JP2002051794A - リン脂質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ホスホリパーゼＤを用いたリン脂質の製造を
行う場合に、有機溶媒やカルシウムを用いることなく、
簡便かつ高収率に目的とするリン脂質を得る。 【解決手段】 原料リン脂質と、水酸基を有する受容体
と、ホスホリパーゼＤと、水とを、有機溶媒を使用せず
に混合して充分に均質化して、１５℃〜６５℃にて酵素
反応を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ホスファチジル基
転移反応（リン脂質塩基交換反応）を利用して目的とす
るリン脂質を生成させる方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスフ
ァチジルグリセロール（ＰＧ）等のリン脂質は、それぞ
れ有用な生理作用や特異な物性を有しており、医薬品や
食品素材、乳化剤等の用途に使用されている。例えば、
ホスファチジルセリンは痴呆症の予防や治療などを目的
とした脳機能改善剤、ホスファチジルグリセロールは乳
化剤、ホスファチジルアスコルビン酸は乳化剤、過酸化
脂質抑制剤としての利用が期待されている。

【０００３】これらリン脂質の製造法としては、従来、
化学合成法やホスホリパーゼＤを使用したホスファチジ
ル基転移反応が用いられており、近年では比較的安価か
つ簡便にリン脂質を製造できる酵素法が汎用されてい
る。

【０００４】ホスファチジル基転移反応（リン脂質塩基
交換反応）を利用して目的とするリン脂質を生成させる
方法については古くより知られている（Yang, S.F. et
al.,J. Biol. Chem., 242, p.477, '67）。例えば、国
生ら（Agric. Biol. Chem.,51, p.2515, '87 ) はイソ
プロピルエーテルに溶解した卵黄ホスファチジルコリン
にＬ−セリン水溶液（塩化カルシウムを含む）を加えて
からホスホリパーゼＤを作用させる二相系反応によりホ
スファチジルセリンを含む反応物を得ている。二相系反
応においては、原料リン脂質を含む油相と受容体を含む
水相が二相をなし、両者の界面において、ホスファチジ
ル基転移反応が起こると考えられている。

【０００５】また、本発明者らは大豆レシチンを分画し
て得たホスファチジルコリンを約８５％含むリン脂質標
品を酢酸エチルに溶解し、更にアスコルビン酸を含む水
溶液を加えてから、ホスホリパーゼＤを作用させる澄明
な均一相反応によりホスファチジルアスコルビン酸を含
む反応物を得ている（特許第２９４２３０２号）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、二相系
反応においては、リン脂質に対して５倍（容量／重量）
以上の溶媒（有機溶媒＋水）を加える必要があったた
め、リン脂質量に対して６倍以上の容量を持つ反応装置
を用いる必要があった。更に、反応の進行を促進させる
ためにカルシウムの添加がなされているが、このカルシ
ウムはリン脂質と速やかに塩を形成してしまう。こうし
て生成するカルシウム塩は、日本や欧州においては化学
合成品の範疇に入るため、食品への利用は難しい。

【０００７】一方、均一相反応では、反応系に多量の水
が存在するため、反応を継続すると、ホスホリパーゼＤ
が有する加水分解活性により、副反応生成物としてのホ
スファチジン酸が生成してしまう。このため、目的リン
脂質の分離精製が困難となることが問題であった。更
に、均一相反応では、リン脂質に対する受容体の添加量
が限定されてしまうため、目的とする反応生成物（リン
脂質）の産生量が頭打ちとなる問題があった。

【０００８】また、藤田ら（特公平７−１６４２６号公
報）は、原料リン脂質を溶解した有機溶媒（ジイソプロ
ピルエーテル、イソオクタン、シクロヘキサン、ベンゼ
ン、クロロホルム−イソオクタン、ｎ−ヘキサン、ジク
ロロメタン−イソオクタン）中に、水酸基を持つ受容体
とホスホリパーゼＤを含む水相（塩化カルシウムを含
む）を逆ミセル中に封入した形態で反応させる逆ミセル
反応により、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグ
リセロール等を製造している。

【０００９】逆ミセル反応においては、使用される水分
量が少ないため、上記方法の問題点であったホスファチ
ジン酸の生成は抑制されていると報告されているが、目
的リン脂質の生成量はおよそ２０％前後と必ずしも十分
とはいえず、また、超音波処理など煩雑な作業も必要と
なるため、作業性、コスト面での問題も生じてしまう。
また、リン脂質に対して１０倍（容量／重量）以上の有
機溶媒を加える必要があるため、リン脂質量に対して大
容量の反応装置を用いる必要があった。

【００１０】また、以上のような従来から知られている
ホスファチジル基転移反応においては、いずれも反応系
中に有機溶媒を加える必要があった。しかしながら、リ
ン脂質を食品、医薬品等の用途に用いる場合には、有機
溶媒の残存は許容されず、完全に除去することが必須で
ある。このため、製造工程においては、有機溶媒除去の
ための設備等が必要となり、作業性、コスト面等の不利
益が生じてしまう。特に、食品製造を目的とした場合に
は、有機溶媒を反応に利用することは食品衛生法上から
実質上不可能である。

【００１１】そこで、有機溶媒やカルシウム塩を使用せ
ずに、各種のリン脂質を製造する方法が望まれている
が、原料リン脂質となるホスファチジルコリン等は油溶
性であるため、有機溶媒を用いなければ反応を円滑に進
行させることができず、生成するリン脂質の収率、作業
性等が低下するものと考えられていた。

【００１２】従って、本発明は、ホスホリパーゼＤを用
いたリン脂質の製造を行う場合に、有機溶媒やカルシウ
ムを用いることなく、簡便かつ高収率に目的とするリン
脂質を得ることができる製造法を確立することを目的と
している。

【００１３】

【課題を解決するための手段】請求項１に記載された発
明に係るリン脂質の製造法は、ホスファチジル基転移反
応を利用してリン脂質を製造する方法において、原料リ
ン脂質と、水酸基を有する受容体と、ホスホリパーゼＤ
と、水とを、有機溶媒を使用せずに均質化する均質化工
程と、得られた均質化物を１５℃〜６５℃で反応させる
反応工程とを備えたものである。

【００１４】請求項２に記載された発明に係るリン脂質
の製造法は、請求項１に記載された均質化工程において
得られる均質化物が、主としてラメラ型リオトロピック
液晶構造を有するものである。

【００１５】請求項３に記載された発明に係るリン脂質
の製造法は、請求項１又は２に記載された均質化工程に
おいて得られる均質化物中の水分含量が、原料リン脂質
に対し、１０重量％〜１００重量％であるものである。

【００１６】請求項４に記載された発明に係るリン脂質
の製造法は、請求項１〜３の何れかに記載された均質化
工程における水酸基を有する受容体の添加量が、原料リ
ン脂質１モルに対して、０．３モル〜１０モルである。

【００１７】請求項５に記載された発明に係るリン脂質
の製造法は、請求項１〜４の何れかに記載された水酸基
を有する受容体が、セリン、グリセロール、Ｌ−アスコ
ルビン酸、グルコース、及びコリンから選ばれる１種又
は２種以上であるものである。

【００１８】請求項６に記載された発明に係るリン脂質
の製造法は、請求項１〜５の何れかに記載された水酸基
を有する受容体が、セリンであり、生成するリン脂質が
ホスファチジルセリンであるものである。

【００１９】請求項７に記載された発明に係るリン脂質
の製造法は、請求項１〜６の何れかに記載された均質化
工程における均質化時に、更に食用油脂を添加するもの
である。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明者らは上記課題を解決する
ために鋭意研究を重ねた結果、原料リン脂質と、水酸基
を有する受容体と、ホスホリパーゼＤと、水とを、有機
溶媒を使用せずに混合して充分に均質化して、１５℃〜
６５℃にて酵素反応を行うことにより、各種の有機溶媒
を使用せずとも効率よくホスファチジル基転移反応物を
得られることを見出し本発明を完成した。

【００２１】すなわち本発明は、ホスファチジル基転移
反応を利用してリン脂質を製造する方法において、原料
リン脂質と、水酸基を有する受容体と、ホスホリパーゼ
Ｄと、水とを、有機溶媒を使用せずに混合して均質化す
る「均質化工程」と、得られた均質化物（混合物）を１
５℃〜６５℃で反応させる「反応工程」とを備える。

【００２２】本発明において、上記の４成分を混合し、
これを均質化することにより得られる均質化物は、その
構造としてラメラ型リオトロピック液晶構造を有してい
るものと考えられる。ラメラ型リオトロピック液晶と
は、リン脂質に水を加えて形成されるリン脂質二分子膜
の液晶をいい、本発明においてはこの二分子膜（時には
多分子膜構造も取る）と水層が交互に連続した配列を取
っているものと推定される。このラメラ型リオトロピッ
ク液晶構造は、例えば均質化物を直交ニコルの元で顕微
鏡観察することにより確認できる。因みに、後述する
「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構
造」は連続した層状の構造物として、「相分離したラメ
ラ型リオトロピック液晶構造」は水相に浮遊した閉環状
の構造物としてそれぞれ観察される。

【００２３】このラメラ型リオトロピック液晶構造は、
均質化時に原料リン脂質に水が添加されることで、リン
脂質の親水基間の相互作用が弱まり結晶構造が崩壊し、
ラメラ型の液晶が形成されることにより生ずる。そし
て、ラメラ型リオトロピック液晶構造を形成することに
より、リン脂質の層状構造の間を水分が自由に移動でき
ることとなり、受容体や酵素の供給、或いはリン脂質か
ら遊離した極性頭部の除去が効率的に行われ、転移反応
が可能になるものと思われる。

【００２４】従って、反応生成物の収率を高めるために
は、ラメラ型リオトロピック液晶構造を均質化物全体に
行き渡らせることが必要となるが、そのためには単に各
成分を混合するだけなく、均質化処理を行う必要があ
る。つまり、均質化により、ラメラ型リオトロピック液
晶構造が構造中全体にわたって観察される状態（主とし
てラメラ型リオトロピック液晶構造を有する状態）とす
ることが、高い反応生成物量を得るためには好ましいの
である。

【００２５】また、このラメラ型リオトロピック液晶構
造の形成には、均質化物中の水分含量が影響する。水分
含量が一定の範囲内（例えば、大豆リン脂質に対し１０
重量％〜１００重量％程度）である場合には、均質化物
はほぼ相分離のないラメラ型（ニート状）の液晶となる
が、水分が多くなると、液体と液晶からなる二相に分離
（相分離）する。本発明の方法では、この相分離のない
状態、或いはほぼ相分離が起こっていない状態（両者合
わせて「主として相分離のないラメラ型リオトロピック
液晶構造」という。）にて反応を行えば、特に高い転移
活性が奏されるため好ましい。

【００２６】一方、均質化物中の水分量が多く相分離を
起こした状態（相分離したラメラ型リオトロピック液晶
構造）では、液晶は不連続の小胞状態となって溶媒中に
漂うこととなり、相分離の無い場合に比べて水分とリン
脂質との接触効率が低下し、そのため転移活性も低下し
てしまう。また、水分量が少なすぎると、リン脂質の結
晶構造が維持され、ラメラ型リオトロピック液晶構造を
全体に渡り形成させ得ず、結果的に酵素反応の場がなく
なってしまうか、或いは流動性が低下して基質と酵素の
接触効率が悪化し、酵素が効率よく働くことができなく
なってしまうと考えられる。

【００２７】他方、均質化時に有機溶媒を添加してしま
うと、従来法であるところの二相系反応様の相分離（ラ
メラ型リオトロピック液晶構造中での相分離ではなく、
油相と水相との分離）が助長される可能性がある。ま
た、上記のとおり有機溶媒の添加は各種の不利益を生ず
るものであるから、均質化時には有機溶媒を使用しない
ことが好ましい。

【００２８】本発明に用いられる原料リン脂質として
は、リン脂質を含む天然物、天然物からの抽出物又は該
抽出物を精製したもの、或いは合成リン脂質等いずれを
用いてもよい。具体的には、大豆レシチン、菜種レシチ
ン、卵黄レシチン、トウモロコシレシチンあるいは綿実
レシチンや、それらの精製物、若しくはホスファチジル
コリン（以下、「ＰＣ」と記載する。）、ホスファチジ
ルエタノールアミン（以下、「ＰＥ」と記載する。）等
又はこれらの混合物等が挙げられる。中でも、大豆レシ
チン、菜種レシチン、卵黄レシチン、或いはこれらの精
製物を用いることが原料の確保のしやすさやコスト面か
ら好ましい。

【００２９】また、本発明の水酸基を有する受容体とし
ては、ホスホリパーゼＤの存在下で、前記原料リン脂質
のホスファチジル基を受容するものであればよい。例え
ば、セリン、グリセロール、Ｌ−アスコルビン酸、グル
コース、コリン、エタノールアミン、１−アミノ−２−
プロパノール、１−オルソメチル−グルコシド等が挙げ
られる。目的生成物の収率等の点からセリン、コリン、
Ｌ−アスコルビン酸、グルコース又はグリセロール等が
好ましく、特にセリン及びグリセロールを用いることが
好ましい。

【００３０】また、ホスホリパーゼＤ（以下、「ＰＬ
Ｄ」と記載する。）としては、ホスファチジル基転移活
性を有するものであれば特に制限されず、その形態は遊
離或いは化学修飾したＰＬＤ、若しくはイオン交換樹脂
やシリカゲル等の担体に固定化された固定化酵素等とし
て用いることも可能である。中でも遊離のＰＬＤを用い
た場合に、反応生成物の収率が特に高くなるため好まし
い。

【００３１】更に、ＰＬＤとしては、具体的には、キャ
ベツやニンジン等の植物由来のＰＬＤを始めとして、放
線菌、細菌、酵母、カビ等の微生物由来のＰＬＤ、或い
は、動物由来のＰＬＤ等いずれも好適に使用でき、公知
の方法により調製したものであっても、市販品、例え
ば、キャベツ由来ＰＬＤ（シグマ社製、P7758）、ピー
ナッツ由来ＰＬＤ（シグマ社製、P0515）、ストレプト
マイセス・クロモフュースカス（Streptmyces chromofu
scus）由来のＰＬＤ等であってもかまわない。

【００３２】本発明においては、まず、原料リン脂質
と、水酸基を有する受容体と、ＰＬＤと、水とを混合し
て均質化する。ここで、均質化とは、上記の４者を混合
するとともに、物理的な力を加えて成分を等しく分散す
ることであり、その方法としては物理的攪拌、超音波処
理等の手段が挙げられる。より具体的には、バイブロミ
キサー、自動乳鉢、ホモミキサー、ヒスコトロン、フー
ドプロセッサー、超音波処理装置等を用いて均質化すれ
ばよく、また、少量であればマイクロスパーテル等を用
いて練り込んでもよい。４者は各々単独で混ぜても、２
〜３を予め混ぜたり溶解したりしてから最終的に均質化
しても良い。

【００３３】本発明の方法において、仮にこの均質化を
行わないと、生成する目的リン脂質の収率は顕著に低下
してしまう。これは、原料リン脂質が一般には室温で硬
いペースト状となっているため、単にその他の成分を混
ぜるだけでは、全体に渡ってラメラ型リオトロピック液
晶構造を生ぜしめることが困難であり、その結果、各成
分が接触する割合が低下して、目的とする生成物の収率
が低下してしまうためと考えられる。このため、各成分
の分散が行える程度までに物理的な力を加える必要があ
り、所謂“均質化”と呼ばれる処理が必要となるのであ
る。

【００３４】均質化の際には、水酸基を有する受容体は
水に溶解させて用いてもよく、粉末として用いることも
できる。また、ＰＬＤも少量の水に溶解して用いるか或
いは粉末として用いる。このとき、受容体を除いた３者
（原料リン脂質、ＰＬＤ及び水）を予め混ぜてしまう
と、副生物であるホスファチジン酸（以下、「ＰＡ」と
記載する）が生成してしまうため、予め原料リン脂質と
受容体とを混ぜてから、残りの成分を添加混合するか、
或いは４者同時に均質化することが好ましい。

【００３５】また、上記のとおり、均質化時の水分量
は、ラメラ型リオトロピック液晶構造の相分離、ひいて
は反応生成物であるリン脂質の収率に影響するため、こ
れを調整し当該相分離を抑制することが好ましい。水分
量として好ましい範囲は、原料リン脂質の種類によって
異なるが、ラメラ型リオトロピック液晶構造中の水分含
量を原料リン脂質に対して１０重量％〜１００重量％と
すれば相分離をおおむね抑制でき、特に２０重量％〜６
０重量％が好ましい。なお、ここでいうラメラ型リオト
ロピック液晶構造中の水分含量とは、均質化時に分離し
た水分を除去して後の均質化物中の水分量を指し、その
測定は公知のカールフィッシャー法（日本油化学会制定
基準油脂分析試験法 1996年版 4.1.1.1-1996 水分）
等により行うことができる。また、分離した水分の除去
は、デカンテーション或いは遠心分離（例えば、１５０
×ｇ、１分間程度）により行えばよい。

【００３６】また、受容体の添加量についても、用いる
受容体の種類によって好ましい添加量の範囲が異なるた
め、これを一般化するのは困難であるが、おおむね原料
リン脂質１モルに対し０．３モル〜１０モル、特に、４
モル〜８モルとすることが、反応生成物の収率や作業性
の点から好ましい。即ち、多量（１０モルを超える量）
の受容体を添加すると未反応の受容体を回収するための
労力が増してしまい、一方で、添加量が少ないと目的と
する生成物の収率が低下してしまうのである。

【００３７】より具体的には、水酸基を有する受容体と
してセリンを用いる場合には、原料リン脂質に対し５重
量％〜１５０重量％、特に、５０重量％〜１００重量％
とすることが好ましく、グリセロールを用いる場合に
は、１０重量％〜２００重量％、特に、２０重量％〜１
００重量％とすることが好ましい。

【００３８】また、ＰＬＤの添加量は特に限定されず、
後の反応工程における反応時間等を鑑みて決定すればよ
いが、一般には、リン脂質１ｋｇあたり５００〜１００
０００ units程度である。

【００３９】また、均質化時の温度条件は特に限定され
ないが、１５℃〜６５℃の範囲で均質化することを目安
とするのが好ましい。１５℃未満では冷却には余分なエ
ネルギーを要し、均質化しがたく格別なメリットはな
く、６５℃以上ではリン脂質が不安定であるからであ
る。

【００４０】更に、均質化時には、上記の各成分の他
に、ラメラ型リオトロピック液晶構造を壊さない範囲内
で、食用油脂を添加することができる。有機溶媒と同
様、食用油脂の添加によってもラメラ型リオトロピック
液晶構造の二相系への移行が助長されてしまうが、少量
の添加であれば却って均質化物の流動性が増し、目的リ
ン脂質の収率が向上するのである。食用油脂としては、
例えばサフラワー油、大豆油、コーン油、菜種油、綿実
油、ヒマワリ油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、ア
マニ油、エゴマ油、カカオバター、ヤシ油等の植物油、
或いはバター油、魚油、ラード、牛脂等の動物油、中鎖
トリアシルグリセロール（ＭＣＴ）等が挙げられ、これ
らを１種又は２種以上組み合わせて原料リン脂質に添加
混合し、流動性を付与することができる。中でもＭＣ
Ｔ、カカオバター、大豆油等を用いれば、目的とする生
成物の収率が向上するため好ましい。

【００４１】食用油脂の添加量は、原料リン脂質や添加
する食用油脂の種類により異なるが、原料リン脂質に対
し等量以下とすることが収率の面から好ましく、特に５
重量％〜１５重量％とすることが好ましい。

【００４２】また、ヘキサンやエーテル等の有機溶媒を
ラメラ型リオトロピック液晶構造を壊さない範囲内で添
加することも同様の趣旨から可能であるが、上記のとお
り有機溶媒の添加は好ましくない。

【００４３】尚、ここで本発明の有利な点を指摘する
と、従来、ホスファチジル基転移反応は、二相系反応、
逆ミセル反応、均一相反応の何れかで行われてきたが、
このうち二層形反応及び逆ミセル反応においては、反応
系を維持するために、リン脂質に対して５倍（容量／重
量）以上の溶媒を加える必要があった。これに対して本
発明では、リン脂質に対して１倍以下の溶媒を加えれば
よいため、同量のリン脂質を製造するのに必要な装置の
容量を小さくすることができる。

【００４４】均一相反応では、リン脂質に対して２倍
（容量／重量）以上の溶媒を加えるため、リン脂質に対
して３倍（容量／重量）以上の容量を持つ反応装置を用
いる必要があることに加え、均一相を維持するために受
容体の添加量が制限されるため、目的物を高含量に含む
反応生成物を得ることが難しかった。例えば、ＰＳを製
造する場合、リン脂質１ｋｇに添加できるセリン量は
０．１５ｋｇであり、反応生成物リン脂質中のＰＳ含量
は３５％が限界であった。これに対して本発明の方法で
は、リン脂質1 ｋｇに1 ｋｇ以上のセリンを添加するこ
とも可能であり、結果としてリン脂質中に４８％以上の
ＰＳを含む反応生成物を得ることができた。すなわち、
均一相反応に比べて本発明は、同量のリン脂質を製造す
るのに必要な装置の容量を小さくすることができること
に加えて、目的物の含量が高い反応生成物が得られる点
でも好ましい方法である。

【００４５】更に、従来のホスファチジル基転移反応は
何れも反応系にエーテル、トルエン、ｎ−ヘキサン、酢
酸エチルなどの有機溶媒を用いる必要があったが、本発
明では有機溶媒を使用する必要がなく、食品など、有機
溶媒の使用が制限された物質の製造に都合が良い。ま
た、本発明によれば、従来法で用いられていたカルシウ
ムイオンを添加せずとも反応が進行する。この理由は明
らかでないが、二相系反応等では、反応が液体中で行な
われているのに対し、本発明では液晶中で行なわれてい
るため、カルシウムの有無に関わらず原料リン脂質が、
転移反応を受け易い構造を取るものと推定される。

【００４６】次に、本発明においては、上記のようにし
て得られた均質化物を反応させ、目的とするリン脂質を
製造する。反応は１５℃〜６５℃、特に４５℃〜５５℃
で行うことが好ましい。１５℃未満では、反応の進行が
促進されず、目的リン脂質の収率が低下してしまい、６
５℃以上では、リン脂質、例えば生成したホスファチジ
ルセリンが分解や酸化等の副反応を起こす可能性がある
ためである。

【００４７】反応時間は特に限定されす、反応温度や用
いる成分の種類、それらの量等に合わせ好適な条件を選
択すればよく、目的リン脂質の収率や副生物であるＰＡ
の生成量等の点からは１〜４８時間程度が好ましい。

【００４８】反応は、静置若しくは攪拌下等いずれの状
態で行ってもよく、例えば卓上型万能ミキサー（KINMIX
MAJOR，KM-230）を用いて、攪拌しながら行うことが
できる。

【００４９】本発明方法によるリン脂質の製造におい
て、原料リン脂質に適量の水が混合されることにより、
相分離のないラメラ型液晶状態が形成され、リン脂質の
層状構造の間を水分が自由に移動できる。従って、水酸
基を有する受容体や酵素の供給、或いはリン脂質から遊
離した極性頭部の除去が効率行われるため、高い転移活
性が達成され、安価、簡便かつ収率よく、目的とするリ
ン脂質を得られることが可能となったのである。

【００５０】転移反応で得られた転移型リン脂質は適当
な精製処理工程に付し、不純物を除いて用いることが望
ましいが、投与上の問題や効果を阻害するような問題が
ない限り、原料由来や製造工程での不純物を含んだまま
用いてもよい。精製の方法は特に限定されず、常法に従
い溶剤による分画や、クロマトグラフィー等を適宜組み
合わせて行えばよい。

【００５１】こうして得られる本発明のリン脂質は医薬
品、食品、化粧品等の形態で投与することも可能であ
る。例えばリン脂質の生理効果を訴求する医薬品形態で
用いる場合であれば、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、散剤
等の固形製剤、或いはシロップ剤等の液状製剤として経
口投与することができる。また、経口投与剤でなくと
も、注射剤、皮膚外用剤、直腸投与剤等非経口形態で投
与することも可能である。

【００５２】各製剤の製造時には、乳糖、澱粉、結晶セ
ルロース、乳酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグ
ネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤、白糖、ヒドロキシプ
ロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、
カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ースカルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウ
ム、タルク等の滑沢剤やその他医薬的に許容される成分
を適宜使用すればよい。

【００５３】また、同様の生理効果を期待して食品形態
で用いる場合には、本発明の方法により得られたリン脂
質をそのまま或いは適宜精製処理したものを油脂、錠
菓、発酵乳、飴、調味料、ふりかけ等の飲食品に添加
し、常法を用いて製造すればよい。

【００５４】これら医薬品、食品等の形態での使用に際
しては、本発明の方法により得られたリン脂質を適宜配
合することができる。また、リン脂質の生理効果を訴求
する場合であれば、その効果を得られかつ過剰摂取等の
問題が生じない程度の量を配合すればよい。例えば、リ
ン脂質としてホスファチジルセリンを生成させた場合に
は、５０ｍｇ〜１０００ｍｇ／日程度の摂取が見込まれ
る量を適宜配合しておけばよいのである。

【００５５】更に、本発明のリン脂質は乳化剤として用
いてもよく、その際には、医薬品、食品、化粧品等へ
０．０１〜１０％添加するのが好ましい。

【００５６】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００５７】実施例１（基本） 大豆レシチンとココアバターとの混合物（NATHIN 250、
セントラルソーヤ社製）１００ｇに６．７ＭのＬ−セリ
ン水溶液（０．１８Ｍ塩化カルシウム添加或いは非添
加）９７ｇを自動乳鉢（ANM−150型）を用いて練り込み
（均質化して）５５℃にて保温した。更に、ストレプト
マイセス属放線菌由来のホスホリパーゼＤ−Ｙ１（ＰＬ
Ｄ−Ｙ１、（株）ヤクルト本社製）８００ unitsを含む
酵素液２．０ｍＬを混合し、自動乳鉢を用いて練り込ん
で均質化し、反応を開始し、攪拌しながら１７時間５５
℃に保ちホスファチジル基転移反応を完了させた。

【００５８】得られた反応物をシリカゲル薄層クロマト
グラフィーにて分析したところ、0.18Ｍ塩化カルシウム
添加の場合、全リン脂質中の４７．９％がホスファチジ
ルセリンに変換されていた。一方、塩化カルシウム非添
加の場合でも全リン脂質中の４４．５％はホスファチジ
ルセリンに変換されており、この反応系においてカルシ
ウムを添加しなくともホスファチジル基転移反応が進行
することが明らかとなった。また、反応開始前の均質化
物を直交ニコルのもとで顕微鏡観察したところ、「主と
して相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」が
観察された。

【００５９】以上のように、本発明は有機溶媒を用いず
にホスファチジル基転移反応を行なう方法を提供するも
のである。すなわち、リン脂質に水酸基を持つ受容体と
ホスホリパーゼＤを含む水溶液を均質化して反応させる
ことにより、効率よくホスファチジル基転移反応物を作
ることが可能である。

【００６０】この際に有機溶媒は一切添加する必要はな
いが、リン脂質に有機溶媒以外の脂溶性物質、例えば、
サフラワー油、大豆油、コーン油、菜種油、綿実油、ひ
まわり油、紅花油、ごま油、オリーブ油、亜麻仁油、エ
ゴマ油、カカオバター、やし油等の植物油、或いは、バ
ター油、魚油、ラード、牛脂等の動物油、或いは中鎖脂
肪酸を出発材料として合成されたグリセリド誘導体等で
あるＭＣＴなどの食用油脂を添加することにより、操作
性を向上させることは可能である。

【００６１】実施例２（カルシウムの添加の有無） 実施例１で示された通り、カルシウムを添加しなくとも
ホスファチジル基転移反応が進行することが明らかとな
ったが、カルシウムの添加の有無を再度検証した。リン
脂質に対するセリンのモル比を１又は５とし、表１に示
すような、カルシウム添加、非添加の条件にて各成分を
混合し、マイクロスパーテルを用いて練り込んで均質化
して、５５℃で１８時間の反応を行った。尚、モル比１
は２．５Ｍのセリン水溶液、モル比５は４．５Ｍのセリ
ン水溶液を使用した。具体的には、NATHIN 250とセリン
水溶液（カルシウム添加の場合はセリン水溶液に溶解）
を混合後、ＰＬＤ−Ｙ１水溶液を添加して反応を開始し
た。

【００６２】反応生成物の量を実施例１と同様に測定し
た。表２に示す通り、カルシウム非添加の場合、ＰＳ生
成率は添加した場合に比べやや少なかったもののほぼ同
等の値が得られた。また、反応開始前の均質化物をそれ
ぞれ直交ニコルのもとで顕微鏡観察したところ、いずれ
も「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶
構造」が観察された。なお、表において、ＰＡはホスフ
ァチジン酸、ＰＥはホスファチジルエタノールアミン、
ＰＩはホスファチジルイノシトールを示す。

【００６３】

【表１】

【００６４】

【表２】

【００６５】以上のことから、本発明においては、カル
シウム添加の有無に関わらず、良い収率を得られること
が判明した。このことから、本発明の方法では、有機溶
媒を用いたホスファチジル基転移反応で多くの場合用い
られていた、反応系中へのカルシウム添加を必要としな
いことが判った。

【００６６】実施例３（トリグリセリドを含まないリン
脂質を基質とした時の反応） NATHIN 250（セントラルソーヤ社製) ５０ｇに特級アセ
トン５００mLを加え、６０℃に加温して溶解後、１５℃
に冷却した。生じた沈殿に特級アセトン３００mLを加
え、６０℃に加温して溶解後、１５℃に冷却することに
より、トリグリセリドを全く含まずリン脂質のみから成
る沈殿物を得た。この沈殿物の乾燥品（NATHIN 250 ア
セトン沈殿物と称す）６ｇに４．５MのＬ−セリン水溶
液（0.18Ｍ塩化カルシウム添加或いは非添加）５．８ｇ
を練り込んで均質化し５５℃にて保温した。更に、ホス
ホリパーゼＤ Ｙ-1（（株）ヤクルト本社製）４９．３u
nitsを含む酵素液０．２mLを混合し、マイクロスパーテ
ルを用いて練り込んで均質化して反応を開始し、１７時
間５５℃に保ちホスファチジル基転移反応を完了させ
た。

【００６７】得られた反応物をシリカゲル薄層クロマト
グラフィーにて分析したところ、０．１８Ｍ塩化カルシ
ウム添加の場合、全リン脂質中の４１．７％がホスファ
チジルセリンに変換されていた。一方、塩化カルシウム
非添加の場合でも全リン脂質中の３５．１％はホスファ
チジルセリンに変換されていた。また、反応開始前の均
質化物を直交ニコルのもとで顕微鏡観察したところ、
「主として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構
造」が観察された。表３は基質組成を、表４はアセトン
沈殿物を基質に用いたＰＳ転移反応の結果を示す。

【００６８】

【表３】

【００６９】

【表４】

【００７０】実施例４ NATHIN 250 アセトン沈殿物にＭＣＴ（パナセート810；
グリセリン脂肪酸エステル、日本油脂（株）製）を重量
比で１〜９％練り込んだ混合物を原料リン脂質として、
NATHIN 250 アセトン沈殿物 ５００ mgに対してセリン
２００mgと、水２００μＬ（リン脂質と水の重量比０．
４）を更に練り込み、ＰＬＤ-Ｙ１水溶液（４．１units
/１５μＬ）を加え、マイクロスパーテルを用いて練り
込んで均質化して５５℃ １７時間反応させた。反応終
了後のホスファチジルセリンをシリカゲル薄層クロマト
グラフィーにより測定した。

【００７１】図１はＭＣＴの最適添加量を検討した結果
を示す線図である。図１に示す通りに、ＭＣＴを５０mg
（リン脂質に対して９％）添加することにより、無添加
の場合に比べてＰＳ生成率が３４．７％から４０．４％
に増加し、ＭＣＴの添加効果が認められた。ＭＣＴの混
合比を１０％〜４０％にして同様に反応させた。図２は
ＭＣＴの最適添加量を検討した結果を示すグラフであ
る。図２に示すように１０％〜４０％のＭＣＴを添加し
た全ての場合にＰＳ産生率が向上した。図１及び図２か
ら、ＭＣＴの添加量は９％〜４０％が好ましい範囲と考
えられた。また、反応開始前の均質化物それぞれを直交
ニコルのもとで顕微鏡観察したところ、いずれも「主と
して相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」が
観察された。

【００７２】実施例５（リン脂質に対するセリンのモル
比） ５００ｍｇのNATHIN 250に２．５Ｍセリン水溶液（０．
１８Ｍ塩化カルシウム含有）をリン脂質に対するセリン
のモル比が０．１〜１５となるように加え、６０℃の水
浴中で温めながらミキサーで攪拌混合した。水浴の温度
を５５℃に下げた後に、反応基質にＰＬＤ−Ｙ１水溶液
を加え、マイクロスパーテル又はバイブロミキサーで混
合、均質化した。５５℃で１７時間反応し、反応物のリ
ン脂質組成をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより
分析した。

【００７３】図３に示すようにリン脂質に対するセリン
のモル比が０．３以上の時には反応生成物中のＰＳ含量
は２０％以上であり、ＰＳの製造に適した条件であるこ
とがわかった。特にモル比が４以上の場合はＰＳ含量が
４５％以上であり、特に適した基質組成と考えられる。
ただし、モル比が１０以上の場合、セリン量を増加させ
てもＰＳ生成量は向上せず、モル比１０までが効率的に
ホスファチジルセリンを製造するうえでの上限と考えら
れた。また、反応開始前の均質化物（モル比０．３〜１
０のもの）を直交ニコルのもとで顕微鏡観察したとこ
ろ、いずれも「主として相分離のないラメラ型リオトロ
ピック液晶構造」が観察された。

【００７４】なお、セリンのモル比が６以上の場合に
は、添加する水分量はリン脂質に対して１００重量部以
上となったが、加えた水分のうち分離したものをデカン
テーションにより除いたところ、実際の均質化物中の水
分量は１００重量部以下であった（カールフィッシャー
法により測定）。

【００７５】実施例６（リン脂質に対する水の重量比） 大豆レシチン （NATHIN 250 アセトン沈殿物又はPC80：
クロクラーン社製）或いは卵黄レシチン（ＰＬ−１００
ＬＥ：キューピー（株）製）５００mgにL-セリン粉末２
００ mgを加え、約６０℃に加温した乳鉢で良く混合し
た後、図４〜６に示した水分含量で蒸留水を練り込み、
５５℃にて保温した。更に、ＰＬＤ-Ｙ１（（株）ヤク
ルト本社製）４．１ unitsを含む酵素液０．０１５mLを
混合してマイクロスパーテルを用いて練り込んで均質化
し、反応を開始し、静置状態で１７時間５５℃に保ちホ
スファチジル基転移反応を完了させた。なお、均質化物
中の水分含量はカールフィッシャー法により測定した。

【００７６】得られた反応物をシリカゲル薄層クロマト
グラフィーにて分析し、横軸を水／大豆レシチン重量％
（対数目盛り）、縦軸を反応生成物のＰＳ含量（％）と
して図示した。図４〜６はその結果を示す線図である。

【００７７】図４に示すように、NATHIN 250 アセトン
沈殿物を原料リン脂質に用いた場合には、均質化物中の
水／リン脂質重量％が３％の時にはＰＳは全く産生しな
いが、１０％〜１００％の範囲ではリン脂質の１０％以
上がＰＳに変換されており、ＰＳの産生に適した水／リ
ン脂質重量％であることがわかった。なお、水／リン脂
質重量％が２０％〜７０％の範囲ではリン脂質の３０％
以上がＰＳに変換されており、ＰＳの産生に最も適した
水／リン脂質重量比であることがわかった。各均質化物
を直交ニコルのもとで顕微鏡観察した結果、ＰＳの産生
に適した水／リン脂質重量％である１０％〜１００％の
範囲では、「主として相分離のないラメラ型リオトロピ
ック液晶構造」が観察されることが確認された。

【００７８】図５に示すように、ＰＣ８０を原料リン脂
質に用いた場合には、均質化物中の水／リン脂質重量％
が８％の時にはＰＳはほとんど産生しないが、１０％〜
６０％の範囲ではリン脂質の１０％以上がＰＳに変換さ
れており、ＰＳの産生に適した水／リン脂質重量％であ
ることがわかった。なお、水／リン脂質重量％が２０％
〜４０％の範囲ではリン脂質の２０％以上がＰＳに変換
されており、ＰＳの産生に最も適した水／リン脂質重量
比であることがわかった。各均質化物を直交ニコルのも
とで顕微鏡観察した結果、ＰＳの産生に適した水／リン
脂質重量％である１０％〜６０％の範囲では、「主とし
て相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」が観
察されることが確認された。

【００７９】図６に示すように、卵黄レシチンを原料リ
ン脂質に用いた場合には、均質化物中の水／リン脂質重
量％が８％の時にはＰＳはほとんど産生しないが、１５
％〜４０％の範囲ではリン脂質の１０％以上がＰＳに変
換されており、ＰＳの産生に適した水／リン脂質重量％
であることがわかった。なお、水／リン脂質重量％が２
０％〜３５％の範囲ではリン脂質の２０％以上がＰＳに
変換されており、ＰＳの産生に最も適した水／リン脂質
重量比であることがわかった。各均質化物を直交ニコル
のもとで顕微鏡観察した結果、ＰＳの産生に適した水／
リン脂質重量％である１５％〜４０％の範囲では、「主
として相分離のないラメラ型リオトロピック液晶構造」
が観察されることが確認された。

【００８０】実施例７（ＰＳ以外） ６０℃にした水浴下で、５００mgのPC80に表５に記載し
た各受容体水溶液 ４９０ mg を混合し、１３．７units
のＰＬＤ（ＰＬＤ-Ｙ１）水溶液５０μL を添加し、マ
イクロスパーテルを用いて練り込んで均質化後、５５℃
１８時間反応し、ホスファチジル基転移反応物の生成を
シリカゲル薄層クロマトグラフィーにより調べた。

【００８１】

【表５】

【００８２】表５は各受容体での転移反応後の転移反応
物の生成率を示す。表５に示す通り、受容体としてグリ
セロール、L-アスコルビン酸、グルコースを用いた時に
は、それぞれに対するホスファチジル基転移反応物が生
成した（ホスファチジルグリセロール４２．７％、ホス
ファチジルアスコルビン酸９．４％、ホスファチジルグ
ルコース１３．３％）。一方、イノシトール、アスコル
ビン酸リン酸エステル、トレハロースを用いた場合には
ホスファチジル基転移反応物は生成しなかった。

【００８３】実施例８（反応温度） NATHIN 250 アセトン沈殿物（ＰＬ） ５００mg、或いは
NATHIN 250 アセトン沈殿物 ４５０mgにＭＣＴ５０mgを
加えて調製したリン脂質基質（ＰＬ＋ＴＧ）に４．５Ｍ
セリン水溶液を４９０mg 添加して６０℃で練り込み、
更に４．１units のＰＬＤ−Ｙ１水溶液１５μＬ添加
後、マイクロスパーテルを用いて練り込んで均質化し
て、１５℃〜６５℃まで１０℃刻みの温度で１８時間反
応させた。ホスファチジル基転移反応物の生成はシリカ
ゲル薄層クロマトグラフィーにより解析した。

【００８４】図７は各反応温度におけるＰＳ生成率を示
す線図である。図７に示す通り、NATHIN 250 アセトン
沈殿物にＭＣＴを添加したものを基質に用いた場合に
は、４５℃でのＰＳ生成率は４３％でありそれ以上温度
を上げても変化なかった。

【００８５】一方、NATHIN 250アセトン沈殿物を基質に
用いた場合には４５℃でのＰＳ生成率は３０．１％であ
ったのに対し、６５℃では３８．７％であり、反応温度
が高いほど好成績が得られた。尚、反応温度が６５℃を
越えるとＰＳ産生量が低下するのに加えて、リン脂質が
変性・分解するおそれもあるので、６５℃が上限と考え
られた。

【００８６】実施例９（芽キャベツＰＬＤ） 滝と松本の総説（蛋白質 核酸 酵素, Vol.31, p.553-55
8,1986）に従って、芽キャベツを材料にホスホリパーゼ
Ｄを調製した結果、粗酵素１ｍｇ当たり約０．０３ uni
tsの酵素標品が得られた。５００ mgのNATHIN 250 に
４．５Ｍセリン水溶液（カルシウム添加の系では塩化カ
ルシウム ９．３mgを添加）を490 mg加え５５℃で混合
した。反応液の温度を４５℃に冷ましてから、上記の芽
キャベツＰＬＤの酵素液（0.6 units／mL）を200μL 添
加し、４５℃で１８時間反応させた。

【００８７】その結果、カルシウムを添加しなかった場
合、反応はほとんど進行しなかったの対して、カルシウ
ムを加えた場合には進行しＰＳ含量６．２％の反応生成
物が得られた。

【発明の効果】本発明は以上説明した通り、ホスホリパ
ーゼＤを用いたリン脂質の製造を行う場合に、有機溶媒
やカルシウムを用いることなく、簡便かつ高収率に目的
とするリン脂質を得ることができるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＭＣＴの最適添加量を検討した結果を示す線図
である。

【図２】ＭＣＴの最適添加量を検討した結果を示すグラ
フである。

【図３】均質化物中のリン脂質に対するセリンのモル比
を検証した結果を示す線図である。

【図４】均質化物中のリン脂質に対する水の重量比を検
証した結果を示す線図である。

【図５】均質化物中のリン脂質に対する水の重量比を検
証した結果を示す線図である。

【図６】均質化物中のリン脂質に対する水の重量比を検
証した結果を示す線図である。

【図７】各反応温度におけるＰＳ生成率を示す線図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大和矢 秀行 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 工藤 聰 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 Ｆターム(参考） 4B064 AE63 CA21 CB27 CC03 CC05 CC06 CC09 CD06 CD08 CD09 CD13 CD21 CD22 DA01 DA10 DA16

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ホスファチジル基転移反応を利用してリ
   ン脂質を製造する方法において、 原料リン脂質と、水酸基を有する受容体と、ホスホリパ
   ーゼＤと、水とを、有機溶媒を使用せずに均質化する均
   質化工程と、 得られた均質化物を１５℃〜６５℃で反応させる反応工
   程とを備えたことを特徴とするリン脂質の製造法。
2. 【請求項２】 前記均質化工程において得られる均質化
   物が、主としてラメラ型リオトロピック液晶構造を有す
   るものであることを特徴とする請求項１記載のリン脂質
   の製造法。
3. 【請求項３】 前記均質化工程において得られる均質化
   物中の水分含量が、原料リン脂質に対し、１０重量％〜
   １００重量％であることを特徴とする請求項１又は２記
   載のリン脂質の製造法。
4. 【請求項４】 前記均質化工程における水酸基を有する
   受容体の添加量が、原料リン脂質１モルに対して、０．
   ３モル〜１０モルであることを特徴とする請求項１〜３
   の何れかに記載のリン脂質の製造法。
5. 【請求項５】 前記水酸基を有する受容体が、セリン、
   グリセロール、Ｌ−アスコルビン酸、グルコース、及び
   コリンから選ばれる１種又は２種以上であることを特徴
   とする請求項１〜４の何れかに記載のリン脂質の製造
   法。
6. 【請求項６】 前記水酸基を有する受容体が、セリンで
   あり、生成するリン脂質がホスファチジルセリンである
   ことを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載のリン脂
   質の製造法。
7. 【請求項７】 前記均質化工程における均質化時に、更
   に食用油脂を添加することを特徴とする請求項１〜６の
   何れかに記載のリン脂質の製造法。