JP2008092871A - ホスファチジルセリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明により、有機溶剤を使用せず、製造作業性の優れた、高収率および高反応率のホスファチジルセリンの製造方法を提供する。
【解決手段】本発明は、（ａ）ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有するリン脂質を油脂に溶解してリン脂質混合物を提供する工程、（ｂ）該リン脂質混合物を緩衝液中に分散させて分散液を提供する工程、および（ｃ）該分散液に、Ｌ−セリン、ホスホリパーゼＤおよびアルカリ土類金属塩を加え、該ホスホリパーゼＤおよびアルカリ土類金属塩の存在下に該リン脂質およびＬ−セリンを反応させて反応混合物を提供する工程、を含むことを特徴とするホスファチジルセリンおよび／またはその金属塩の製造方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ホスファチジルセリンの製造方法に関する。特に、本発明は、水性媒体中でリン脂質をセリンと反応させることにより、リン脂質から出発してホスファチジルセリンを製造する方法に関する。

ホスファチジルセリンは、多岐にわたる重要性を有し、特に老化または血管病理性などの各種起源の退行性脳疾患の治療に好適な医薬組成物の製造用として、特殊なリポソーム製剤の製造用として、並びに最近ではホスファチジルセリンが、豊富な天然レシチン、特に大豆レシチンおよびポリ不飽和脂肪酸のアシル残基を含有する食事療法組成物の商業化に特に重要である。

従来、酵素によるホスファチジルセリンの製造方法として、原料となるリン脂質に酵素としてホスホリパーゼＤをセリンの存在下に作用させ、ホスファチジル基転移反応を利用して、ホスファチジルセリンを製造する技術は、公知である（例えば、特許文献１〜６など）。

一般に原料となるホスファチジルコリンは、水に不溶であり、従来、製造の際には、有機溶剤を用いて原料のホスファチジルコリンを溶解し、セリン、ホスホリパーゼＤを含む水溶液と混合して乳化状態の系において、塩基交換反応を行うものが殆どであった（例えば、特許文献１〜６など）。しかし、酵素ホスホリパーゼＤは、合成触媒作用と塩基交換触媒作用、さらに加水分解触媒作用も有するので、塩基交換反応よりも加水分解反応が早く進行する系の場合には、基質の加水分解物の生成が塩基交換反応より優勢となり、目的とするホスファチジルセリンを高濃度で得ることができず、その結果、物性、生理活性面で十分満足できるホスファチジルセリンを得ることができなかった。加えて、環境問題や食の安全性の理由から、無溶剤系での製造への要求が高まってきている。

特許文献３には、リン脂質の塩基交換反応を行う際に反応溶媒として有機溶剤を用い、界面活性剤を利用した技術が開示されているが、やはり塩基交換反応よりも加水分解反応が優勢となり、目的とするリン脂質を高濃度で得ることができず、結果、物性、生理活性面等で十分満足できるリン脂質を製造することができなかった。

また、有機溶剤を用いてリン脂質を製造した後、反応溶液からリン脂質を得る際に、特にリン脂質を取り出し、食品用途や医薬品等の用途に使用する場合には、有機溶剤を完全に除去する必要があり、その際には、長時間加熱を必要とする場合等では、リン脂質の劣化が引き起こされるなど問題があった。特許文献６には、リン脂質の精製の際に、過剰のリン脂質あるいは例えばホスファチジルセリンのリン脂質の場合、カルシウム塩等の塩型にして溶剤で精製し、さらに他の塩型にする方法が開示されている。しかし、有機溶剤の問題や、反応率が２２％と、まだ十分でない等の問題があった。

また、ホスファチジルセリンの塩基交換反応を行う際に、有機溶剤を用いない水系で、特定の界面活性剤を用いて反応効率を上げる技術が報告されている（非特許文献１）。さらに詳細には非特許文献１には、塩基交換反応に有機溶剤を用いず、乳化剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＨＬＢ＝４０）、デオキシコーレートナトリウム（胆汁酸Ｎａ、ＨＬＢ＝１８．９）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（ＨＬＢ＝６．７）を用い、ホスファチジルコリンからホスファチジルセリンを調製する際の最高の反応率がそれぞれ２５％、２９％、４６％であることが読みとれる。しかしながら、使用した乳化剤は一般的なもので食品添加物として認められていないので、得られたホスファチジルセリンを含む生成物を食用等として摂取することができないという問題があった。また反応率や収率が十分に高くなっていないという問題が挙げられ、工業的な生産方法としては適さないものであった。

上記のような問題を解決するため、水系で界面活性剤の存在下、リン脂質中に含有するホスファチジルコリンとセリンとのホスホリパーゼＤを用いた塩基交換反応によるホスファチジルセリンの製造方法において、上記界面活性剤を特定の種類および特定のＨＬＢ値を有するものに限定することが提案された（特許文献７）。しかしながら、上記製造方法においては、リン脂質中に含有するホスファチジルコリンとセリンとの反応率や、所望のホスファチジルセリンの収率が未だ十分に得られていないことや、乳化物を崩壊する上で十分に分離しにくく収量が低くなるなどの問題があった。

更に、水性媒体中で、リン脂質をセリンと反応することによるホスファチジルセリンの製造方法において、上記反応をカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウム存在下で行う方法が提案されている（特許文献８）。しかしながら、上記製造方法においても、ホスファチジルコリンなどの含有率が低いリン脂質とセリンとの反応率や、所望のホスファチジルセリンの収率が未だ十分に得られないという問題や、得られたホスファチジルセリンが塩を形成するため融点が高く、上記製造方法の反応温度では反応中に反応容器に付着し反応率の低下原因となるとともに取り出しが困難になるという製造作業上の問題があった。
特開昭６３‐３６１９０号公報 特開昭６３‐３６１９１号公報 特開昭６３‐３６７９２号公報 特開平２‐７９９９０号公報 特開平４‐１７１９７６号公報 特開平９‐１７３０９２号公報 特開２００２‐２１８９９１号公報 特開２０００‐３３３６８９号公報 Ｐａｕｌ Ｃｏｍｆｕｒｉｕｓら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１、１７１９−１７２１（１９９０）

本発明は、上記のような従来のホスファチジルセリンの製造方法の有する問題点を解決し、有機溶剤を使用せず、製造作業性に優れた、高収率および高反応率のホスファチジルセリンの製造方法を提供することを目的とする。

本発明者等は上記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有するリン脂質と油脂との混合物を、水性媒体としての緩衝液中に分散させて、アルカリ土類金属塩および反応触媒としての酵素ホスホリパーゼＤの存在下で、セリンと反応させ、有機溶剤を用いず、製造作業性の優れた、高収率および高反応率のホスファチジルセリンの製造方法が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、
（ａ）ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有するリン脂質を油脂に溶解してリン脂質混合物を提供する工程、
（ｂ）該リン脂質混合物を緩衝液中に分散させて分散液を提供する工程、および
（ｃ）該分散液に、Ｌ−セリン、ホスホリパーゼＤおよびアルカリ土類金属塩を加え、該ホスホリパーゼＤおよびアルカリ土類金属塩の存在下に該リン脂質およびＬ−セリンを反応させて反応混合物を提供する工程
を含むことを特徴とするホスファチジルセリンおよび／またはその金属塩の製造方法に関する。

更に、本発明を好適に実施するためには、
上記アルカリ土類金属塩が、カルシウム塩およびマグネシウム塩から成る群から選択され；
上記アルカリ土類金属塩が、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸カルシウムおよび酢酸マグネシウムから成る群から選択され；
上記緩衝液が、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液であり；
上記反応が、温度２５〜６０℃の範囲で行われ；
上記油脂が、ＭＣＴ、水産油脂、シソ油および亜麻仁油から成る群から選択される１種または２種以上の混合物であり；
上記リン脂質が、ＤＨＡ、ＥＰＡを含む水産リン脂質および／またはアラキドン酸を含むリン脂質であり；
上記反応混合物を、液‐液分離の遠心分離機を用いて分離する工程を更に含む；
ことが好ましい。

本発明のホスファチジルセリンの製造方法は、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有するリン脂質をセリンと触媒としての酵素ホスホリパーゼＤの存在下で反応させる際に、上記リン脂質と油脂との混合物を水性媒体としての緩衝液中に分散させ、アルカリ土類金属塩の存在下で反応を行って反応混合物を生成し、有機溶剤を使用せず、得られるホスファチジルセリンが反応容器に付着して、反応率が低下したり、取り出しが困難になったりするという問題がなく、製造作業性が優れ、高収率および高反応率でホスファチジルセリンを得ることができる。

本発明のホスファチジルセリンおよび／またはその金属塩の製造方法は、前述のように、（ａ）ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有するリン脂質を油脂に溶解してリン脂質混合物を提供する工程、（ｂ）上記リン脂質混合物を緩衝液中に分散させて分散液を提供する工程、および（ｃ）上記分散液に、Ｌ−セリン、ホスホリパーゼＤおよびアルカリ土類金属塩を加え、上記ホスホリパーゼＤおよびアルカリ土類金属塩の存在下に上記リン脂質およびＬ−セリンを反応させて反応混合物を提供する工程を含むものである。

本発明のホスファチジルセリンおよび／またはその金属塩の製造方法に用いる上記リン脂質としては、アシル基を有するホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有するものであれば特に限定されないが、天然に存在するリン脂質が挙げられる。それらの具体例として、大豆、菜種、米、コーン、麦芽、シソなどの植物由来のリン脂質；牛、豚などの脳や肝臓、鶏卵黄、マグロ、イワシ、カツオなどの魚類を含む動物由来のリン脂質；パン酵母、ラビリンチュラなどの微生物由来のリン脂質；またはそれらの混合物等が挙げられる。これらの内、上記アシル基は不飽和結合の有無や炭素数については任意であり公知の脂肪酸残基等でよいが、ポリ不飽和脂肪酸残基を含むものが望ましい。このような脂肪酸としてアラキドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等を例示でき、これらの１種または２種以上を含むものが好適である。ＤＨＡ、ＥＰＡを含有する水産リン脂質および／またはアラキドン酸を含有するリン脂質が特に好ましい。上記ポリ不飽和リン脂質含有率は３〜８０重量％、好ましくは５〜７０重量％、より好ましくは１０〜５０重量％であることが望ましい。上記ポリ不飽和リン脂質含有率が３重量％未満では機能的に十分な活性を得ることができないし、８０重量％を超えると天然物ではこれらの含有率を得られずリパーゼ酵素などで濃縮する上で限界に達する。

出発原料である上記リン脂質は、他の材料を加える前に、活性を促進するために、水性媒体としての緩衝液中に十分分散させて分散液とする。上記緩衝液とは、少量の酸や塩基を加えたり、多少濃度が変化したりしても、ｐＨが変化しないようにした溶液であり、通常、弱酸とその塩などを溶解した水溶液を指す。上記緩衝液の例としては、例えばギ酸−ギ酸ナトリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸−リン酸ナトリウム緩衝液等が挙げられ、これらの内、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸−リン酸ナトリウム緩衝液が好ましい。上記酵素ホスホリパーゼＤは活性を発揮するために好適なｐＨの範囲を有しており、２〜８のｐＨの範囲で反応を行うことが好ましい。上記緩衝液の使用量は、特に限定されないが、上記リン脂質の重量をベースとして１００ｇに対し４００〜２５００ｍＬを用いる。上記分散は、２０〜５０℃で１０分〜２時間撹拌することで可能である。撹拌装置としては、特に限定されず、当業者に公知の装置を用いることができる。

原料として用いるセリンの起源は問わず、Ｄ−セリンおよびＬ−セリンを使用できるが、ホスファチジル基転移反応効率および生体内活性の点からＬ−セリンが好適である。上記セリンの配合量は、リン脂質をベースとして、１００〜２０００重量％、好ましくは２００〜１０００重量％、より好ましくは４００〜１０００重量％である。上記セリンの配合量が１００重量％未満では、反応が進みにくく、２０００重量％を超えるとセリンの濃度が飽和し溶液に溶解しなくなる。

上記ホスホリパーゼＤとしては、キャベツ、米糠、ピーナッツなどの植物由来のホスホリパーゼＤや、ストレプトマイセス属の放線菌などの微生物由来のホスホリパーゼＤが挙げられるが、一般に市販されているものを使用することができる。これらの内、セルフクローニングしたものを含むストレプトマイセス由来のものやアクチノマジューラなどが好ましい。また、上記微生物由来のホスホリパーゼＤを使用する場合、上記ホスホリパーゼＤを含む培養液をそのまま使用してもよい。上記ホスホリパーゼＤの配合量は、リン脂質をベースとして、０．１〜２０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％、より好ましくは１〜５重量％である。上記ホスホリパーゼＤの配合量が０．１重量％未満では、酵素が失活する方が早く十分な反応収率が得られず、２０重量％を超えると反応のための酵素自体が過剰であり価格が高くなるだけである。

更に、上記（ｃ）工程において酵素反応を行う際には、酵素であるホスホリパーゼＤの活性を高めるために、カルシウム等のイオンを活性化剤として添加することがより望ましい。即ち、上記反応は、アルカリ土類金属存在下に行われることが望ましい。上記アルカリ土類金属としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウムなどのカルシウム塩；および塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウムなどのマグネシウム塩から成る群から選択されることが望ましい。反応率の点および反応液からの分離の点から、カルシウム塩、特に塩化カルシウムが好ましい。上記アルカリ土類金属塩の配合量は、リン脂質をベースとして、５〜３００重量％、好ましくは１０〜１５０重量％、より好ましくは３０〜８０重量％である。上記アルカリ土類金属塩の配合量が５重量％以下では、反応の平衡が悪くホスファチジルセリンの収率が悪く、３００重量％を超えるとホスファチジルセリンのアルカリ土類塩が過剰になり反応の収率向上には役立たなくなる。例えば酵素ホスホリパーゼＤの反応では、好適なｐＨは２〜８であり、好適な温度は、２５〜６０℃であり、この範囲で反応することが望ましい。

次に、本発明のホスファチジルセリンの製造方法における上記（ｃ）工程について詳述する。まず、上記（ｂ）工程にて作製した分散液に、上記セリン、ホスホリパーゼＤおよびアルカリ土類金属塩を加える。この際に上記ホスホリパーゼＤは、上記セリンのヒドロキシル基にリン脂質のホスファチジル基を転移する反応（ホスファチジル基転移反応）の触媒として作用する。

以下に化学式を用いて簡単に説明する。まず、本発明の製造方法により得られるホスファチジルセリンは、以下の式（１）：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、飽和、モノ不飽和またはポリ不飽和のＣ_１０〜Ｃ_３０のアシル基であり、ＹはＯＨまたはＯＭであり、Ｍはアルカリ土類金属である）
において、Ｘが以下の式（２）：

で表されるリン脂質である。同様に上記式（１）において、Ｘが
‐ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ(ＣＨ_３)_３
の場合にはホスファチジルコリンであり、Ｘが
‐ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２
である場合にはホスファチジルエタノールアミンである。

更に、本発明の製造方法に用いられるリン脂質には、前述のように、上記Ｒ^１およびＲ^２として、ヘキサ不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ペンタ不飽和脂肪酸のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含有する水産リン脂質および／またはテトラ不飽和脂肪酸のアラキドン酸を含有するリン脂質が好ましい。

以下の式（３）：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、飽和、モノ不飽和またはポリ不飽和のＣ_１０〜Ｃ_３０のアシル基であり、ＹはＯＨまたはＯＭであり、Ｍはアルカリ土類金属である）
に示すように、リン脂質がホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの場合には、ホスホリパーゼＤ（式中ではＰＬＤ）は、リン脂質を加水分解して、ＸがＨであるホスファチジン酸を生成する反応の触媒として作用する。更に、このような反応系にヒドロキシル基を有する化合物、本発明ではＬ−セリンを加えると、上記ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）は、上記Ｌ−セリンのヒドロキシル基にリン脂質のホスファチジル基を転移する反応（ホスファチジル基転移反応）の触媒としても作用する。このホスファチジル基転移反応により、本発明の目的物であるホスファチジルセリンおよび／またはそのアルカリ土類金属塩が生成される。

ここで、上記（ｃ）工程における上記反応の条件としては、前述のように、温度は、ホスホリパーゼＤに適する温度範囲が好ましく、かつ、目的とするリン脂質、即ち、ホスファチジルセリンが加水分解や熱履歴により着色しない範囲が好ましい。具体的には反応温度は、２５〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃、より好ましくは４２〜４７℃の範囲が望ましい。上記反応温度が２５℃未満の場合は、反応速度が遅くて平衡に達するまでに酵素が失活し、反応効率が悪くなる傾向にあり、上記反応温度が６０℃より高い場合は、反応中に酸化やリン脂質や油脂の加水分解が著しくなる傾向にあるので好ましくない。また反応時間は反応溶液の組成により異なるが、３０分間〜４８時間、好ましくは４時間〜１２時間である。反応の確認方法としては、反応液中のホスファチジルコリンの減少量を薄層クロマトグラフィーなどでチェックし、反応の終点はホスファチジルセリンの生成量が最高の含有率になる時点で反応を停止し、最大の収率を得ることが望ましい。

本発明のホスファチジルセリンの製造方法では、上記（ａ）工程において、上記原料リン脂質を油脂に溶解することを要件とする。上記（ｃ）工程において水性媒体としての緩衝液中でリン脂質のみを反応させて生成した反応混合物では、反応中に固体状になり反応容器に付着して反応の進まない成分が器壁に残ったり、反応後の取り出しが困難になったりするという反応収率や製造作業性の問題があったが、本発明の製造方法では、上記原料リン脂質を油脂に溶解することによって、優れた反応収率や製造作業性を達成したものである。上記油脂の例には、ＭＣＴ（中鎖脂肪酸トリグリセリド）、水産油脂、シソ油および亜麻仁油から成る群から選択される１種または２種以上の混合物が挙げられる。ゼラチンカプセルなどへの充填用に液状であることが要求される用途によっては、このままの形で使用してもよい。このようにして得られたホスファチジルセリンを含有する反応混合物は、液−液分離のため、遠心式の分離機を用いて、分離、精製して、高収率および高反応率のホスファチジルセリンを得ることができる。なお、本発明の製造方法の反応条件では、油脂の加水分解もほとんど進むことがないことも確認された。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）
２Ｌ四つ口フラスコ中で大豆リン脂質（辻製油製ＳＰＬ−ＰＣ７０）５０ｇとＭＣＴ（花王製ココナードＭＴ）５０ｇを４５℃で撹拌溶解する。これに緩衝液（０．１モル酢酸溶液：０．１モル酢酸ソーダ溶液の２：１混合物）３００ｍＬに溶解、分散させる。これにＰＬＤ酵素（名糖産業製アクチノマジューラ）１．６０ｇ、緩衝液８００ｍＬ、塩化カルシウム２９．０ｇおよびＬ−セリン４００ｇを混合溶解したものを４５℃で混合する。１２時間反応後分液し上層を遠心分離して水層を除去する。更に硫酸マグネシウムを加えて更に水分を除去する。得られた反応物の重量は９８．３ｇで組成はホスファチジルセリンが２３．１％（リン脂質あたり４６．２％）であった。ホスファチジルコリンの残存は認められなかった。

（比較例１）
２Ｌ四つ口フラスコ中で大豆リン脂質（辻製油製ＳＰＬ−ＰＣ７０）５０ｇを緩衝液（０．１モル酢酸溶液：０．１モル酢酸ソーダ溶液の２：１混合物）３００ｍＬに溶解、分散させる。これにＰＬＤ酵素（名糖産業製アクチノマジューラ）１．６０ｇ、緩衝液８００ｍＬ、塩化カルシウム２９．０ｇおよびＬ−セリン４００ｇを混合溶解したものを４５℃で混合する。１２時間反応後分液し反応物を濾取する。濾過物を４５℃以下で減圧乾燥する。得られた反応物は器壁に付着し残存しているが水洗しながら器壁から回収し
反応物と併せて乾燥する。得られた反応物の重量は４６．９ｇで組成はホスファチジルセリンが３５．７％であった。ホスファチジルコリンは９．５％の残存が認められた。

本発明の製造方法は、有機溶剤を使用せず、製造作業性が優れ、高収率および高反応率であるホスファチジルセリンの製造方法として有用である。本発明の製造方法により得られるホスファチジルセリンは、老化または血管病理性などの各種起源の退行性脳疾患の治療に好適な医薬組成物、特殊なリポソーム製剤、豊富な天然レシチン、特に大豆レシチンおよびポリ不飽和脂肪酸のアシル残基も含有する食事療法組成物などに利用することができる。

Claims (8)

1. （ａ）ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有するリン脂質を油脂に溶解してリン脂質混合物を提供する工程、
   （ｂ）該リン脂質混合物を緩衝液中に分散させて分散液を提供する工程、および
   （ｃ）該分散液に、Ｌ−セリン、ホスホリパーゼＤおよびアルカリ土類金属塩を加え、該ホスホリパーゼＤおよびアルカリ土類金属塩の存在下に、該リン脂質およびＬ−セリンを反応させて反応混合物を提供する工程
   を含むことを特徴とするホスファチジルセリンおよび／またはその金属塩の製造方法。
2. 前記アルカリ土類金属塩が、カルシウム塩およびマグネシウム塩から成る群から選択される請求項１記載の製造方法。
3. 前記アルカリ土類金属塩が、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸カルシウムおよび酢酸マグネシウムから成る群から選択される請求項１記載の製造方法。
4. 前記緩衝液が、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液である請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
5. 前記反応が、温度２５〜６０℃の範囲で行われる請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
6. 前記油脂が、ＭＣＴ、水産油脂、シソ油および亜麻仁油から成る群から選択される１種または２種以上の混合物である請求項１〜５のいずれか１項記載の製造方法。
7. 前記リン脂質が、ＤＨＡ、ＥＰＡを含む水産リン脂質および／またはアラキドン酸を含むリン脂質である請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法。
8. 前記反応混合物を、液‐液分離の遠心分離機を用いて分離する工程を更に含む請求項１〜７のいずれか１項記載の製造方法。