G/108G, 63R/65G/108G/189L, 63R/65G/108G/377I, 63R/65G/282A/285L/320W/323I, 63R/65G/320W/323I, 63R/108G, 63R/108G/282A/285L/377L, 63R/108G/285L/377I, 63R/108G/320W/323C, 63R/377I, 63T/215R, 63Y, 63Y/189L, 63Y/212P/215R, 63Y/212P/215R/268A/269N/343V, 63Y/215P/269N, 63Y/215R, 63Y/215R/270I/271S, 63Y/268A/269N/270I/429V, 65G/320W, 65G/320W/323I, 65W/69L/372L, 65W/69M/70A/281P/372L, 65W/69W/70L/372L, 65W/70L/372M, 68P, 68P/69L/189E/214R/271Y/280G, 68P/69L/189E/214R/372L, 68P/69L/189I/214R/215P/271Y, 68P/69L/189I/281P/282C/372L/377Y/381L, 68P/69L/189Q/214R, 68P/69L/189Q/271Y/280G/372L/381L, 68P/69L/215P, 68P/69L/271Y, 68P/69L/282C/287I, 68P/69L/343V/372L, 68P/69W/189E/214R/215P/271Y/281P/282G/343V/381L, 68P/69W/189E/280G/281P/282A/372L/377Y, 68P/69W/189E/343V/381L, 68P/69W/189I/214R/215P, 68P/69W/189I/214R/377Y/381L, 68P/69W/189I/271Y, 68P/69W/189I/372L, 68P/69W/189I/381L, 68P/69W/214R/215P/271Y, 68P/69W/214R/343V, 68P/69W/215P, 68P/108G/377L, 68P/184S, 68P/184S/189E, 68P/189I/271Y/372L, 68P/189I/343V, 68P/214R/215P/271Y/281P/282A/372L, 68P/215P/271Y/343V/372L/381L, 68P/215P/377L, 68P/271Y/372L, 68P/377L, 69F/108G/270E/372L/377L, 69F/189L, 69F/215K, 69F/215K/269L/270I/377L, 69F/215R, 69F/285L/373G, 69L, 69L/70L/331Q/372M, 69L/189E/271Y/281P/282A, 69L/189I, 69L/189I/214R/271Y/281P/282A/343V, 69L/189I/271Y/343V/381L, 69L/189I/280G/282G/343V/372L/381L, 69L/189I/282A, 69L/189Q/377Y, 69L/215P/271Y/280G/281P/282C, 69L/215P/271Y/282A, 69L/215P/271Y/372L, 69L/215P/343V/372L/381L, 69L/215R/285P/317P, 69L/271Y, 69L/271Y/372L, 69L/282C/343V/372L, 69L/372L, 69M/70A/372M, 69W, 69W/70L, 69W/70L/372M, 69W/70L/459R, 69W/108S, 69W/189E/214R/343V/372L, 69W/189E/271Y/343V, 69W/189E/372L, 69W/189I, 69W/189I/215P/343V, 69W/189I/271Y, 69W/189I/343V/381L, 69W/189Q/372L/377Y, 69W/212A/213L/215R/280G/281P, 69W/214R/215P/271Y/372L/377Y/381L, 69W/214R/271Y/282A, 69W/214R/271Y/343V, 69W/215K/343V, 69W/215P, 69W/215R, 69W/215R/323Y, 69W/282A, 69W/372M, 69Y/108G/281P/285P, 69Y/110A/215R/281P, 69Y/189L/281P/373G, 70L, 70L/212P, 108G, 108G/189I/282A/285L/320W, 108G/189L, 108G/189L/320W, 108G/189L/377I, 108G/215K, 108G/215P/377L, 108G/269L/270E, 108G/270E, 108G/282A/285L/377L, 108G/285L, 108G/320W/323I, 108G/377I, 108G/377L, 126C, 126C/184S/213S/280G/281P/285L/320G, 126C/184S/213S/372L, 126C/189I/285L/372L, 126C/215P, 126C/372L, 181L/215P, 189E/372L/377Y, 189I, 189I/214R/215P/271Y/282G, 189I/215K, 189I/215P/343V/372L, 189I/215R/249T/277M, 189I/270E/285L, 189I/270E/372L, 189I/280G/282A, 189I/320W/377I, 189I/343V, 189I/377I, 189L, 189Q, 189Q/214R, 189Q/215P/271Y/281P/282C/377Y, 189Q/343V, 189Q/343V/377Y, 189Q/381L, 213S/215P/320G, 214R/215P/271Y, 214R/215P/271Y/377Y, 214R/271Y, 214R/280G/282A/343V/377Y/381L, 215K, 215K/281P/285L/372L, 215K/281P/373G, 215K/285L/317P, 215K/285L/445L, 215K/323Y, 215K/372L, 215K/372L/377L, 215K/373G, 215P, 215P/271Y/372L, 215P/320G, 215P/320G/372L, 215P/372L, 215P/372L/377L, 215P/377L, 215P/381L, 215R, 215R/249T/280G/281P/285L/372L, 215R/280G/281P/285L/372L, 215R/281P/285L/373G, 215R/285P, 215R/320G, 215R/372L, 215W, 215W/285L/346S, 215W/285P, 215W/373G, 249T/377L, 269L/270E/281P/372L/377L, 270E/377L, 271Y, 271Y/343V, 271Y/343V/372L, 271Y/343V/372L/381L, 280G/285L/372L, 281P/372L, 282A/285L/320W/323I, 285L/323I, 320W, 343V/372L, 372L, 372L/377L, 372L/381L, 372M, 373G и 377L, причем положения аминокислот пронумерованы согласно SEQ ID NO:8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует сконструированную карбоксиэстеразу, содержащую по крайней мере одну замену или совокупность замен, выбранную из P63A, P63A/M189A, P63A/N215R/A343V, P63R, P63R/Y65G/A108G, P63R/Y65G/A108G/M189L, P63R/Y65G/A108G/F377I, P63R/Y65G/T282A/A285L/Y320W/F323I, P63R/Y65G/Y320W/F323I, P63R/A108G, P63R/A108G/T282A/A285L/F377L, P63R/A108G/A285L/F377I, P63R/A108G/Y320W/F323C, P63R/F377I, P63T/N215R, P63Y, P63Y/M189L, P63Y/G212P/N215R, P63Y/G212P/N215R/P268A/A269N/A343V, P63Y/N215P/A269N, P63Y/N215R, P63Y/N215R/V270I/W271S, P63Y/P268A/A269N/V270I/A429V, Y65G/Y320W, Y65G/Y320W/F323I, Y65W/I69L/I372L, Y65W/I69M/G70A/L281P/I372L, Y65W/I69W/G70L/I372L, Y65W/G70L/I372M, A68P, A68P/I69L/M189E/G214R/W271Y/V280G, A68P/I69L/M189E/G214R/I372L, A68P/I69L/M189I/G214R/N215P/W271Y, A68P/I69L/M189I/L281P/T282C/I372L/F377Y/A381L, A68P/I69L/M189Q/G214R, A68P/I69L/M189Q/W271Y/V280G/I372L/A381L, A68P/I69L/N215P, A68P/I69L/W271Y, A68P/I69L/T282C/V287I, A68P/I69L/A343V/I372L, A68P/I69W/M189E/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282G/A343V/A381L, A68P/I69W/M189E/V280G/L281P/T282A/I372L/F377Y, A68P/I69W/M189E/A343V/A381L, A68P/I69W/M189I/G214R/N215P, A68P/I69W/M189I/G214R/F377Y/A381L, A68P/I69W/M189I/W271Y, A68P/I69W/M189I/I372L, A68P/I69W/M189I/A381L, A68P/I69W/G214R/N215P/W271Y, A68P/I69W/G214R/A343V, A68P/I69W/N215P, A68P/A108G/F377L, A68P/E184S, A68P/E184S/M189E, A68P/M189I/W271Y/I372L, A68P/M189I/A343V, A68P/G214R/N215P/W271Y/L281P/T282A/I372L, A68P/N215P/W271Y/A343V/I372L/A381L, A68P/N215P/F377L, A68P/W271Y/I372L, A68P/F377L, I69F/A108G/V270E/I372L/F377L, I69F/M189L, I69F/N215K, I69F/N215K/A269L/V270I/F377L, I69F/N215R, I69F/A285L/T373G, I69L, I69L/G70L/P331Q/I372M, I69L/M189E/W271Y/L281P/T282A, I69L/M189I, I69L/M189I/G214R/W271Y/L281P/T282A/A343V, I69L/M189I/W271Y/A343V/A381L, I69L/M189I/V280G/T282G/A343V/I372L/A381L, I69L/M189I/T282A, I69L/M189Q/F377Y, I69L/N215P/W271Y/V280G/L281P/T282C, I69L/N215P/W271Y/T282A, I69L/N215P/W271Y/I372L, I69L/N215P/A343V/I372L/A381L, I69L/N215R/A285P/T317P, I69L/W271Y, I69L/W271Y/I372L, I69L/T282C/A343V/I372L, I69L/I372L, I69M/G70A/I372M, I69W, I69W/G70L, I69W/G70L/I372M, I69W/G70L/G459R, I69W/A108S, I69W/M189E/G214R/A343V/I372L, I69W/M189E/W271Y/A343V, I69W/M189E/I372L, I69W/M189I, I69W/M189I/N215P/A343V, I69W/M189I/W271Y, I69W/M189I/A343V/A381L, I69W/M189Q/I372L/F377Y, I69W/G212A/A213L/N215R/V280G/L281P, I69W/G214R/N215P/W271Y/I372L/F377Y/A381L, I69W/G214R/W271Y/T282A, I69W/G214R/W271Y/A343V, I69W/N215K/A343V, I69W/N215P, I69W/N215R, I69W/N215R/F323Y, I69W/T282A, I69W/I372M, I69Y/A108G/L281P/A285P, I69Y/T110A/N215R/L281P, I69Y/M189L/L281P/T373G, G70L, G70L/G212P, A108G, A108G/M189I/T282A/A285L/Y320W, A108G/M189L, A108G/M189L/Y320W, A108G/M189L/F377I, A108G/N215K, A108G/N215P/F377L, A108G/A269L/V270E, A108G/V270E, A108G/T282A/A285L/F377L, A108G/A285L, A108G/Y320W/F323I, A108G/F377I, A108G/F377L, R126C, R126C/E184S/A213S/V280G/L281P/A285L/Y320G, R126C/E184S/A213S/I372L, R126C/M189I/A285L/I372L, R126C/N215P, R126C/I372L, V181L/N215P, M189E/I372L/F377Y, M189I, M189I/G214R/N215P/W271Y/T282G, M189I/N215K, M189I/N215P/A343V/I372L, M189I/N215R/A249T/G277M, M189I/V270E/A285L, M189I/V270E/I372L, M189I/V280G/T282A, M189I/Y320W/F377I, M189I/A343V, M189I/F377I, M189L, M189Q, M189Q/G214R, M189Q/N215P/W271Y/L281P/T282C/F377Y, M189Q/A343V, M189Q/A343V/F377Y, M189Q/A381L, A213S/N215P/Y320G, G214R/N215P/W271Y, G214R/N215P/W271Y/F377Y, G214R/W271Y, G214R/V280G/T282A/A343V/F377Y/A381L, N215K, N215K/L281P/A285L/I372L, N215K/L281P/T373G, N215K/A285L/T317P, N215K/A285L/V445L, N215K/F323Y, N215K/I372L, N215K/I372L/F377L, N215K/T373G, N215P, N215P/W271Y/I372L, N215P/Y320G, N215P/Y320G/I372L, N215P/I372L, N215P/I372L/F377L, N215P/F377L, N215P/A381L, N215R, N215R/A249T/V280G/L281P/A285L/I372L, N215R/V280G/L281P/A285L/I372L, N215R/L281P/A285L/T373G, N215R/A285P, N215R/Y320G, N215R/I372L, N215W, N215W/A285L/G346S, N215W/A285P, N215W/T373G, A249T/F377L, A269L/V270E/L281P/I372L/F377L, V270E/F377L, W271Y, W271Y/A343V, W271Y/A343V/I372L, W271Y/A343V/I372L/A381L, V280G/A285L/I372L, L281P/I372L, T282A/A285L/Y320W/F323I, A285L/F323I, Y320W, A343V/I372L, I372L, I372L/F377L, I372L/A381L, I372M, T373G и F377L, причем положения аминокислот пронумерованы согласно SEQ ID NO:8.

[0139] Выделенным полинуклеотидом, кодирующим улучшенный полипептид карбоксиэстеразу, можно манипулировать различными способами для обеспечения экспрессии полипептида. Манипуляции выделенным полинуклеотидом перед его вставкой в вектор могут быть желательными или необходимыми в зависимости от экспрессионного вектора. Методы модификации полинуклеотидов и последовательностей нуклеиновых кислот с использованием методов рекомбинантных ДНК хорошо известны в данной области техники.

[0140] Для бактериальных клеток-хозяев подходящие промоторы для управления транскрипцией конструкций нуклеиновых кислот по настоящему изобретению включают промоторы, полученные из lac оперона E. coli, гена агаразы Streptomyces coelicolor (dagA), гена левансукразы Bacillus subtilis (sacB), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus (amyM), гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP), генов xylA и xylB Bacillus subtilis и прокариотического гена бета-лактамазы (смотрите, например, Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 [1978]), а также tac-промотор (смотрите, например, DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]). Дополнительные подходящие промоторы известны специалистам в данной области техники.

[0141] Для мицелиальных грибов в качестве клеток-хозяев подходящие промоторы для управления транскрипцией конструкций нуклеиновых кислот по настоящему изобретению включают промоторы, полученные из генов TAKA-амилазы Aspergillus oryzae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, кислотоустойчивой альфа-амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger или Aspergillus awamori (glaA), липазы Rhizomucor miehei, щелочной протеазы Aspergillus oryzae, триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae, ацетамидазы Aspergillus nidulans и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum (WO 96/00787), а также промотор NA2-tpi (гибрид промоторов генов для нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger и триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae), и их мутантные, усеченные и гибридные промоторы.

[0142] В дрожжах в качестве хозяина применимые промоторы включают, но без ограничения этим, промоторы из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), галактокиназы Saccharomyces cerevisiae (GAL1), алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидазы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) и 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae, а также другие промоторы, применимые для дрожжей в качестве клеток-хозяев (смотрите, например, Romanos, et al., Yeast 8:423-488 [1992]).

[0143] Контролирующей последовательностью также может быть подходящая последовательность терминатора транскрипции, последовательность, распознаваемая клеткой-хозяином для терминации транскрипции. Терминаторная последовательность функционально связана с 3'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Любой терминатор, который функционирует в выбранной клетке-хозяине, может использоваться в настоящем изобретении.

[0144] Например, приведенные в качестве примера терминаторы транскрипции для мицелиальных грибов в качестве клеток-хозяев могут быть получены из генов для TAKA-амилазы Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger и трипсиноподобной протеиназы Fusarium oxysporum.

[0145] Приведенные в качестве примера терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев могут быть получены из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae, цитохрома С Saccharomyces cerevisiae (CYC1) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae, а также других терминаторов, применимых для дрожжевых клеток-хозяев, известных в данной области техники (смотрите, например, Romanos et al., выше).

[0146] Контролирующей последовательностью также может быть подходящая лидерная последовательность, нетранслируемая область мРНК, которая важна для трансляции клеткой-хозяином. Лидерная последовательность функционально связана с 5'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Может использоваться любая лидерная последовательность, которая является функциональной в выбранной клетке-хозяине. Приведенные в качестве примера лидерные последовательности клеток-хозяев в виде мицелиальных грибов получают из генов TAKA-амилазы Aspergillus oryzae и триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans. Подходящие лидерные последовательности для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов энолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-L), 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae, альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

[0147] Контролирующей последовательностью также может быть последовательность полиаденилирования, последовательность, функционально связанная с 3'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, и которая при транскрипции распознается клеткой-хозяином как сигнал для добавления остатков полиаденозина к транскрибируемой мРНК. Любая последовательность полиаденилирования, которая является функциональной в выбранной клетке-хозяине, может использоваться в настоящем изобретении. Приведенные в качестве примера последовательности полиаденилирования для клеток-хозяев в виде мицелиальных грибов могут происходить из генов для TAKA-амилазы Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum и альфа-глюкозидазы Aspergillus niger, а также дополнительных последовательностей полиаденилирования, применимых для дрожжевых клеток-хозяев, известных в данной области техники (Смотрите, например, Guo et al., Mol. Cell. Biol., 15:5983-5990 [1995]).

[0148] Контролирующая последовательность также может представлять собой кодирующую сигнальный пептид область, которая кодирует аминокислотную последовательность, связанную с N-концом полипептида, и направляет кодируемый полипептид на путь секреции клеткой. 5'-конец кодирующей последовательности нуклеотидной последовательности может естественно содержать кодирующую сигнальный пептид область, связанную естественно в трансляционной рамке считывания с сегментом кодирующей области, который кодирует секретируемый полипептид. Альтернативно, 5'-конец кодирующей последовательности может содержать кодирующую сигнальный пептид область, которая является чужеродной для кодирующей последовательности. Область, кодирующая чужеродный сигнальный пептид, может потребоваться, когда кодирующая последовательность естественно не содержит кодирующую сигнальный пептид область.

[0149] Альтернативно, область, кодирующая чужеродный сигнальный пептид, может просто замещать кодирующую природный сигнальный пептид область для усиления секреции полипептида. Однако любая кодирующая сигнальный пептид область, которая направляет экспрессированный полипептид на путь секреции выбранной клеткой-хозяином, может использоваться в настоящем изобретении.

[0150] Кодирующие эффективные сигнальные пептиды области для бактериальных клеток-хозяев представляют собой кодирующие сигнальные пептиды области, полученные из генов мальтогенной амилазы Bacillus NC1B 11837, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus, субтилизина Bacillus licheniformis, бета-лактамазы Bacillus licheniformis., нейтральных протеаз (nprT, nprS, nprM) Bacillus stearothermophilus и prsA Bacillus subtilis, а также дополнительные сигнальные пептиды, известные в данной области (смотрите, например, Simonen et al., Microbiol. Rev., 57: 109-137 [1993]).

[0151] Кодирующие эффективные сигнальные пептиды области для клеток-хозяев в виде мицелиальных грибов включают, но без ограничения этим, кодирующие сигнальные пептиды области, полученные из генов TAKA-амилазы Aspergillus oryzae, нейтральной амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, целлюлазы Humicola insolens и липазы Humicola lanuginosa. Применимые сигнальные пептиды для дрожжевых клеток-хозяев могут быть получены из генов альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и инвертазы Saccharomyces cerevisiae, а также из дополнительные применимых областей, кодирующих сигнальные пептиды (смотрите, например, Romanos et al., 1992, выше).

[0152] Контролирующая последовательность также может представлять собой кодирующую пропептид область, которая кодирует аминокислотную последовательность, расположенную на N-конце полипептида. Полученный полипептид известен как профермент или прополипептид (или в некоторых случаях зимоген). Прополипептид, как правило, неактивен и может быть превращен в зрелый активный полипептид путем каталитического или аутокаталитического отщепления пропептида от прополипептида. Кодирующая пропептид область может быть получена из генов щелочной протеазы Bacillus subtilis (aprE), нейтральной протеазы Bacillus subtilis (nprT), альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei и лактазы Myceliophthora thermophila (WO 95/33).

[0153] В тех случаях, когда как сигнальные пептидные, так и пропептидные области присутствуют на N-конце полипептида, пропептидная область расположена рядом с N-концом полипептида, а сигнальная пептидная область расположена рядом с N-концом пропептидной области.

[0154] Также может быть желательным добавление регуляторных последовательностей, которые позволяют регулировать экспрессию полипептида относительно роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных систем являются те, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, включая присутствие регуляторного соединения. В прокариотических клетках-хозяевах подходящие регуляторные последовательности включают системы lac, tac и trp операторов. В дрожжевых клетках-хозяевах подходящие регуляторные системы включают, например, систему ADH2 или систему GAL1. В мицелиальных грибах подходящие регуляторные последовательности включают промотор TAKA-альфа-амилазы, промотор глюкоамилазы Aspergillus niger и промотор глюкоамилазы Aspergillus oryzae.

[0155] Другими примерами регуляторных последовательностей являются те, которые делают возможной амплификацию генов. В эукариотических системах они включают ген дигидрофолатредуктазы, который амплифицируется в присутствии метотрексата, и гены металлотионеина, которые амплифицируются с помощью тяжелых металлов. В этих случаях последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид карбоксиэстеразу по настоящему изобретению, будет функционально связана с регуляторной последовательностью.

[0156] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также направлено на рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий сконструированный полипептид карбоксиэстеразу или ее вариант, и одну или более регулирующих экспрессию областей, таких как промотор и терминатор, начало репликация и т.д., в зависимости от типа хозяев, в которые они должны быть введены. Различные нуклеиновые кислоты и контролирующие последовательности, описанные выше, могут быть соединены вместе для получения рекомбинантного экспрессионного вектора, который может включать один или более удобных рестрикционных сайтов для обеспечения вставки или замены последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, в таких сайтах. Альтернативно, последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может быть экспрессирована путем вставки последовательности нуклеиновой кислоты или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, в подходящий вектор для экспрессии. При создании экспрессионного вектора кодирующую последовательность располагают в векторе, так что кодирующая последовательность функционально связана с соответствующими контролирующими экспрессию последовательностями.

[0157] Рекомбинантный экспрессионный вектор может представлять собой любой вектор (например, плазмиду или вирус), который может быть легко подвергнут методам рекомбинантных ДНК и может привести к экспрессии полинуклеотидной последовательности. Выбор вектора обычно зависит от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую этот вектор должен быть введен. Векторы могут быть линейными или замкнутыми кольцевыми плазмидами.

[0158] Экспрессионный вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор (т.е. вектор, который существует как внехромосомный элемент), репликация которого не зависит от репликации хромосом, (например, плазмиду, внехромосомный элемент, минихромосому или искусственную хромосому). Вектор может содержать любые средства для обеспечения саморепликации. Альтернативно, вектор может представлять собой вектор, который при введении в клетку-хозяина интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую он был интегрирован. Более того, может использоваться один вектор или плазмида или два или более векторов или плазмид, которые вместе содержат всю ДНК, которая должна быть введена в геном клетки-хозяина, или транспозон.

[0159] Экспрессионный вектор по настоящему изобретению предпочтительно содержит один или более селектируемых маркеров, которые позволяют легко отбирать трансформированные клетки. Селектируемый маркер может представлять собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофию к ауксотрофам и т.п. Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются гены dal из Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis или маркеры, которые придают устойчивость к антибиотикам, например устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Подходящими маркерами для дрожжевых клеток-хозяев являются ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 и URA3.

[0160] Селектируемые маркеры для использования в клетке-хозяине в виде мицелиальных грибов включают, но без ограничения этим, amdS (ацетамидазу), argB (орнитинкарбамоилтрансферазу), bar (фосфинотрицинацетилтрансферазу), hph (гигромицинфосфотрансферазу), niaD (нитратредуктазу), pyrG (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилазу), sC (сульфат-аденилилтрансферазу) и trpC (антранилатсинтазу), а также их эквиваленты. Варианты осуществления для использования в клетке Aspergillus включают гены amdS и pyrG Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae и ген bar Streptomyces hygroscopicus.

[0161] Экспрессионные векторы по настоящему изобретению могут содержать элемент(ы), который обеспечивает интеграцию вектора в геном клетки-хозяина или автономную репликацию вектора в клетке независимо от генома. Для интеграции в геном клетки-хозяина вектор может опираться на последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, или любой другой элемент вектора для интеграции вектора в геном путем гомологичной или негомологичной рекомбинации.

[0162] Альтернативно, экспрессионный вектор может содержать дополнительные последовательности нуклеиновых кислот для направления интеграции путем гомологичной рекомбинации в геном клетки-хозяина. Дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты позволяют вектору интегрироваться в геном клетки-хозяина в точном месте(ах) в хромосоме(ах). Для увеличения вероятности интеграции в точном месте, интеграционные элементы должны предпочтительно содержать достаточное число нуклеиновых кислот, например 100-10000 пар оснований, предпочтительно 400-10000 пар оснований и наиболее предпочтительно 800-10000 пар оснований, которые являются в высокой степени гомологичными соответствующей последовательности-мишени, для увеличения вероятности гомологичной рекомбинации. Интеграционными элементами могут быть любые последовательности, которые гомологичны последовательности-мишени в геноме клетки-хозяина. Более того, интеграционные элементы могут представлять собой некодирующие или кодирующие последовательности нуклеиновых кислот. С другой стороны, вектор может интегрироваться в геном клетки-хозяина путем негомологичной рекомбинации.

[0163] Для автономной репликации вектор может содержать, кроме того, начало репликации, позволяющее вектору автономно реплицироваться в рассматриваемой клетке-хозяине. Неограничивающими примерами бактериальных начал репликации являются ori P15A или начала репликации плазмид pBR322, pUCl9, pACYC177 (которая имеет ori P15A) или pACYCl84, позволяющие реплицироваться в E.coli, и pUB110, rE194 или pTAl060, позволяющие реплицироваться в Bacillus. Примерами начал репликации для использования в дрожжевой клетке-хозяине являются начало репликации 2-микронной плазмиды, ARS1, ARS4, комбинация ARS1 и CEN3 и комбинация ARS4 и CEN6. Начало репликации может иметь мутацию, которая делает его функционирование чувствительным к температуре в клетке-хозяине (смотрите, например, Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1433 [1978]).

[0164] Более чем одна копия последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может быть вставлена в клетку-хозяина для увеличения продукции продукта гена. Увеличение числа копий последовательности нуклеиновой кислоты может быть достигнуто путем интеграции по крайней мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина или путем включения амплифицируемого селектируемого гена-маркера вместе с последовательностью нуклеиновой кислоты, поскольку клетки, содержащие амплифицированные копии селектируемого гена-маркера и, следовательно, дополнительные копии последовательности нуклеиновой кислоты, могут быть отобраны при культивировании клеток в присутствии подходящего селектируемого агента.

[0165] Многие экспрессионные векторы для использования в настоящем изобретении коммерчески доступны. Подходящие коммерческие экспрессионные векторы включают, но без ограничения этим, экспрессионные векторы p3xFLAG™ (Sigma-Aldrich), которые включают промотор CMV и сайт полиаденилирования hGH для экспрессии в клетках млекопитающих-хозяевах, и начало репликации pBR322 и маркеры устойчивости к ампициллину для амплификации в E.coli. Другие коммерчески доступные подходящие экспрессионные векторы включают, но без ограничения этим, векторы pBluescriptII SK(-) и pBK-CMV (Stratagene) и плазмиды, полученные из pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pREP4, pCEP4 (Invitrogen) или pPoly (смотрите, Lathe et al., Gene 57:193-201 [1987]).

[0166] Специалисту в данной области техники будет понятно, что при получении фермента, в частности, в зависимости от используемой линии клеток и конкретной аминокислотной последовательности фермента, могут происходить посттрансляционные модификации. Например, такие посттрансляционные модификации могут включать отщепление некоторых лидерных последовательностей, добавление различных сахарных частей с различными паттернами гликозилирования и фосфорилирования, деамидирование, окисление, перетасовку дисульфидных связей, изомеризацию, отсекание С-концевого лизина и циклизацию N-концевого глютамина. Настоящее изобретение охватывает применение сконструированных ферментов карбоксиэстераз, которые были подвергнуты или претерпели одну или более посттрансляционных модификаций. Таким образом, сконструированные карбоксиэстеразы по настоящему изобретению включают ту, которая претерпела посттрансляционную модификацию, например, описанную здесь.

[0167] Деамидирование представляет собой ферментативную реакцию, в которой главным образом аспарагин (N) превращается в изоаспарагиновую кислоту (изоаспартат) и аспарагиновую кислоту (аспартат) (D) в соотношении приблизительно 3:1. Следовательно, эта реакция деамидирования относится к изомеризации аспартата (D) в изо-аспартат. И деамидирование аспарагина, и изомеризация аспартата включают промежуточный сукцинимид. В гораздо меньшей степени деамидирование может происходить аналогичным образом с остатками глютамина.

[0168] Окисление может происходить во время производства и хранения (т.е. при наличии условий окисления) и приводит к ковалентной модификации белка, вызванной либо непосредственно активными формами кислорода, либо косвенно реакцией с вторичными побочными продуктами окислительного стресса. Окисление происходит главным образом с остатками метионина, но может происходить с остатками триптофана и свободного цистеина.

[0169] Перетасовка дисульфидных связей может происходить во время производства и условий основного хранения. При определенных обстоятельствах дисульфидные связи могут разрываться или образовываться неправильно, что приводит к появлению неспаренных остатков цистеина (-SH). Эти свободные (неспаренные) сульфгидрилы (-SH) могут способствовать перетасовке.

[0170] N-концевой глютамин (Q) и глютамат (глютаминовая кислота) (E) в сконструированных карбоксиэстеразах, вероятно, образуют пироглютамат (pGlu) посредством циклизации. В основном образование pGlu происходит при производстве, но он может образовываться неферментативно, в зависимости от pH и температуры обработки и условий хранения.

[0171] Отсекание С-концевого лизина является ферментативной реакцией, катализируемой карбоксипептидазами, и обычно наблюдается в ферментах. Варианты этого процесса включают удаление лизина из ферментов из рекомбинантной клетки-хозяина.

[0172] В настоящем изобретении посттрансляционные модификации и изменения первичной аминокислотной последовательности, описанные выше, не приводят к значительным изменениям активности сконструированных ферментов карбоксиэстераз.

Клетки-хозяева для экспрессии полипептидов карбоксиэстераз

[0173] В другом аспекте настоящим изобретением предоставляется клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид, кодирующий улучшенный полипептид карбоксиэстеразу по настоящему изобретению, при этом полинуклеотид функционально связан с одной или более контролирующих последовательностей для экспрессии фермента карбоксиэстеразы в клетке-хозяине. Клетки-хозяева, используемые для экспрессии полипептидов карбоксиэстераз, кодируемых экспрессионными векторами по настоящему изобретению, хорошо известны в данной области техники и включают, но без ограничения этим, бактериальные клетки, такие как E. coli, Geobacillus stearothermophilus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis, Lactobacillus minor, Mycobacterium tuberculosis, Streptomyces и Salmonella typhimurium, клетки грибов, такие как дрожжевые клетки (например, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris (№ доступа в ATCC: 201178)); клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как CHO, COS, BHK, 293 и клетки меланомы Bowes; и клетки растений. Подходящие культуральные среды и условия роста для вышеописанных клеток-хозяев хорошо известны в данной области техники.

[0174] Полинуклеотиды для экспрессии карбоксиэстеразы могут быть введены в клетки различными способами, известными в данной области техники. Способы включают, среди прочего, электропорацию, бомбардировку биолистическими частицами, опосредованную липосомами трансфекцию, трансфекцию с использованием хлорида кальция и слияние протопластов. Специалисту в данной области техники будут очевидны различные способы введения полинуклеотидов в клетки.

[0175] Escherichia coli W3110 является штаммом-хозяином, который находит применение в настоящем изобретении, хотя не предполагается, что настоящее изобретение ограничивается этим конкретным штаммом-хозяином. Экспрессионный вектор был создан путем функционального связывания полинуклеотида, кодирующего улучшенную карбоксиэстеразу, с плазмидой pCK110900, функционально связанной с lac-промотором под контролем lacl-репрессора. Экспрессионный вектор также содержал начало репликации Pl5a и ген устойчивости к хлорамфениколу. Клетки, содержащие указанный полинуклеотид в Escherichia coli W3110, можно выделить, подвергнув клетки отбору с использованием хлорамфеникола.

Способы получения сконструированных полипептидов карбоксиэстераз

[0176] В некоторых вариантах осуществления для получения улучшенных полинуклеотидов и полипептидов карбоксиэстераз по настоящему изобретению встречающийся в природе фермент карбоксиэстеразу, который катализирует реакцию амидирования, получают (или происходит) из T. fusca. В некоторых вариантах осуществления исходная полинуклеотидная последовательность является оптимизированной в отношении частоты использования кодонов для усиления экспрессии карбоксиэстеразы в указанной клетке-хозяине. В качестве иллюстрации, исходная полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид карбоксиэстеразу дикого типа T. fusca, была сконструирована из олигонуклеотидов, полученных на основе известной полипептидной последовательности карбоксиэстеразы T. fusca, доступной в базе данных Genbank (№ доступа в Genbank: WP_0l 1292850.1). Исходная полинуклеотидная последовательность, обозначенная как SEQ ID NO:1, была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов для экспрессии в E.coli, и оптимизированный в отношении частоты использования кодонов полинуклеотид клонирован в экспрессионный вектор, поместив экспрессию гена карбоксиэстеразы под контроль промотора lac и гена репрессора lacI. Клоны, экспрессирующие активную карбоксиэстеразу в E.coli, были идентифицированы, а гены секвенированы для подтверждения их идентичности. Оптимизированная в отношении частоты использования кодонов полинуклеотидная последовательность, обозначенная SEQ ID NO:1, была исходной последовательностью, использованной в качестве отправной точки для большинства экспериментов и конструирования библиотеки сконструированных карбоксиэстераз, разработанных исходя из исходной карбоксиэстеразы дикого типа.

[0177] В других вариантах осуществления для получения улучшенных полинуклеотидов и полипептидов карбоксиэстераз по настоящему изобретению встречающийся в природе фермент карбоксиэстеразу, который катализирует реакцию амидирования, получают (или происходят) из G. stearothermophilus. В некоторых вариантах осуществления исходная полинуклеотидная последовательность оптимизирована в отношении частоты использования кодонов для усиления экспрессии карбоксиэстеразы в указанной клетке-хозяине. В качестве иллюстрации, исходная полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид карбоксиэстеразу дикого типа G. stearothermophilus, была сконструирована из олигонуклеотидов, полученных на основе известной полипептидной последовательности карбоксиэстеразы G. stearothermophilus, доступной в базе данных Genbank (№ доступа в Genbank: WP_0330155113). Исходная полинуклеотидная последовательность, обозначенная как SEQ ID NO:137, была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов для экспрессии в E.coli, и оптимизированный в отношении частоты использования кодонов полинуклеотид клонирован в экспрессионный вектор, поместив экспрессию гена карбоксиэстеразы под контроль промотора lac и гена репрессора lacI. Клоны, экспрессирующие активную карбоксиэстеразу в E.coli, были идентифицированы, а гены секвенированы для подтверждения их идентичности. Полинуклеотидная последовательность, обозначенная SEQ ID NO:137, была исходной последовательностью, использованной в качестве отправной точки для большинства экспериментов и конструирования библиотеки сконструированных карбоксиэстераз, разработанных исходя из исходной карбоксиэстеразы дикого типа.

[0178] В некоторых вариантах для получения улучшенных полинуклеотидов и полипептидов карбоксиэстераз по настоящему изобретению встречающийся в природе фермент карбоксиэстераза, который катализирует реакцию амидирования, был получен или происходил из M. tuberculosis. В некоторых вариантах осуществления исходная полинуклеотидная последовательность была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов для усиления экспрессии карбоксиэстеразы в указанной клетке-хозяине. В качестве иллюстрации, исходная полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид карбоксиэстеразу дикого типа M. tuberculosis, была сконструирована из олигонуклеотидов, полученных на основе известной полипептидной последовательности карбоксиэстеразы M. tuberculosis, доступной в базе данных Genbank (№ доступа в Genbank: WP_003407276). Исходная полинуклеотидная последовательность, обозначенная как SEQ ID NO:139, была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов для экспрессии в E.coli, и оптимизированный в отношении частоты использования кодонов полинуклеотид клонирован в экспрессионный вектор, поместив экспрессию гена карбоксиэстеразы под контроль промотора lac и гена репрессора lacI. Клоны, экспрессирующие активную карбоксиэстеразу в E.coli, были идентифицированы, а гены секвенированы для подтверждения их идентичности. Оптимизированная в отношении частоты использования кодонов полинуклеотидная последовательность, обозначенная SEQ ID NO:139, была исходной последовательностью, использованной в качестве отправной точки для большинства экспериментов и конструирования библиотеки сконструированных карбоксиэстераз, разработанных исходя из исходной карбоксиэстеразы дикого типа, как здесь описано.

[0179] В некоторых вариантах осуществления сконструированные карбоксиэстеразы получают, подвергая полинуклеотид, кодирующий встречающуюся в природе карбоксиэстеразу, или оптимизированный в отношении частоты использования кодонов вариант полинуклеотида, кодирующего встречающуюся в природе карбоксиэстеразу, методам мутагенеза и/или направленной эволюции, как обсуждалось выше. Мутагенез может быть выполнен в соответствии с любым из методов, известных в данной области техники, включая неспецифический и сайт-специфический мутагенез. Направленная эволюция может быть осуществлена с помощью любого из методов, известных в данной области техники для отбора улучшенных вариантов промотора, включая перетасовку. Методы мутагенеза и направленной эволюции хорошо известны в данной области техники (смотрите, например, патенты США с №№ 5605793, 5811238, 5830721, 5834252, 5837458, 5928905, 6096548, 6117679, 6132970, 6165793, 6180406, 6251674, 6265201, 6277638, 6287861, 6287862, 6291242, 6297053, 6303344, 6309883, 6319713, 6319714, 6323030, 6326204, 6335160, 6335198, 6344356, 6352859, 6355484, 6358740, 6358742, 6365377, 6365408, 6368861, 6372497, 6337186, 6376246, 6379964, 6387702, 6391552, 6391640, 6395547, 6406855, 6406910, 6413745, 6413774, 6420175, 6423542, 6426224, 6436675, 6444468, 6455253, 6479652, 6482647, 6483011, 6484105, 6489146, 6500617, 6500639, 6506602, 6506603, 6518065, 6519065, 6521453, 6528311, 6537746, 6573098, 6576467, 6579678, 6586182, 6602986, 6605430, 6613514, 6653072, 6686515, 6703240, 6716631, 6825001, 6902922, 6917882, 6946296, 6961664, 6995017, 7024312, 7058515, 7105297, 7148054, 7220566, 7288375, 7384387, 7421347, 7430477, 7462469, 7534564, 7620500, 7620502, 7629170, 7702464, 7747391, 7747393, 7751986, 7776598, 7783428, 7795030, 7853410, 7868138, 7783428, 7873477, 7873499, 7904249, 7957912, 7981614, 8014961, 8029988, 8048674, 8058001, 8076138, 8108150, 8170806, 8224580, 8377681, 8383346, 8457903, 8504498, 8589085, 8762066, 8768871, 9593326, 9665694, 9684771 и все связанные с ними неамериканские эквиваленты; Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767; и WO 2009/152336. Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767 и WO 2009/152336. Не предполагается, что настоящее изобретение ограничивается какими-либо конкретными методами, поскольку различные методы находят применение в данной области техники.

[0180] В некоторых вариантах осуществления, в которых желаемым улучшенным свойством фермента является термостойкость, активность фермента может быть определена после подвергания препараты фермента воздействию определенной температуры и определения количества ферментативной активности, остающейся после термических обработок. Клоны, содержащие полинуклеотид, кодирующий карбоксиэстеразу, затем выделяют, секвенируют для идентификации изменений нуклеотидной последовательности (если они есть) и используют для экспрессии фермента в клетке-хозяине.

[0181] Когда последовательность сконструированного полипептида известна, кодирующие фермент полинуклеотиды могут быть получены с помощью стандартных твердофазных способов в соответствии с известными способами синтеза. В некоторых вариантах осуществления фрагменты размером до приблизительно 100 оснований могут быть по отдельности синтезированы, а затем объединены (например, с использованием способов ферментативного или химического лигирования или способов с использованием полимераз) с образованием любой желаемой непрерывной последовательности. Например, полинуклеотиды и олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть получены с помощью химического синтеза (например, используя классический фосфорамидитный метод, описанный Beaucage et al., Tet. Lett., 22:1859-69 [1981], или метод, описанный Matthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984], как это обычно осуществляется на практике в случае автоматизированных методов синтеза). В соответствии с фосфорамидитным методом олигонуклеотиды синтезируются (например, в автоматическом синтезаторе ДНК), очищаются, подвергаются отжигу, лигируются и клонируются в соответствующие векторы. Кроме того, практически любая нуклеиновая кислота может быть получена из любого множества коммерческих источников (например, The Midland Certified Reagent Company, Midland, TX, The Great American Gene Company, Ramona, CA, ExpressGen Inc. Chicago, IL, Operon Technologies Inc., Alameda, CA, и многих других).

[0182] Сконструированные ферменты карбоксиэстеразы, экспрессированные в клетке-хозяине, могут быть выделены из клеток и/или культуральной среды с использованием любого одного или более хорошо известных методов очистки белков, включая, среди прочего, обработку лизоцимом, обработку ультразвуком, фильтрацию, высаливание, ультрацентрифугирование и хроматографию. Подходящие растворы для лизирования и высокоэффективной экстракции белков из бактерий, таких как E. coli, коммерчески доступны под торговым названием CelLytic B (Sigma-Aldrich).

[0183] Хроматографические методы выделения полипептида карбоксиэстеразы включают, среди прочего, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с обращенной фазой, ионообменную хроматографию, гель-электрофорез и аффинную хроматографию. Условия для очистки конкретного фермента будут частично зависеть от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность, гидрофильность, молекулярная масса, молекулярная форма и т.д., и будут очевидны для специалистов в данной области техники.

[0184] В некоторых вариантах осуществления аффинные методы могут использоваться для выделения улучшенных ферментов карбоксиэстераз. Для очистки с помощью аффинной хроматографии может использоваться любое антитело, которое специфически связывается с полипептидом карбоксиэстеразой. Для получения антител различные животные-хозяева, включая, но без ограничения этим, кроликов, мышей, крыс и т.д., могут быть иммунизированы путем инъекции карбоксиэстеразы. Полипептид карбоксиэстраза может быть присоединен к подходящему носителю, такому как BSA, с помощью функциональной группы боковой цепи или линкеров, связанных с функциональной группой боковой цепи. Различные адъюванты могут использоваться для усиления иммунологического ответа, в зависимости от вида хозяина, включая, но без ограничения этим, адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы плюроники, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол и потенциально полезные для человека адъюванты, такие как BCG (Bacillus Calmette Guerin) и Corynebacterium parvum.

[0185] Карбоксиэстеразы могут быть приготовлены и использованы в форме клеток, экспрессирующих ферменты, в виде неочищенных экстрактов или в виде выделенных или очищенных препаратов. Карбоксиэстеразы могут быть приготовлены в виде лиофилизатов, в виде порошка (например, ацетоновых порошков) или в виде растворов ферментов. В некоторых вариантах осуществления карбоксиэстеразы могут быть в форме по существу чистых препаратов.

[0186] В некоторых вариантах осуществления полипептиды карбоксиэстеразы могут быть присоединены к твердому субстрату. Субстрат может быть твердой фазой, поверхностью и/или мембраной. Твердая подложка может состоять из органических полимеров, таких как полистирол, полиэтилен, полипропилен, полифторэтилен, полиэтиленокси и полиакриламид, также их сополимеров и привитых компонентов сополимера. Твердая подложка также может быть неорганической, такой как стекло, диоксид кремния, стекло с регулируемым размером пор (CPG), диоксид кремния с обращенной фазой или металл, такой как золото или платина. Конфигурация субстрата может быть в форме шариков, сфер, частиц, гранул, геля, мембраны или поверхности. Поверхности могут быть плоскими, практически плоскими или неплоскими. Твердые подложки могут быть пористыми или непористыми и могут иметь характеристики набухаемости или ненабухаемости. Твердая подложка может быть выполнена в форме лунки, углубления или другого контейнера, сосуда, элемента или места. Множество подложек может быть сконфигурировано в чипе в различных местах, адресуемых для роботизированной доставки реагентов, или в соответствии со способами детектирования и/или средствами измерения.

Способы применения сконструированных ферментов карбоксиэстераз и полученных с их помощью соединений

[0187] Целые клетки, трансформированные геном(ами), кодирующим сконструированный фермент карбоксиэстеразу и/или дополнительные ферменты регенерации в качестве кофакторов, или клеточные экстракты и/или их лизаты могут использоваться в ряде различных форм, включая твердые (например, лиофилизированные, высушенные распылением и т.п.) или полутвердые (например, неочищенную пасту).

[0188] Клеточные экстракты или клеточные лизаты могут быть частично очищены осаждением (с использованием сульфата аммония, полиэтиленимина, термической обработки или т.п.) с последующей процедурой обессоливания перед лиофилизацией (например, с использованием ультрафильтрации, диализа и т.п.). Любой из клеточных препаратов может быть стабилизирован путем сшивания с использованием известных сшивающих агентов, таких как, например, глутаральдегид, или иммобилизации на твердой фазе (например, Eupergit C и т.п.).

[0189] Твердые реагенты (например, фермент, соли и т.д.) могут вводиться в реакцию в ряде различных форм, включая порошок (например, лиофилизированный, высушенный распылением и т.п.), раствор, эмульсию, суспензию и т.п. Реагенты могут быть легко лиофилизированы или высушены распылением с использованием способов и оборудования, которые известны специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники. Например, раствор белка может быть заморожен при -80^οС небольшими аликвотами, затем добавлен в предварительно охлажденную камеру для лиофилизации с последующим применением вакуума. После удаления воды из образцов температуру обычно повышают до 4^οС в течение двух часов перед тем, как сбросить вакуум и извлечь лиофилизированные образцы.

[0190] Количество реагентов, используемых в реакции амидирования, обычно будет варьироваться в зависимости от количества требуемого продукта и одновременно используемого количества субстрата карбоксиэстеразы. Следующие рекомендации могут использоваться для определения количеств карбоксиэстеразы и/или амина. Как правило, субстраты в виде сложных эфиров и аминов могут использоваться в концентрации от приблизительно 5 до 200 г/л, используя от приблизительно 50 мг до приблизительно 5 г карбоксиэстеразы.

[0191] Специалисты со средним уровнем компетентности в данной области техники легко поймут, как варьировать эти количества, чтобы адаптировать их к желаемому уровню производительности и масштабам производства.

[0192] Порядок добавления реагентов не является критическим. Реагенты могут добавляться вместе в одно и то же время в растворитель (например, однофазный растворитель, двухфазную водную систему сорастворителей и т.п.), или, альтернативно, некоторые из реагентов могут быть добавлены по отдельности, а некоторые вместе в разные моменты времени. Например, карбоксиэстераза и субстрат карбоксиэстеразы могут быть добавлены сначала к растворителю.

[0193] Для повышения эффективности смешивания, когда используется водная система сорастворителей, сначала карбоксиэстераза и амин могут быть добавлены и смешаны с водной фазой. Затем может быть добавлена и смешана органическая фаза с последующим добавлением субстрата карбоксиэстеразы. Альтернативно, субстрат карбоксиэстеразы может быть предварительно вмешан в органическую фазу перед добавлением к водной фазе.

[0194] Подходящие условия для проведения описанных здесь реакций амидирования, катализируемых карбоксиэстеразой, включают широкий ряд условий, которые можно легко оптимизировать с помощью обычного экспериментирования, которое включает, но без ограничения этим, контактирование сконструированного фермента карбоксиэстеразы и субстратов при экспериментальных значениях рН и температуры и детектирование продукта, например, с использованием способов, описанных в приведенном здесь разделе «Примеры».

[0195] Катализируемое карбоксиэстеразой амидирование обычно проводят при температуре в диапазоне от приблизительно 15^οС до приблизительно 75^οС. Для некоторых вариантов осуществления реакцию проводят при температуре в диапазоне от приблизительно 20^οС до приблизительно 55^οС. В еще одних вариантах осуществления ее проводят при температуре в диапазоне от приблизительно 20^οС до приблизительно 45^οС. Реакция также может быть проведена в условиях окружающей среды.

[0196] Реакции амидирования, как правило, разрешается протекать до тех пор, пока не будет достигнуто практически полное или почти полное сочетание субстратов. Образование амида (продукта) может контролироваться с использованием известных способов путем детектирования субстратов и/или продукта. Подходящие способы включают, но без ограничения этим, газовую хроматографию, ВЭЖХ и т.п. Выходы продукта превращения в виде амида, образующегося в реакционной смеси, как правило, превышают приблизительно 50%, могут также превышать приблизительно 60%, также могут превышать приблизительно 70%, также могут превышать приблизительно 80%, могут также превышать 90% и часто превышают приблизительно 97%.

ПРИМЕРЫ

[0197] Различные признаки и варианты осуществления настоящего изобретения проиллюстрированы в следующих репрезентативных примерах, которые предназначены для иллюстрации, а не ограничения.

[0198] В приведенном ниже экспериментальном описании применяются следующие сокращения: ч/млн (частей на миллион); М (молярный); мМ (миллимолярный), мкМ и мкМ (микромолярный); нМ (наномолярный); моль (моль); г и г (граммы); мг (миллиграммы); мкг и мкг (микрограммы); Л и л (литр); мл и мл (миллилитр); см (сантиметры); мм (миллиметры); мкм и мкм (микрометры); сек. (секунды; мин (минута(ы); ч и ч (час(ы)); U (ед.); М.м. (молекулярная масса); об./мин. (оборотов в минуту); ^οC (градусы Цельсия); RT (комнатная температура); MWD (многоволновый детектор); CDS (кодирующая последовательность); ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота); РНК (рибонуклеиновая кислота); RP-HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой); FIOP (кратное улучшение по сравнению с положительным контролем); HTP (высокая пропускная способность); LB (бульон Лурия); TFA (трифторуксусная кислота); MeCN (ацетонитрил); TEoA (триэтаноламин); THF (тетрагидрофуран); Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); Millipore (Millipore, Corp., Billerica MA); Difco (Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, Detroit, MI); Daicel (Daicel, West Chester, PA); Genetix (Genetix USA, Inc., Beaverton, OR); Molecular Devices (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA); Applied Biosystems (Applied Biosystems, часть Life Technologies, Corp., Grand Island, NY), Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA); Thermo Scientific (часть Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); Corning (Corning, Inc., Palo Alto, CA); и Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA); Phenomenex (Phenomenex, Inc., Torrence, CA); Epicentre (Epicentre, Madison, WI).

Пример 1

Получение гена карбоксиэстеразы дикого типа и конструирование экспрессионных векторов

[0199] В этом примере описано получение оптимизированных в отношении частоты использования кодонов рекомбинантных полинуклеотидов, кодирующих карбоксиэстеразы дикого типа (SEQ ID NO:2, 138 и 140), от которых происходят гены, кодирующие сконструированные карбоксиэстеразы, в следующих примерах и экспрессионные векторы и клетки-хозяева, подходящие для такого конструирования.

[0200] Оптимизированные в отношении частоты использования кодонов гены дикого типа (SEQ ID NO:1, 137 и 139), кодирующие карбоксиэстеразы дикого типа (SEQ ID NO:2, 138 и 140) T. fusca, G. stearothermophilus и M. tuberculosis, соответственно, были синтезированы для экспрессии в E.coli. Оптимизированный в отношении частоты использования кодонов ген клонировали в экспрессионный вектор pCK11900 (смотрите, например, патент США с № 9714437 и публикацию заявки на патент США с № 2006/0195947, оба из которых включены сюда посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей), под контроль промотора lac. Экспрессионный вектор также содержал начало репликации Pl5a и ген устойчивости к хлорамфениколу. Эти верифицированные по последовательности векторы трансформировали в штамм W3110 E.coli для экспрессии. Полинуклеотиды (с нечетными номерами SEQ ID NO:1-135), кодирующие сконструированные карбоксиэстеразы (с четным номером SEQ ID NO: 2-136) по настоящему изобретению, так же клонированы в вектор pCK110900 для экспрессии в производном штамма W3110 E. coli. Методы направленной эволюции, общеизвестные специалистам в данной области техники, использовали для создания библиотек сконструированных карбоксиэстераз.

Пример 2

Получение с высокой пропускной способностью (HTP) и анализ полипептидов карбоксиэстеразы дикого типа

[0201] Лизаты получали с HTP, взяв оптимизированные в отношении частоты использования кодонов гены карбоксиэстераз (описанные в примере 1), которые затем трансформировали в E.coli W3110 и высевали на агаризованную среду Luria-Bertani (LB), содержащую 1% глюкозы и 30 мкг/мл хлорамфеникола (САМ). После инкубации в течение по крайней мере 16 часов при 30^οС колонии отбирали, используя автоматизированное устройство для отбора колоний Q-Bot (Genetix), в микропланшет для титрования с 96 неглубокими лунками, содержащими 200 мкл LB, 1% глюкозы и 30 мкг/мл CAM. Клетки выращивали в течение 18-20 часов при 30^οС со встряхиванием при 200 об/мин. Затем 20 мкл этих культур переносили в 360 мкл Terrific Broth (TB) и 30 мкг/мл САМ в планшете с глубокими лунками. После инкубации при 30^οС при встряхивании при 250 об/мин в течение 2,5 час (ОП₆₀₀ =0,6-0,8) экспрессию рекомбинантного гена индуцировали добавлением изопропилтиогликозида (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ. Затем планшеты инкубировали при 30^οС со встряхиванием при 250 об/мин в течение 18-21 часа.

[0202] Клеточные культуры осаждали при 3500хg в течение 20 минут, и среду отбрасывали. Клеточные осадки лизировали в 200 мкл 0,2 М TEoA, pH 7,5 с 1 г/л лизоцима, 0,5 г/л сульфата полимиксина B и 0,5 мкл эндонуклеазы OmniCleave™ (Epicenter) при встряхивании при комнатной температуре в течение 2 часов. Образцы центрифугировали при 3500хg в течение 20 минут для осветления клеточного дебриса, и супернатант использовали для проведения трансформаций, описанных в примерах 3 и 4.

Пример 3

Активность карбоксиэстераз дикого типа на комбинации субстратов #1

[0203] Полипептиды карбоксиэстеразы дикого типа получали, как описано в примере 2. Для анализа способности к амидированию на комбинации субстратов #1 (таблица 3.1) 20 мкл супернатанта добавляли к смеси 10 мкл анилина, 10 мкл этилацетата, 100 мкл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,0. Реакционные смеси инкубировали при 20^οС и встряхивали при 300 об/мин в течение 18 часов. Образцы гасили, разводя в 2 раза в MeCN. Анализ реакций проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ, как описано в Примере 12.1.

Таблица 3.1. Используемые для оценки способности к амидированию карбоксиэстераз комбинации субстратов

Пример 4

Активность карбоксиэстераз дикого типа на комбинациях субстратов #2-7

[0204] Полипептиды карбоксиэстеразы дикого типа получали в соответствии со способами, описанными в примере 2. Для анализа способности к амидированию на комбинации субстратов #2 (смотрите таблицу 3.1) 100 мкл супернатанта добавляли к смеси 10 мкл метилфенилацетата, 10 мкл н-бутиламина, 10 мкл диметилсульфоксида (DMSO) и 20 мкл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,0. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре и встряхивали при 300 об/мин в течение 18 часов. Образцы гасили, разводя равным объемом MeCN. Анализ субстратов и продуктов проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ с использованием описанных в Примере 12.1 способов

[0205] Для анализа способности к амидированию на комбинациях субстратов #3-7 (смотрите таблицу 3.1) 120 мкл смеси 75-100 г/л амина и 15 г/л этилбензоата в 0,1 М калий-фосфатном буфере (KPi), рН 7,5, с 50% изопропанолом (IPA) или без него, добавляли к 100 мкл супернатанта, полученного, как описано в примере 2. Реакционные смеси инкубировали при 55^οС и встряхивали при 400 об/мин в течение 18 часов. Образцы гасили, разводя в 3 раза в MeCN, и затем центрифугировали в течение 5-8 минут при 4000хg. Полученный супернатант анализировали методом ОФ-ВЭЖХ с использованием описанных в примере 12.2 способов. В одном эксперименте с использованием комбинации субстратов #3 120 мкл смеси 5 г/л изобутиламина и 15 г/л этилбензоата в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,5 добавляли к 100 мкл супернатанта, полученного, как описано в примере 2. Результаты для всех этих комбинаций субстратов представлены в таблице 4.1, при этом комбинации субстратов обозначенными номерами «реакций» (т.е. «R1», «R2», «R3» и т.д.).

Таблица 4.1 Устойчивость к растворителю и объем субстратов карбоксиэстераз дикого типа (SEQ ID NO:2, 138 и 140) ¹
Условия (KPi-буфер, pH 7,5)	R1	R2	R3	R4	R5	R6	R7
T. fusca	‡		†		+++++	+++	+++
G. stearothermophilus	##	+++++	#	+		†
M. tuberculosis	#	++++	+	+++		++++
Условия (KPi-буфер, pH 7,5/IPA (50:50 в объемном отношении %)	R1	R2	R3	R4	R5	R6	R7
T. fusca			†				++++
G. stearothermophilus			##			#	++
M. tuberculosis			##	+	+		+++
¹Уровни повышенной активности определяли относительно эталонной площади пика порошка в качестве отрицательного контроля. В этой таблице, "+" = > 0, < 20; "++" = > 20, < 50; "+++" = > 50, < 100; "++++" = > 100, < 500; "+++++" = > 500, < 1000; "#" = > 1000, < 2000; "##" = > 2000, < 5000; "†" = >5000, < 10000; "‡" = > 10000, < 15000.

Пример 5

Получение порошков карбоксистеразы дикого типа во встряхиваемых колбах

[0206] Карбоксиэстеразы дикого типа (SEQ ID NO:2, 138 и 140) получали во встряхиваемых колбах для дальнейшей характеристики. Трансформанты E.coli, содержащие плазмиду, кодирующую карбоксиэстеразы WT, выращивали на агаризованной среде Luria-Bertani (LB), содержащей 1% глюкозы и 30 мкг/мл хлорамфеникола (САМ). После инкубации в течение по крайней мере 16 часов при 30^οС отдельные колонии отбирали в 6 мл LB, 1% глюкозы и 30 мкг/мл CAM. Клетки выращивали в течение 18-20 часов при 30^οС со встряхиванием при 250 об/мин. Затем эту культуру переносили в Terrific Broth (TB) и 30 мкг/мл САМ до конечной ОП₆₀₀=0,2 и конечного объема 250 мл. После инкубации колб при 25^οС или 30^οС при встряхивании при 250 об/мин в течение 2,5 ч (ОП₆₀₀=(0,6-0,8)) экспрессию рекомбинантного гена индуцировали с помощью изопропилтиогликозида (IPTG) в конечной концентрации 1 мМ. Затем колбу инкубировали при 30^οС со встряхиванием при 250 об/мин в течение 18-21 часа. Клетки осаждали при 3500xg в течение 20 минут, и супернатант отбрасывали. Клеточный осадок промывали 3 раза в 30 мл охлажденного на льду 50 мМ фосфата натрия, рН 7,5, ресуспендировали в 12 мл того же буфера и лизировали с использованием разрушителя клеток при 18-20 кфунт/дюйм². Лизаты осветляли при 10000xg в течение 30 мин, а осветленные супернатанты лиофилизировали до не совсем белого порошка.

Таблица 5.1 Оценка роста трансформантов карбоксиэстеразами дикого типа (SEQ ID NO:2, 138 и 140)
	SEQ ID NO:	Рост ОП₆₀₀ ¹	Рост ОП₆₀₀	Сбор ОП₆₀₀	Сбор ОП₆₀₀	Вес осадка	Вес осадка	³ Вес порошка	Вес порошка
Встряхиваемая колба		25^οC	30^οC	25^οC	30^οC	25^οC	30^οC	25^οC	30^οC
Отрицательный контроль	-	+++	+++	++	++	++++	+++	+	++
T. fusca	2	++++	++++	+++	++++	+++	++++	++	++
G. stearothermophilus	138	++++	++++	+	N/A	++	N/A	++	N/A
M. tuberculosis	140	++++	++++	+++	+++	++++	++++	+++	+++
¹ ОП₆₀₀ со следующими оценками ("+" = >10, <15: "++"= >15, <20: "+++" = >20, <25; "++++" = >25, <30); ²Вес осадка со следующими оценками ("+" = > 3 г, <4 г; "++"= > 4 г, <5 г; "+++"= > 5 г, <6 г; "++++"= > 6 г, <7 г); ³Вес порошка со следующими оценками ("+" = > 0,2 г, <0,5 г; "++"= > 0,5 г, <1,0 г; "+++" = > 1,0 г, < 1,5 g)

ПРИМЕР 6

Оценка устойчивости к растворителю полипептидов карбоксиэстераз дикого типа

[0207] В этом примере описаны эксперименты, которые проводились для определения устойчивости к растворителю карбоксиэстераз дикого типа. В этих экспериментах устойчивость к органическому растворителю лиофилизированных порошков во встряхиваемых колбах, полученных в примере 5, определяли путем проверки активности на комбинациях субстратов #3 и #5. Реакции проводили в 96-луночном планшете (в объеме реакции, равном 220 мкл) с использованием 10 г/л порошка фермента, 30-34 г/л амина, 43 г/л сложного эфира и 10% DMSO, или 50% изопропанола, или 15-25% MeCN, или 25% THF в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,5. Реакционные смеси нагревали до 50^οС со встряхиванием при 400 об/мин в течение 18-21 часа. Реакции гасили, разводя в 3 раза MeCN. Образцы реакций анализировали методом ОФ-ВЭЖХ с использованием описанных в примере 12.2 способов.

Таблица 6.1 Оценка устойчивости к растворителю карбоксиэстераз дикого типа (SEQ ID NO:2, 138 и 140)
Комбинация субстратов	Сорастворитель		*T. fusca*	*G. stearothermophilus*	*M. tuberculosis*
#3	Только буфер		+++++	++	++
	MeCN	15%	++	++	++
	MeCN	25%	++	++	++
	THF	15%	++	-	++
	THF	25%	++	++	++
	DMSO	15%	++++	+	-
	DMSO	25%	+++	++	++
#5	Только буфер		++	-	-
	MeCN	15%	+	+	++
	MeCN	25%	+	+	-
	THF	15%	++	-	-
	THF	25%	+	-	-
	DMSO	15%	++	-	-
	DMSO	25%	++	-	-
¹Уровни повышенной активности определяли относительно эталонного порошка в качестве отрицательного контроля (таблица 5.1), и им давали следующие значения: “-” = отсутствие активности; “+” >1-кратной активности; “++” >1-кратной активности, <2-кратной активности; “+++” >2-кратной, <3-кратной активности; "++++" >4-кратной, <5-кратной активности; “+++++” >5-кратной активности.

Пример 7

Получение и анализ библиотек сконструированных полипептидов карбоксиэстераз Т.fusca

[0208] Библиотеки плазмид, содержащих разработанные гены карбоксиэстераз T.fusca, трансформировали в E.coli в соответствии со способами, описанными в примере 1, и получали, следуя описанным в примере 2 способам. Клеточные лизаты использовали для проведения оценок активностей, описанных в примерах 8 и 9.

Пример 8

Способность к амидированию сконструированных полипептидов карбоксиэстераз Т. fusca на комбинациях субстратов #3, 8-12

[0209] Варианты карбоксиэстеразы T. fusca были получены в соответствии с примером 7. Для анализа способности к амидированию на комбинации субстратов #3 (смотрите таблицу 3.1) 20 мкл супернатанта, полученного, как описано в примере 7, добавляли к смеси 25 мкл MeCN с 3 М этилбензоатом, 110 мкл 0,6 М изобутиламина в 0,2 М TEoA (с доведением pH до 9,5) и 65 мкл 0,2 М TEoA, pH 8,5. Реакционные смеси инкубировали при 50^οС и встряхивали при 300 об/мин в течение 18 часов. Образцы гасили путем разведения в 4 раза в MeCN. Анализ реакций проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ с использованием описанных в примере 12.2 способов.

[0210] Для оценки способности к амидированию на комбинациях субстратов #3, 8-12 (смотрите таблицу 3.1), 20-50 мкл супернатанта, полученного, как описано в примере 7, добавляли к смеси 25 мкл MeCN с 2-3,2 М амином, 110 мкл 0,4-0,6 М суспензии эфира в 0,2 М TEoA (с доведением pH до 8) и 35-65 мкл 0,2 М TEoA, pH 8,5-9,0. Реакционные смеси инкубировали при 50^οС и встряхивали при 300 об/мин в течение 16-18 часов. Образцы гасили путем разведения в 4 раза в MeCN. Анализ реакций проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ, как описано в примерах 13.3, 13.4 и 13.5. В одном эксперименте с использованием комбинации субстратов #8, 50 мкл супернатанта, полученного, как описано в примере 7, добавляли к смеси 25 мкл MeCN с 3 М метиловым эфиром глицина, 110 мкл 0,6 М анилина в 0,2 М TEoA (с доведением рН до 8) и 35 мкл 0,2 М TEoA, рН 8,5. Реакционные смеси инкубировали при 50^οС и встряхивали при 300 об/мин в течение 18 часов. Образцы гасили путем разведения в 4 раза в MeCN. Анализ реакций проводили методом ОФ-ВЭЖХ с использованием описанных в примере 12.3 способов. Замены аминокислот в этих вариантах указаны согласно SEQ ID NO:2.

Таблица 8.1: Амидирование ¹ с помощью вариантов карбоксиэстераз *T. fusca* относительно SEQ ID NO:2 на комбинациях субстратов 3, 8, 9, 10, 11 и 12
№ варианта	SEQ ID NO: (нуклеотидная/ аминокислотная)	Мутации аминокислот	Комбинация 3	Комбинация 8	Комбинация 9	Комбинация 10	Комбинация 11	Комбинация 12
1		A108W	***
2	3/4	L282Q	***
3	5/6	L282A	***	*		*
4	7/8	L282T	***			*	*****
5		A108K	***
6	9/10	A285L	**	*
7		I69F	**
8	11/12	L282C	**	*
9		L282W	**
10		L282R	**
11		F323Y	**
12		I69W	*
13	13/14	A108G	*	***
14		I69Y	*
15		T110A	*
16		A108Q	*
17		A285P	*
18		T373G	*
19	15/16	N215R	*	*
20		T317P	*
21		I69L	*
22		N215K	*	*
23		A108R	*
24	17/18	L281P	*				*****
25	19/20	N215W	*					*
26		L209P	*
27		P283K	*
28		F377Y	*
29		A213P	*
30		G70W	*
31		A249V/F284P	*
32	21/22	G212P	*	*
33		A186G	*
34		I372A/V376A	*
35		A71R	*	*
36		Y320S	*
37	135/136	I372L	*
38		A71Y	*
39		A108S	*
40		S115T	*
41		A71G	*
42		A71F	*
43		S190H	*
44	23/24	V280G	*				*****
45		P64W	*
46		I69V	*
47		L209E	*
48		P117A	*
49		A68L	*
50		P64I	*
51		L209S	*
52		Y65W	*
53	25/26	N215P	*	*
54		P63A	*
55		S279L/V280G/ L282M	*
56		T110S	*
57		S115H	*
58		V376M	*
59		V376L	*
60		G70L	*
61		G214T	*
62		G212A	*
63		V376A	*
64		F284T	*
65		P405D	*
66		S185T	*
67		G70R	*
68		V280E	*
69	27/28	P283D	*				*****
70		Y320S/I372A/ V376G	*
71		G70T	*
72		P64E	*
73		Y320F	*
74		R428V	*
75		Y320A	*
76		R321S	*
77		W271K	*
78		W271P	*
79		Y65T	*
80		V376G	*
81		F377W	*
82		V118I	*
83		F323R	*
84		A217W	*
85		G214K	*
86		A429L	*
87		T110H	*
88		T110P	*
89		R153L	*
90	29/30	Y320G	*				***
91		Y320S/V376G/ F377V	*
92		G114H	*
93		V280S	*
94	31/32	R321L	*				***
95		Y320S/F323S/ I372A	*
96		T224I/P268S/I372F	*
97		V118N	*
98		A217V	*
99		A71P	*
100		L209V	*
101		Y320G/F323S	*
102		W271L	*
103		P420G	*
104	33/34	W271T	*					*
105		P283C	*
106	35/36	P63R	*	*
107	37/38	Y320W	*	*
108	39/40	S190K	*					*
109		R126C					****
110		L282S						*
111		F284C					*****
112		F284V						*
113		A269N		*
114		W271A					**
115		P283T					****
116		A71H/Q263R					*
117	41/42	N215R/W271R			*		*
118		A217G		*
119		A213S					**
120		G277M					***
121		L281V					***
122	43/44	P283V					****
123		D427A					*
124		P63Y		*
125		V270I/V470M			*
126		A269V					*
127		S279G					****
128		A217S					*
129	45/46	A68P				*	*
130		P63T		*
131		A285M		*				*
132	47/48	P283Y					*****
133		L311I		*
134		S279C					****
135		V270I		*
136		V270R					**
137		T317C					**
138		W271S		*			*
139		S279V					****
140		A217R			*
141		S190L					*
142		P64A					*
143		A71V					*
144		P117F					*
145	49/50	E184S/A249T					*****
146	51/52	F284T/P438T					*****
147		L209G					*
148		G278H					***
149		L324A					****
150		S190M					*
151		P64G					*
152		A276F					****
153		P64V					*
154		P64T					*
155		P66N					*
156		A217L					*
157		I69H					*
158		M216P					*
159		A213N					*
160		A217R/A231V					*
161		A213T/W271K					*
162		V118G/A349V					*
163		N215M					*
164		A188G					*
165		S190Q					*
166		T39M/F323I		*
167		G278S					****
168		V118N/A269T					*
169		A213C					*
170		Y65S					*
171		P283R/A429V						*
172		A213V					*
173	53/54	A213L			*		*
174		A186C					*
175		E184F			*
176		A213Q					*
177		I104Q/A429V					*
178		A217P					*
179		N111W					*
180	55/56	F377L		**
181	57/58	E184G			*		*****
182		G214V					*
183		F323C		*
184	59/60	R153H/N215P			*		*
185		W164R/W271T					**
186		G212R					*
187		P286V					**
188		F323I		*
189		N111M					*
190		I69G					*
191	61/62	G214L					*
192		G212S					*
193		W271Q/A416V					*
194	63/64	S190W			*		*
195		Q210T			*
196		G114Q					*
197		N111V					*
198		Y119S					*
199		N111L					*
200		A213E					*
201		S211I						*
202		A186T					*
203		F109G/P117M					*
204		Y119G					*
205		S211V					*
206		L281Y/D374N					*
207		E184P					*****
208		Y119P					*
209		A213R/S345G					*
210		W103T/P147S					*
211		W103R						*
212		N111S					*
213		W103P					*
214		Q210W					*
215		I104P					*
216		S211L					*
217		S190R					*
218		G183P					*
219		Q210P					*
220		A188E					*
221		H105L					*
222		G107P					*
223		S113P					*
224		G114A					*
225	65/66	F77S/E184G					*****
226		S279E					****
227		G107D/S185W					**
228		S211R					*
229		S185A					*
230		A186R					*
231		G187P					*
232		A186P					*
233		R62H/P117G					*
234		N111R					*
235		S115V					*
236		G107L			*
237		G107S			*
238		Y65G		*
239		E184Y						*
240		G174D/L282V						*
¹Уровни повышенной активности определяли относительно эталонного полипептида, и им давали следующие значения: < 1,5x; “ * ” = > 1,5x, < 3,5x; “ ” = > 3,5x, < 5,5x; “ * ” = > 5,5x, < 7,5x; “ ** ” = > 7,5x, < 9,5x; “ *** ” = > 9,5x, <10,5x.

ПРИМЕР 9

Оценка порошков во встряхиваемых колбах сконструированных полипептидов карбоксиэстераз T. fusca

[0211] Порошки разработанных карбоксиэстераз T. fusca готовили в количествах в масштабе встряхиваемой колбы в соответствии со способами, описанными в примере 5. Способность к амидированию лиофилизированных порошков во встряхиваемых колбах оценивали путем проверки их активности на комбинации субстратов #3. Сначала готовили реакционные смеси в объеме 1,0 мл с использованием 10 г/л порошка фермента, 0,3 М изобутиламина, 0,3 М этилбензоата в толуоле с последующим добавлением 20 мкл 0,2 М буфера TEoA, рН 8,5. Реакционные смеси нагревали до 50^οС при встряхивании при 500 об/мин в течение 60 часов. Реакции гасили, разводя 100 мкл реакционной смеси в 1,4 мл ацетона. Образцы реакций анализировали с помощью ОФ-ВЭЖХ, используя представленные в таблице 12.2 способы.

Таблица 9.1: Образованием амидов вариантами карбоксиэстеразы *T. fusca*
№ варианта:	Образование амида (FIOP) ¹ относительно SEQ ID NO:2
4	++++
3	++++
12	+++
31	+++
28	++
24	++
37	++
^{1 1}Уровни повышенной активности или избирательности определяли относительно эталонного полипептида SEQ ID NO:2, и им давали следующие значения: “++” > чем 1,2-кратное, но меньше чем 2,5-кратное повышение; “+++” > чем 2,5-кратное, но меньше чем 5-кратное; "++++" > чем 5-кратное, но менее чем 10-кратное.

Пример 10

Получение и анализ комбинаторных библиотек карбоксиэстераз T. fusca

[0212] Библиотеки в плазмидах, полученные путем комбинаторной перетасовки на варианте карбоксиэстеразы T. fusca (SEQ ID NO:8), трансформировали в E. coli W3110 в соответствии с описанными в примере 1 способами. Лизаты, полученные с HTP в соответствии с описанными в примере 2 способами, использовали для проведения оценок активности, описанных в примере 11.

Пример 11

Активность сконструированных полипептидов карбоксиэстераз T. fusca на выбранных комбинациях субстратов 3, 5, 8, 12-15

[0213] Варианты карбоксиэстеразы T. fusca, полученные из комбинаторных библиотек, анализировали на способность к амидированию на комбинациях субстратов #3, 5, 8 и 12-15 (смотрите таблицу 3.1). Для анализа способности к амидированию на комбинациях субстратов #3 (смотрите таблицу 3.1) 10 мкл супернатанта, полученного, как описано в примере 7, добавляли к смеси 25 мкл MeCN с 3 М этилбензоатом, 110 мкл 0,6 М изобутиламина в 0,2 М TEoA (с доведением pH до 8) и 75 мкл 0,2 M TEoA, pH 8,5. Реакционные смеси инкубировали при 50^οС и встряхивали при 300 об/мин в течение 18 часов. Образцы гасили, разводя в 4 раза в MeCN. Для анализа способности к амидированию на комбинациях субстратов #5, 8 и 12-15, 20-50 мкл супернатанта получали, как описано в примере 7, и добавляли к смеси 25 мкл MeCN с 2-3,2 М амина, 110 мкл 0,4-0,6 М суспензии эфира в 0,2 М TEoA (с доведением рН до 8) и 35-65 мкл 0,2 М TEoA, рН 8,5-9. Реакционные смеси инкубировали при 50^οС и встряхивали при 300 об/мин в течение 16-18 часов. Образцы гасили, разводя в 4 раза в MeCN. Анализ реакций проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ, используя способы, описанные в примерах 12.2 (для комбинации 3), 12.3 (для комбинации 8), 12,5 (для комбинаций 12 и 13), 12,6 (для комбинации 14) и 12,7 (для комбинаций 5 и 15). В одном эксперименте с использованием комбинации субстратов #8 20 мкл супернатанта, полученного, как описано в примере 7, добавляли к смеси 25 мкл MeCN с 3 М метиловым эфиром глицина, 110 мкл 0,6 М анилина в 0,2 М TEoA (с доведением рН до 9,5) и 65 мкл 0,2 М TEoA, рН 8,5. Реакционные смеси инкубировали при 50^οС и встряхивали при 300 об/мин в течение 18 часов. Образцы гасили, разводя в 4 раза в MeCN. Анализ реакций проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ, используя описанные в примере 12.3 способы.

Таблица 11.1: Амидирование с помощью вариантов карбоксиэстеразы *T. fusca* относительно SEQ ID NO:8
на комбинациях субстратов 3, 5, 8 и 12-15
№ варианта	SEQ ID NO: (нуклеотидная/ аминокислотная)	Мутации аминокислот	Комбинация 3	Комбинация 5	Комбинация 8	Комбинация 12	Комбинация 13	Комбинация 14	Комбинация 15
241	67/68	Y65W/I69L/I372L	****
242		Y65W/I69W/G70L/I372L	***
243		I69W/G70L/G459R	***
244		I69W/G70L	***
245		G70L	**
246	69/70	A68P/I69L/A343V/I372L	*		*			*
247		I69L/G70L/P331Q/I372M	*		*
248	71/72	I69L/W271Y/I372L	*	*	*
249	73/74	I372L	*	*	*	*
250	75/76	P63R/A108G	*					*	*
251		R126C/I372L	*
252		Y320W	*						*
253		I69L/I372L	*
254		I69W/G212A/A213L/N215R/ V280G/L281P	*
255		I69W/G70L/I372M	*
256	77/78	Y65W/I69M/G70A/L281P/ I372L	*		*	*
257		A108G	*					*	*
258		R126C	*
259	79/80	I69W/I372M	*	*	**			*
260		I69M/G70A/I372M	*		*				*
261		I69L/T282C/A343V/I372L	*
262		P63R	*						*
263	81/82	V280G/A285L/I372L	*			*			*
264		A68P/I69L/W271Y	*		*
265	83/84	W271Y/A343V/I372L	*	*		*	*
266	85/86	I69L	*		*		*		*
267	87/88	L281P/I372L	*	*	*			*
268		I69L/W271Y			*
269		I372M		*	*
270	89/90	P63R/Y65G/A108G						*	***
271		A343V/I372L			*
272	91/92	A68P/W271Y/I372L		**					**
273	93/94	A108G/A285L						*	**
274		Y65W/G70L/I372M		*		*
275		I372L/A381L		*					**
276		I69W/N215P							***
277		I69W		*****	*
278		A108G/V270E						*	*
279		W271Y/A343V/I372L/A381L		*****
280		P63Y				*
281		A108G/F377I							****
282		P63A						*
283		A68P/I69L/T282C/V287I							*
284		T373G				*			*
285		I69W/T282A			*
286	95/96	A108G/N215K				*			*****
287		N215P/I372L				*			*
288		Y65G/Y320W							*
289		I69Y/A108G/L281P/A285P						*
290		P63R/A108G/Y320W/F323C							*
291		I69L/N215P/W271Y/I372L				**
292	97/98	A68P		**			*		*
293		P63Y/P268A/A269N/V270I/ A429V		*		*
294		W271Y		*
295		W271Y/A343V		*****
296		A68P/I69W/N215P							*****
297		R126C/E184S/A213S/I372L				*
298		A108G/M189L/Y320W							***
299		I69F/A108G/V270E/I372L/ F377L							*****
300		I69L/N215P/W271Y/V280G/ L281P/T282C							***
301	99/100	N215R/I372L				*			**
302		P63R/F377I							****
303		A108G/Y320W/F323I							*
304		I372L/F377L							*****
305		N215P/W271Y/I372L							***
306		I69L/N215P/A343V/I372L/ A381L				*
307		R126C/N215P							*
308	101/102	N215K/L281P/A285L/I372L				**			**
309		A68P/F377L							**
310		A68P/I69W/G214R/N215P/ W271Y				*	*
311		A68P/A108G/F377L							*****
312		F377L							**
313	103/104	P63T/N215R				*	*		**
314		A68P/I69W/M189I/A381L					**
315		A68P/E184S				*
316	105/106	I69W/N215R				*			*****
317		I69L/N215P/W271Y/T282A							**
318		I69W/A108S			*
319		N215P/Y320G				*			*
320		N215R/V280G/L281P/A285L/ I372L				*			*
321		V181L/N215P							*
322	107/108	P63A/N215R/A343V				*	*		***
323		N215P/Y320G/I372L				*
324		M189I/F377I							***
325	109/110	P63Y/G212P/N215R				*	*		**
326		A108G/F377L							***
327		P63Y/N215P/A269N				*	*
328		I69W/N215K/A343V					*
329		A68P/I69W/M189E/G214R/ N215P/W271Y/L281P/T282G/ A343V/A381L		*
330	111/112	P63Y/G212P/N215R/P268A/ A269N/A343V				*			**
331		I69F/N215K				*			*****
332		G214R/N215P/W271Y							***
333		I69F/A285L/T373G				*			*
334		N215R/A249T/V280G/L281P/ A285L/I372L				*			*
335		A68P/I69L/N215P					*
336		A68P/I69W/M189I/I372L					**
337		R126C/M189I/A285L/I372L							**
338		N215P				*			**
339		A249T/F377L							*
340		N215K/A285L/V445L				*			***
341	113/114	P63Y/N215R				*	*		*
342		P63A/M189A							*
343		N215K				*			***
344		N215K/F323Y				*			*
345		A285L/F323I							*
346		A68P/I69W/M189I/W271Y					*
347		I69W/M189I/A343V/A381L		*
348		P63Y/N215R/V270I/W271S							*
349		N215R				*	*		*
350		I69W/M189E/I372L		*
351		N215P/I372L/F377L				*			*****
352		A68P/N215P/W271Y/A343V/ I372L/A381L				*	*
353		N215R/Y320G				*			***
354		I69W/M189I/W271Y							***
355		I69L/M189I/V280G/T282G/ A343V/I372L/A381L		*****
356		P63R/A108G/A285L/F377I							*****
357		I69W/M189E/W271Y/A343V		*
358		I69W/M189I					*
359		A68P/G214R/N215P/W271Y/ L281P/T282A/I372L							*
360		M189I/Y320W/F377I							****
361		N215K/L281P/T373G				*			*
362		N215R/A285P							****
363		M189I/V270E/A285L							**
364		P63R/Y65G/A108G/F377I							*****
365		I69W/N215R/F323Y				*			*
366		M189Q		*****
367		M189I/N215P/A343V/I372L				*
368		M189Q/A343V		*****
369		P63R/Y65G/Y320W/F323I							**
370		I69W/G214R/N215P/W271Y/ I372L/F377Y/A381L		*****
371		A108G/T282A/A285L/F377L							*****
372		N215P/A381L				*	*
373		A108G/M189I/T282A/A285L/ Y320W							**
374		T282A/A285L/Y320W/F323I							**
375		P63R/A108G/T282A/A285L/ F377L							*****
376		I69W/G214R/W271Y/T282A							**
377		M189Q/A381L		****
378	115/116	A68P/I69W/M189I/G214R/ N215P		*****		*	*
379		Y65G/Y320W/F323I							***
380	117/118	N215K/T373G				*			****
381		I69W/M189Q/I372L/F377Y		*****
382		M189E/I372L/F377Y		*****
383		A108G/M189L							**
384		A68P/I69W/M189E/A343V/ A381L					*
385		I69W/M189E/G214R/A343V/ I372L		*****
386		I69L/M189I/T282A					*
387		A68P/M189I/W271Y/I372L					*
388		G214R/N215P/W271Y/F377Y				*
389	119/120	N215K/I372L/F377L				*			*****
390	121/122	M189I/A343V		*****			*
391	123/124	N215R/L281P/A285L/T373G				***			*
392	125/126	N215W/A285L/G346S				*			**
393		G214R/W271Y							*
394		R126C/E184S/A213S/V280G/ L281P/A285L/Y320G				**
395		A68P/I69L/M189I/L281P/ T282C/I372L/F377Y/A381L				***
396		A68P/M189I/A343V					*
397		I69L/M189I/W271Y/A343V/ A381L					**
398		M189L							**
399		P63Y/M189L							*
400		I69L/M189I					**
401		A68P/I69W/G214R/A343V					*
402		N215W				*			*
403		M189I/V280G/T282A					*
404		N215W/A285P							**
405		M189I/N215K							*
406		A68P/I69L/M189I/G214R/ N215P/W271Y					*
407		A68P/I69L/M189Q/W271Y/ V280G/I372L/A381L		**
408	127/128	M189I		**			*		*
409		P63R/Y65G/T282A/A285L/ Y320W/F323I							*
410		I69W/M189I/N215P/A343V					*
411		A108G/M189L/F377I							**
412		I69F/M189L							**
413		N215K/A285L/T317P				*			*
414		I69Y/T110A/N215R/L281P				*
415		I69L/N215R/A285P/T317P							*
416		I69W/G214R/W271Y/A343V					*
417		A213S/N215P/Y320G				*
418		I69Y/M189L/L281P/T373G							*
419		N215W/T373G				*			*
420		M189I/G214R/N215P/W271Y/ T282G					*
421		P63R/Y65G/A108G/M189L							*
422	129/130	I69F/N215K/A269L/V270I/ F377L							*****
423		A68P/N215P/F377L							****
424		N215P/F377L							****
425		I69L/M189I/G214R/W271Y/ L281P/T282A/A343V							**
426		M189I/N215R/A249T/G277M							*
427		G70L/G212P							*
428		A68P/E184S/M189E				**
429		M189Q/G214R		*****
430		M189Q/A343V/F377Y		*****
431	131/132	M189Q/N215P/W271Y/L281P/ T282C/F377Y		*****
432		G214R/V280G/T282A/A343V/ F377Y/A381L		**
433		A68P/I69L/M189E/G214R/ W271Y/V280G		**
434		A68P/I69W/M189E/V280G/ L281P/T282A/I372L/F377Y		**
435		A68P/I69L/M189E/G214R/ I372L		*
436		I69L/M189E/W271Y/L281P/ T282A		*
437		I69L/M189Q/F377Y		*
438		A68P/I69L/M189Q/G214R		*
439		A68P/I69W/M189I/G214R/ F377Y/A381L		*
440	133/134	A108G/N215P/F377L							*****
441		I69F/N215R				*			***
442		N215K/I372L				*			***
443		V270E/F377L							*
444		A269L/V270E/L281P/I372L/ F377L							*
445		M189I/V270E/I372L							*
446		A108G/A269L/V270E						*
¹¹Уровни повышенной активности определяли относительно эталонного полипептида, и им давали следующие значения: < 1,5x; “ * ” = > 1,5x, < 3,5x; “ ” = > 3,5x, < 5,5x; “ * ” = > 5,5x, < 7,5x; “ ** ” = > 7,5x, < 9,5x; “ *** ” = > 9,5x, <10,5x.

ПРИМЕР 12

Аналитическое детектирование образуемых амидов и предшествующих субстратов

[0214] Данные, описанные в вышеприведенных примерах, были собраны с использованием аналитических методов, представленных в таблицах 12.1-12.7. Все представленные здесь методы находят применение при анализе продуктов вариантов карбоксиэстеразы T. fusca, полученных с использованием настоящего изобретения. Однако не предполагается, что настоящее изобретение ограничивается описанными здесь методами для анализа продуктов, представленных здесь и/или полученных с использованием представленных здесь способов. Действительно, любой подходящий способ находит применение в настоящем изобретении. Пик элюции продукта подтверждали либо путем подтверждения с использованием коммерчески доступного стандарта, либо путем анализа с использованием ЖХ-МС/МС (жидкостной хроматографией с тандемной масс-спектрометрией).

Таблица 12.1: Аналитический метод
Инструментальное средство	ВЭЖК серии Agilent 1100
Колонка	Agilent XDB C-18, 4,6×100 мм, 5 мкм
Подвижная фаза	Градиент I (20% метанола; 80% воды) Изократический градиент
Скорость потока	1000 мл/мин
Время выполнения	10,0 мин
Порядок элюирования	Комбинация субстратов #1 - анилин, ацетанилид (1) Комбинация субстратов #2 - амид (2), метилфенилацетат
Температура колонки	RT
Объем инъекции	10 мкл
Детектирование	УФ 254 нм; Детектор: распределение по молекулярной массе

Таблица 12.2: Аналитический метод
Инструментальное средство	ВЭЖК серии Agilent 1100
Колонка	Phenomenex Luna, C-18 4,6×150 мм, 5 мкм
Подвижная фаза	Градиент I (A=0,1% TFA в воде, B=0,1% TFA в MeCN) Время(мин) % A 0,000 100 7,000 5
Скорость потока	1,5 мл/мин
Время выполнения	8,000 мин
Порядок элюирования	Комбинация субстратов #3 - изобутилбензамид (3), этилбензоат Комбинация субстратов #4 - трет-бутилбензамид (4), этилбензоат Комбинация субстратов #6 - трет-бутоксибензамид (6), этилбензоат Комбинация субстратов #7 - N’-трет-бутоксикарбонилбензгидразид (7), этилбензоат
Температура колонки	25^οC
Объем инъекции	10 мкл
Детектирование	УФ 254 нм; Детектор: распределение по молекулярной массе

Таблица 12.3: Аналитический метод
Инструментальное средство	ВЭЖК серии Agilent 1100
Колонка	Phenomenex Luna, C-18 4,6×150 мм, 5 мкм
Подвижная фаза	Градиент I (A=0.1% TFA в воде, B=0,1% TFA в MeCN) Время(мин) % A 0,000 90 2,750 45 3,150 5
Скорость потока	1,5 мл/мин
Время выполнения	5,000 мин
Порядок элюирования	Комбинация субстратов #8 - анилин, (амид 8)
Температура колонки	30^οC
Объем инъекции	10 мкл
Детектирование	УФ 220 и 260 нм; Детектор: распределение по молекулярной массе

Таблица 12.4: Аналитический метод
Инструментальное средство	ВЭЖК серии Agilent 1100
Колонка	Phenomenex Luna, C-18 4,6×150 мм, 5 мкм
Подвижная фаза	Градиент I (A=0,1% TFA в воде, B=0,1% TFA в MeCN) Время(мин) % A 0,000 90 2,750 30 3,150 5
Скорость потока	1,5 мл/мин
Время выполнения	5,000 мин
Порядок элюирования	Комбинация субстратов #9 - бензиламид, (амид 9)
Температура колонки	30^οC
Объем инъекции	10 мкл
Детектирование	УФ 230 и 260 нм; Детектор: распределение по молекулярной массе

Таблица 12.5: Аналитический метод
Инструментальное средство	ВЭЖК серии Agilent 1100
Колонка	Phenomenex Luna, C-18 4,6×150 мм, 5 мкм
Подвижная фаза	Градиент I (A=0,1% TFA в воде, B=0,1% TFA в MeCN) Время(мин) %A 0,000 95 1,100 75 5,900 30
Скорость потока	1,5 мл/мин
Время выполнения	8,000 мин
Порядок элюирования	Комбинация субстратов #10 - S-фенилэтиламин, (амид 10), этилбензоат Комбинация субстратов #11 - R-фенилэтиламин, (амид 11), этилбензоат Комбинация субстратов #12-4-метилпиперидин, этиловый эфир пиразина (амид 12) Комбинация субстратов #13 - S-фенилэтиламин, этиловый эфир пиразина, (амид 13)
Температура колонки	25^οC
Объем инъекции	10 мкл
Детектирование	УФ 230 и 260 нм; Детектор: распределение по молекулярной массе

Таблица 12.6: Аналитический метод
Инструментальное средство	ВЭЖК серии Agilent 1100
Колонка	Phenomenex Luna, C-18 4,6×150 мм, 5 мкм
Подвижная фаза	Градиент I (A=0,1% TFA в воде, B=0,1% TFA в MeCN) Время(мин) %A 0,000 70 2,750 5 3,750 5
Скорость потока	1,5 мл/мин
Время выполнения	5,800 мин
Порядок элюирования	Комбинация субстратов #14 - (амид 14), эфир этил-4-индола
Температура колонки	25^οC
Объем инъекции	10 мкл
Детектирование	УФ 230 и 260 нм; Детектор: распределение по молекулярной массе

Таблица 12.7: Аналитический метод
Инструментальное средство	ВЭЖК серии Agilent 1200 с использованием автоматической пипетки CTC-PAL; Q-Trap масс-спектрометра AB Sciex 4000
Колонка	Agilent Eclipse, C-18 4,6×50 мм, 1,6 мкм
Подвижная фаза	Градиент I (A: 0,1% муравьиная кислота в воде; B: 0,1% муравьиная кислота в MeCN) Время(мин) % A 0,000 90 1,000 90 3,000 5 4,000 5
Скорость потока	0,6 мл/мин
Время выполнения	5,000 мин
Целевая масса при регистрации MRT-переходов	MRM: 204,3 → 105,4; (амид 5) MRM: 235,4 → 86,4; (амид 15)
Температура колонки	RT
Объем инъекции	10 мкл (Образцы гасили 2-кратным разведением в смеси MeCN и воды в соотношении 1:1).
Параметры детектирования	Анализ ЖХ-МС/МС Исходные параметры: CUR: 40; IS: 5500; TEM: 550^οC; GS1: 40; GS2: 40; DP: 120; EP: 10; CE: 27; CXP: 14.

[0215] Хотя были проиллюстрированы и описаны различные конкретные варианты осуществления, будет понятно, что могут быть внесены различные изменения без отступа от сущности и объема настоящего изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CODEXIS, INC.

<120> ПОЛИПЕПТИДЫ КАРБОКСИЭСТЕРАЗЫ ДЛЯ ОБРАЗОВАНИЯ АМИДОВ В РЕЗУЛЬТАТЕ

РЕАКЦИЙ СОЧЕТАНИЯ

<130> CX2-165US1

<160> 140

<170> FastSEQ для Windows версии 4.0

<210> 1

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 1

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 2

<211> 497

<212> Белок

<213> Thermobifida fusca

<400> 2

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 3

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 3

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgcagccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 4

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 4

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Gln Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 5

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 5

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctggctccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 6

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 6

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Ala Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 7

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 7

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 8

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 8

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 9

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 9

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttctgcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 10

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 10

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Leu Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 11

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 11

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgtgtccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 12

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 12

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Cys Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 13

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 13

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgggtttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 14

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 14

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 15

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 15

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaggatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 16

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 16

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Arg Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 17

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 17

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

cctctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 18

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 18

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Pro Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 19

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 19

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gctggatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 20

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 20

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Trp Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 21

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 21

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agccctgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 22

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 22

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Pro Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 23

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 23

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtggg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 24

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 24

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Gly Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 25

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 25

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcccgatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 26

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 26

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Pro Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 27

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 27

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctggatt ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 28

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 28

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Asp Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 29

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 29

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaaggt 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 30

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 30

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Gly

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 31

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 31

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

ttgctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccagc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 32

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 32

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Leu Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 33

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 33

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gtgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt actggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 34

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 34

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Thr Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 35

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 35

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtcggc catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 36

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 36

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Arg Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 37

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 37

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatgg 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 38

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 38

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Trp

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 39

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 39

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgaag gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 40

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 40

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Lys Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 41

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 41

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaggatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt aggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 42

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 42

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Arg Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Arg Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 43

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 43

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctggttt ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 44

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 44

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Val Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 45

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 45

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga gcctattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 46

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 46

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Pro Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 47

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 47

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgtatt ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 48

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 48

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Tyr Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 49

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 49

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggct ctagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttacacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 50

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 50

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Ser Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Thr Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 51

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 51

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccaa ctgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gacagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 52

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 52

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Thr Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Thr Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 53

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 53

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcctgg gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 54

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 54

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Leu Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 55

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 55

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgct tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 56

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 56

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Leu Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 57

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 57

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg ggagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 58

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 58

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Gly Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 59

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 59

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcacg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gccctatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 60

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 60

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn His Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Pro Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 61

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 61

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcac ttaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 62

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 62

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Leu Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 63

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 63

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgtgg gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 64

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 64

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Trp Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 65

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 65

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctc cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg ggagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 66

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 66

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Ser Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Gly Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 67

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 67

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catggccaga ggcacttggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcctgaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 68

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 68

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Trp Pro Glu Ala Leu Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 69

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 69

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga gccgctgggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagtga agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcctgaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 70

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 70

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Pro Leu Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Val Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 71

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 71

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcactgggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tatggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcctgaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 72

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 72

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Leu Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 73

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 73

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atccttaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 74

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 74

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 75

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 75

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtcggc catacccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tggctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 76

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 76

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Arg Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 77

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 77

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catggccaga ggcaatggct gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgtca gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtt 840

ccgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atccttaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 78

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 78

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Trp Pro Glu Ala Met Ala Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Pro Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 79

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 79

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcatggggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatgaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 80

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 80

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Trp Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Met Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 81

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 81

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgcga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcccag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtggt 840

ctgacgccat ttctgcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatat 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atccttaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 82

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 82

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Gly Leu Thr Pro Phe Leu Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 83

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 83

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tatggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagtga agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcctgaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 84

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 84

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Val Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 85

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 85

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcactgggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 86

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 86

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Leu Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 87

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 87

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtt 840

ccgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcctgaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 88

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 88

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Pro Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 89

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 89

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtcggc caggaccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tggctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 90

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 90

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Arg Pro

50 55 60

Gly Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 91

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 91

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga gccgattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tatggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcctgaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 92

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 92

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Pro Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 93

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 93

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccgc catacccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tggctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgaccccat ttttacccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 94

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 94

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Leu Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 95

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 95

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgggtttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaagatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 96

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 96

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Lys Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 97

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 97

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga gccgattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 98

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 98

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Pro Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 99

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 99

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgcga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcgg gccgaatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atccttaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 100

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 100

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Arg Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 101

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 101

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcatttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaagatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ccgacgccat ttttacccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atccttaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 102

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 102

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Lys Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Pro Thr Pro Phe Leu Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 103

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 103

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtacgc catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggagcag gccgcatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 104

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 104

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Thr Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Arg Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 105

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 105

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcatggggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaggatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 106

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 106

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Trp Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Arg Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 107

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 107

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtgcgc catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggagcag gccgcatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccggcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagtga agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 108

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 108

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Ala Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Arg Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Val Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 109

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 109

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgttatc catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agccccgcag gccgcatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccggcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 110

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 110

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Tyr Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Pro Ala Gly Arg Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 111

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 111

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgttatc catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agccccgcag gccgcatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tgcgaatgtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagtga agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 112

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 112

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Tyr Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Pro Ala Gly Arg Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Ala Asn Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Val Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 113

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 113

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgttatc catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggagcag gccgcatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcga agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 114

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 114

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Tyr Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Arg Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 115

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 115

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga gccgtggggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgattagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcac gtccgatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 116

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 116

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Pro Trp Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Arg Pro Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 117

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 117

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaaaatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac ggatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcgggg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 118

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 118

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Lys Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Gly Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 119

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 119

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaagatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atccttaccg accaggtgtt gcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 120

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 120

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Lys Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Leu Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 121

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 121

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgattagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagtga agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 122

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 122

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Val Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 123

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 123

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaggatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ccgacgccat ttctgcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcgggg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 124

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 124

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Arg Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Pro Thr Pro Phe Leu Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Gly Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 125

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 125

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gctggatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttctgcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac ggatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcagttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcactg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 126

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 126

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Trp Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Leu Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Ser Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 127

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 127

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgattagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 128

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 128

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 129

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 129

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcatttggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaagatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccattaatc tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcattaccg accaggtgtt gcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 130

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 130

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Phe Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Lys Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Leu Ile Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Leu Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 131

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 131

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgcagagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcccgatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tatggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ccgtgcccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcatcaccg accaggtgta tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 132

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 132

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Gln Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Pro Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Pro Cys Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 133

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 133

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgggtttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcccgatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgacgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atcattaccg accaggtgtt gcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 134

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 134

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Pro Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Thr Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Ile Thr Asp Gln Val Leu Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 135

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 135

atggagatcg tgattcgcac gggcagcgga gatgtgcgtg gtagtaaaga gaacggcatt 60

gcagtgtttc gtggcatccc ctatgcggaa ccaccggttg gcgctcaccg ctttacggcg 120

ccacgtccac cacgtccatg ggatggtgtt cgtgacgcta ctgaattctc ggcgactgca 180

ccacgtccac catatccaga ggcaattggt gcgttgctga tcgaacgctt cattcctggc 240

gacgattacc tgaccctgaa cgtatggact ccggacccga atgcagttgg tctgccagtc 300

atggtgtgga ttcatggtgg tgcctttact aacggtagtg gtagcgaacc ggtgtatgac 360

ggtgcagcat ttgcacgtga tggtgtggtg tttgtgagct tcaactatcg tctgggcatc 420

attggctttg cagatctgcc agatgcacca agtaatcgcg gcctgttaga tcaaatcgcc 480

gcactggaat gggttcgcga caacattgca cgctttgggg gtgacccagg taatgtgacc 540

gtgtttggcg aaagtgcggg cgcgatgagc gtgtgcaccc tgatggcaac cccgcgtgca 600

cgtggtctgt ttcgtcgtgc tatcttacag agcggcgcag gcaacatggc agtcgctgca 660

gaagatgcta ccacaatcgc agctgtgatt gcccatcgtt taggtgttga gccaactgca 720

gcagcattag cgcatgttcc agttgcacag ttactggatg ttcagcagca agttgcccaa 780

gagattcaag gcgcgccaga tccagcagtt tggggtgaac gtattgcggg cggcagtgtg 840

ctgctgccat ttgctcccgt cattgatggg gaactgctga gccaacgtcc agcggaagcc 900

attgcgggcg gcgcaggtca tgatgtagac ctcttgtttg gcactaccac cgatgaatac 960

cgtctgtttc tggcaccaac tgggctgctg ccgttcatca caggggacta tgttaccact 1020

cacttagcca agagcggttt agatgcagat gcggccaaag cgtataccgc ggaaggtcgt 1080

ggtgaagaac cgggcgacat cttggccagc atccttaccg accaggtgtt tcgtattccg 1140

gcgctgcgta ttgcagaatc ccgtgttgat gcgcctgcac gtacctttgg ctacgaattc 1200

gcgtggcgta cgccacaatt ggacggcatt ctgggtgctt gtcatgcggt ggaacttccg 1260

ttcgtgtttc gcaccttaga ccgtgcggca tcgctggtgg gcacaaaccc gccagaagaa 1320

ctggcagaaa ccgtacacaa tgcctgggtg cgcttcgcga catcaggtga tccagggtgg 1380

ccggcgtgga atccggaaac ccgcagcgtg atgcgctttg atcacccggt ttccgagatg 1440

gttaccgacc cgtacccggc gacccgtgca ctgtgggatg gtgtgccatt g 1491

<210> 136

<211> 497

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 136

Met Glu Ile Val Ile Arg Thr Gly Ser Gly Asp Val Arg Gly Ser Lys

1 5 10 15

Glu Asn Gly Ile Ala Val Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Ala His Arg Phe Thr Ala Pro Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp

35 40 45

Gly Val Arg Asp Ala Thr Glu Phe Ser Ala Thr Ala Pro Arg Pro Pro

50 55 60

Tyr Pro Glu Ala Ile Gly Ala Leu Leu Ile Glu Arg Phe Ile Pro Gly

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Val Trp Thr Pro Asp Pro Asn Ala Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Thr Asn Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Glu Pro Val Tyr Asp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Phe Val Ser Phe Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Ile Gly Phe Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Asp Ala Pro Ser Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Trp Val Arg Asp Asn Ile Ala Arg Phe Gly Gly Asp Pro

165 170 175

Gly Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Cys

180 185 190

Thr Leu Met Ala Thr Pro Arg Ala Arg Gly Leu Phe Arg Arg Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Ala Gly Asn Met Ala Val Ala Ala Glu Asp Ala Thr

210 215 220

Thr Ile Ala Ala Val Ile Ala His Arg Leu Gly Val Glu Pro Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ala His Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Asp Val Gln Gln

245 250 255

Gln Val Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Pro Asp Pro Ala Val Trp Gly

260 265 270

Glu Arg Ile Ala Gly Gly Ser Val Leu Leu Pro Phe Ala Pro Val Ile

275 280 285

Asp Gly Glu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Ala Glu Ala Ile Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Gly His Asp Val Asp Leu Leu Phe Gly Thr Thr Thr Asp Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Leu Phe Leu Ala Pro Thr Gly Leu Leu Pro Phe Ile Thr Gly Asp

325 330 335

Tyr Val Thr Thr His Leu Ala Lys Ser Gly Leu Asp Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Gly Glu Glu Pro Gly Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ser Ile Leu Thr Asp Gln Val Phe Arg Ile Pro Ala Leu Arg Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Arg Val Asp Ala Pro Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Glu Phe

385 390 395 400

Ala Trp Arg Thr Pro Gln Leu Asp Gly Ile Leu Gly Ala Cys His Ala

405 410 415

Val Glu Leu Pro Phe Val Phe Arg Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Leu

420 425 430

Val Gly Thr Asn Pro Pro Glu Glu Leu Ala Glu Thr Val His Asn Ala

435 440 445

Trp Val Arg Phe Ala Thr Ser Gly Asp Pro Gly Trp Pro Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Glu Thr Arg Ser Val Met Arg Phe Asp His Pro Val Ser Glu Met

465 470 475 480

Val Thr Asp Pro Tyr Pro Ala Thr Arg Ala Leu Trp Asp Gly Val Pro

485 490 495

Leu

<210> 137

<211> 1494

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 137

atggaacgta cggttgtgga aactcgttat ggtcgtttac gcggagaaat gaatgaaggt 60

gtgtttgtct ggaaaggtat tccttacgct aaagcccctg taggagagcg tcgctttctg 120

ccaccagaac caccagatgc atgggatggt gttcgtgagg cgaccagctt tggtccagtt 180

gttatgcagc cgagtgatcc aatcttcagc ggtctgttag gtcgcatgtc cgaagcgcca 240

agtgaagatg gtctgtacct gaacatttgg agcccagcgg cagatggtaa gaaacgtcca 300

gtactgttct ggattcatgg tggtgcgttc ctgttcggta gtggtagtag tccatggtac 360

gatggtactg cgtttgccaa acacggtgat gttgtggtgg tgacgatcaa ctatcgtatg 420

aacgtattcg gctttctgca tttgggggat tctttcggag aagcgtatgc gcaagccggc 480

aacctgggta ttctggatca ggtggcagca ttacgctggg tgaaggagaa cattgccgca 540

ttcggaggcg acccggacaa catcacaatc ttcggcgagt cagcgggcgc ggcatcggtt 600

ggtgttcttc tgagtttacc agaagcaagt ggtctgtttc gtcgtgcaat gttgcaaagc 660

ggtagtggta gtctgttact gcgttcgccg gagactgcga tggcaatgac cgagcgtatt 720

ctggacaaag caggtattcg tccaggtgat cgtgaacgtc tgcttagtat tccggcggaa 780

gagctcttgc gtgcagcgtt gagtttaggt ccaggcgtta tgtatggtcc ggttgttgat 840

ggtcgtgtgc tgcgccgtca tccaattgaa gcactccgtt atggtgccgc aagtggcatt 900

cccattctga ttggcgtgac caaggacgag tacaatctgt ttaccttaac tgacccgagt 960

tggactaagc tgggtgagaa agaactgctg gaccgcatca atcgcgaagt tggtccagtt 1020

ccagaggaag caatccgcta ctacaaggaa accgcggaac caagtgcacc aacttggcag 1080

acttggctgc gcatcatgac ctatcgtgtc tttgtggagg gtatgttgcg taccgcggat 1140

gcacaggcag cacaaggagc cgatgtgtac atgtaccgct tcgactacga aacgccagtg 1200

tttggcggcc aattgaaagc ttgtcatgca ttggaactgc cgtttgtgtt ccacaacctg 1260

catcaacctg gagtggctaa cttcgttggt aatcgccctg agcgtgaagc gattgcaaac 1320

gagatgcatt acgcgtggtt gagctttgcg cgcaccggtg acccgaatgg tgctcatctg 1380

ccggaagcat ggccggcata caccaatgaa cgtaaagcag cgtttgtgtt tagcgcggcc 1440

tctcatgttg aagacgatcc ctttgggcgc gaacgtgcgg cgtggcaagg tcgc 1494

<210> 138

<211> 498

<212> Белок

<213> Geobacillus stearothermophilus

<400> 138

Met Glu Arg Thr Val Val Glu Thr Arg Tyr Gly Arg Leu Arg Gly Glu

1 5 10 15

Met Asn Glu Gly Val Phe Val Trp Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Ala

20 25 30

Pro Val Gly Glu Arg Arg Phe Leu Pro Pro Glu Pro Pro Asp Ala Trp

35 40 45

Asp Gly Val Arg Glu Ala Thr Ser Phe Gly Pro Val Val Met Gln Pro

50 55 60

Ser Asp Pro Ile Phe Ser Gly Leu Leu Gly Arg Met Ser Glu Ala Pro

65 70 75 80

Ser Glu Asp Gly Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Ser Pro Ala Ala Asp Gly

85 90 95

Lys Lys Arg Pro Val Leu Phe Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Leu Phe

100 105 110

Gly Ser Gly Ser Ser Pro Trp Tyr Asp Gly Thr Ala Phe Ala Lys His

115 120 125

Gly Asp Val Val Val Val Thr Ile Asn Tyr Arg Met Asn Val Phe Gly

130 135 140

Phe Leu His Leu Gly Asp Ser Phe Gly Glu Ala Tyr Ala Gln Ala Gly

145 150 155 160

Asn Leu Gly Ile Leu Asp Gln Val Ala Ala Leu Arg Trp Val Lys Glu

165 170 175

Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asp Asn Ile Thr Ile Phe Gly

180 185 190

Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Gly Val Leu Leu Ser Leu Pro Glu

195 200 205

Ala Ser Gly Leu Phe Arg Arg Ala Met Leu Gln Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Leu Leu Leu Arg Ser Pro Glu Thr Ala Met Ala Met Thr Glu Arg Ile

225 230 235 240

Leu Asp Lys Ala Gly Ile Arg Pro Gly Asp Arg Glu Arg Leu Leu Ser

245 250 255

Ile Pro Ala Glu Glu Leu Leu Arg Ala Ala Leu Ser Leu Gly Pro Gly

260 265 270

Val Met Tyr Gly Pro Val Val Asp Gly Arg Val Leu Arg Arg His Pro

275 280 285

Ile Glu Ala Leu Arg Tyr Gly Ala Ala Ser Gly Ile Pro Ile Leu Ile

290 295 300

Gly Val Thr Lys Asp Glu Tyr Asn Leu Phe Thr Leu Thr Asp Pro Ser

305 310 315 320

Trp Thr Lys Leu Gly Glu Lys Glu Leu Leu Asp Arg Ile Asn Arg Glu

325 330 335

Val Gly Pro Val Pro Glu Glu Ala Ile Arg Tyr Tyr Lys Glu Thr Ala

340 345 350

Glu Pro Ser Ala Pro Thr Trp Gln Thr Trp Leu Arg Ile Met Thr Tyr

355 360 365

Arg Val Phe Val Glu Gly Met Leu Arg Thr Ala Asp Ala Gln Ala Ala

370 375 380

Gln Gly Ala Asp Val Tyr Met Tyr Arg Phe Asp Tyr Glu Thr Pro Val

385 390 395 400

Phe Gly Gly Gln Leu Lys Ala Cys His Ala Leu Glu Leu Pro Phe Val

405 410 415

Phe His Asn Leu His Gln Pro Gly Val Ala Asn Phe Val Gly Asn Arg

420 425 430

Pro Glu Arg Glu Ala Ile Ala Asn Glu Met His Tyr Ala Trp Leu Ser

435 440 445

Phe Ala Arg Thr Gly Asp Pro Asn Gly Ala His Leu Pro Glu Ala Trp

450 455 460

Pro Ala Tyr Thr Asn Glu Arg Lys Ala Ala Phe Val Phe Ser Ala Ala

465 470 475 480

Ser His Val Glu Asp Asp Pro Phe Gly Arg Glu Arg Ala Ala Trp Gln

485 490 495

Gly Arg

<210> 139

<211> 957

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант эстеразы из Thermobifida fusca

<400> 139

atgaccgaac caaccgtggc acgtcccgac attgatcctg tcctcaagat gctcctggat 60

acctttcccg ttacctttac cgctgcagat ggtgttgaag tagcccgcgc acgcttacgt 120

cagcttaaga cccctcctga attgctgccg gaactgcgca tcgaagaacg cactgtgggg 180

tatgatggac tgactgacat tccagttcgt gtgtactggc caccagttgt tcgtgataac 240

ctgccggtcg ttgtttacta tcacgggggt ggttggagtt taggcggctt agatacccat 300

gacccagttg cacgtgcaca cgctgtaggc gcacaagcga tcgtcgtgtc ggtggactac 360

cgcctggcac cggaacatcc gtatccagcc ggcattgatg attcttgggc ggcactgcgt 420

tgggttggtg agaacgcagc ggaattgggt ggtgatccga gtcgtattgc agttgcgggc 480

gatagtgcgg gcggcaacat ttccgctgtg atggcacagc tggcacgtga tgttggtggt 540

ccgccactgg tgtttcaact gctctggtat ccaacgacta tggctgattt gtcgctgccg 600

agctttaccg agaatgctga tgcaccaatc ctggatcgtg atgtgattga cgcgtttctc 660

gcgtggtatg tacctggctt ggacatctcc gatcatacga tgctgcctac tactttggcc 720

cctggcaatg cggatctgag cggtttaccg ccagcgttca ttggtaccgc tgaacatgac 780

cctttacgcg acgacggagc gtgttatgcg gagttgctga ccgcagctgg tgtgagcgtc 840

gaactctcaa atgaacccac catggttcat ggctatgtga actttgcctt agtggttccg 900

gcggcggcag aagcaaccgg acgtggactg gccgccctga aacgtgcgct gcacgct 957

<210> 140

<211> 319

<212> Белок

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 140

Met Thr Glu Pro Thr Val Ala Arg Pro Asp Ile Asp Pro Val Leu Lys

1 5 10 15

Met Leu Leu Asp Thr Phe Pro Val Thr Phe Thr Ala Ala Asp Gly Val

20 25 30

Glu Val Ala Arg Ala Arg Leu Arg Gln Leu Lys Thr Pro Pro Glu Leu

35 40 45

Leu Pro Glu Leu Arg Ile Glu Glu Arg Thr Val Gly Tyr Asp Gly Leu

50 55 60

Thr Asp Ile Pro Val Arg Val Tyr Trp Pro Pro Val Val Arg Asp Asn

65 70 75 80

Leu Pro Val Val Val Tyr Tyr His Gly Gly Gly Trp Ser Leu Gly Gly

85 90 95

Leu Asp Thr His Asp Pro Val Ala Arg Ala His Ala Val Gly Ala Gln

100 105 110

Ala Ile Val Val Ser Val Asp Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Pro Tyr

115 120 125

Pro Ala Gly Ile Asp Asp Ser Trp Ala Ala Leu Arg Trp Val Gly Glu

130 135 140

Asn Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asp Pro Ser Arg Ile Ala Val Ala Gly

145 150 155 160

Asp Ser Ala Gly Gly Asn Ile Ser Ala Val Met Ala Gln Leu Ala Arg

165 170 175

Asp Val Gly Gly Pro Pro Leu Val Phe Gln Leu Leu Trp Tyr Pro Thr

180 185 190

Thr Met Ala Asp Leu Ser Leu Pro Ser Phe Thr Glu Asn Ala Asp Ala

195 200 205

Pro Ile Leu Asp Arg Asp Val Ile Asp Ala Phe Leu Ala Trp Tyr Val

210 215 220

Pro Gly Leu Asp Ile Ser Asp His Thr Met Leu Pro Thr Thr Leu Ala

225 230 235 240

Pro Gly Asn Ala Asp Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ala Phe Ile Gly Thr

245 250 255

Ala Glu His Asp Pro Leu Arg Asp Asp Gly Ala Cys Tyr Ala Glu Leu

260 265 270

Leu Thr Ala Ala Gly Val Ser Val Glu Leu Ser Asn Glu Pro Thr Met

275 280 285

Val His Gly Tyr Val Asn Phe Ala Leu Val Val Pro Ala Ala Ala Glu

290 295 300

Ala Thr Gly Arg Gly Leu Ala Ala Leu Lys Arg Ala Leu His Ala

305 310 315

<---

Claims

1. Сконструированная карбоксиэстераза, включающая полипептидную последовательность, которая на по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична SEQ ID NO:2, или ее функциональный фрагмент, причем указанная сконструированная карбоксиэстераза содержит по крайней мере одну замену или совокупность замен в указанной полипептидной последовательности, включающие замены в положениях, выбранных из: 282, 279/280/282, 39/323, 62/117, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 71/263, 77/184, 103, 103/147, 104, 104/429, 105, 107, 107/185, 108, 109/117, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 118/269, 118/349, 119, 126, 153, 153/215, 164/271, 174/282, 183, 184, 184/249, 185, 186, 187, 188, 190, 209, 210, 211, 212, 213, 213/271, 213/345, 214, 215, 215/271, 216, 217, 217/231, 224/268/372, 249/284, 269, 270, 270/470, 271, 271/416, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 281/374, 283, 283/429, 284, 284/438, 285, 286, 311, 317, 320, 320/323, 320/323/372, 320/372/376, 320/376/377, 321, 323, 324, 372, 372/376, 373, 374, 376, 377, 405, 420, 427, 428 и 429, причем положения аминокислот в указанной полипептидной последовательности пронумерованы согласно SEQ ID NO: 2, и где указанная сконструированная карбоксиэстераза обладает увеличенной способностью к амидированию по сравнению с карбоксиэстеразой дикого типа T. fusca с SEQ ID NO: 2.

2. Сконструированная карбоксиэстераза по п. 1, которая содержит аминокислотную замену в положении 282, выбранную из: X282T, X282G, X282A, X282V, X282M, X282C, X282W, X282Q, X282S и X282R.

3. Сконструированная карбоксиэстераза по п. 1, где:

(a) указанная сконструированная карбоксиэстераза содержит набор замен, указанный в Таблице 8.1 или Таблице 11.1; или

(b) указанная полипептидная последовательность выбрана из: SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 124, 126, 130, 132, 134 и 136.

4. Сконструированная карбоксиэстераза по любому из предшествующих пунктов, которая обладает по крайней мере одним улучшенным свойством по сравнению с карбоксиэстеразой дикого типа T. fusca с SEQ ID NO: 2, выбранным из: (a) устойчивости к растворителю, такому как растворитель, выбранный из: ацетона, ацетонитрила, толуола, тетрагидрофурана, изопропанола, изопропилацетата, диметилсульфоксида и метилэтилкетона; (b) термостойкости; (c) устойчивости к pH; (d) региоизбирательности; (e) стереоизбирательности; (f) объема субстратов; (g) уменьшенного ингибирования субстратом или продуктом и (h) пониженной токсичности для бактериальных клеток-хозяев, например E.coli, продуцирующих указанную сконструированную карбоксиэстеразу.

5. Сконструированная карбоксиэстераза по любому из предшествующих пунктов, где:

(a) указанная сконструированная карбоксиэстераза проявляет большую активность, чем карбоксиэстераза T. fusca дикого типа по крайней мере на одном субстрате, выбранном из: изобутиламина, этилбензоата, анилина, н-бутиламина, трет-бутиламина, N’-трет-бутоксикарбонилбензгидразида, 4-метилпиперидина О-трет-бутилгидроксиламина, бензиламина, 2,6-диметиланилина, (S)-(-)-α-метилбензиламина, (R)-(+)-α-метилбензиламина, метилфенилацетата, этилацетата, 2-пиразинил-этилового эфира, эфира 4-этил-1H-индола и N, N-диэтилглицил-метилового эфира; и/или

(b) указанная сконструированная карбоксиэстераза проявляет большую активность, чем карбоксиэстераза T. fusca дикого типа, в продукции по крайней мере одного продукта, выбранного из: N-изобутилбензамида, ацетанилида, N-н-бутилбензилацетамида, N-[(S)-1-фенилэтил]-пиразиниламида, N-[(S)-1-фенилэтил]-бензамида, N-[(R)-1-фенилэтил]-бензамида, N’-трет-бутоксикарбонил-бензгидразида, 1-бензоил-4-метилпиперидина, 2-пиразинил-4-метилпиперидина, N-трет-бутилбензамида, N-трет-бутилгидроксилбензамида, N-изобутил-1H-индол-4-амида, N’,N’-(диэтиламино)-N-фенилацетамида, N’,N’-(диэтиламино)-N-бензилацетамида и N’,N’-(диэтиламино)-N-2,6-диметилфенилацетамида.

6. Сконструированная карбоксиэстераза по любому из предшествующих пунктов, где указанная сконструированная карбоксиэстераза проявляет более высокую активность по превращению изобутиламина и этилбензоата в N-изобутилбензамид, чем карбоксиэстераза дикого типа T. fusca.

7. Сконструированная карбоксиэстераза по любому из предшествующих пунктов, где указанная сконструированная карбоксиэстераза обладает способностью превращать субстратное соединение (субстратные соединения) в продукт(ы) с активностью, по крайней мере в 1,2 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 100 раз, 200 раз, 500 раз, 1000 раз или более большей относительно активности полипептида карбоксиэстеразы дикого типа T. fusca в подходящих условиях реакции.

8. Сконструированная карбоксиэстераза по п. 1, содержащая:

(a) по крайней мере одну замену, выбранную из: X282C, X343V, X372L, X320W/G, X214R, X271Y, X65G, причем указанная сконструированная карбоксиэстераза проявляет большую активность, чем карбоксиэстераза T. fusca дикого типа на стерически затрудненном амине, в отношении образования N’,N’-(диэтиламино)-N-2,6-диметилфенилацетамида из этилбензоата и 2,6-диметиланилина; или

(b) по крайней мере одну замену, выбранную из: X282G/C, X268A, X63A/R, X189Q/I/E, X214R, X381L, X69W, причем указанная сконструированная карбоксиэстераза проявляет большую активность, чем карбоксиэстераза T. fusca дикого типа на вторичном амине, с образованием 1-бензоил-4-метилпиперидина из этилбензоата и 4-метилпиперидина.

9. Сконструированная карбоксиэстераза по любому из предшествующих пунктов, где указанная сконструированная карбоксиэстераза является очищенной и/или иммобилизованной.

10. Полинуклеотид, кодирующий сконструированную карбоксиэстеразу по любому из пп. 1-8, необязательно где указанный полинуклеотид, кодирующий карбоксиэстеразу, содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 123, 125, 129, 131, 133, 135, 137 и 139.

11. Полинуклеотид по п. 10, где последовательность указанного полинуклеотида является оптимизированной в отношении частоты использования кодонов.

12. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 10 или 11.

13. Клетка-хозяин для получения сконструированной карбоксиэстеразы по любому из пп. 1-8, содержащая по меньшей мере один экспрессионный вектор по п. 12, необязательно где указанная клетка-хозяин представляет собой Е.coli.

14. Способ получения сконструированной карбоксиэстеразы в клетке-хозяине, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 13 в подходящих условиях, так что продуцируется по меньшей мере одна сконструированная карбоксиэстераза, необязательно где указанный способ дополнительно включает:

(a) выделение по меньшей мере одной сконструированной карбоксиэстеразы из культуры и/или клетки-хозяина; и/или

(b) стадию очистки указанной по меньшей мере одной сконструированной карбоксиэстеразы.