CN110066759A

CN110066759A - 一种耐金属离子和有机溶剂的羧酸酯酶及其应用

Info

Publication number: CN110066759A
Application number: CN201910361159.9A
Authority: CN
Inventors: 廖祥儒; 黄琳; 杨邵岚; 孟迪; 蔡宇杰; 管政兵
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2019-07-30
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110066759B

Abstract

本发明公开了一种耐金属离子和有机溶剂的羧酸酯酶及其应用，属于酶工程领域。本发明将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶BaCEs04在大肠杆菌中异源表达，得到的羧酸酯酶BaCEs04在Zn²⁺，NH⁴⁺存在下，分别提高了24.3％和23.5％的酶活，其余金属离子Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺对酶活几乎没有影响甚至有略微的提高，说明该羧酸酯酶在存在金属离子的环境中较为稳定。该酶在丙酮，正己烷，异丙醇中放置1h后，酶活分别提高了22％、30％、26％，说明该酶具有较好的有机溶剂耐受性。

Description

一种耐金属离子和有机溶剂的羧酸酯酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种耐金属离子和有机溶剂的羧酸酯酶及其应用，属于酶工程领域。

背景技术

羧酸酯酶(carboxylesterase，EC 3.1.1.1)是指能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶。羧酸酯酶在生产和实际生活中应用广泛，并且已经得到了越来越多现代药物工业、手性化合物合成以及精细化工等相关行业的青睐。利用羧酸酯酶作为催化剂催化手性分子合成，例如生产萘普生和2-芳基萘酸；同时羧酸酯酶也被作为绿色催化剂降解土壤中的农药残留及土壤、水体中的塑化剂邻苯二甲酸酯类。由于产自动植物的羧酸酯酶存在着酶活低、产量少、提取复杂、热稳定性差等缺陷，而微生物来源的羧酸酯酶具有良好的区位选择性和立体选择性，可以高效温和的催化酯类和酰胺类化合物的水解、酯合成和酯交换等反应，在食品工业、生物去污剂、医药、能源开发和环境保护等相关领域都具有广阔的应用前景。

微生物中羧酸酯酶存在于真菌、细菌及个别种类的放线菌中。真菌在其中承担着重要作用，真菌中12属23种可产生羧酸酯酶；由于真菌来源的羧酸酯酶表达量少、酶活较低，而细菌来源的羧酸酯酶容易获得，酶学性质优异，催化效率高，所以细菌来源的羧酸酯酶越来越受到人们的关注。在细菌中羧酸酯酶主要存在于包括链球菌、乳杆菌、假单胞菌中。而野生菌中羧酸酯酶的表达量较低，不能满足工业应用；随着基因工程应用于羧酸酯酶的研究中，很多羧酸酯酶基因得到了异源表达。

但目前大部分羧酸酯酶对于金属离子和有机溶剂的耐受性较低，严重限制了羧酸酯酶的应用。例如谢振荣等人从脂环酸芽孢杆菌中克隆得到的羧酸酯酶CarE3和CarE5在1mM的不同金属离子Cu²⁺，Zn²⁺，Ag⁺，Fe³⁺中放置1h后，剩余的相对酶活均小于15％；将其放置于不同有机溶剂乙醇、甲醇、异丙醇和丙酮中放置1h后，酶活分别降低了28％、45％、70％和49％。Chenghong Wang等人从废水杆菌属中克隆得到的羧酸酯酶，当其在10mM不同金属离子中放置1h后，Zn²⁺，Ca²⁺，Fe³⁺对酶活性有轻度的抑制作用，而NH₄ ⁺，Mg²⁺，Cu²⁺，Ag⁺严重抑制的酶的活性。Nehad Noby等人从极端微生物中克隆出的酯酶EstN7，当其在5mM的不同金属离子中，酶活性受到Cu²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Na⁺金属离子不同程度的抑制作用。

且由于羧酸酯酶的大部分底物都是难溶于水的，耐有机溶剂的羧酸酯酶可以在含有有机溶剂的缓冲液(代替水相缓冲液)中更好的作用于底物，因此，获得一种既耐金属离子又耐有机溶剂的羧酸酯酶，在工业应用中将具有十分重要的价值和意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种降解含有金属离子或有机溶剂的体系中邻苯二甲酸酯类的方法，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶为催化剂，降解邻苯二甲酸酯类。

在一种实施方式中，所述金属离子为Na⁺、K⁺、Zn²⁺、NH₄ ⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺或Fe³⁺。

在一种实施方式中，所述金属离子的浓度为0.5～2mM。

在一种实施方式中，所述金属离子的浓度为1mM。

在一种实施方式中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正己烷或异丙醇。

在一种实施方式中，所述有机溶剂的浓度为0.5～2％(v/v)。

在一种实施方式中，所述有机溶剂的浓度为1％(v/v)。

在一种实施方式中，所述邻苯二甲酸酯类为：邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯。

在一种实施方式中，所述羧酸酯酶的降解条件为：pH5.0～8.0。

在一种实施方式中，所述羧酸酯酶的降解条件优选为：pH 7.5。

在一种实施方式中，所述羧酸酯酶的降解温度为：15～70℃。

在一种实施方式中，所述羧酸酯酶的降解温度优选为：60℃。

在一种实施方式中，所述降解时间为1～6h。

本发明的第二个目的是提供一种产羧酸酯酶的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因。

在一种实施方式中，所述表达是以pColdII为表达载体在大肠杆菌中表达。

本发明的第三个目的是提供一种产羧酸酯酶的方法，其特征在于，所述方法是应用所述的重组菌进行发酵生产。

本发明还提供所述的重组菌或其生产的羧酸酯酶在环境保护领域的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶BaCEs04在大肠杆菌中异源表达，得到的羧酸酯酶BaCEs04在Zn²⁺，NH⁴⁺存在下，分别提高了24.3％和23.5％的酶活，其余金属离子Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺对酶活几乎没有影响甚至有略微的提高，说明该羧酸酯酶在存在金属离子的环境中较为稳定。该酶在丙酮，正己烷，异丙醇中放置1h后，酶活分别提高了22％、30％、26％，说明该酶具有较好的有机溶剂耐受性。

(2)纯化得到的羧酸酯酶(BaCEs04)以1-乙酸萘酯和2-乙酸萘酯为底物的比酶活，分别为0.28U/mg和0.13U/mg。

(3)纯化得到的羧酸酯酶BaCEs04对邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率分别高达79.4％、86.9％、76.1％，提供了一种高效降解塑化剂邻苯二甲酸酯类的方法。

附图说明

图1为最适反应温度。

图2为温度稳定性。

图3为最适反应pH。

图4为pH稳定性。

图5为1-乙酸萘酯酶促反应速率图。

图6为2-乙酸萘酯酶促反应速率图。

具体实施方式

(1)以1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯为底物测定羧酸酯酶酶活的方法：

1％的固蓝B盐：称取1g的固蓝B盐溶于蒸馏水中定容至100mL，避光保存。

5％的SDS：称取5g的SDS溶于蒸馏水中，于37℃水浴1小时，待其完全溶解后定容至100mL，于冰箱保存。

0.6M的1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯：称取11.17g的1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯溶于95％的乙醇中，定容至100mL，避光保存。

磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液：1/15M磷酸氢二钠与1/15M磷酸二氢钾混合配置至pH7.0。

将15μL的底物1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯加入到1.5mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中(pH 7.0)于37℃水浴保温5min，加入250μL纯化后的酶液，反应5min，加入0.5mL终止显色液DBLS(1％固蓝B盐与5％SDS以2:5混合)，摇匀，静置10min，595/555nm下测定吸光值。

酶活定义：在最适反应条件下，1min内从0.6M的1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯溶液中释放1μM的1-萘酚或2-萘酚所需的酶量为一个酶活单位。

(2)羧酸酯酶蛋白浓度的测定：根据Bradford蛋白定量试剂盒方法，将稀释一定倍数的酶液与G250染色液混合，用酶标仪测定595nm处的吸光值，根据蛋白浓度标曲计算蛋白浓度。比酶活(U·mg^-1)＝酶活(U·mL^-1)×[蛋白浓度(mg·mL^-1)]^-1。

(3)邻苯二甲酸酯类高效液相色谱检测条件为：C18柱(Agilent 4.6×250mm)，波长254nm，流动相比例为甲醇：水＝80:20，检测温度为30℃。

(4)邻苯二甲酸酯类降解率计算公式：降解率(％)＝剩余底物浓度/初始底物浓度

实施例1：工程菌株的构建

人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的羧酸酯酶BaCEs04基因序列。将BaCEs04基因序列和质粒载体pColdII用限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ双酶切后连接转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs04。

实施例2：羧酸酯酶(BaCEs04)的表达与纯化

LB培养基g/L：氯化钠10，胰蛋白胨10，Yeast Extract 5，pH 7。

将重组大肠杆菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs04接种于含有100mg·mL^-1氨苄的LB液体培养基中，以原始菌株E.coli BL21(DE3)和空载菌株(E.coli BL21(DE3)中转入pClodII质粒)作为对照，37℃，200rmp培养12h，然后将500μL上述种子液接种于含有50μL氨苄的50mL LB培养液中，37℃培养2.5h，至OD₆₀₀为0.6，将摇床降温至15℃，静置30min。每瓶加入40μL终浓度为0.4mol/L的IPTG作为诱导剂，以不加诱导剂作为对照组，于15℃200rmp培养24h。

收集菌液，4℃，8000rmp离心10min后得到菌体，加入5mL磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，pH7.0)重悬菌体，超声破碎仪破碎，离心收集上清液得到粗酶液。将上述得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统进行镍柱纯化得到BaCEs04酶液。

实施例3：羧酸酯酶(BaCEs04)的酶活测定

在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7)中，以2-乙酸萘酯为底物，15～75℃范围内，每隔5℃，测定羧酸酯酶BaCEs04酶活，可知羧酸酯酶BaCEs04的最适温度为60℃。在最适反应温度60℃条件下，pH 5.0～8.0范围内，每隔0.5，测定酶活，确定最佳反应pH为7.5。

在最适反应条件下，即磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.5)中，60℃下，分别以0.6M1-乙酸萘酯和2-乙酸萘酯为底物测定实施例2中纯化得到的羧酸酯酶BaCEs04的比酶活，纯化得到的羧酸酯酶BaCEs04的比酶活分别达到0.28U/mg和0.13U/mg。

温度稳定性：将羧酸酯酶(BaCEs04)酶液250μL，在pH为7.5时分别在15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃中保存1h后测定剩余酶活，以酶活最高的设置为100％。结果显示：羧酸酯酶在10-50℃下放置1h后酶活性保持在40％以上，具有良好的温度稳定性。

pH稳定性：将250μL羧酸酯酶(BaCEs04)酶液在温度60℃条件下，分别在pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0中保存1h后测定剩余酶活，以酶活最高的设置为100％。结果显示：pH5.0-8.5范围内放置1h后酶活性依然保持在50％以上，具有良好的pH稳定性。

实施例4：金属离子对羧酸酯酶(BaCEs04)的影响

在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.5)中，60℃下，加入250μLBaCEs04酶液，15μL的0.6M 2-乙酸萘酯，1mM不同金属离子(Na⁺、K⁺、Zn²⁺、NH₄ ⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu² ⁺、Fe³⁺)，测定金属离子对羧酸酯酶BaCEs04酶活的影响。结果如表1所示，可知Zn²⁺，NH⁴⁺分别提高了24.3％和23.5％的酶活，其余金属离子对酶活几乎没有影响甚至有略微的提高，总体而言，该羧酸酯酶在存在金属离子的自然环境中较为稳定。

表1 不同金属离子对羧酸酯酶酶活的影响

实施例5：有机溶剂对羧酸酯酶(BaCEs04)的影响

在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.5)中，60℃下，加入250μLBaCEs04酶液，15μL的0.6M 2-乙酸萘酯，1％(v/v)不同的有机溶剂(甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正己烷、异丙醇)，放置1h后，加入DBLS溶液终止反应，测定不同有机溶剂对羧酸酯酶活性的影响。结果如表2所示，在丙酮，正己烷，异丙醇中放置1h后，酶活分别提高了22％、30％、26％，而在甲醇、乙醇、乙腈中放置1h后，剩余的相对酶活分别为77％，93％，57％。

表2 不同有机溶剂对羧酸酯酶酶活的影响

实施例6：羧酸酯酶(BaCEs04)的底物特异性

在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.5)中，60℃下，加入250μLBaCEs04酶液，测定羧酸酯酶BaCEs04催化0.2-3.4mmol·L^-1的1-乙酸萘酯和0.1-3.2mmol·L^-1的2-乙酸萘酯的反应速率，利用Origin软件进行非线性拟合曲线计算得到Vmax和Km值，进而计算得到Kcat/Km值。如表3所示，底物1-乙酸萘酯与2-乙酸萘酯相比，羧酸酯酶对1-乙酸萘酯的亲和力更大(K_m越低，亲和力越大)，对1-乙酸萘酯的催化效率(K_cat/K_m)更好，达到0.032。

表3 不同底物动力学参数

实施例7：羧酸酯酶(BaCEs04)的应用

取50μL纯化后的羧酸酯酶(BaCEs04)酶液加入到终浓度为1mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)中，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.5)中，以不加羧酸酯酶(BaCEs04)酶液作为对照组，于40℃水浴1h后，在反应体系中加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度。计算得到羧酸酯酶BaCEs04对3种塑化剂邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率分别为68.7％、75.8％、65.3％。由此而知，该羧酸酯酶对低浓度的三种塑化剂的降解率均达到65％以上，在环境修复中有很大的应用价值。

表4 BaCEs04对低浓度邻苯二甲酸酯类的降解

实施例8：羧酸酯酶(BaCEs04)的应用

与实施例7中过程相同，所不同的是体系中邻苯二甲酸酯类的终浓度为10mM。

将50μL实施例2中纯化后的羧酸酯酶(BaCEs04)酶液加入到终浓度为10mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)中，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，以不加羧酸酯酶(BaCEs04)酶液作为对照组，于40℃水浴1h后，在反应体系中加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度，计算得到该羧酸酯酶对3种塑化剂邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率分别为32.8％、40.4％、38.1％。由此结果可知，在不增加酶量的情况下，该羧酸酯酶对高浓度的3种塑化剂的降解率都达到了30％以上。

表5 BaCEs04对高浓度邻苯二甲酸酯类的降解

实施例9：羧酸酯酶(BaCEs04)的应用

与实施例7中过程相同，所不同的水解时间延长至6h。

将50μL纯化后的酶液加入到终浓度为1mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)中，以不加酶液作为对照组，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.5)中,于40℃水浴6h后，加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度，计算得到该羧酸酯酶对3种塑化剂的降解率分别为79.4％、86.9％、76.1％。该结果说明延长反应时间，该羧酸酯酶对3种塑化剂邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率均达到了75％以上，说明延长反应时间能够提高降解率。

表6 BaCEs04对低浓度邻苯二甲酸酯类的降解

实施例10：重组菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs04全细胞催化反应

将实施例1中得到的重组菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs04收集后用磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.5)重悬稀释至OD₆₀₀为1.0，分别加入100μL菌液到终浓度1mM邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)中，于40℃水浴1h后，加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度，计算得到该重组菌对3种塑化剂的降解率分别为16.8％、10.4％和20.5％。

表7 重组菌对低浓度邻苯二甲酸酯类的降解

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种耐金属离子和有机溶剂的羧酸酯酶及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Asp Gly Lys Gln Ile Asn Arg Gly Phe Ala Pro Ala Gly Arg Tyr

1 5 10 15

Ala Val Pro Gly Thr Glu Val Arg Glu Met Arg Ser Lys Gly Gly Arg

20 25 30

Thr Phe Arg Ile Phe Val Ser Phe Pro Gln Glu Glu Pro Pro Ala Ser

35 40 45

Gly Phe Pro Val Ile Tyr Leu Leu Asp Ala Asn Ser Val Phe Gly Thr

50 55 60

Met Ala Glu Ala Leu Arg Val Gln Ser Arg Arg Pro Glu Lys Thr Gly

65 70 75 80

Val Val Pro Ala Val Ile Val Gly Ile Gly Tyr Pro Thr Asp Gln Pro

85 90 95

Phe Ser Ala Glu Arg His Ser Asp Phe Thr Met Pro Leu Ser Glu Ser

100 105 110

Glu Leu Pro Val His Pro Arg Gly Ala Ala Trp Pro Glu Gln Gly Gly

115 120 125

Ala Glu Ala Phe Leu Glu Phe Ile Glu Glu Glu Val Lys Pro Ala Met

130 135 140

Glu Arg Asp Tyr Pro Ile Asp Arg Gly Arg Gln Thr Ile Phe Gly His

145 150 155 160

Ser Leu Gly Gly Leu Phe Val Leu Gln Val Leu Leu Thr Arg Pro Asp

165 170 175

Met Phe Gln Thr Tyr Val Ala Gly Ser Pro Ser Ile His Trp Asn Lys

180 185 190

Arg Phe Ile Gln Glu Asn Ala Glu Arg Leu Ser Asp Arg Leu Ser Ala

195 200 205

Glu Asn Leu Gln Val Ser Val Leu Leu Ala Ala Gly Glu Ile Glu Lys

210 215 220

Thr His Lys Ser Arg Ile Pro Gln His Ala Glu Ala Leu Tyr Ala Leu

225 230 235 240

Leu Ser Gly Phe Glu Gly Asp Gly Val Arg Ala Glu Tyr Ser Glu Phe

245 250 255

Glu Gly Glu Gly His Ile Ser Val Leu Pro Val Leu Ile Ser Arg Ala

260 265 270

Leu Arg Phe Cys Leu Asn Pro Gly Gly Pro His Thr Pro Tyr Ser Pro

275 280 285

Ala

<210> 2

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atggacggaa aacaaataaa ccgggggttc gcgccggccg gccgatacgc ggttccgggc 60

acagaagtaa gagaaatgcg ctcaaaagga ggccgtacgt ttcgtatctt tgtctctttt 120

cctcaggaag aaccgcctgc ctccggcttc cccgtcatat acctgctcga tgcgaattcc 180

gtgttcggca caatggccga agctttgcgg gtgcaaagcc ggcggcctga aaaaacaggc 240

gttgttccgg cggtgattgt cggaatcggc tacccgacag atcagccgtt ttccgccgaa 300

cggcacagtg attttacgat gccgctttct gaatcagaat tgccggtgca tccgcgcggc 360

gcggcatggc ccgaacaggg aggggcggaa gcgtttctgg agtttataga agaagaagta 420

aagcccgcga tggagcggga ttatccgatc gacagaggca ggcagacgat tttcggccat 480

tcgctgggcg gtctttttgt gctgcaagtg cttttgacga ggccggacat gttccagacc 540

tatgttgcgg gaagtccgtc aattcattgg aacaagcgtt ttattcagga aaacgcagaa 600

cgtttgtcag accggctctc tgcggaaaat cttcaagtca gcgtattgct ggctgcggga 660

gaaattgaaa aaacacataa aagcagaatc ccgcagcacg cagaggcgct gtacgcttta 720

ttatccggat ttgaaggtga tggagtccgc gctgaataca gcgagtttga aggagagggc 780

catatttctg tcctgcccgt tttaatcagc agagccctgc gtttctgcct gaatccggga 840

gggccgcata ccccgtattc tcccgcatga 870

Claims

1.一种降解含有金属离子或有机溶剂的体系中邻苯二甲酸酯类的方法，其特征在于，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶为催化剂，降解邻苯二甲酸酯类。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属离子为Na⁺、K⁺、Zn²⁺、NH₄ ⁺、Mg²⁺、Ca² ⁺、Cu²⁺或Fe³⁺。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属离子的浓度为0.5～2mM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正己烷或异丙醇。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂的浓度为0.5～2％(v/v)。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类为：邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯。

7.一种产羧酸酯酶的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达氨基酸序列如SEQID NO.1所示的基因。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，是以pColdII为表达载体在大肠杆菌中表达。

9.一种产羧酸酯酶的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求7～8任一所述的重组菌进行发酵生产。

10.权利要求7～8任一所述的重组菌或其生产的羧酸酯酶在环境保护领域的应用。