JP2000333689A - ホスファチジルセリンの製造方法 - Google Patents
ホスファチジルセリンの製造方法Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ホスファチジルセリンを製造する方法の提
供。 【構成】 ホスファチジルコリン及びホスファチジルエ
タノールアミンなどのホスファチドと、ラセミ体もしく
はエナンチオマー的に純粋なセリン、好ましくはＬ−セ
リンとの反応からなるホスファチジルセリンの製造方法
であり、反応は前記ホスファチドの水性分散液中でホス
ホリパーゼＤ（ＰＬＤ）及びカルシウム塩の存在下に行
われる。
供。 【構成】 ホスファチジルコリン及びホスファチジルエ
タノールアミンなどのホスファチドと、ラセミ体もしく
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はホスファチジルセリ
ンの製造方法に関する。特に、本発明は、水性媒体中で
天然又は合成のリン脂質をセリンと反応することによ
り、リン脂質から出発してホスファチジルセリンを製造
する方法に関する。
ンの製造方法に関する。特に、本発明は、水性媒体中で
天然又は合成のリン脂質をセリンと反応することによ
り、リン脂質から出発してホスファチジルセリンを製造
する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ホスファチジルセリンは、多岐にわたる
重要性を有し、特に老化又は血管病理性などの各種起源
の退行性脳疾患の治療に好適な医薬組成物の製造、特殊
なリポソーム製剤の製造用、並びに最近ではホスファチ
ジル−Ｌ−セリン（以下、ＰＳという。）が豊富な天然
レシチン、特に大豆レシチンを含み、さらにポリ不飽和
脂肪酸のアシル残基も含有する食事療法組成物の商業化
に特に重要である。
重要性を有し、特に老化又は血管病理性などの各種起源
の退行性脳疾患の治療に好適な医薬組成物の製造、特殊
なリポソーム製剤の製造用、並びに最近ではホスファチ
ジル−Ｌ−セリン（以下、ＰＳという。）が豊富な天然
レシチン、特に大豆レシチンを含み、さらにポリ不飽和
脂肪酸のアシル残基も含有する食事療法組成物の商業化
に特に重要である。
【０００３】低価格のＰＳを工業的な量で得ることが次
第に求められていることから、本願出願人は、工業的な
規模における実施可能性の要求を満足すべくこの製品を
製造する条件を見出すために広範囲にわたる検討を行っ
た。
第に求められていることから、本願出願人は、工業的な
規模における実施可能性の要求を満足すべくこの製品を
製造する条件を見出すために広範囲にわたる検討を行っ
た。
【０００４】本願出願人による米国特許第5,700,668号
には、ＰＳの製造方法が開示されている。それによる
と、先行技術（特に、Comfurius P. et al., Biochim.
Biophys.Acta 488, 36(1977)、Yamane et al., Biochi
m. Biophys. Acta 1003,277 （1989）、特開昭63−0367
91号公報、特開平02−079990号公報、及びJ. Chem. So
c. Perkin Trans. 1, 919（1995）参照）のものとは対
照的に、工業規模で高収率で、しかも精製していない出
発材料から、かつクロマトグラフ精製を用いることなく
ＰＳが製造できる。
には、ＰＳの製造方法が開示されている。それによる
と、先行技術（特に、Comfurius P. et al., Biochim.
Biophys.Acta 488, 36(1977)、Yamane et al., Biochi
m. Biophys. Acta 1003,277 （1989）、特開昭63−0367
91号公報、特開平02−079990号公報、及びJ. Chem. So
c. Perkin Trans. 1, 919（1995）参照）のものとは対
照的に、工業規模で高収率で、しかも精製していない出
発材料から、かつクロマトグラフ精製を用いることなく
ＰＳが製造できる。
【０００５】この米国特許に記載の方法は、有機溶媒、
代表的にはトルエンに原料ホスファチドを溶解した溶液
と、セリン及びホスホリパーゼＤを含む水溶液とからな
る二相系中で天然ホスファチド又は合成ホスファチドと
セリンとを反応させるものである。前記の系を十分撹拌
すると、ホスファチドはＰＳに変換され、ＰＳはアセト
ンで沈殿することによって有機相から回収することがで
きる。
代表的にはトルエンに原料ホスファチドを溶解した溶液
と、セリン及びホスホリパーゼＤを含む水溶液とからな
る二相系中で天然ホスファチド又は合成ホスファチドと
セリンとを反応させるものである。前記の系を十分撹拌
すると、ホスファチドはＰＳに変換され、ＰＳはアセト
ンで沈殿することによって有機相から回収することがで
きる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】類似の方法は、高収率
で大規模にホスファチジルセリンを製造するけれど、有
機溶媒の使用を減らし、副製品を最少にするという工業
的な化学プロセスの現在のトレンドから懸け離れてい
る。実際、この方法は、膨大な量の有機溶媒の使用（及
びリサイクル）と、反応中及び最終製品の単離中の両方
でそれらの回収を含んでいる。
で大規模にホスファチジルセリンを製造するけれど、有
機溶媒の使用を減らし、副製品を最少にするという工業
的な化学プロセスの現在のトレンドから懸け離れてい
る。実際、この方法は、膨大な量の有機溶媒の使用（及
びリサイクル）と、反応中及び最終製品の単離中の両方
でそれらの回収を含んでいる。
【０００７】本発明は、先行技術に関する上述の欠点を
克服し、工業規模でホスファチジルセリンを製造する方
法を提供することを目的とする。
克服し、工業規模でホスファチジルセリンを製造する方
法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明により、係る問題
は解消された。すなわち、本発明は、下記一般式（１）
で表されるホスファチジルセリンの製造方法において、
は解消された。すなわち、本発明は、下記一般式（１）
で表されるホスファチジルセリンの製造方法において、
【０００９】
【化３】
【００１０】（式（１）において、Ｒ1及びＲ2は独立し
て、飽和、モノ不飽和又はポリ不飽和のＣ10〜Ｃ30のア
シル基であり、ＸはＯＨ又はＯＭであり、Ｍはアルカリ
金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は分子内塩を
含むアルキルアンモニウムである。）
て、飽和、モノ不飽和又はポリ不飽和のＣ10〜Ｃ30のア
シル基であり、ＸはＯＨ又はＯＭであり、Ｍはアルカリ
金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は分子内塩を
含むアルキルアンモニウムである。）
【００１１】下記一般式（２）で表されるホスファチド
と、ラセミ体もしくはエナンチオマー的に純粋なセリ
ン、好ましくはＬ−セリンとをホスホリパーゼＤ（ＰＬ
Ｄ）の存在下に反応させることからなり、反応媒体が水
性分散液であることを特徴とする式（１）のホスファチ
ジルセリンを製造する方法である。
と、ラセミ体もしくはエナンチオマー的に純粋なセリ
ン、好ましくはＬ−セリンとをホスホリパーゼＤ（ＰＬ
Ｄ）の存在下に反応させることからなり、反応媒体が水
性分散液であることを特徴とする式（１）のホスファチ
ジルセリンを製造する方法である。
【００１２】
【化４】
【００１３】（式（２）において、Ｒ1、Ｒ2及びＸは上
記式（１）で定義したとおりであり、Ｒ3はＣＨ2−ＣＨ
2−ＮＨ2又はＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3である。）
記式（１）で定義したとおりであり、Ｒ3はＣＨ2−ＣＨ
2−ＮＨ2又はＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3である。）
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の方法に用いる出発原料
は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）
のような合成ホスファチジルコリン（ＰＣ）又は天然の
ホスファチジルコリン又は、大豆又は卵のレシチンある
いは大豆又は卵のレシチンの部分精製により得られる商
業的に入手可能なリン脂質混合物のようなリン脂質混合
物のいずれでもよい。これらのリン脂質含有率は２０重
量％〜９５重量％であることが好ましい。
は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）
のような合成ホスファチジルコリン（ＰＣ）又は天然の
ホスファチジルコリン又は、大豆又は卵のレシチンある
いは大豆又は卵のレシチンの部分精製により得られる商
業的に入手可能なリン脂質混合物のようなリン脂質混合
物のいずれでもよい。これらのリン脂質含有率は２０重
量％〜９５重量％であることが好ましい。
【００１５】プロセスコストに関する限り、レシチンか
ら誘導された出発原料を用いることは、それらの低コス
トと、それらの混合物の重要な成分であるホスファチジ
ルエタノールアミン（ＰＥ）はその反応条件下にＰＳに
変換されるという事実の両方の観点から、とりわけ好都
合である。
ら誘導された出発原料を用いることは、それらの低コス
トと、それらの混合物の重要な成分であるホスファチジ
ルエタノールアミン（ＰＥ）はその反応条件下にＰＳに
変換されるという事実の両方の観点から、とりわけ好都
合である。
【００１６】出発原料は、他の試薬を加える前に、活性
を促進するために、水性媒体中に十分分散されるべきで
ある。分散は、出発リン脂質原料を３〜１０容量倍の水
又は塩溶液と２０〜５０℃で１〜１０時間撹拌すること
を保持することにより行われる。
を促進するために、水性媒体中に十分分散されるべきで
ある。分散は、出発リン脂質原料を３〜１０容量倍の水
又は塩溶液と２０〜５０℃で１〜１０時間撹拌すること
を保持することにより行われる。
【００１７】この段階で界面活性剤を使用すると、基質
の分散が促進され、その結果反応速度が速くなる。イオ
ン系又は非イオン系界面活性剤を好ましく用いることが
でき、界面活性剤は、より好ましくは、ビス−（２−エ
チルヘキシル）スルホこはく酸エステル（ＡＯＴ）又は
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅ
ｎ ８０(R)）であり、基質（ホスファチド）１ｇ当た
り０．０１〜０．４ｇ添加する。これらの界面活性剤の
効果は、水性媒体に分散する傾向が劣るＤＭＰＣのよう
なホスファチジルコリンを用いるとき、特に好適であ
る。
の分散が促進され、その結果反応速度が速くなる。イオ
ン系又は非イオン系界面活性剤を好ましく用いることが
でき、界面活性剤は、より好ましくは、ビス−（２−エ
チルヘキシル）スルホこはく酸エステル（ＡＯＴ）又は
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅ
ｎ ８０(R)）であり、基質（ホスファチド）１ｇ当た
り０．０１〜０．４ｇ添加する。これらの界面活性剤の
効果は、水性媒体に分散する傾向が劣るＤＭＰＣのよう
なホスファチジルコリンを用いるとき、特に好適であ
る。
【００１８】本発明のさらなる特徴は、天然のリン脂質
（例えば、大豆レシチンから得られるホスファチジルコ
リン濃縮分画）の調製物をしばしば汚濁するか、もしく
は、それら（アルコール溶媒）はホスホリパーゼＤの存
在下に反応し、相当するホスファチジル誘導体（エタノ
ールが混合物中に存在するときホスファチジルエタノー
ルのような誘導体）を生成することから、引き続いて起
こるＰＳ形成反応において邪魔をするアルコール溶媒、
特にエタノール、を容易に除去することができることで
ある。
（例えば、大豆レシチンから得られるホスファチジルコ
リン濃縮分画）の調製物をしばしば汚濁するか、もしく
は、それら（アルコール溶媒）はホスホリパーゼＤの存
在下に反応し、相当するホスファチジル誘導体（エタノ
ールが混合物中に存在するときホスファチジルエタノー
ルのような誘導体）を生成することから、引き続いて起
こるＰＳ形成反応において邪魔をするアルコール溶媒、
特にエタノール、を容易に除去することができることで
ある。
【００１９】これは、水性塩溶液中に出発リン脂質を分
散し、その懸濁物をデカンテーションし、エタノールが
溶け込んでいる液体相を除去することによって簡便に除
去することができる。ホスファチドは、不純物のアルコ
ール含有量が０．１重量％以下であることが好ましい。
散し、その懸濁物をデカンテーションし、エタノールが
溶け込んでいる液体相を除去することによって簡便に除
去することができる。ホスファチドは、不純物のアルコ
ール含有量が０．１重量％以下であることが好ましい。
【００２０】水性塩溶液として十分高い密度を有する塩
溶液であれば如何なるものも使用でき、容易に出発原料
を分離できる。好ましくは、塩化カルシウム溶液又は酢
酸ナトリウム／酢酸緩衝溶液又はそれらの混合物であ
る。
溶液であれば如何なるものも使用でき、容易に出発原料
を分離できる。好ましくは、塩化カルシウム溶液又は酢
酸ナトリウム／酢酸緩衝溶液又はそれらの混合物であ
る。
【００２１】出発原料の水性分散液には、セリン、塩化
カルシウム、ｐＨ制御のバッファー及びホスホリパーゼ
Ｄを含む水溶液が添加される。
カルシウム、ｐＨ制御のバッファー及びホスホリパーゼ
Ｄを含む水溶液が添加される。
【００２２】セリンの量は、ＰＳに変換するために便宜
的にはリン脂質１モル当たりセリン４〜２０モルの範囲
とする。セリンは、Ｄ体、Ｌ体又はラセミ体であっても
よく、どの場合にも、対応するホスファチジル誘導体が
得られる。
的にはリン脂質１モル当たりセリン４〜２０モルの範囲
とする。セリンは、Ｄ体、Ｌ体又はラセミ体であっても
よく、どの場合にも、対応するホスファチジル誘導体が
得られる。
【００２３】塩化カルシウムは、ホスホリパーゼＤ触媒
反応に好ましいカルシウムイオンの源泉であり、さら
に、カルシウムイオンの存在により、反応の終結後、簡
単に濾過できる形でホスファチジルセリンの分離が誘導
される。塩化カルシウムの濃度は、好ましくは０．０５
〜０．５Ｍの範囲である。
反応に好ましいカルシウムイオンの源泉であり、さら
に、カルシウムイオンの存在により、反応の終結後、簡
単に濾過できる形でホスファチジルセリンの分離が誘導
される。塩化カルシウムの濃度は、好ましくは０．０５
〜０．５Ｍの範囲である。
【００２４】水溶液のｐＨは、用いる酵素の起源に依存
し、ｐＨ４〜９、特にはｐＨ４〜４．５が好ましい。酵
素の場合、実質的に酸媒体においてそれらの活性を発揮
するので、水溶液は０．０２〜０．２Ｍ 酢酸塩でバッ
ファーすることが好ましい。
し、ｐＨ４〜９、特にはｐＨ４〜４．５が好ましい。酵
素の場合、実質的に酸媒体においてそれらの活性を発揮
するので、水溶液は０．０２〜０．２Ｍ 酢酸塩でバッ
ファーすることが好ましい。
【００２５】加水分解活性より高いホスファチジル変換
（transphosphatidylation）活性を有する酵素は、反応
を遂行する酵素として好適に用いることができる。発酵
起源の酵素は有用に用いることができ、さらに、ＡＴＣ
Ｃ（American Type Culture Collection）に寄託番号５
５７１７号として寄託された微生物の発酵により得られ
た酵素が好ましい。
（transphosphatidylation）活性を有する酵素は、反応
を遂行する酵素として好適に用いることができる。発酵
起源の酵素は有用に用いることができ、さらに、ＡＴＣ
Ｃ（American Type Culture Collection）に寄託番号５
５７１７号として寄託された微生物の発酵により得られ
た酵素が好ましい。
【００２６】酵素は、粗酵素の形で、すなわち微生物を
濾過除去した後の発酵混合物を使用することができる
し、より好ましくは、低分子量の不純物を除去するため
に適切なカットオフ値（例えば、１０，０００ダルト
ン）を有する膜をとおす限外濾過による精製後のものを
使用することもできる。酵素濃縮溶液はそのまま用いて
も、あるいはそれを凍結乾燥して固体の形で得た酵素を
用いることもできる。酵素の量は、好ましくは、ホスフ
ァチド１ｇ当たり１０〜１００unitsの範囲である（酵
素活性は、Biotechn 7, 795 (1993) に記載される試験
で測定できる）。
濾過除去した後の発酵混合物を使用することができる
し、より好ましくは、低分子量の不純物を除去するため
に適切なカットオフ値（例えば、１０，０００ダルト
ン）を有する膜をとおす限外濾過による精製後のものを
使用することもできる。酵素濃縮溶液はそのまま用いて
も、あるいはそれを凍結乾燥して固体の形で得た酵素を
用いることもできる。酵素の量は、好ましくは、ホスフ
ァチド１ｇ当たり１０〜１００unitsの範囲である（酵
素活性は、Biotechn 7, 795 (1993) に記載される試験
で測定できる）。
【００２７】反応は、好ましくは２５〜６０℃、より好
ましくは４０〜５０℃で行うことができる。ＰＳは、反
応混合物を濾過し、セリン及び存在する塩を除去するた
めに水で洗浄することによって回収される。
ましくは４０〜５０℃で行うことができる。ＰＳは、反
応混合物を濾過し、セリン及び存在する塩を除去するた
めに水で洗浄することによって回収される。
【００２８】本発明の方法の特に有用な点は、反応生成
物（ＰＳ）がその反応混合物から、その回収が溶剤を添
加して沈殿させることを必要とせずに簡単な濾過により
効果的になされるという形で、分離されることである。
物（ＰＳ）がその反応混合物から、その回収が溶剤を添
加して沈殿させることを必要とせずに簡単な濾過により
効果的になされるという形で、分離されることである。
【００２９】本発明の方法の主要な利点は、水性媒体中
でホスファチジルコリン及び類似のホスファチドのホス
ファチジル変換反応を遂行し、良好な純度のホスファチ
ジルセリンを、しかも満足できる高い収率で得るとい
う、先行技術から予測され得ない、実施可能性にある。
でホスファチジルコリン及び類似のホスファチドのホス
ファチジル変換反応を遂行し、良好な純度のホスファチ
ジルセリンを、しかも満足できる高い収率で得るとい
う、先行技術から予測され得ない、実施可能性にある。
【００３０】
【実施例】本発明の特徴及び利点を、以下の実施例によ
りさらに詳細に示す。なお、％は、特に断らない限り、
以下重量％を示す。
りさらに詳細に示す。なお、％は、特に断らない限り、
以下重量％を示す。
【００３１】実施例１ 純度９５％の大豆ホスファチジルコリン５ｇを、ｐＨ
４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー３０ｍｌに加えた。
混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一
に分散した。寄託番号ＡＴＣＣ ５５７１７号で寄託し
た微生物の発酵により得られた粗酵素溶液を、１０，０
００ダルトンで分画する限外濾過膜を通して低分子量の
不純物を完全に除去するまで透析した。なお、酵素とし
ては２Ｕ／ｇの活性を有する８０ｍｌのホスホリパーゼ
Ｄ溶液からなる酵素溶液を用いた。この酵素溶液にＬ−
セリン４０ｇ及び塩化カルシウム２．９ｇを加えた。得
られた溶液をホスファチジルコリン分散液に加え、その
混合物を４５℃に加熱した。６時間撹拌し反応を行っ
た。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終
物の重量は４．２４ｇであった。 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による組成分
析結果：ＰＳ ９０．７％、ＰＣ １．４％、ＰＡ（ホ
スファチジン酸）６．２％。
４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー３０ｍｌに加えた。
混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一
に分散した。寄託番号ＡＴＣＣ ５５７１７号で寄託し
た微生物の発酵により得られた粗酵素溶液を、１０，０
００ダルトンで分画する限外濾過膜を通して低分子量の
不純物を完全に除去するまで透析した。なお、酵素とし
ては２Ｕ／ｇの活性を有する８０ｍｌのホスホリパーゼ
Ｄ溶液からなる酵素溶液を用いた。この酵素溶液にＬ−
セリン４０ｇ及び塩化カルシウム２．９ｇを加えた。得
られた溶液をホスファチジルコリン分散液に加え、その
混合物を４５℃に加熱した。６時間撹拌し反応を行っ
た。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終
物の重量は４．２４ｇであった。 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による組成分
析結果：ＰＳ ９０．７％、ＰＣ １．４％、ＰＡ（ホ
スファチジン酸）６．２％。
【００３２】実施例２ 純度９５％の大豆ホスファチジルコリン５ｇを、Ｔｗｅ
ｅｎ ８０(R)を０．０８ｇ含有するｐＨ４．５の０．
１Ｍ酢酸塩バッファー３０ｍｌに加えた。混合物を４０
℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。
実施例１に記したようにして得られた２Ｕ／ｇの活性を
有するホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌにＬ−セリン４０
ｇ、塩化カルシウム２．９ｇを加えた。得られた溶液を
ホスファチジルコリン分散液に加え、その混合物を４５
℃に加熱した。９０分後のＨＰＬＣ分析による組成は次
のとおり：ＰＳ ６９．７％、ＰＣ １１．６％、ＰＡ
５．３％。さらに４時間撹拌して反応を進めた。固体を
濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は
４．７６ｇであった。 ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ９０．２％、ＰＣ ０．６
％、ＰＡ ６．４％。
ｅｎ ８０(R)を０．０８ｇ含有するｐＨ４．５の０．
１Ｍ酢酸塩バッファー３０ｍｌに加えた。混合物を４０
℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。
実施例１に記したようにして得られた２Ｕ／ｇの活性を
有するホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌにＬ−セリン４０
ｇ、塩化カルシウム２．９ｇを加えた。得られた溶液を
ホスファチジルコリン分散液に加え、その混合物を４５
℃に加熱した。９０分後のＨＰＬＣ分析による組成は次
のとおり：ＰＳ ６９．７％、ＰＣ １１．６％、ＰＡ
５．３％。さらに４時間撹拌して反応を進めた。固体を
濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は
４．７６ｇであった。 ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ９０．２％、ＰＣ ０．６
％、ＰＡ ６．４％。
【００３３】実施例３ 純度９５％の大豆ホスファチジルコリン５ｇを、ＡＯＴ
を０．3ｇ含有するｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッフ
ァー３０ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌
し、リン脂質を水相に均一に分散した。実施例１に記し
たようにして得られた２Ｕ／ｇの活性を有するホスホリ
パーゼＤ溶液８０ｍｌにＬ−セリン４０ｇ、塩化カルシ
ウム２．９ｇを加えた。得られた溶液をホスファチジル
コリン分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。
６時間反応した後、固体を濾別し、水で洗浄し、そして
乾燥した。最終物の重量は４．１６ｇであった。 ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８８．８％、ＰＣ ０．６
％、ＰＡ ４．１％。
を０．3ｇ含有するｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッフ
ァー３０ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌
し、リン脂質を水相に均一に分散した。実施例１に記し
たようにして得られた２Ｕ／ｇの活性を有するホスホリ
パーゼＤ溶液８０ｍｌにＬ−セリン４０ｇ、塩化カルシ
ウム２．９ｇを加えた。得られた溶液をホスファチジル
コリン分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。
６時間反応した後、固体を濾別し、水で洗浄し、そして
乾燥した。最終物の重量は４．１６ｇであった。 ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８８．８％、ＰＣ ０．６
％、ＰＡ ４．１％。
【００３４】実施例４ 主な成分がＰＣ６６％、ＰＥ１７％、ＰＡ２％である大
豆レシチンを濃縮することにより得られたリン脂質２５
ｇを、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー１００ｍ
ｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質
を水相に均一に分散した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩
バッファー８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ、塩化カルシウ
ム２．９ｇの溶液を別途調製し、この溶液に実施例１に
記したようにして得られたホスホリパーゼＤ溶液を凍結
乾燥して得た固体１８８ｍｇを加えた。この固体の活性
は０．９Ｕ／ｍｇである。得られた溶液をリン脂質分散
液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。混合物を３
時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥
した。最終物の重量は２２．８ｇであった。 ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ５９．８％、ＰＣ １．６％、
ＰＡ ６．１％、ＰＥ６．７％。
豆レシチンを濃縮することにより得られたリン脂質２５
ｇを、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー１００ｍ
ｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質
を水相に均一に分散した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩
バッファー８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ、塩化カルシウ
ム２．９ｇの溶液を別途調製し、この溶液に実施例１に
記したようにして得られたホスホリパーゼＤ溶液を凍結
乾燥して得た固体１８８ｍｇを加えた。この固体の活性
は０．９Ｕ／ｍｇである。得られた溶液をリン脂質分散
液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。混合物を３
時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥
した。最終物の重量は２２．８ｇであった。 ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ５９．８％、ＰＣ １．６％、
ＰＡ ６．１％、ＰＥ６．７％。
【００３５】実施例５ 出発原料として、実施例４で用いたリン脂質を、ｐＨ
４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー１００ｍｌに加え
た。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に
均一に分散した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファ
ー８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ及び塩化カルシウム２．
９ｇの溶液を別途調製し、この溶液に実施例４に記した
ように調製した凍結乾燥酵素９０ｍｇを加えた。得られ
た溶液をリン脂質分散液に加え、その混合物を４５℃に
加熱し、そして１６時間撹拌した。最終組成物をＨＰＬ
Ｃで分析した：ＰＳ ３９．１％、ＰＣ ８．３％、Ｐ
Ａ １６．６％、ＰＥ ６．８％。
４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー１００ｍｌに加え
た。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に
均一に分散した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファ
ー８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ及び塩化カルシウム２．
９ｇの溶液を別途調製し、この溶液に実施例４に記した
ように調製した凍結乾燥酵素９０ｍｇを加えた。得られ
た溶液をリン脂質分散液に加え、その混合物を４５℃に
加熱し、そして１６時間撹拌した。最終組成物をＨＰＬ
Ｃで分析した：ＰＳ ３９．１％、ＰＣ ８．３％、Ｐ
Ａ １６．６％、ＰＥ ６．８％。
【００３６】実施例６ 反応中温度を５５℃に保持した以外は実施例５に記載し
た条件と同じ条件で反応を行った。１６時間後、反応を
中止した。ＨＰＬＣ分析による組成は次のとおり：ＰＳ
４１．７％、ＰＣ ８．３％、ＰＡ １１．０％、ＰＥ
９．９％。
た条件と同じ条件で反応を行った。１６時間後、反応を
中止した。ＨＰＬＣ分析による組成は次のとおり：ＰＳ
４１．７％、ＰＣ ８．３％、ＰＡ １１．０％、ＰＥ
９．９％。
【００３７】実施例７ 塩化カルシウムを添加しなかった以外は実施例４に記載
した条件と同じ条件で反応を行った。２０時間後、反応
を中止した。ＨＰＬＣ分析による組成は次のとおり：Ｐ
Ｓ ４１．２％、ＰＣ １５．９％、ＰＡ １０．９
％、ＰＥ ７．４％。
した条件と同じ条件で反応を行った。２０時間後、反応
を中止した。ＨＰＬＣ分析による組成は次のとおり：Ｐ
Ｓ ４１．２％、ＰＣ １５．９％、ＰＡ １０．９
％、ＰＥ ７．４％。
【００３８】実施例８ 実施例４で出発原料として用いたリン脂質２ｇを、水４
０ｍｌ中に塩化カルシウム３ｇを含む溶液が入った分液
漏斗に加え、その混合物を２５℃で１時間撹拌した。撹
拌を中止して３時間放置後、水相の３６ｍｌを底部バル
ブで抜き出した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファ
ー６．５ｍｌ、Ｌ−セリン３．２ｇの溶液を別途調製
し、この溶液に実施例４に記したように調製した凍結乾
燥酵素１５ｍｇを加えた。得られた溶液をリン脂質分散
液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。１時間撹拌
し反応した。最終組成物をＨＰＬＣで分析した：ＰＳ
５５．７％、ＰＣ ９．４％、ＰＡ ４．０％、ＰＥ
９．０％。なお、この反応におけるホスファチジルエタ
ノールの生成は、薄層クロマログラフィー（ＴＬＣ）検
出限界以下（０．１％）であった。
０ｍｌ中に塩化カルシウム３ｇを含む溶液が入った分液
漏斗に加え、その混合物を２５℃で１時間撹拌した。撹
拌を中止して３時間放置後、水相の３６ｍｌを底部バル
ブで抜き出した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファ
ー６．５ｍｌ、Ｌ−セリン３．２ｇの溶液を別途調製
し、この溶液に実施例４に記したように調製した凍結乾
燥酵素１５ｍｇを加えた。得られた溶液をリン脂質分散
液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。１時間撹拌
し反応した。最終組成物をＨＰＬＣで分析した：ＰＳ
５５．７％、ＰＣ ９．４％、ＰＡ ４．０％、ＰＥ
９．０％。なお、この反応におけるホスファチジルエタ
ノールの生成は、薄層クロマログラフィー（ＴＬＣ）検
出限界以下（０．１％）であった。
【００３９】実施例９ ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）５
ｇ、Ｔｗｅｅｎ ８０(R)１．６ｇ及びｐＨ４．５の
０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー３０ｍｌを４５℃で
１時間撹拌した。この分散液を実施例１に記載するよう
にして得た水性ホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌ、Ｌ−セ
リン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加え、５
０℃の温度で１７時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗
浄し、そして乾燥した。最終物の重量は５．４ｇであっ
た。 ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８３．２％、ＰＣ ４．３
％、ＰＡ １１．７％。
ｇ、Ｔｗｅｅｎ ８０(R)１．６ｇ及びｐＨ４．５の
０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー３０ｍｌを４５℃で
１時間撹拌した。この分散液を実施例１に記載するよう
にして得た水性ホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌ、Ｌ−セ
リン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加え、５
０℃の温度で１７時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗
浄し、そして乾燥した。最終物の重量は５．４ｇであっ
た。 ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８３．２％、ＰＣ ４．３
％、ＰＡ １１．７％。
【００４０】実施例１０ ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）５
ｇ、ＡＯＴ１．０ｇ及びｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナト
リウムバッファー３０ｍｌを５０℃で４５分間撹拌し
た。この分散液を実施例１に記載するようにして得た水
性ホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ、
塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加え、５０℃の温度で
２０時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗浄し、そして
乾燥した。最終物の重量は３．６６ｇであった。 ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８５．２％、ＰＣ １０．５
％、ＰＡ ３．５％。
ｇ、ＡＯＴ１．０ｇ及びｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナト
リウムバッファー３０ｍｌを５０℃で４５分間撹拌し
た。この分散液を実施例１に記載するようにして得た水
性ホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ、
塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加え、５０℃の温度で
２０時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗浄し、そして
乾燥した。最終物の重量は３．６６ｇであった。 ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８５．２％、ＰＣ １０．５
％、ＰＡ ３．５％。
【００４１】実施例１１ オレイン酸エステル分解ぜず（non-deoleated）、トリ
グリセライドを除去していない大豆レシチンのＰＣ濃縮
分画（組成：トリグリセライド５０％、ＰＣ３５％、Ｐ
Ｅ８％）１０ｇをｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム
バッファー３０ｍｌに加え、２５℃で１時間撹拌した。
この混合物を実施例１に記載するようにして調製したホ
スホリパーゼＤ酵素の溶液８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ
及び塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加えた。４５℃の
温度で１１時間撹拌し反応した。水相を分離し、ゴム状
の固体にアセトン１００mlを加えた。濾過後乾燥して
３．９ｇの製品を得た。 ＨＰＬＣ 分析： ＰＳ ５８％、ＰＣ ２．０％、ＰＡ
１７．０％、ＰＥ １．８％。
グリセライドを除去していない大豆レシチンのＰＣ濃縮
分画（組成：トリグリセライド５０％、ＰＣ３５％、Ｐ
Ｅ８％）１０ｇをｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム
バッファー３０ｍｌに加え、２５℃で１時間撹拌した。
この混合物を実施例１に記載するようにして調製したホ
スホリパーゼＤ酵素の溶液８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ
及び塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加えた。４５℃の
温度で１１時間撹拌し反応した。水相を分離し、ゴム状
の固体にアセトン１００mlを加えた。濾過後乾燥して
３．９ｇの製品を得た。 ＨＰＬＣ 分析： ＰＳ ５８％、ＰＣ ２．０％、ＰＡ
１７．０％、ＰＥ １．８％。
Claims (22)
- 【請求項１】 下記一般式（１） 【化１】 （式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して、飽和、モノ不
飽和又はポリ不飽和のＣ 10〜Ｃ30のアシル基であり、Ｘ
はＯＨ又はＯＭであり、Ｍはアルカリ金属、アルカリ土
類金属、アンモニウム又は分子内塩を含むアルキルアン
モニウムである。）で表されるホスファチジルセリンの
製造方法において、下記一般式（２） 【化２】 （式中、Ｒ1、Ｒ2及びＸは上記式（１）で定義したもの
と同じであり、Ｒ3はＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2又はＣＨ2−
ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3である。）で表されるホスファチ
ドと、ラセミ体もしくはエナンチオマー的に純粋なセリ
ン、好ましくはＬ−セリンとをホスホリパーゼＤ（ＰＬ
Ｄ）の存在下に反応させることからなり、反応媒体が水
性分散液であることを特徴とするホスファチジルセリン
の製造方法。 - 【請求項２】反応が、カルシウム塩、好ましくは塩化カ
ルシウムの存在下に行われる請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】カルシウム塩が、塩化カルシウムであり、
その濃度が０．０５〜０．５Ｍである請求項１に記載の
方法。 - 【請求項４】セリンの量が、リン脂質１モル当たり４〜
２０モルの範囲である請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】ホスファチドは、不純物として含まれるア
ルコールが０．１％以下のものである請求項１〜４のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項６】アルコールが、エタノールである請求項５
に記載の方法。 - 【請求項７】リン脂質が、セリンと反応する前に、当該
リン脂質を水性塩溶液に懸濁し、次いで液相をデカンテ
ーションすることによりアルコールを分離し、精製され
たものである請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】水性塩溶液が、塩化カルシウム及び／又は
酢酸／酢酸ナトリウム緩衝溶液である請求項７に記載の
方法。 - 【請求項９】ホスファチド水性分散液が、ｐＨ４〜９、
好ましくはｐＨ４〜４．５の範囲で緩衝されるものであ
る請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】反応が、温度２５〜６０℃、好ましくは
４０〜５０℃の範囲で行われる請求項１〜９のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項１１】ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）が、高いホ
スファチジル変換（transphosphatidylation）活性を有
する細胞外ホスホリパーゼＤを産生する微生物菌株の発
酵液を遠心して得られたものである請求項１〜１０のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】ホスホリパーゼＤが、ストレプトミセス
菌株ＡＴＣＣ ５５７１７によって産生されたものであ
る請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】ホスホリパーゼＤが、その溶液を限外濾
過により精製されたものである請求項１１に記載の方
法。 - 【請求項１４】限外濾過は１０，０００ダルトンを分画
する膜を用いて行われる請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】限外濾過の濾液は凍結乾燥され、固体の
形でホスホリパーゼＤを得る請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１６】ホスファチドの水性分散液が当該ホスフ
ァチドと３〜１０容量倍の水又は塩溶液を混合し、該混
合物を２０〜５０℃で１〜１０時間撹拌保持する請求項
１〜１５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１７】ホスファチド混合物及び水又は塩溶液
は、１種以上の界面活性剤が加えられたものである請求
項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】１種以上の界面活性剤が、ビス−（２−
エチルヘキシル）スルホこはく酸エステル（ＡＯＴ）又
はポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅ
ｅｎ ８０(R)）である請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】界面活性剤をホスファチド１ｇ当たり
０．０１〜０．４ｇ加える請求項１７又は１８に記載の
方法。 - 【請求項２０】式（１）のホスファチジルセリンが、反
応混合物から、濾過し、水で洗浄することにより回収さ
れる請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２１】式（２）のホスファチドが、リン脂質含
有率２０％〜９５％である、大豆もしくは卵のレシチン
から選択される天然起源のホスファチジルコリン及び／
又はホスファチジルエタノールアミンの混合物である請
求項１〜２０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２２】式（２）のホスファチドが、合成ホスフ
ァチジルコリンである請求項１７に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| IT1999MI000895A IT1311929B1 (it) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | Procedimento per la preparazione di fosfatidilserine. |
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| IT99A000895 | 1999-04-28 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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| DE (1) | DE60005241T2 (ja) |
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| ES (1) | ES2206099T3 (ja) |
| IT (1) | IT1311929B1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002218991A (ja) * | 2001-01-23 | 2002-08-06 | Nof Corp | ホスファチジルセリンの製造方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| IT1319679B1 (it) * | 2000-12-05 | 2003-10-23 | Chemi Spa | Processo di purificazione di fosfatidilserina. |
| JP3697189B2 (ja) * | 2001-01-11 | 2005-09-21 | 日清オイリオグループ株式会社 | リン脂質の塩基交換方法 |
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| ITPD20010031A1 (it) * | 2001-02-09 | 2002-08-09 | Fidia Farmaceutici | Procedimento per la preparazione di fosfatidi puri e loro impiego in campo cosmetico, farmaceutico ed alimentare. |
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| KR20030086128A (ko) * | 2002-05-03 | 2003-11-07 | 주식회사 두산 | 효소 및 세린의 재사용을 포함하는 포스파티딜세린 및리소포스파티딜세린의 제조방법 |
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| KR101055094B1 (ko) * | 2009-05-23 | 2011-08-08 | 주식회사 고센바이오텍 | 양배추 포스포리파아제 d에 의한 난황 인지질로부터 포스파티딜세린의 생합성 방법 |
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