ITMI990895A1 - Procedimento per la preparazione di fosfatidilserine - Google Patents
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo:
PROCEDIMENTO PER LA PREPARAZIONE DI FOSFATIDILSERI-NE"
La presente invenzione riguarda, in generale, un procedimento per la preparazione di fosfatidilserine.
In particolare, Γ invenzione si riferisce ad un procedimento per la preparazione di fosfatidilserine a partire da fosfolipidi naturali o sintetici, per reazione di questi ultimi con Serina in un mezzo acquoso.
L'importanza delle fosfatidilserine è molteplice, in particolare nella produzione di composizioni farmaceutiche adatte per la terapia di sindromi cerebrali involutive di natura diversa quali ad esempio decadimento senile o patologie vascolari, nella preparazione di particolari formulazioni liposomiali, e più recentemente, nella commercializzazione di composizioni dietetiche a base di lecitine naturali, in particolare lecitina di soia, arricchita in fosfatidil-(L)- Serina, d'ora in avanti indicata con la sigla PS, contenente anche acidi grassi poliinsaturi quali residui acilici.
La richiesta da parte del mercato di quantità industriali crescenti e a costo contenuto di PS, ha spinto la Richiedente ad effettuare un'intensa attività sperimentale al fine di individuare le condizioni per la preparazione di un siffatto prodotto che rispondessero ai requisiti di fattibilità su scala industriale.
Nel brevetto US 5700668, a nome della Richiedente, è descritto un procedimento per la preparazione di PS, che, a differenza di quelli noti in precedenza (si vedano in particolare Comfurius P et al., Biochim. Biophys. Acta 488, 36 (1977); Yamane et al., Biochim. Biophys. Acta 1003, 277 (1989); JP-A-63 036,791; JP-A-02 079,990 e J.Chem.Soc. Perkin Trans. 1, 919 (1995)) consente di produrre PS con buone rese su scala industriale a partire anche da materiali di partenza non purificati e senza la necessità di procedere a purificazioni cromatografiche.
Il procedimento descritto in tale brevetto prevede la reazione fra fosfatidi naturali o sintetici e Serina in un sistema bifasico costituito da una soluzione del fosfatide di partenza in un solvente organico, tipicamente toluene, e da una soluzione acquosa contenente Serina e fosfolipasi D. Mantenendo tale sistema sotto buona agitazione si ha la conversione dei fosfatidi in PS e quest’ultima può essere recuperata dalla fase organica precipitandola con acetone.
Un simile procedimento, pur permettendo la produzione di fosfatidilserina su larga scala con buoni rendimenti, si discosta dall’attuale tendenza ad avere processi chimici industriali che comportino un ridotto impiego di solventi organici ed una minima formazione di sottoprodotti. Infatti esso prevede l’utilizzo (ed il riciclo) di notevoli quantità di solventi organici ed il loro recupero sia nella conduzione della reazione che durante l’isolamento del prodotto finito.
Il problema alla base della presente invenzione è stato pertanto quello di mettere a disposizione un procedimento per la preparazione di fosfatidilserine su scala industriale, che superasse gli inconvenienti sopra evidenziati con riferimento alla tecnica nota.
Un tale problema è stato risolto, secondo l’invenzione, da un procedimento per la preparazione di fosfatidilserine di formula (I)
in cui R<1 >e R<2 >rappresentano indipendentemente un acile C10-C30, saturo, monoinsaturo o poliinsaturo,
X = OH oppure OM, dove M = metallo alcalino o alcalino-terroso, ammonio, alchilammonio (incluso il sale interno),
comprendente la reazione di fosfatidi di formula generale (II)
( )
in cui R<1>, R<2 >e X hanno i significati sopra definiti e
con Serina, racemica o enantiomericamente pura, preferibilmente con (L)-Serina, in presenza di una fosfolipasi D (PLD), caratterizzato dal fatto che la reazione è condotta addizionando la Serina ad una dispersione acquosa tamponata di fosfatidi in presenza di sali di calcio.
La materia prima usata nel processo può essere una fosfatidilcolina (PC) di sintesi come per esempio Di Miristoil Fosfatidii Colina (DMPC), o fosfatidilcolina di origine naturale o una miscela di fosfolipidi come la lecitina di soia o da uovo o una delle miscele di fosfolipidi disponibili commercialmente ottenute per parziale purificazione della lecitina di soia o da uovo.
Da un punto di vista dell’economicità del processo è particolarmente conveniente impiegare materie prime derivate dalla lecitina sia per il loro minor costo sia perchè la fosfatidiletanolammina (PE), che è un importante costituente di queste miscele, nelle condizioni di reazione si converte essa stessa in PS.
Per favorire la reattività della materia prima è importante farne una buona dispersione in ambiente acquoso prima dell’aggiunta degli altri reagenti.
La dispersione si realizza mantenendo per 1-10 ore la materia prima fosfolipidica a 20-50°C sotto agitazione con 3-10 volumi di acqua o soluzioni saline.
L’impiego di tensioattivi in questa fase favorisce la dispersione del substrato e, di conseguenza, la velocità della reazione.
Possono essere convenientemente impiegati tensioattivi ionici o non ionici, più convenientemente il tensioattivo è bis(2-etilesil)sulfosuccinato sale sodico (AOT) o il tensioattivo Tween 80<® >nella quantità da 0.01 a 0.4 g per ogni grammo di substrato.
L’effetto di questi tensioattivi si manifesta in modo particolarmente positivo usando le fosfatidilcoline di sintesi come la DMPC che hanno scarsa tendenza a disperdersi in ambiente acquoso.
Un altro aspetto caratteristico di questa invenzione è la possibilità di allontanare facilmente i solventi alcolici ed in particolare Γ etanolo che spesso inquinano le preparazioni di fosfolipidi di origine naturale (per es. le frazioni arricchite in Fosfatidilcolina ottenute a partire da lecitina di soia) e che interferiscono nella successiva reazione di formazione di PS reagendo essi stessi in presenza di fosfolipasi D per dare i corrispondenti fosfatidii derivati (per es. il fosfatidii etanolo se nella miscela è presente etanolo).
Questo allontanamento può essere convenientemente realizzato disperdendo il fosfolipide di partenza in una soluzione acquosa salina, lasciando decantare la sospensione e rimuovendo la fase liquida che contiene disciolto l’etanolo presente.
Come soluzione acquosa salina può essere impiegata ogni soluzione salina che abbia una densità sufficientemente elevata da permettere l’agevole separazione della materia prima, preferibilmente sarà una soluzione di calcio cloruro o di tampone Sodio Acetato/Acido Acetico o di entrambe.
Alla dispersione acquosa della materia prima si aggiunge una soluzione acquosa contenente Serina, Calcio Cloruro, un tampone per il controllo del pH e la fosfolipasi D.
Il quantitativo di Serina sarà convenientemente compreso tra le 4 e le 20 moli di Serina per mole di fosfolipide da convertire in PS. La Serina può essere di forma D, L o racemica ottenendo in ciascun caso i corrispondenti fosfatidii derivati.
Il calcio cloruro è la fonte di ione calcio che favorisce le reazioni catalizzate da Fosfolipasi D; la presenza di ione calcio provoca inoltre la separazione della Fosfatidilserina in una forma facilmente filtrabile al termine della reazione.
La concentrazione di calcio cloruro è preferibilmente compresa tra 0.05 e 0.5 M.
Il pH della soluzione acquosa dipenderà dall’origine dell’enzima utilizzato, essendo compreso preferibilmente tra pH= 4 e pH=9. Nel caso di enzimi la cui attività si esplica favorevolmente in ambiente tendenzialmente acido, per tamponare la soluzione acquosa si usa preferibilmente tampone acetato con concentrazione del tampone compreso tra 0.02 M e 0.2 M.
Come enzima per effettuare la reazione è conveniente usare un enzima per il quale Γ attività transfosfatidilante sia superiore all’ attività idrolizzante; vantaggiosamente verrà utilizzato un enzima di origine fermentativa, ancora più convenientemente l’enzima che si produce dalla fermentazione del microorganismo depositato alla ATCC al numero 55717.
L’enzima può essere utilizzato sia nella forma grezza, consistente nella miscela di fermentazione dopo aver rimosso per filtrazione il microorganismo, o, più preferibilmente purificandolo mediante ultrafiltrazione su membrane il cui cut-off sia tale da permettere la rimozione delle impurezze a peso molecolare inferiore. La soluzione ricca di enzima dopo Γ ultrafiltrazione può essere utilizzata tal quale oppure può essere liofilizzata per avere l’enzima in forma solida; la quantità di enzima è compresa preferibilmente tra 10 e 100 unità per grammo di fosfatide (l’attività dell’enzima è determinata con il test descritto in Biotechn Techn 7 795 (1993)).
La reazione è preferibilmente condotta tra 25 e 60°C, ancora più preferibilmente tra 40 e 50°C.
L’isolamento della PS si effettua per filtrazione della miscela di reazione, lavando il solido con acqua per rimuovere la Serina e i sali presenti.
Un aspetto particolarmente vantaggioso del processo secondo l’invenzione è proprio il fatto che il prodotto di reazione (PS) si separa dalla miscela di reazione in una forma tale che l’isolamento può essere effettuato per semplice filtrazione senza dover ricorrere a precipitazioni per aggiunta di solventi.
Il maggior vantaggio del procedimento secondo l’invenzione è comunque costituito dalla possibilità, inaspettata alla luce della tecnica nota, di effettuare la reazione di transfosfatidilazione della fosfatidilcolina e di simili fosfatidi in un mezzo acquoso, ottenendo fosfatidilserina di buona purezza e con rese altamente soddisfacenti.
Le caratteristiche e i vantaggi del procedimento secondo l’invenzione risulteranno ulteriormente dagli esempi di attuazione forniti qui di seguito a titolo illustrativo e non limitativo.
Esempio 1
5 g di Fosfatidilcolina da soia di purezza al 95% sono stati aggiunti a 30 mi di tampone acetato 0.1 M a pH 4.5. La miscela è stata mantenuta in agitazione a 40°C per 1 ora; al termine dell’operazione il fosfolipide era ben disperso nella fase acquosa. Come enzima sono stati usati 80 mi di una soluzione di fosfolipasi D di attività pari a 2 U/g ottenuta dalla fermentazione del microorganismo depositato come ATCC55717 e dializzando la soluzione enzimatica grezza attraverso una membrana per ultrafiltrazione di cutoff 10000 Dalton fino ad avere rimozione completa delle impurezze a basso peso molecolare. A questa soluzione enzimatica sono stati aggiunti 40 g L-Serina, 2.9 g Calcio Cloruro. La soluzione così ottenuta è stata aggiunta alla dispersione di Fosfatidilcolina e la miscela riscaldata a 45°C.
La reazione è stata mantenuta in agitazione per 6 ore. Il solido è stato filtrato, lavato con acqua e essiccato. Peso finale 4.24 g.
Composizione HPLC: PS 90.7% PC 1.4% PA (acido fosfatidico) 6.2%. Esempio 2
5 g di Fosfatidilcolina da soia di purezza al 95% sono stati aggiunti a 30 mi di tampone acetato 0.1 M a pH 4.5 contenente 0.08 g Tween 80<®>. La miscela è stata mantenuta in agitazione a 40°C per 1 ora; al termine dell’ operazione il fosfolipide era ben disperso nella fase acquosa. Come enzima sono stati usati 80 ml di una soluzione di fosfolipasi D di attività pari a 2 U/g ottenuta come descritto nell’esempio 1. Alla soluzione enzimatica sono stati aggiunti 40 g L-Serina, 2.9 g Calcio Cloruro. La soluzione così ottenuta è stata aggiunta alla dispersione di Fosfatidilcolina e la miscela riscaldata a 45°C. Dopo 90 minuti Γ analisi HPLC mostrava la composizione PS 69.7% PC 11.6% PA 5.3%.
La reazione è stata mantenuta in agitazione per altre 4 ore. Il solido è stato filtrato, lavato con acqua e essiccato. Peso finale 4.76 g.
Composizione HPLC: PS 90.2% PC 0.6% PA 6.4%.
Esempio 3
5 g di Fosfatidilcolina da soia di purezza al 95% sono stati aggiunti a 30 ml di tampone acetato 0.1 M a pH 4.5 contenente 0.3 g AOT. La miscela è stata mantenuta in agitazione a 40°C per 1 ora; al termine dell’operazione il fosfolipide era ben disperso nella fase acquosa. Come enzima sono stati usati 80 ml di una soluzione di fosfolipasi D di attività pari a 2 U/g ottenuta come descritto nell’esempio 1. Alla soluzione enzimatica sono stati aggiunti 40 g L-Serina, 2.9 g Calcio Cloruro. La soluzione così ottenuta è stata aggiunta alla dispersione di Fosfatidilcolina e la miscela riscaldata a 45°C.
Dopo 6 ore di reazione il solido è stato filtrato, lavato con acqua e essiccato. Peso finale 4.16 g.
Composizione HPLC: PS 88.8% PC 0.6% PA 4.1%.
Esempio 4
25 g di una miscela di fosfolipidi ottenuta per arricchimento della lecitina di soia i cui principali componenti sono PC 66% PE 17% PA 2% sono stati aggiunti a 100 ml di tampone acetato 0.1 M a pH 4.5. La miscela è stata mantenuta in agitazione a 40°C per 1 ora; al termine dell' operazione il fosfolipide era ben disperso nella fase acquosa. A parte è stata preparata una soluzione con 80 ml tampone acetato 0.1 M a pH 4.5, 40 g L-Serina, 2.9 g Calcio Cloruro; a questa soluzione sono stati aggiunti 188 mg del solido che si ricava liofilizzando la soluzione di Fosfolipasi D ottenuta così come descritto nell’esempio 1; l’attività di questo solido è di 0.9 U/mg. La soluzione così ottenuta è stata aggiunta alla dispersione di Fosfolipidi e la miscela riscaldata a 45°C.
La miscela è stata mantenuta in agitazione per 3 ore. Il solido è stato filtrato, lavato con acqua e essiccato. Peso finale 22.8 g.
Composizione HPLC: PS 59.8% PC 1.6% PA 6.1%, PE 6.7%.
Esempio 5
25 g della miscela di fosfolipidi utilizzata come materia prima nell’esempio 4 sono stati aggiunti a 100 mi di tampone acetato 0.1 M a pH 4.5. La miscela è stata mantenuta in agitazione a 40°C per 1 ora; al termine dell’ operazione il fosfolipide era ben disperso nella fase acquosa. A parte è stata preparata una soluzione con 80 mi tampone acetato 0.1 M a pH 4.5, 10 g L-Serina, 2.9 g Calcio Cloruro; a questa soluzione sono stati aggiunti 90 mg dell’enzima liofilizzato la cui preparazione è descritta nell’esempio 4. La soluzione così ottenuta è stata aggiunta alla dispersione di Fosfolipidi e la miscela riscaldata a 45 °C e mantenuta in agitazione per 16 ore. La composizione finale è stata determinata mediante HPLC: PS 39.1%, PC 8.3%, PA 16.6%, PE 6.8%.
Esempio 6
E’ stata condotta una reazione nelle stesse condizioni di quanto descritto nell’esempio 5 ma mantenendo nel corso della reazione la temperatura di 55°C. Dopo 16 ore la reazione è stata interrotta e dall’analisi HPLC è risultato PS 41.7%, PC 8.3%, PA 11.0%, PE 9.9%.
Esempio 7
E’ stata condotta una reazione nelle stesse condizioni di quanto descritto nell’esempio 4 ma omettendo l’aggiunta di Calcio cloruro. Dopo 20 ore la reazione è stata interrotta e dall’analisi HPLC è risultato PS 41.2%, PC 15.9%, PA 10.9%, PE 7.4%.
Esempio 8
2 g della miscela di fosfolipidi utilizzata come materia prima nell’esempio 4 sono stati aggiunti in un imbuto separatore a una soluzione di 3 g Calcio Cloruro in 40 mi Acqua; la miscela è stata mantenuta in agitazione a 25°C per 1 ora; l’agitazione è stata interrotta e, dopo tre ore in quiete, 36 mi di fase acquosa sono stati spillati dalla valvola di fondo. A parte è stata preparata una soluzione con 6.5 mi tampone acetato 0.1 M a pH 4.5, 3.2 g LSerina; a questa soluzione sono stati aggiunti 15 mg dell’enzima liofilizzato la cui preparazione è descritta nell’esempio 4. La soluzione così ottenuta è stata aggiunta alla dispersione di Fosfolipidi e la miscela riscaldata a 45°C.
La reazione è stata mantenuta in agitazione per 1 ora. La composizione finale è stata determinata mediante HPLC: PS 55.7%, PC 9.4%, PA 4.0%, PE 9.0% . La formazione di Fosfatidiletanolo in questa reazione è stata inferiore al limite di rivelabilità in TLC (0.1%)
Esempio 9
5 g DiMiristoilFosfatidilcolina (DMPC), 1.6 g Tween 80® e 30 mi tampone sodio acetato 0.1 M a pH 4.5 sono stati tenuti in agitazione a 45 °C per 1 ora. Alla dispersione è stata aggiunta una soluzione composta da 80 mi di soluzione acquosa di Fosfolipasi D ottenuta come descritto nell’esempio 1, 40 g L-Serina e 2.9 g Calcio Cloruro, la temperatura è stata portata a 50°C e l’agitazione mantenuta per 17 ore. Il solido è stato filtrato, lavato con acqua e essiccato. Peso finale 5.4 g.
Composizione HPLC: PS 83.2% PC 4.3% PA 11.7%.
Esempio 10
5 g DiMiristoilFosfatidilcolina (DMPC), 1.0 g AOT e 30 ml tampone sodio acetato 0.1 M a pH 4.5 sono stati tenuti in agitazione a 50 °C per 45 minuti. Alla dispersione è stata aggiunta una soluzione composta da 80 ml di soluzione acquosa di Fosfolipasi D ottenuta come descritto nell’esempio 1, 40 g L-Serina e 2.9 g Calcio Cloruro, la temperatura è stata portata a 50°C e l’agitazione mantenuta per 20 ore. Il solido è stato filtrato, lavato con acqua e essiccato. Peso finale 3.66 g.
Composizione HPLC: PS 85.2%, PC 10.5 %, PA 3.5%.
Esempio 11
10 g di una frazione di lecitina di soia non deoleata arricchita in PC (composizione: Trigliceridi 50% PC 35% PE 8%) sono stati aggiunti a 30 mi di tampone sodio acetatato a pH 4.5 e lasciati in agitazione a 25°C per 1 ora. Alla miscela è stata aggiunta una soluzione costituita da 80 mi di soluzione dell’enzima fosfolipasi D preparata come descritto nell’ esempio 1, 40 g L-Serina e 2.9 g Calcio cloruro. La reazione è stata mantenuta in agitazione a 45 °C per 11 ore, la fase acquosa è stata separata e al solido gommoso sono stati aggiunti 100 mi acetone. Ottenuti dopo filtrazione ed essiccamento 3.9 g. Analisi HPLC PS58% PC 2.0% PA 17.0, PE 1.8%.
Claims (19)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la preparazione di fosfatidilserine di formula (I)in cui R<1 >e R<2 >rappresentano indipendentemente un acile C10-C30, saturo, monoinsaturo o poliinsaturo, X = OH oppure OM, dove M = metallo alcalino o alcalino-terroso, ammonio, alchilammonio (incluso il sale interno), comprendente la reazione di fosfatidi di formula generale (II)in cui R1, R2 e X hanno i significati sopra definiti econ Serina, racemica o enantiomericamente pura, preferibilmente con (L)-Serina, in presenza di una fosfolipasi D (PLD), caratterizzato dal fatto che detta reazione è condotta addizionando detta Serina ad una dispersione acquosa tamponata di detti fosfatidi in presenza di sali di calcio.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detti fosfatidi contengono alcoli, in particolare etanolo, quali impurezze, in quantità inferiore a 0,1%.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, comprendente la fase di rimuovere detti alcoli da detti fosfolipidi prima di sottoporre questi ultimi alla reazione con Serina, mediante sospensione di detti fosfolipidi in una soluzione salina acquosa e successiva eliminazione della fase liquida per decantazione.
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui detta soluzione acquosa salina è una soluzione di cloruro di calcio e/o un tampone acido acetico/acetato di sodio.
- 5. Procedimento secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, in cui detta dispersione acquosa di fosfatidi è tamponata ad un pH compreso fra 4 e 9, preferibilmente fra 4 e 4,5.
- 6. Procedimento secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, in cui detta reazione è condotta ad una temperatura compresa fra 25 e 60°C, preferibilmente fra 40 e 50°C.
- 7. Procedimento secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, in cui detta fosfolipasi D è ottenuta da brodi di fermentazione centrifugati di ceppi di microorganismi produttori di PLD extracellulare ad elevata capacità di transfosfatidilazione.
- 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui detta fosfolipasi D è prodotta dal ceppo di Streptomyces ATCC 55717.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui detta fosfolipasi D è purificata mediante ultrafiltrazione di una sua soluzione.
- 10. Procedimento secondo la rivendicazione 9, in cui l’ultrafiltrazione è condotta con l’utilizzo di una membrana avente un cut-off di 10.000 dalton.
- 11. Procedimento secondo la rivendicazione 9, in cui detta soluzione ultrafiltrata è sottoposta a liofilizzazione, dando luogo a fosfolipasi D in forma solida.
- 12. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detti sali di calcio sono costituiti da calcio cloruro e sono presenti in concentrazione compresa fra 0,05 e 0,5M.
- 13. Procedimento secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che detta dispersione acquosa di fosfatidi è ottenuta miscelando detti fosfatidi con 3- 10 volumi di acqua o di soluzioni saline e mantenendo in agitazione la miscela così ottenuta per 1-10 ore a 20-50°C.
- 14. Procedimento secondo la rivendicazione 13, in cui a detta miscela di fosfatidi e acqua o soluzioni saline vengono addizionati uno o più tensioattivi.
- 15. Procedimento secondo la rivendicazione 14, in cui detti uno o più tensioattivi sono bis-(2-etilesil)solfosuccinato (AOT) o poliossietilene sorbitan monooleato (Tween 80<®>)
- 16. Procedimento secondo la rivendicazione 14 o 15, in cui detti tensioattivi sono addizionati in quantità pari a 0,01-0,4 g per grammo di fosfatidi.
- 17. Procedimento secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, in cui la fosfatidilserina di formula (I) viene recuperata dalla miscela di reazione mediante filtrazione e lavaggio con acqua.
- 18. Procedimento secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, in cui detti fosfatidi di formula (II) sono miscele di fosfatidilcolina e/o etanolammina di origine naturale, scelte fra lecitine di soia e di uovo, a titolo in fosfolipidi compreso fra 20% e 95%.
- 19. Procedimento secondo la rivendicazione 14, in cui detti fosfatidi di formula (II) sono fosfatidilcoline di sintesi.
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