JP4298902B2 - リン脂質の製造法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスファチジル基転移反応（リン脂質塩基交換反応）を利用して目的とするリン脂質を生成させる方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）等のリン脂質は、それぞれ有用な生理作用や特異な物性を有しており、医薬品や食品素材、乳化剤等の用途に使用されている。例えば、ホスファチジルセリンは痴呆症の予防や治療などを目的とした脳機能改善剤、ホスファチジルグリセロールは乳化剤、ホスファチジルアスコルビン酸は乳化剤、過酸化脂質抑制剤としての利用が期待されている。
【０００３】
これらリン脂質の製造法としては、従来、化学合成法やホスホリパーゼＤを使用したホスファチジル基転移反応が用いられており、近年では比較的安価かつ簡便にリン脂質を製造できる酵素法が汎用されている。
【０００４】
ホスファチジル基転移反応（リン脂質塩基交換反応）を利用して目的とするリン脂質を生成させる方法については古くより知られている（Yang, S.F. et al., J. Biol. Chem., 242, p.477, '67）。例えば、国生ら（Agric. Biol. Chem., 51, p.2515, '87 ) はイソプロピルエーテルに溶解した卵黄ホスファチジルコリンにＬ−セリン水溶液（塩化カルシウムを含む）を加えてからホスホリパーゼＤを作用させる二相系反応によりホスファチジルセリンを含む反応物を得ている。二相系反応においては、原料リン脂質を含む油相と受容体を含む水相が二相をなし、両者の界面において、ホスファチジル基転移反応が起こると考えられている。
【０００５】
また、本発明者らは大豆レシチンを分画して得たホスファチジルコリンを約８５％含むリン脂質標品を酢酸エチルに溶解し、更にアスコルビン酸を含む水溶液を加えてから、ホスホリパーゼＤを作用させる澄明な均一相反応によりホスファチジルアスコルビン酸を含む反応物を得ている（特許第２９４２３０２号）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、二相系反応においては、リン脂質に対して５倍（容量／重量）以上の溶媒（有機溶媒＋水）を加える必要があったため、リン脂質量に対して６倍以上の容量を持つ反応装置を用いる必要があった。更に、反応の進行を促進させるためにカルシウムの添加がなされているが、このカルシウムはリン脂質と速やかに塩を形成してしまう。こうして生成するカルシウム塩は、日本や欧州においては化学合成品の範疇に入るため、食品への利用は難しい。
【０００７】
一方、均一相反応では、反応系に多量の水が存在するため、反応を継続すると、ホスホリパーゼＤが有する加水分解活性により、副反応生成物としてのホスファチジン酸が生成してしまう。このため、目的リン脂質の分離精製が困難となることが問題であった。更に、均一相反応では、リン脂質に対する受容体の添加量が限定されてしまうため、目的とする反応生成物（リン脂質）の産生量が頭打ちとなる問題があった。
【０００８】
また、藤田ら（特公平７−１６４２６号公報）は、原料リン脂質を溶解した有機溶媒（ジイソプロピルエーテル、イソオクタン、シクロヘキサン、ベンゼン、クロロホルム−イソオクタン、ｎ−ヘキサン、ジクロロメタン−イソオクタン）中に、水酸基を持つ受容体とホスホリパーゼＤを含む水相（塩化カルシウムを含む）を逆ミセル中に封入した形態で反応させる逆ミセル反応により、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等を製造している。
【０００９】
逆ミセル反応においては、使用される水分量が少ないため、上記方法の問題点であったホスファチジン酸の生成は抑制されていると報告されているが、目的リン脂質の生成量はおよそ２０％前後と必ずしも十分とはいえず、また、超音波処理など煩雑な作業も必要となるため、作業性、コスト面での問題も生じてしまう。また、リン脂質に対して１０倍（容量／重量）以上の有機溶媒を加える必要があるため、リン脂質量に対して大容量の反応装置を用いる必要があった。
【００１０】
また、以上のような従来から知られているホスファチジル基転移反応においては、いずれも反応系中に有機溶媒を加える必要があった。しかしながら、リン脂質を食品、医薬品等の用途に用いる場合には、有機溶媒の残存は許容されず、完全に除去することが必須である。このため、製造工程においては、有機溶媒除去のための設備等が必要となり、作業性、コスト面等の不利益が生じてしまう。特に、食品製造を目的とした場合には、有機溶媒を反応に利用することは食品衛生法上から実質上不可能である。
【００１１】
そこで、有機溶媒やカルシウム塩を使用せずに、各種のリン脂質を製造する方法が望まれているが、原料リン脂質となるホスファチジルコリン等は油溶性であるため、有機溶媒を用いなければ反応を円滑に進行させることができず、生成するリン脂質の収率、作業性等が低下するものと考えられていた。
【００１２】
従って、本発明は、ホスホリパーゼＤを用いたリン脂質の製造を行う場合に、有機溶媒やカルシウムを用いることなく、簡便かつ高収率に目的とするリン脂質を得ることができる製造法を確立することを目的としている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載された発明に係るリン脂質の製造法は、ホスファチジル基転移反応を利用してリン脂質を製造する方法において、
原料リン脂質と、水酸基を有する受容体と、ホスホリパーゼＤと、原料リン脂質に対して１０重量％〜１００重量％となる水とを、有機溶媒を使用せずに均質化する均質化工程と、
得られた均質化物を１５℃〜６５℃で反応させる反応工程とを備えたものである。
【００１４】
請求項２に記載された発明に係るリン脂質の製造法は、請求項１に記載された均質化工程において得られる均質化物が、主としてラメラ型リオトロピック液晶構造を有するものである。
【００１６】
請求項３に記載された発明に係るリン脂質の製造法は、請求項１又は２の何れかに記載された均質化工程における水酸基を有する受容体の添加量が、原料リン脂質１モルに対して、０．３モル〜１０モルである。
【００１７】
請求項４に記載された発明に係るリン脂質の製造法は、請求項１〜３の何れかに記載された水酸基を有する受容体が、セリン、グリセロール、Ｌ−アスコルビン酸、グルコース、及びコリンから選ばれる１種又は２種以上であるものである。
【００１８】
請求項５に記載された発明に係るリン脂質の製造法は、請求項１〜４の何れかに記載された水酸基を有する受容体が、セリンであり、生成するリン脂質がホスファチジルセリンであるものである。
【００１９】
請求項６に記載された発明に係るリン脂質の製造法は、請求項１〜５の何れかに記載された均質化工程における均質化時に、更に食用油脂を添加するものである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、原料リン脂質と、水酸基を有する受容体と、ホスホリパーゼＤと、水とを、有機溶媒を使用せずに混合して充分に均質化して、１５℃〜６５℃にて酵素反応を行うことにより、各種の有機溶媒を使用せずとも効率よくホスファチジル基転移反応物を得られることを見出し本発明を完成した。
【００２１】
すなわち本発明は、ホスファチジル基転移反応を利用してリン脂質を製造する方法において、
原料リン脂質と、水酸基を有する受容体と、ホスホリパーゼＤと、水とを、有機溶媒を使用せずに混合して均質化する「均質化工程」と、得られた均質化物（混合物）を１５℃〜６５℃で反応させる「反応工程」とを備える。
【００２２】
本発明において、上記の４成分を混合し、これを均質化することにより得られる均質化物は、その構造としてラメラ型リオトロピック液晶構造を有しているものと考えられる。ラメラ型リオトロピック液晶とは、リン脂質に水を加えて形成されるリン脂質二分子膜の液晶をいい、本発明においてはこの二分子膜（時には多分子膜構造も取る）と水層が交互に連続した配列を取っているものと推定される。このラメラ型リオトロピック液晶構造は、例えば均質化物を直交ニコルの元で顕微鏡観察することにより確認できる。因みに、後述する「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」は連続した層状の構造物として、「相分離したラメラ型リオトロピック液晶構造」は水相に浮遊した閉環状の構造物としてそれぞれ観察される。
【００２３】
このラメラ型リオトロピック液晶構造は、均質化時に原料リン脂質に水が添加されることで、リン脂質の親水基間の相互作用が弱まり結晶構造が崩壊し、ラメラ型の液晶が形成されることにより生ずる。そして、ラメラ型リオトロピック液晶構造を形成することにより、リン脂質の層状構造の間を水分が自由に移動できることとなり、受容体や酵素の供給、或いはリン脂質から遊離した極性頭部の除去が効率的に行われ、転移反応が可能になるものと思われる。
【００２４】
従って、反応生成物の収率を高めるためには、ラメラ型リオトロピック液晶構造を均質化物全体に行き渡らせることが必要となるが、そのためには単に各成分を混合するだけなく、均質化処理を行う必要がある。つまり、均質化により、ラメラ型リオトロピック液晶構造が構造中全体にわたって観察される状態（主としてラメラ型リオトロピック液晶構造を有する状態）とすることが、高い反応生成物量を得るためには好ましいのである。
【００２５】
また、このラメラ型リオトロピック液晶構造の形成には、均質化物中の水分含量が影響する。水分含量が一定の範囲内（例えば、大豆リン脂質に対し１０重量％〜１００重量％程度）である場合には、均質化物はほぼ相分離のないラメラ型（ニート状）の液晶となるが、水分が多くなると、液体と液晶からなる二相に分離（相分離）する。本発明の方法では、この相分離のない状態、或いはほぼ相分離が起こっていない状態（両者合わせて「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」という。）にて反応を行えば、特に高い転移活性が奏されるため好ましい。
【００２６】
一方、均質化物中の水分量が多く相分離を起こした状態（相分離したラメラ型リオトロピック液晶構造）では、液晶は不連続の小胞状態となって溶媒中に漂うこととなり、相分離の無い場合に比べて水分とリン脂質との接触効率が低下し、そのため転移活性も低下してしまう。また、水分量が少なすぎると、リン脂質の結晶構造が維持され、ラメラ型リオトロピック液晶構造を全体に渡り形成させ得ず、結果的に酵素反応の場がなくなってしまうか、或いは流動性が低下して基質と酵素の接触効率が悪化し、酵素が効率よく働くことができなくなってしまうと考えられる。
【００２７】
他方、均質化時に有機溶媒を添加してしまうと、従来法であるところの二相系反応様の相分離（ラメラ型リオトロピック液晶構造中での相分離ではなく、油相と水相との分離）が助長される可能性がある。また、上記のとおり有機溶媒の添加は各種の不利益を生ずるものであるから、均質化時には有機溶媒を使用しないことが好ましい。
【００２８】
本発明に用いられる原料リン脂質としては、リン脂質を含む天然物、天然物からの抽出物又は該抽出物を精製したもの、或いは合成リン脂質等いずれを用いてもよい。具体的には、大豆レシチン、菜種レシチン、卵黄レシチン、トウモロコシレシチンあるいは綿実レシチンや、それらの精製物、若しくはホスファチジルコリン（以下、「ＰＣ」と記載する。）、ホスファチジルエタノールアミン（以下、「ＰＥ」と記載する。）等又はこれらの混合物等が挙げられる。中でも、大豆レシチン、菜種レシチン、卵黄レシチン、或いはこれらの精製物を用いることが原料の確保のしやすさやコスト面から好ましい。
【００２９】
また、本発明の水酸基を有する受容体としては、ホスホリパーゼＤの存在下で、前記原料リン脂質のホスファチジル基を受容するものであればよい。例えば、セリン、グリセロール、Ｌ−アスコルビン酸、グルコース、コリン、エタノールアミン、１−アミノ−２−プロパノール、１−オルソメチル−グルコシド等が挙げられる。目的生成物の収率等の点からセリン、コリン、Ｌ−アスコルビン酸、グルコース又はグリセロール等が好ましく、特にセリン及びグリセロールを用いることが好ましい。
【００３０】
また、ホスホリパーゼＤ（以下、「ＰＬＤ」と記載する。）としては、ホスファチジル基転移活性を有するものであれば特に制限されず、その形態は遊離或いは化学修飾したＰＬＤ、若しくはイオン交換樹脂やシリカゲル等の担体に固定化された固定化酵素等として用いることも可能である。中でも遊離のＰＬＤを用いた場合に、反応生成物の収率が特に高くなるため好ましい。
【００３１】
更に、ＰＬＤとしては、具体的には、キャベツやニンジン等の植物由来のＰＬＤを始めとして、放線菌、細菌、酵母、カビ等の微生物由来のＰＬＤ、或いは、動物由来のＰＬＤ等いずれも好適に使用でき、公知の方法により調製したものであっても、市販品、例えば、キャベツ由来ＰＬＤ（シグマ社製、P7758）、ピーナッツ由来ＰＬＤ（シグマ社製、P0515）、ストレプトマイセス・クロモフュースカス（Streptmyces chromofuscus）由来のＰＬＤ等であってもかまわない。
【００３２】
本発明においては、まず、原料リン脂質と、水酸基を有する受容体と、ＰＬＤと、水とを混合して均質化する。ここで、均質化とは、上記の４者を混合するとともに、物理的な力を加えて成分を等しく分散することであり、その方法としては物理的攪拌、超音波処理等の手段が挙げられる。より具体的には、バイブロミキサー、自動乳鉢、ホモミキサー、ヒスコトロン、フードプロセッサー、超音波処理装置等を用いて均質化すればよく、また、少量であればマイクロスパーテル等を用いて練り込んでもよい。４者は各々単独で混ぜても、２〜３を予め混ぜたり溶解したりしてから最終的に均質化しても良い。
【００３３】
本発明の方法において、仮にこの均質化を行わないと、生成する目的リン脂質の収率は顕著に低下してしまう。これは、原料リン脂質が一般には室温で硬いペースト状となっているため、単にその他の成分を混ぜるだけでは、全体に渡ってラメラ型リオトロピック液晶構造を生ぜしめることが困難であり、その結果、各成分が接触する割合が低下して、目的とする生成物の収率が低下してしまうためと考えられる。このため、各成分の分散が行える程度までに物理的な力を加える必要があり、所謂“均質化”と呼ばれる処理が必要となるのである。
【００３４】
均質化の際には、水酸基を有する受容体は水に溶解させて用いてもよく、粉末として用いることもできる。また、ＰＬＤも少量の水に溶解して用いるか或いは粉末として用いる。このとき、受容体を除いた３者（原料リン脂質、ＰＬＤ及び水）を予め混ぜてしまうと、副生物であるホスファチジン酸（以下、「ＰＡ」と記載する）が生成してしまうため、予め原料リン脂質と受容体とを混ぜてから、残りの成分を添加混合するか、或いは４者同時に均質化することが好ましい。
【００３５】
また、上記のとおり、均質化時の水分量は、ラメラ型リオトロピック液晶構造の相分離、ひいては反応生成物であるリン脂質の収率に影響するため、これを調整し当該相分離を抑制することが好ましい。水分量として好ましい範囲は、原料リン脂質の種類によって異なるが、ラメラ型リオトロピック液晶構造中の水分含量を原料リン脂質に対して１０重量％〜１００重量％とすれば相分離をおおむね抑制でき、特に２０重量％〜６０重量％が好ましい。なお、ここでいうラメラ型リオトロピック液晶構造中の水分含量とは、均質化時に分離した水分を除去して後の均質化物中の水分量を指し、その測定は公知のカールフィッシャー法（日本油化学会制定 基準油脂分析試験法 1996年版 4.1.1.1-1996 水分）等により行うことができる。また、分離した水分の除去は、デカンテーション或いは遠心分離（例えば、１５０×ｇ、１分間程度）により行えばよい。
【００３６】
また、受容体の添加量についても、用いる受容体の種類によって好ましい添加量の範囲が異なるため、これを一般化するのは困難であるが、おおむね原料リン脂質１モルに対し０．３モル〜１０モル、特に、４モル〜８モルとすることが、反応生成物の収率や作業性の点から好ましい。即ち、多量（１０モルを超える量）の受容体を添加すると未反応の受容体を回収するための労力が増してしまい、一方で、添加量が少ないと目的とする生成物の収率が低下してしまうのである。
【００３７】
より具体的には、水酸基を有する受容体としてセリンを用いる場合には、原料リン脂質に対し５重量％〜１５０重量％、特に、５０重量％〜１００重量％とすることが好ましく、グリセロールを用いる場合には、１０重量％〜２００重量％、特に、２０重量％〜１００重量％とすることが好ましい。
【００３８】
また、ＰＬＤの添加量は特に限定されず、後の反応工程における反応時間等を鑑みて決定すればよいが、一般には、リン脂質１ｋｇあたり５００〜１０００００ units程度である。
【００３９】
また、均質化時の温度条件は特に限定されないが、１５℃〜６５℃の範囲で均質化することを目安とするのが好ましい。１５℃未満では冷却には余分なエネルギーを要し、均質化しがたく格別なメリットはなく、６５℃以上ではリン脂質が不安定であるからである。
【００４０】
更に、均質化時には、上記の各成分の他に、ラメラ型リオトロピック液晶構造を壊さない範囲内で、食用油脂を添加することができる。有機溶媒と同様、食用油脂の添加によってもラメラ型リオトロピック液晶構造の二相系への移行が助長されてしまうが、少量の添加であれば却って均質化物の流動性が増し、目的リン脂質の収率が向上するのである。食用油脂としては、例えばサフラワー油、大豆油、コーン油、菜種油、綿実油、ヒマワリ油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、アマニ油、エゴマ油、カカオバター、ヤシ油等の植物油、或いはバター油、魚油、ラード、牛脂等の動物油、中鎖トリアシルグリセロール（ＭＣＴ）等が挙げられ、これらを１種又は２種以上組み合わせて原料リン脂質に添加混合し、流動性を付与することができる。中でもＭＣＴ、カカオバター、大豆油等を用いれば、目的とする生成物の収率が向上するため好ましい。
【００４１】
食用油脂の添加量は、原料リン脂質や添加する食用油脂の種類により異なるが、原料リン脂質に対し等量以下とすることが収率の面から好ましく、特に５重量％〜１５重量％とすることが好ましい。
【００４２】
また、ヘキサンやエーテル等の有機溶媒をラメラ型リオトロピック液晶構造を壊さない範囲内で添加することも同様の趣旨から可能であるが、上記のとおり有機溶媒の添加は好ましくない。
【００４３】
尚、ここで本発明の有利な点を指摘すると、従来、ホスファチジル基転移反応は、二相系反応、逆ミセル反応、均一相反応の何れかで行われてきたが、このうち二層形反応及び逆ミセル反応においては、反応系を維持するために、リン脂質に対して５倍（容量／重量）以上の溶媒を加える必要があった。これに対して本発明では、リン脂質に対して１倍以下の溶媒を加えればよいため、同量のリン脂質を製造するのに必要な装置の容量を小さくすることができる。
【００４４】
均一相反応では、リン脂質に対して２倍（容量／重量）以上の溶媒を加えるため、リン脂質に対して３倍（容量／重量）以上の容量を持つ反応装置を用いる必要があることに加え、均一相を維持するために受容体の添加量が制限されるため、目的物を高含量に含む反応生成物を得ることが難しかった。例えば、ＰＳを製造する場合、リン脂質１ｋｇに添加できるセリン量は０．１５ｋｇであり、反応生成物リン脂質中のＰＳ含量は３５％が限界であった。これに対して本発明の方法では、リン脂質1 ｋｇに1 ｋｇ以上のセリンを添加することも可能であり、結果としてリン脂質中に４８％以上のＰＳを含む反応生成物を得ることができた。すなわち、均一相反応に比べて本発明は、同量のリン脂質を製造するのに必要な装置の容量を小さくすることができることに加えて、目的物の含量が高い反応生成物が得られる点でも好ましい方法である。
【００４５】
更に、従来のホスファチジル基転移反応は何れも反応系にエーテル、トルエン、ｎ−ヘキサン、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いる必要があったが、本発明では有機溶媒を使用する必要がなく、食品など、有機溶媒の使用が制限された物質の製造に都合が良い。また、本発明によれば、従来法で用いられていたカルシウムイオンを添加せずとも反応が進行する。この理由は明らかでないが、二相系反応等では、反応が液体中で行なわれているのに対し、本発明では液晶中で行なわれているため、カルシウムの有無に関わらず原料リン脂質が、転移反応を受け易い構造を取るものと推定される。
【００４６】
次に、本発明においては、上記のようにして得られた均質化物を反応させ、目的とするリン脂質を製造する。反応は１５℃〜６５℃、特に４５℃〜５５℃で行うことが好ましい。１５℃未満では、反応の進行が促進されず、目的リン脂質の収率が低下してしまい、６５℃以上では、リン脂質、例えば生成したホスファチジルセリンが分解や酸化等の副反応を起こす可能性があるためである。
【００４７】
反応時間は特に限定されす、反応温度や用いる成分の種類、それらの量等に合わせ好適な条件を選択すればよく、目的リン脂質の収率や副生物であるＰＡの生成量等の点からは１〜４８時間程度が好ましい。
【００４８】
反応は、静置若しくは攪拌下等いずれの状態で行ってもよく、例えば卓上型万能ミキサー（KINMIX MAJOR，KM-230）を用いて、攪拌しながら行うことができる。
【００４９】
本発明方法によるリン脂質の製造において、原料リン脂質に適量の水が混合されることにより、相分離のないラメラ型液晶状態が形成され、リン脂質の層状構造の間を水分が自由に移動できる。従って、水酸基を有する受容体や酵素の供給、或いはリン脂質から遊離した極性頭部の除去が効率行われるため、高い転移活性が達成され、安価、簡便かつ収率よく、目的とするリン脂質を得られることが可能となったのである。
【００５０】
転移反応で得られた転移型リン脂質は適当な精製処理工程に付し、不純物を除いて用いることが望ましいが、投与上の問題や効果を阻害するような問題がない限り、原料由来や製造工程での不純物を含んだまま用いてもよい。精製の方法は特に限定されず、常法に従い溶剤による分画や、クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行えばよい。
【００５１】
こうして得られる本発明のリン脂質は医薬品、食品、化粧品等の形態で投与することも可能である。例えばリン脂質の生理効果を訴求する医薬品形態で用いる場合であれば、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、散剤等の固形製剤、或いはシロップ剤等の液状製剤として経口投与することができる。また、経口投与剤でなくとも、注射剤、皮膚外用剤、直腸投与剤等非経口形態で投与することも可能である。
【００５２】
各製剤の製造時には、乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤やその他医薬的に許容される成分を適宜使用すればよい。
【００５３】
また、同様の生理効果を期待して食品形態で用いる場合には、本発明の方法により得られたリン脂質をそのまま或いは適宜精製処理したものを油脂、錠菓、発酵乳、飴、調味料、ふりかけ等の飲食品に添加し、常法を用いて製造すればよい。
【００５４】
これら医薬品、食品等の形態での使用に際しては、本発明の方法により得られたリン脂質を適宜配合することができる。また、リン脂質の生理効果を訴求する場合であれば、その効果を得られかつ過剰摂取等の問題が生じない程度の量を配合すればよい。例えば、リン脂質としてホスファチジルセリンを生成させた場合には、５０ｍｇ〜１０００ｍｇ／日程度の摂取が見込まれる量を適宜配合しておけばよいのである。
【００５５】
更に、本発明のリン脂質は乳化剤として用いてもよく、その際には、医薬品、食品、化粧品等へ０．０１〜１０％添加するのが好ましい。
【００５６】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５７】
実施例１（基本）
大豆レシチンとココアバターとの混合物（NATHIN 250、セントラルソーヤ社製）１００ｇに６．７ＭのＬ−セリン水溶液（０．１８Ｍ塩化カルシウム添加或いは非添加）９７ｇを自動乳鉢（ANM−150型）を用いて練り込み（均質化して）５５℃にて保温した。更に、ストレプトマイセス属放線菌由来のホスホリパーゼＤ−Ｙ１（ＰＬＤ−Ｙ１、（株）ヤクルト本社製）８００ unitsを含む酵素液２．０ｍＬを混合し、自動乳鉢を用いて練り込んで均質化し、反応を開始し、攪拌しながら１７時間５５℃に保ちホスファチジル基転移反応を完了させた。
【００５８】
得られた反応物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにて分析したところ、0.18Ｍ塩化カルシウム添加の場合、全リン脂質中の４７．９％がホスファチジルセリンに変換されていた。一方、塩化カルシウム非添加の場合でも全リン脂質中の４４．５％はホスファチジルセリンに変換されており、この反応系においてカルシウムを添加しなくともホスファチジル基転移反応が進行することが明らかとなった。また、反応開始前の均質化物を直交ニコルのもとで顕微鏡観察したところ、「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」が観察された。
【００５９】
以上のように、本発明は有機溶媒を用いずにホスファチジル基転移反応を行なう方法を提供するものである。すなわち、リン脂質に水酸基を持つ受容体とホスホリパーゼＤを含む水溶液を均質化して反応させることにより、効率よくホスファチジル基転移反応物を作ることが可能である。
【００６０】
この際に有機溶媒は一切添加する必要はないが、リン脂質に有機溶媒以外の脂溶性物質、例えば、サフラワー油、大豆油、コーン油、菜種油、綿実油、ひまわり油、紅花油、ごま油、オリーブ油、亜麻仁油、エゴマ油、カカオバター、やし油等の植物油、或いは、バター油、魚油、ラード、牛脂等の動物油、或いは中鎖脂肪酸を出発材料として合成されたグリセリド誘導体等であるＭＣＴなどの食用油脂を添加することにより、操作性を向上させることは可能である。
【００６１】
実施例２（カルシウムの添加の有無）
実施例１で示された通り、カルシウムを添加しなくともホスファチジル基転移反応が進行することが明らかとなったが、カルシウムの添加の有無を再度検証した。リン脂質に対するセリンのモル比を１又は５とし、表１に示すような、カルシウム添加、非添加の条件にて各成分を混合し、マイクロスパーテルを用いて練り込んで均質化して、５５℃で１８時間の反応を行った。尚、モル比１は２．５Ｍのセリン水溶液、モル比５は４．５Ｍのセリン水溶液を使用した。具体的には、NATHIN 250とセリン水溶液（カルシウム添加の場合はセリン水溶液に溶解）を混合後、ＰＬＤ−Ｙ１水溶液を添加して反応を開始した。
【００６２】
反応生成物の量を実施例１と同様に測定した。表２に示す通り、カルシウム非添加の場合、ＰＳ生成率は添加した場合に比べやや少なかったもののほぼ同等の値が得られた。また、反応開始前の均質化物をそれぞれ直交ニコルのもとで顕微鏡観察したところ、いずれも「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」が観察された。なお、表において、ＰＡはホスファチジン酸、ＰＥはホスファチジルエタノールアミン、ＰＩはホスファチジルイノシトールを示す。
【００６３】
【表１】

【００６４】
【表２】

【００６５】
以上のことから、本発明においては、カルシウム添加の有無に関わらず、良い収率を得られることが判明した。このことから、本発明の方法では、有機溶媒を用いたホスファチジル基転移反応で多くの場合用いられていた、反応系中へのカルシウム添加を必要としないことが判った。
【００６６】
実施例３（トリグリセリドを含まないリン脂質を基質とした時の反応）
NATHIN 250（セントラルソーヤ社製) ５０ｇに特級アセトン５００mLを加え、６０℃に加温して溶解後、１５℃に冷却した。生じた沈殿に特級アセトン３００mLを加え、６０℃に加温して溶解後、１５℃に冷却することにより、トリグリセリドを全く含まずリン脂質のみから成る沈殿物を得た。この沈殿物の乾燥品（NATHIN 250 アセトン沈殿物と称す）６ｇに４．５MのＬ−セリン水溶液（0.18Ｍ塩化カルシウム添加或いは非添加）５．８ｇを練り込んで均質化し５５℃にて保温した。更に、ホスホリパーゼＤ Ｙ-1（（株）ヤクルト本社製）４９．３unitsを含む酵素液０．２mLを混合し、マイクロスパーテルを用いて練り込んで均質化して反応を開始し、１７時間５５℃に保ちホスファチジル基転移反応を完了させた。
【００６７】
得られた反応物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにて分析したところ、０．１８Ｍ塩化カルシウム添加の場合、全リン脂質中の４１．７％がホスファチジルセリンに変換されていた。一方、塩化カルシウム非添加の場合でも全リン脂質中の３５．１％はホスファチジルセリンに変換されていた。また、反応開始前の均質化物を直交ニコルのもとで顕微鏡観察したところ、「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」が観察された。表３は基質組成を、表４はアセトン沈殿物を基質に用いたＰＳ転移反応の結果を示す。
【００６８】
【表３】

【００６９】
【表４】

【００７０】
実施例４
NATHIN 250 アセトン沈殿物にＭＣＴ（パナセート810；グリセリン脂肪酸エステル、日本油脂（株）製）を重量比で１〜９％練り込んだ混合物を原料リン脂質として、NATHIN 250 アセトン沈殿物 ５００ mgに対してセリン２００mgと、水２００μＬ（リン脂質と水の重量比０．４）を更に練り込み、ＰＬＤ-Ｙ１水溶液（４．１units/１５μＬ）を加え、マイクロスパーテルを用いて練り込んで均質化して５５℃ １７時間反応させた。反応終了後のホスファチジルセリンをシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより測定した。
【００７１】
図１はＭＣＴの最適添加量を検討した結果を示す線図である。図１に示す通りに、ＭＣＴを５０mg（リン脂質に対して９％）添加することにより、無添加の場合に比べてＰＳ生成率が３４．７％から４０．４％に増加し、ＭＣＴの添加効果が認められた。ＭＣＴの混合比を１０％〜４０％にして同様に反応させた。図２はＭＣＴの最適添加量を検討した結果を示すグラフである。図２に示すように１０％〜４０％のＭＣＴを添加した全ての場合にＰＳ産生率が向上した。図１及び図２から、ＭＣＴの添加量は９％〜４０％が好ましい範囲と考えられた。また、反応開始前の均質化物それぞれを直交ニコルのもとで顕微鏡観察したところ、いずれも「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」が観察された。
【００７２】
実施例５（リン脂質に対するセリンのモル比）
５００ｍｇのNATHIN 250に２．５Ｍセリン水溶液（０．１８Ｍ塩化カルシウム含有）をリン脂質に対するセリンのモル比が０．１〜１５となるように加え、６０℃の水浴中で温めながらミキサーで攪拌混合した。水浴の温度を５５℃に下げた後に、反応基質にＰＬＤ−Ｙ１水溶液を加え、マイクロスパーテル又はバイブロミキサーで混合、均質化した。５５℃で１７時間反応し、反応物のリン脂質組成をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより分析した。
【００７３】
図３に示すようにリン脂質に対するセリンのモル比が０．３以上の時には反応生成物中のＰＳ含量は２０％以上であり、ＰＳの製造に適した条件であることがわかった。特にモル比が４以上の場合はＰＳ含量が４５％以上であり、特に適した基質組成と考えられる。ただし、モル比が１０以上の場合、セリン量を増加させてもＰＳ生成量は向上せず、モル比１０までが効率的にホスファチジルセリンを製造するうえでの上限と考えられた。また、反応開始前の均質化物（モル比０．３〜１０のもの）を直交ニコルのもとで顕微鏡観察したところ、いずれも「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」が観察された。
【００７４】
なお、セリンのモル比が６以上の場合には、添加する水分量はリン脂質に対して１００重量部以上となったが、加えた水分のうち分離したものをデカンテーションにより除いたところ、実際の均質化物中の水分量は１００重量部以下であった（カールフィッシャー法により測定）。
【００７５】
実施例６（リン脂質に対する水の重量比）
大豆レシチン （NATHIN 250 アセトン沈殿物又はPC80：クロクラーン社製）或いは卵黄レシチン（ＰＬ−１００ＬＥ：キューピー（株）製）５００mgにL-セリン粉末２００ mgを加え、約６０℃に加温した乳鉢で良く混合した後、図４〜６に示した水分含量で蒸留水を練り込み、５５℃にて保温した。更に、ＰＬＤ-Ｙ１（（株）ヤクルト本社製）４．１ unitsを含む酵素液０．０１５mLを混合してマイクロスパーテルを用いて練り込んで均質化し、反応を開始し、静置状態で１７時間５５℃に保ちホスファチジル基転移反応を完了させた。なお、均質化物中の水分含量はカールフィッシャー法により測定した。
【００７６】
得られた反応物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにて分析し、横軸を水／大豆レシチン重量％（対数目盛り）、縦軸を反応生成物のＰＳ含量（％）として図示した。図４〜６はその結果を示す線図である。
【００７７】
図４に示すように、NATHIN 250 アセトン沈殿物を原料リン脂質に用いた場合には、均質化物中の水／リン脂質重量％が３％の時にはＰＳは全く産生しないが、１０％〜１００％の範囲ではリン脂質の１０％以上がＰＳに変換されており、ＰＳの産生に適した水／リン脂質重量％であることがわかった。なお、水／リン脂質重量％が２０％〜７０％の範囲ではリン脂質の３０％以上がＰＳに変換されており、ＰＳの産生に最も適した水／リン脂質重量比であることがわかった。各均質化物を直交ニコルのもとで顕微鏡観察した結果、ＰＳの産生に適した水／リン脂質重量％である１０％〜１００％の範囲では、「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」が観察されることが確認された。
【００７８】
図５に示すように、ＰＣ８０を原料リン脂質に用いた場合には、均質化物中の水／リン脂質重量％が８％の時にはＰＳはほとんど産生しないが、１０％〜６０％の範囲ではリン脂質の１０％以上がＰＳに変換されており、ＰＳの産生に適した水／リン脂質重量％であることがわかった。なお、水／リン脂質重量％が２０％〜４０％の範囲ではリン脂質の２０％以上がＰＳに変換されており、ＰＳの産生に最も適した水／リン脂質重量比であることがわかった。各均質化物を直交ニコルのもとで顕微鏡観察した結果、ＰＳの産生に適した水／リン脂質重量％である１０％〜６０％の範囲では、「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」が観察されることが確認された。
【００７９】
図６に示すように、卵黄レシチンを原料リン脂質に用いた場合には、均質化物中の水／リン脂質重量％が８％の時にはＰＳはほとんど産生しないが、１５％〜４０％の範囲ではリン脂質の１０％以上がＰＳに変換されており、ＰＳの産生に適した水／リン脂質重量％であることがわかった。なお、水／リン脂質重量％が２０％〜３５％の範囲ではリン脂質の２０％以上がＰＳに変換されており、ＰＳの産生に最も適した水／リン脂質重量比であることがわかった。各均質化物を直交ニコルのもとで顕微鏡観察した結果、ＰＳの産生に適した水／リン脂質重量％である１５％〜４０％の範囲では、「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」が観察されることが確認された。
【００８０】
実施例７（ＰＳ以外）
６０℃にした水浴下で、５００mgのPC80に表５に記載した各受容体水溶液 ４９０ mg を混合し、１３．７units のＰＬＤ（ＰＬＤ-Ｙ１）水溶液５０μL を添加し、マイクロスパーテルを用いて練り込んで均質化後、５５℃１８時間反応し、ホスファチジル基転移反応物の生成をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより調べた。
【００８１】
【表５】

【００８２】
表５は各受容体での転移反応後の転移反応物の生成率を示す。表５に示す通り、受容体としてグリセロール、L-アスコルビン酸、グルコースを用いた時には、それぞれに対するホスファチジル基転移反応物が生成した（ホスファチジルグリセロール４２．７％、ホスファチジルアスコルビン酸９．４％、ホスファチジルグルコース１３．３％）。一方、イノシトール、アスコルビン酸リン酸エステル、トレハロースを用いた場合にはホスファチジル基転移反応物は生成しなかった。
【００８３】
実施例８（反応温度）
NATHIN 250 アセトン沈殿物（ＰＬ） ５００mg、或いはNATHIN 250 アセトン沈殿物 ４５０mgにＭＣＴ５０mgを加えて調製したリン脂質基質（ＰＬ＋ＴＧ）に４．５Ｍセリン水溶液を４９０mg 添加して６０℃で練り込み、更に４．１units のＰＬＤ−Ｙ１水溶液１５μＬ添加後、マイクロスパーテルを用いて練り込んで均質化して、１５℃〜６５℃まで１０℃刻みの温度で１８時間反応させた。ホスファチジル基転移反応物の生成はシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより解析した。
【００８４】
図７は各反応温度におけるＰＳ生成率を示す線図である。図７に示す通り、NATHIN 250 アセトン沈殿物にＭＣＴを添加したものを基質に用いた場合には、４５℃でのＰＳ生成率は４３％でありそれ以上温度を上げても変化なかった。
【００８５】
一方、NATHIN 250アセトン沈殿物を基質に用いた場合には４５℃でのＰＳ生成率は３０．１％であったのに対し、６５℃では３８．７％であり、反応温度が高いほど好成績が得られた。尚、反応温度が６５℃を越えるとＰＳ産生量が低下するのに加えて、リン脂質が変性・分解するおそれもあるので、６５℃が上限と考えられた。
【００８６】
実施例９（芽キャベツＰＬＤ）
滝と松本の総説（蛋白質 核酸 酵素, Vol.31, p.553-558,1986）に従って、芽キャベツを材料にホスホリパーゼＤを調製した結果、粗酵素１ｍｇ当たり約０．０３ unitsの酵素標品が得られた。５００ mgのNATHIN 250 に４．５Ｍセリン水溶液（カルシウム添加の系では塩化カルシウム ９．３mgを添加）を490 mg加え５５℃で混合した。反応液の温度を４５℃に冷ましてから、上記の芽キャベツＰＬＤの酵素液（0.6 units／mL）を200μL 添加し、４５℃で１８時間反応させた。
【００８７】
その結果、カルシウムを添加しなかった場合、反応はほとんど進行しなかったの対して、カルシウムを加えた場合には進行しＰＳ含量６．２％の反応生成物が得られた。
【発明の効果】
本発明は以上説明した通り、ホスホリパーゼＤを用いたリン脂質の製造を行う場合に、有機溶媒やカルシウムを用いることなく、簡便かつ高収率に目的とするリン脂質を得ることができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＣＴの最適添加量を検討した結果を示す線図である。
【図２】ＭＣＴの最適添加量を検討した結果を示すグラフである。
【図３】均質化物中のリン脂質に対するセリンのモル比を検証した結果を示す線図である。
【図４】均質化物中のリン脂質に対する水の重量比を検証した結果を示す線図である。
【図５】均質化物中のリン脂質に対する水の重量比を検証した結果を示す線図である。
【図６】均質化物中のリン脂質に対する水の重量比を検証した結果を示す線図である。
【図７】各反応温度におけるＰＳ生成率を示す線図である。

Claims (6)

1. ホスファチジル基転移反応を利用してリン脂質を製造する方法において、
   原料リン脂質と、水酸基を有する受容体と、ホスホリパーゼＤと、原料リン脂質に対して１０重量％〜１００重量％となる水とを、有機溶媒を使用せずに均質化する均質化工程と、
   得られた均質化物を１５℃〜６５℃で反応させる反応工程とを備えたことを特徴とするリン脂質の製造法。
2. 前記均質化工程において得られる均質化物が、主としてラメラ型リオトロピック液晶構造を有するものであることを特徴とする請求項１記載のリン脂質の製造法。
3. 前記均質化工程における水酸基を有する受容体の添加量が、原料リン脂質１モルに対して、０，３モル〜１０モルであることを特徴とする請求項１又は２の何れかに記載のリン脂質の製造法。
4. 前記水酸基を有する受容体が、セリン、グリセロール、Ｌ−アスコルビン酸、グルコース、及びコリンから選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のリン脂質の製造法。
5. 前記水酸基を有する受容体が、セリンであり、生成するリン脂質がホスファチジルセリンであることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のリン脂質の製造法。
6. 前記均質化工程における均質化時に、更に食用油脂を添加することを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載のリン脂質の製造法。

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