CN101177686A - 一种丙酮酸氧化酶基因、其重组表达质粒及转化的菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绿色气球菌来源的丙酮酸氧化酶基因AvPyOD，该基因所构建的重组表达质粒，以及该重组表达质粒转化的大肠杆菌基因工程菌株。该AvPyOD基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，是一种全新的基因。含有该基因的重组表达质粒转化大肠杆菌后所获得的工程菌，其产酶能力得到大幅提高，因而可以用于工业化生产丙酮酸氧化酶。

Description

一种丙酮酸氧化酶基因、其重组表达质粒及转化的菌株

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种绿色气球菌(Aerococcus viridansATCC10400)来源的丙酮酸氧化酶基因AvPyOD，其重组表达质粒，及重组表达质粒转化的大肠杆菌基因工程菌株。

背景技术

已发现的丙酮酸氧化酶可分为两类，一类丙酮酸氧化酶(EC.1.2.2.2)在催化转化时不以氧分子为直接受体，不产生过氧化氢，催化反应为：

丙酮酸+亚铁细胞色素b₁+H₂O＝醋酸盐+CO₂+亚铁细胞色素b₁；

大肠杆菌丙酮酸氧化酶就是一个代表。

另一类丙酮酸氧化酶(EC.1.2.3.3)以氧分子为直接受体，产生过氧化氢，催化反应为：

丙酮酸+磷酸盐+O₂+H₂O＝乙酰磷酸+CO₂+H₂O₂；

来自乳酸杆菌属、链球菌属、绿色气球菌及白色念球藻属的丙酮酸氧化酶则属于此类。

临床生化检验中广泛使用的是丙酮酸氧化酶(EC.1.2.3.3)。

丙酮酸氧化酶(EC.1.2.3.3)在临床生化检验中用途广泛，可用于丙酮酸、丙酮酸激酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、无机磷酸、唾液酸、唾液酸激酶的酶活性及尿素的检测。

基因工程是高效表达和大量生产丙酮酸氧化酶的有效手段。1984年Charlotte Grabau等首次克隆了大肠杆菌丙酮酸氧化酶基因poxB(Charlotte Grabau et al.Journal ofbacteriology，Dec.1984，p.1088-1092)；1986年Ying-ying Chang等克隆了大肠杆菌丙酮酸氧化酶突变基因poxB3和poxB4(Ying-ying Chang et al.Journal of bacteriology，July 1986，p.312-318)。1992年美国专利5096821报道了来自Lactobacillus plantarum(DSM 2571)菌株的突变型丙酮酸氧化酶基因的表达(US Patent 5096821 Schumacher，et al.March 17，1992)；1994年Kopetzki等以基因工程手段对Lactobacillus plantarum丙酮酸氧化酶蛋白肽链结构进行了改造，在酶蛋白肽链N端添加Met-Thr-Met-(His)₃结构，构成金属螯合尾，使重组酶通过金属亲和柱分离纯化(Erhard Kopetzki，et al.CLIN.CHEM.40/5，688-7041994)；2004年Fre′de′rique Lorquet等克隆了Lactobacillus plantarum的丙酮酸氧化酶基因poxB，构建的Lactobacillus plantarum工程菌其表达的丙酮酸氧化酶的活力可达2.1U/mg(Fre′de′rique Lorquet，et al.Journal of bacteriology，June 2004，p.3749-3759)；2001年，侯本祥等(侯本祥等华西医大学报2001；32(1)：15～17)成功地从血链球菌ATCC10557扩增出血链球菌丙酮酸氧化酶基因(Sopox)，并在大肠杆菌JM105中得到表达，所表达的目的产物占总菌体蛋白的25.46％。但该研究不是以制备生化检验用的丙酮酸氧化酶为目的，所提供的基因工程菌株高产丙酮酸氧化酶主要用于牙周病的防治研究。

美国专利4246342(US Patent 4246342 Misaki，et al.January 20，1981)报道利用野生型绿色气球菌(Aerococcus viridans IFO-12219，Aerococcus viridans IFO-12317)进行发酵生产丙酮酸氧化酶，丙酮酸氧化酶的产量仅为46～52U/L。绿色气球菌丙酮酸氧化酶(AvPyOD)基因工程菌株的构建至今尚未见到报道，本发明是首次报道绿色气球菌丙酮酸氧化酶(AvPyOD)基因工程菌株的构建及表达。

Lac启动子的启动受活化子cAMP受体蛋白与Lac抑制子共同调控。Lac抑制子由lacI基因编码，由自身启动子起始。Lac抑制子只在乳糖或IPTG缺乏时才结合DNA从而抑制转录，在乳糖或IPTG存在时，抑制子没有活性，Lac启动子下游基因是去抑制表达的。葡萄糖或其它易利用碳源能够降低细胞内cAMP的浓度，只有cAMP水平高(葡萄糖或其它易利用碳源水平低)时活化子cAMP受体蛋白才结合DNA从而激活表达。另外，RNA聚合酶偶尔会取代Lac抑制子成功地结合到Lac启动子上，造成Lac启动子下游基因的渗漏表达。强启动子trc是由Lac与Trp杂合而得，它具有Lac启动子的上述特性。因此，在没有乳糖或IPTG等诱导剂存在时，trc启动子也能渗漏性地表达外源蛋白。本发明就是利用trc启动子的渗漏性，不使用诱导剂而高效表达重组丙酮酸氧化酶。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种绿色气球菌来源的丙酮酸氧化酶基因AvPyOD。

本发明的第二个目的在于提供一种含有所述AvPyOD基因的组成型重组表达质粒pSMLPyOD。

本发明的第三个目的在于提供一种转化有上述重组表达质粒pSMLPyOD的大肠杆菌基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD。

本发明通过PCR方法从绿色气球菌ATCC10400基因组中扩增出了AyPyOD基因，经限制性酶切后与pSML104质粒相连接，得到重组表达质粒pSMLPyOD。经测序验证，本发明所获得的绿色气球菌(Aerococcus viridans ATCC10400)丙酮酸氧化酶基因AvPyOD具有SEQ ID NO：1所示的序列。通过将重组表达质粒pSMLPyOD转化大肠杆菌DH5α，获得组成型、高表达基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD。

本发明获得的绿色气球菌(Aerococcus viridans ATCC10400)丙酮酸氧化酶基因AyPyOD，其序列与现有已知的丙酮酸氧化酶基因AvPyOD均不同，因此是一种全新的基因；而且，本发明的绿色气球菌来源的AvPyOD基因的重组表达质粒pSMLPyOD也是首次构建的。

本发明在构建AvPyOD基因的重组表达质粒pSMLPyOD时所使用的质粒pSML104中所含的强启动子trc具有渗漏表达的特点，特别是在不含变异基因lac I^q的宿主菌DH5α中，trc启动的渗漏表达量非常高。因此，本发明构建的工程菌株DH5α/pSMLPyOD不需要添加诱导剂IPTG，利用渗漏表达就能达到高的表达量，因而可以显著降低发酵成本，简化培养条件，从而有利于丙酮酸氧化酶的工业化生产。

本发明所提供的培养基与培养条件既能保证基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD的生长繁殖又能保证丙酮酸氧化酶的高效表达，丙酮酸氧化酶的表达量具有工业化生产的前景。

本发明的基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD的丙酮酸氧化酶表达产量高，在5L发酵罐中培养，菌体量最高达到了60g湿菌体/L，酶活力最高达1748.3U/L，是现有报道的绿色气球菌株(52U/L)的33.6倍；经SDS-PAGE分析，目的酶96.8％为可溶状态，并且含量可达到约450mg/L。

此外，本发明的基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD发酵生产的酶，其N端带有组氨酸纯化标签，因此可以采用金属螯合柱亲和层析的方法，快速、高效地纯化丙酮酸氧化酶，从而降低酶的成本。

我国临床使用的丙酮酸氧化酶一直以来主要依赖进口，而本发明的基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD提供了工业化大规模生产丙酮酸氧化酶的前景。

附图说明

图1为重组表达质粒pSMLPyOD的构建示意图。

图2为本发明的AvPyOD基因(上行)与A.viridans IFO 012219序列(下行)进行同源性比较的示意图，其中阴影部分表示相同的部分。

图3为本发明的AvPyOD基因(上行)与L.plantarum Lp80序列(下行)进行同源性比较的示意图，其中阴影部分表示相同的部分。

图4为本发明的AvPyOD基因(上行)与S.oralis ATCC10557序列(下行)进行同源性比较的示意图，其中阴影部分表示相同的部分。

图5为本发明的AvPyOD基因(上行)与S.pneumoniae D39序列(下行)进行同源性比较的示意图，其中阴影部分表示相同的部分。

图6为本发明的AvPyOD基因(上行)与Salmonella typhimurium UK-1序列(下行)进行同源性比较的示意图，其中阴影部分表示相同的部分。

图7为本发明的AvPyOD基因(上行)与E.coli K12序列(下行)进行同源性比较的示意图，其中阴影部分表示相同的部分。

图8为基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD发酵过程中的菌体生长与产酶曲线图。

图9为发酵液、裂解液上清以及裂解液沉淀重悬液的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2为发酵液，泳道3为裂解液上清，泳道4为裂解液沉淀的重悬液，分子量66.8Kda的条带为丙酮酸氧化酶。

图10为裂解液上清和透析酶液的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2为裂解液上清，泳道3为透析后的酶液，分子量66.8Kda的条带为丙酮酸氧化酶。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本发明通过PCR方法从绿色气球菌ATCC10400基因组中扩增出了AvPyOD基因，经限制性酶切后与pSML104质粒相连接，得到重组表达质粒pSMLPyOD；然后将重组表达质粒pSMLPyOD转化大肠杆菌DH5α，获得基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD。

本发明的基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD在本专利所述的培养条件下，其所表达丙酮酸氧化酶酶活力最高可达到1748.3U/L，与现有报道的产丙酮酸氧化酶的野生型绿色气球菌相比具有非常明显的产量优势。

本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD已于2006年10月26日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1856。

实施例1、AvPyOD基因的克隆

首先设计以下引物对：

上游：5’-CATGCCATGGGAATGCATCACCATCACCATCACTCAGATAACAAAATTAACATC-3’；

(Nco I酶切位点)

(同时添加对应9个氨基酸残基MGMHHHHHH的核苷酸序列用于纯化)

下游：5’-CGCGGATCCTTATCATTTGATGTATTTAGATTCTAAGCCTTCAGC-3’；

(BamH I酶切位点)

以绿色气球菌ATCC10400基因组为模板，采用以上引物对，PCR扩增得到AvPyOD基因。

PCR体系：

5μl 10×PCR反应缓冲液，1μl下游引物(50pM)，1μl下游引物(50pM)，2μl绿色气球菌ATCC10400基因组DNA(50ng/μl)，5μl dNTP混合物(10mM，每种各2.5mM)，0.5μl Pyrobest DNA聚合酶(5U/μl)，灭菌去离子水至50μl。

PCR条件：

95℃5分钟，然后30次循环(每一循环条件为95℃45秒，60℃45秒，72℃2分钟)，最后72℃延伸10分钟。

由于在引物设计时引入了对应9个氨基酸残基MGMHHHHHH的核苷酸序列，因此扩增得到的AvPyOD基因，其所表达的蛋白在N端带有组氨酸纯化标签，因而可以采用金属螯合柱亲和层析的方法，快速、高效地纯化丙酮酸氧化酶。

实施例2、重组表达质粒pSMLPyOD的构建

本实施例中所使用的质粒pSML104根据文献(Li Y，et al.Eur.J.Biochem.，1999，262：713-719)的方法获得，该质粒以trc为启动子，带有自身表达元件，转录终止子为rrnb，复制子为p15a(中拷贝)，并且含有四环素(Tc)抗性基因。

将实施例1获得的扩增产物用限制性内切酶Nco I、BamH I双酶切，得到两端带有粘性末端的AvPyOD基因；同时用限制性内切酶Nco I、Bgl II双酶切pSML104质粒；然后将两酶切片段连接，连接条件为：2.5μl 10×T4DNA连接酶缓冲液，2U T4 DNA连接酶，灭菌去离子水至25μl，16℃连接反应16小时；连接后得到的产物即为重组表达质粒pSMLPyOD；整个构建过程如图1所示。

在重组表达质粒pSMLPyOD中，AvPyOD基因依靠trc启动子、自身表达元件以及rrnb转录终止子而表达；其复制子为p15a(中拷贝)，并且含有四环素(Tc)抗性基因。

经测序验证，重组表达质粒pSMLPyOD中所插入的AvPyOD基因具有SEQ ID NO：1所示的序列。

图2-7显示了该序列与GenBank中已报道的其它来源的丙酮酸氧化酶基因序列作同源性比对的结果，其中阴影部分表示相同的部分，同源率如以下表1所示。

表1、同源性比较

序列	GenBank登陆号	同源率(％)
			A.viridans IFO 012219	E01757	97.35
L.plantarum Lp80	AY458428	53.92
			S.oralis ATCC10557	AF091510	70.33
S.pneumoniae D39	AY254852	71.18
			Salmonella typhimurium UK-1	AF001831	43.36
E.coli K12	X04105	45.06

由表1的结果可见，本发明获得的绿色气球菌来源的丙酮酸氧化酶基因AvPyOD与现有报道的丙酮酸氧化酶基因均不同，因而是一种全新的基因。

实施例3、基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD的获得

将重组表达质粒pSMLPyOD转化到大肠杆菌DH5α(大连宝生物公司){遗传特征为F^-，supE44，ΔlacU169.φ80d/lacZΔM15，hsdR17，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1}中，得到的转化子DH5α/pSMLPyOD，具体如下：

取1μl重组表达质粒pSMLPyOD，加入100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴20分钟，42℃水浴90秒，冰浴3分钟，加入LB培养基(蛋白胨1％，酵母抽提物0.5％，氯化钠1％)900μl，37℃孵育1小时；然后取100μl涂布于含四环素的选择性平板(丙酮酸钠10g蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠10g硫酸镁0.5g辣根过氧化物酶500U联大茴香胺10mg四环素50mg琼脂粉15g去离子水至1000ml)上，于30～37℃培养24小时，置4℃显色，显棕褐色的菌落即为转化有重组表达质粒pSMLPyOD的转化子，命名为DH5α/pSMLPyOD。

通过上述方法所获得的大肠杆菌基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD已于2006年10月26日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.1856。

实施例4、DH5α/pSMLPyOD的发酵与纯化

本实施例中所使用的培养基配方如下(除特别说明外，其中的百分比均为重量百分比)：

1、种子培养基：

丙酮酸钠1％，甘油1％，蛋白胨1％，酵母抽提物0.5％，氯化钠1％。

2、发酵培养基：

配方1：葡萄糖1％，蛋白胨2％，酵母抽提物1％，硫酸铵0.7％，磷酸盐0.4％，氯化钠1％，4×微量元素母液0.125％(v/v)。

配方2：醋酸铵10％，蛋白胨5％，酵母抽提物2.5％，硫酸铵1.75％，硫酸镁0.75％，氯化钠2.5％，4×微量元素母液0.625％(v/v)。

其中：

磷酸盐组成(质量比)：磷酸二氢钾∶磷酸氢二钠∶磷酸氢二钾＝1∶2∶1；

4×微量元素母液组成：FeSO₄·7H₂O 6.4g，ZnSO₄·7H₂O 1.42g，CuSO₄·5H₂O 0.8g，MnSO₄·H₂O 1.6g，CaCl₂ 0.14g，CoCl₂·6H₂O 0.8g，H₃BO₄ 0.12g，Na₂MoO₄ 6.4g，KI 0.08g，浓硫酸调节至溶解，去离子水定容至500ml。

取实施例3获得的转化有重组表达质粒pSMLPyOD的转化子，接种于50ml种子培养基中，于37℃、250rpm振荡培养20小时。然后将培养物再接种于600ml种子培养基中，于37℃、250rpm振荡培养至对数生长期。随后将培养物再接种到装有3L配方1的发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为20％，控制溶氧DO在20～40％，转速350rpm，培养温度37℃。当葡萄糖耗尽时，流加配方2的发酵培养基，流加总量为400ml，培养温度降低为30℃。在5L发酵罐中的总的培养时间为24小时。

培养过程中，每隔2～4时间取样，分别测定发酵液的细胞湿重以及酶活，具体测定方法如下：

1、细胞湿重：离心后的湿菌体重量/发酵液体积。

2、丙酮酸氧化酶的活力按以下方法计算：

(1)测定原理：

(2)测定试剂

a、反应混合液1(临用前按以下用量混合)：

pH6.7、1mol/L磷酸二氢钾2.0ml；

1mmol/L黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD-2Na)0.1ml；

10mmol/L焦磷酸硫胺素0.2ml；

15mmol/L4-氨基比林1.0ml；

辣根过氧化物酶(≥50U/ml)1.0ml；

蒸馏水1.7ml。

b、反应混合液2(临用前按以下用量混合)：

0.2％2，4-二氯苯酚2.0ml；

0.1mol/L氯化镁2.0ml。

c、底物溶液：1.0mol/L丙酮酸钠。

d、反应终止液：将EDTA-2Na 3.72g溶解于pH5.5柠檬酸缓冲液(0.1mol/L柠檬酸36.85ml和0.2mol/L磷酸氢二钠63.15ml)100ml中。

e、酶稀释液：pH7.0、10mmol/L磷酸二氢钾-氢氧化钠溶液(内含有1μmol/L黄素腺嘌呤二核苷酸)。

(3)测定操作

a、取0.6ml反应混合液1，0.3ml反应混合液2和0.1ml底物溶液，充分混合并预温至37℃；

b、加入待测定酶活的样品0.02ml(预先用酶稀释液稀释至其酶活单位约0.1～0.2U/ml)混匀，在37℃恒温准10分钟；

c、加入反应终止液2.0ml，5分钟后在510nm读吸光度(As)；

d、用酶稀释液代替酶重复上述步骤，测吸光度(Ab)；

e、计算ΔA，如果ΔA＞0.4，再调节酶液浓度重复实验。

(4)酶活力单位定义：在上述条件下，1分钟内消耗1μmol丙酮酸的酶量为1单位。

(5)计算公式：

其中：

ΔA＝As-Ab；

10＝反应时间；

总体积3.02ml；

样品体积0.02ml；

E₅₁₀＝29.8cm²/μmol(微摩尔消光系数)；

1/2＝反应中2mol H₂O₂生成1mol色素物质。

以上述方法获得的细胞湿重以及酶活对发酵时间作菌体生长与产酶曲线图，结果如图8所示。

由图8的结果可见，在发酵的第21小时，基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD的菌体量达到最高，约为60g湿菌体/L，在发酵的第22小时，重组丙酮酸氧化酶的活力达到最高，约为1748.3U/L，远远超过现有报道的绿色气球菌株的酶活(52U/L)。

实施例5、DH5α/pSMLPyOD发酵液的SDS-PAGE分析

取300ml实施例4获得的发酵液，于4℃、10000g离心15分钟，菌体用结合缓冲液(含20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠、10mM硫酸镁，pH 7.1)洗涤三次，然后重悬于300ml上述结合缓冲液中，充分分散菌体；随后加入溶菌酶溶液，使溶菌酶的浓度达到1mg/ml；之后于37℃保温30分钟，然后置于-20℃冷冻，37℃溶解，如此反复3次。

菌体裂解液于4℃、12000g离心60分钟，上清液过0.45μm滤膜后加入12ml结合缓冲液处理过的Ni-IDA琼脂糖，4℃下缓慢搅拌，结合4小时，混合液加入空玻璃柱，用72ml结合缓冲液洗涤，再用48ml洗涤缓冲液(含20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠、10mM硫酸镁，pH 6.1)洗涤至流出液的A₂₈₀小于0.01，最后用洗脱缓冲液(含50mM咪唑或150mM组氨酸、20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠、10mM硫酸镁，pH 6.1)洗脱，分别收集单一的洗脱峰，通过丙酮酸氧化酶活性检测确定所要的洗脱峰液。

含目的丙酮酸氧化酶的洗脱液置透析缓冲液(含20mM柠檬酸钠、10mM硫酸镁，pH6.5)中透析24小时，透析后的丙酮酸氧化酶液体积为59ml。

分别取菌体裂解液的发酵液、上清、沉淀及透析后的丙酮酸氧化酶液进行SDS-PAGE电泳，结果如图9、图10所示。

由图9的结果可见，目的蛋白丙酮酸氧化酶主要存在于上清液中，经QuantityOne4.52软件(Bio-Rad公司)分析，丙酮酸氧化酶96.8％可溶。由图10的结果可见，透析后的丙酮酸氧化酶液呈现单一条带。

经采用Lowry法，即福林-酚法，对透析后的丙酮酸氧化酶液进行蛋白含量测定，结果显示目的蛋白含量达到约450mg/L发酵液。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种丙酮酸氧化酶基因、其重组表达质粒及转化的菌株

<130>061891N

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1776

<212>DNA

<213>绿色气球菌ATCC10400

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1776)

<400>1

atgtcagata acaaaattaa catcggttta gcagttatga agattttaga atcttgggga     60

gcagatacta tttacggtat tccttcaggt actttaagtt cattgatgga cgcgatgggt    120

gaagaagaaa acaacgttaa attcctacaa gtgaaacacg aagaagtagg tgctatggct    180

gctgtaatgc aaagcaaatt cggcggtaac ctaggtgtta ctgttggttc tggtggtcca    240

ggtgcatctc acttgattaa cggtttatac gatgcagcaa tggataacat tccagtagtt    300

gcgatcttag gttctcgtcc acaacgcgaa ttaaacatgg acgctttcca agaattaaac    360

caaaacccaa tgtacgacca cattgcagtt tacaaccgtc gtgtagctta cgctgagcaa    420

ttaccaaaat tagttgacga agcggctcgt atggctatcg ctaaacgtgg tgtagcagtt    480

ctagaagtac ctggtgattt cgctaaagtt gaaatcgaca acgaccaatg gtactcatct    540

gcaaacagct tacgtaaata tgaaccaatc gctccagcag cacaagatat cgacgcagca    600

gttgaattat taaacaactc taaacgtcca gtaatctacg ctggtattgg tactatgggc    660

cacggtcctg cagttcaaga attagctcgt aaaatcaaag cgccagttat cactactggt     720

aaaaactttg aaactttcga gtgggacttc gaagcgttaa caggttctac ttaccgtgta     780

ggttggaaac cagctaacga aacaatctta gaagcagata cagtattatt tgctggttca     840

aacttcccat tctcagaggt tgaaggtact ttccgtaatg ttgataactt catccaaatc     900

gatatcgacc cagctatgtt aggtaaacgt caccacgctg atgttgctat cttaggtgat     960

gctggtttag caatcgacga aatcttaaac aaagttgacg ctgttgaaga gtcagcatgg    1020

tggacagcta acttgaaaaa catcgctaac tggcgtgaat acatcaacat gttagaaact    1080

aaagaagaag gcgacttgca attctaccaa gtgtacaatg caatcaacaa ccatgctgat    1140

gaagatgcaa tttactcaat tgatgttggt aactcaacac aaacatctat tcgtcattta    1200

cacatgacac ctaaaaacat gtggagaact tctccattat tcgcgacaat gggtatcgct    1260

atccctggtg gtttaggtgc taaaaacact tacccagatc gtcaagtttg gaacatcatc    1320

ggtgatggtg ctttctctat gacttaccca gatgtagtaa ctaacgtacg ttacaacatg    1380

cctgtaatca acgttgtatt ctctaacact gaatatgcct tcatcaaaaa caaatatgaa    1440

gacactaaca aaaacttatt cggtgtagac tttacagatg ttgactacgc taaaatcgct    1500

gaagcacaag gtgctaaagg atttactgta agccgtatcg aagatatgga ccgtgtaatg    1560

gctgaagctg ttgcagctaa caaagcaggt catactgtag ttatcgactg taagattact    1620

caagaccgtc caatccctgt agaaacattg aaattggatt caaaactata cagcgaagac    1680

gaaatcaaag cttacaaaga acgttacgaa gctgctaact tagtaccatt cagagagtac    1740

ttagaagctg aaggcttaga atctaaatac atcaaa                              1776

Claims (11)

1.一种丙酮酸氧化酶基因AvPyOD，其特征在于，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的丙酮酸氧化酶基因AvPyOD，其特征在于，该基因来源于绿色气球菌ATCC10400。

3.如权利要求1或2所述的丙酮酸氧化酶基因AvPyOD，其特征在于，所述基因还含有对应9个氨基酸残基MGMHHHHHH的核苷酸序列。

4.如利要求1～3中任一项所述的丙酮酸氧化酶基因AvPyOD所编码的氨基酸序列。

5.如权利要求4所述的氨基酸序列，其特征在于，该氨基酸序列带有9个氨基酸残基MGMHHHHHH的纯化标签。

6.一种重组表达质粒pSMLPyOD，其特征在于，该重组表达质粒克隆有权利要求1～3中任一项所述的丙酮酸氧化酶基因AvPyOD。

7.如权利要求6所述的重组表达质粒，其特征在于，该重组表达质粒是将丙酮酸氧化酶基因AvPyOD与质粒pSML104相连接而获得。

8.如权利要求7所述的重组表达质粒，其特征在于，所述质粒pSML104以trc为启动子，带有自身表达元件，转录终止子为rrnb，复制子为p15a，并且含有四环素抗性基因。

9.如权利要求6～8中任一项所述的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒还带有对应9个氨基酸残基MGMHHHHHH的核苷酸序列。

10.一种大肠杆菌基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD，其特征在于，该菌株转化有权利要求6～9中任一项所述的重组表达质粒。

11.如权利要求10所述的基因工程菌株DH5α/pSMLPyOD，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.1856。

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