ES2328014T3 - Procedimiento para la produccion de fosfolipidos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la producción de un fosfolípido por transfosfatidilación, que comprende las etapas que consisten en: - mezclar un fosfolípido de materia prima, un aceptor que contiene hidroxilo, fosfolipasa D y agua en ausencia de un disolvente orgánico, para obtener una mezcla, siendo dicho aceptor que contiene hidroxilo una molécula que acepta un grupo fosfatidilo de dicho fosfolípido de materia prima en presencia de fosfolipasa D; - homogeneizar dicha mezcla en ausencia de un disolvente orgánico mediante la aplicación de una fuerza física para presentar una estructura cristalina líquida liotrópica laminar; y - someter dicha mezcla homogeneizada a una reacción de transfosfatidilación a una temperatura comprendida dentro del intervalo de 15ºC a 65ºC.
Description
Procedimiento para la producción de
fosfolípidos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción de un fosfolípido utilizando la
transfosfatidilación (reacciones de intercambio de bases de
fosfolípidos).
Los fosfolípidos, tales como fosfatidilserinas
(PS) y fosfatidilgliceroles (PG), tienen cada uno sus funciones
fisiológicas o biológicas útiles y unas propiedades físicas
específicas, y se utilizan, por ejemplo, en preparaciones
farmacéuticas, materiales alimenticios y agentes emulsionantes. Por
ejemplo, las fosfatidilserinas son prometedoras como fármacos para
profilaxis y/o terapia de la demencia senil y la dismnesia (desorden
de la memoria), los fosfatidilgliceroles son prometedores como
agentes emulsionantes y los ácidos fosfatidilascórbicos son
prometedores como agentes emulsionantes e inhibidores de
lipoperóxidos.
Convencionalmente, estos fosfolípidos han sido
preparados por síntesis química o por transfosfatidilación
utilizando fosfolipasa D. Entre estos métodos de producción, los
métodos enzimáticos pueden producir de forma relativamente sencilla
fosfolípidos con un coste relativamente bajo, y son ampliamente
utilizados.
Los métodos para la producción de los
fosfolípidos objetivo por transfosfatidilación (reacciones de
intercambio de bases de fosfolípidos) se conocen desde hace mucho
tiempo (Yang, S.F. et al, J. Biol. Chem., 242, p. 477,
1967). Por ejemplo, Kokusho et al dan a conocer que se
obtiene un producto de reacción que contiene fosfatidilserina
mediante una reacción bifásica en la que la fosfolipasa D se deja
actuar sobre una mezcla de una solución de fosfatidilcolina de yema
de huevo en isopropiléter con una solución acuosa de
L-serina que contiene cloruro de calcio (Agric.
Biol. Chem., 51, p. 2515, 1987). Generalmente, se cree que un
sistema de reacción en una reacción bifásica de este tipo comprende
dos fases, una fase oleica que contiene un fosfolípido y una fase
acuosa que contiene un aceptor, y que la transfosfatidilación tiene
lugar en la interfase entre dichas dos fases.
La patente japonesa 2.942.302 describe una
reacción homogénea en la que una preparación de fosfolípido que
contiene aproximadamente un 85% de fosfatidilcolina preparada por
fraccionamiento de lecitina de soja se disuelve en acetato de
etilo, la solución resultante se mezcla con una solución acuosa de
ácido ascórbico con el fin de obtener una mezcla, y dicha mezcla se
hace reaccionar con fosfolipasa D con el fin de obtener un producto
de reacción que contiene ascorbato de fosfatidilo.
Sin embargo, la reacción bifásica se debe llevar
a cabo en presencia de disolventes (un disolvente orgánico y agua)
en una proporción de cinco veces o más (volumen/peso) la cantidad de
fosfolípido, por lo que la misma requiere un reactor con una
capacidad volumétrica seis veces mayor que la cantidad de
fosfolípido. Además, el calcio añadido con el fin de acelerar la
reacción forma rápidamente una sal con el fosfolípido. La sal de
calcio formada pertenece a la categoría de sustancias sintetizadas
químicamente en Japón y Europa, resultando así la utilización en los
alimentos de dicho producto difícil.
En la reacción homogénea (reacción monofásica),
el sistema de reacción contiene grandes cantidades de agua y da
lugar a un ácido fosfatídico como subproducto debido a la actividad
hidrolítica de la fosfolipasa D durante una reacción continua,
volviéndose difícil la separación y purificación del fosfolípido
objetivo. Además, la proporción de aceptor con respecto a los
fosfolípidos está limitada en la reacción homogénea, estando
limitada por ello la cantidad de producción del producto de reacción
objetivo (fosfolípido).
Una patente concedida a Fujita et al
(JP-B-7-016426)
describe la preparación de fosfatidilserina, fosfatidilglicerol
et al mediante una reacción de micela inversa, en la que una
fase acuosa que contiene cloruro de calcio, un aceptor que contiene
hidroxilo y fosfolipasa D, y estando encapsulada en una micela
inversa, se hace reaccionar con una solución de fosfolípido de
materia prima en un disolvente orgánico (diisopropil éter,
isooctano, ciclohexano, benceno,
cloroformo-isooctano, n-hexano o
diclorometano-isooctano).
En la publicación de patente japonesa, Fujita
et al describen que la reacción de micela inversa requiere
únicamente una pequeña cantidad de agua y, en consecuencia, eliminan
la formación de ácidos fosfatídicos, el problema del método
anterior. Sin embargo, el método en cuestión produce
insuficientemente el fosfolípido objetivo, en un rendimiento máximo
de aproximadamente el 20%, exige operaciones complicadas tales como
tratamiento ultrasónico y, en consecuencia, presenta problemas de
operabilidad y de coste. El método también requiere una cantidad de
disolvente orgánico 10 veces (volumen/peso) mayor que el fosfolípido
y exige la utilización de un reactor con una capacidad muchas veces
mayor que la cantidad de fosfolípido.
En la patente WO 00/77183 se da asimismo a
conocer un procedimiento para la preparación enzimática de
fosfolípidos en ausencia de disolventes orgánicos.
\newpage
Estas reacciones convencionales de
transfosfatidilación deben ser llevadas a cabo en un sistema de
reacción que contiene un disolvente orgánico. Sin embargo, cuando
los fosfolípidos resultantes se utilizan, por ejemplo, en
preparaciones alimenticias y farmacéuticas, el disolvente orgánico
no puede permanecer en dichos productos y debe ser eliminado
completamente. En consecuencia, las etapas de su procedimiento de
preparación exigen equipos para la eliminación del disolvente
orgánico, lo que supone desventajas, por ejemplo, en operabilidad y
coste. Particularmente, dichos disolventes orgánicos no pueden ser
utilizados sustancialmente en las reacciones en base a la ley de
saneamiento de alimentos cuando los productos se utilizan en la
preparación de alimentos.
En consecuencia, se ha producido una demanda de
procedimientos para la producción de fosfolípidos sin la utilización
de disolventes orgánicos y/o sales de calcio. Sin embargo, el
experto en la materia cree generalmente que una reacción no se
desarrolla sin problemas sin la utilización de disolventes orgánicos
y que, en consecuencia, el rendimiento del fosfolípido objetivo y
la operabilidad decrecerán, dado que los fosfolípidos materiales,
tales como las fosfatidilcolinas, son solubles en aceite.
\vskip1.000000\baselineskip
En consecuencia, un objetivo de la presente
invención consiste en dar a conocer un procedimiento para la
producción de fosfolípidos por transfosfatidilación utilizando
fosfolipasa D, que puede dar lugar fácilmente al fosfolípido
objetivo con un rendimiento elevado sin utilizar disolventes
orgánicos y/o calcio.
De este modo, según la presente invención, el
objetivo anterior se puede alcanzar mediante un procedimiento para
la producción de fosfolípidos mediante transfosfatidilación, que
comprende las etapas siguientes:
- -
- mezclar un fosfolípido de materia prima, un aceptor que contiene hidroxilo, fosfolipasa D y agua en ausencia de disolvente orgánico con el fin de obtener una mezcla, siendo dicho aceptor que contiene hidroxilo una molécula que acepta un grupo fosfatidilo de dicho fosfolípido de materia prima en presencia de fosfolipasa D;
- -
- homogeneizar dicha mezcla en ausencia de un disolvente orgánico mediante la aplicación de una fuerza física con el fin de obtener una estructura de cristal líquido liotrópico laminar; y
- -
- someter la mezcla homogeneizada a una reacción de transfosfatidilación a una temperatura comprendida entre 15ºC y 65ºC.
En el procedimiento según la presente invención,
los cuatro componentes, el fosfolípido de materia prima, el aceptor
que contiene hidroxilo, la fosfolipasa D y el agua, se mezclan
suficientemente, y la mezcla resultante se homogeneiza
adicionalmente. Se supone que la mezcla homogeneizada presenta una
estructura de cristal líquido liotrópico laminar. El término
"cristal líquido liotrópico laminar" se refiere a un cristal
líquido de una membrana bicapa de fosfolípido formada añadiendo
agua a un fosfolípido. En la presente invención, se supone que la
mezcla homogeneizada presenta una estructura ordenada que contiene
la membrana bicapa (a veces una estructura de membrana de capa
polimolecular) y una capa acuosa ordenadas alternadamente de forma
continua. La estructura de cristal líquido liotrópico laminar se
puede identificar, por ejemplo, por observación microscópica de la
mezcla homogeneizada en nicoles cruzados.
Así, una "estructura de cristal líquido
liotrópico laminar sustancialmente sin separación de fases",
mencionada a continuación, y una "estructura de cristal líquido
liotrópico laminar con separación de fases" se consideran como
una estructura laminar continua y como una estructura de anillo
cerrado suspendida en una fase acuosa, respectivamente.
La estructura de cristal líquido liotrópico
laminar se genera del siguiente modo. Esto es, añadiendo agua al
fosfolípido de materia prima en el procedimiento de homogeneización,
la interacción entre los grupos hidrofílicos en el fosfolípido se
debilita y su estructura cristalina se desintegra, formando un
cristal líquido laminar. Debido a la formación de la estructura de
cristal líquido liotrópico laminar, el agua se puede desplazar
libremente entre las capas de la estructura laminar del
fosfolípido, haciéndose eficiente el suministro del aceptor y/o la
enzima y la eliminación de las cabezas polares liberadas del
fosfolípido, permitiéndose de este modo una reacción de
transfosfatidilación.
Con el fin de aumentar el rendimiento del
producto de reacción, toda la mezcla homogeneizada debe presentar
la estructura de cristal líquido liotrópico laminar. Con este
propósito, los componentes individuales deben ser homogeneizados
además de simplemente mezclados. En otras palabras, toda la mezcla
homogeneizada presenta preferentemente la estructura de cristal
líquido liotrópico laminar (es decir, la mezcla presenta
sustancialmente la estructura de cristal líquido liotrópico
laminar) como resultado de la homogeneización para un rendimiento
más elevado del producto de reacción.
El contenido en agua en la mezcla homogeneizada
afecta a la formación de la estructura de cristal líquido
liotrópico laminar. Si el contenido en agua está comprendido dentro
de un intervalo específico (por ejemplo, de aproximadamente 10% en
peso a aproximadamente 100% en peso relativos a la cantidad de
fosfolípido de soja), la mezcla homogeneizada presentará un cristal
líquido (nítido) laminar sustancialmente sin separación de fases.
Sin embargo, si el contenido en agua es excesivamente más elevado
que dicho intervalo específico, la mezcla homogeneizada puede
sufrir separación de fases, formando dos fases que contienen un
líquido y un cristal líquido. En el procedimiento según la presente
invención, la reacción se lleva a cabo preferentemente mientras la
mezcla homogeneizada no presenta separación de fases o no presenta
sustancialmente separación de fases (en adelante, se hace
referencia a ambos casos como "estructura de cristal líquido
liotrópico laminar sustancialmente sin separación de fases")
para una actividad de transferencia mayor.
En cambio, en una mezcla homogeneizada que
contiene una cantidad excesivamente elevada de agua, lo que provoca
la separación de fases (una estructura de cristal líquido liotrópico
laminar con separación de fases), el cristal líquido puede
constituir gránulos pequeños discontinuos suspendidos en el
disolvente. En consecuencia, la eficacia de contacto entre el agua
y el fosfolípido disminuye, disminuyendo de este modo la actividad
de transferencia en comparación con el caso sin separación de
fases. Si el contenido en agua es excesivamente bajo, el
fosfolípido puede mantener su estructura cristalina, inhibiendo la
formación de una estructura de cristal líquido liotrópico laminar
en todo el fosfolípido, perdiéndose de este modo el campo para una
reacción enzimática. Alternativamente, la mezcla homogeneizada
puede tener una fluidez disminuida y, en consecuencia, presentar
una eficacia de contacto deteriorada entre el sustrato y la enzima,
por lo que la enzima no puede actuar eficientemente sobre dicho
sustrato.
En el procedimiento de homogeneización no se
utilizan disolventes orgánicos. Si se añade un disolvente orgánico
durante el procedimiento de homogeneización, se puede hacer aumentar
la separación de fases como en las reacciones bifásicas
convencionales (no una separación de fases en la estructura de
cristal líquido liotrópico laminar, sino una separación entre una
fase oleosa y una fase acuosa). Además, la adición de un disolvente
orgánico introduce diversas desventajas, tal como se ha descrito
anteriormente.
Los fosfolípidos de materia prima que se pueden
utilizar en la presente invención incluyen cualquier producto
natural con contenido en fosfolípidos, extractos o extractos
purificados de dichos productos naturales, así como fosfolípidos
sintéticos. Los ejemplos de fosfolípidos incluyen, sin limitarse a
los mismos, lecitina de soja, lecitina de semillas de nabina,
lecitina de yema de huevo, lecitina de maíz, lecitina de algodón,
productos purificados de estas lecitinas, fosfatidilcolinas (en
adelante, abreviadas como "PC"), fosfatidiletanolaminas (en
adelante, abreviadas como "PE") y mezclas de dichas sustancias.
De entre las mismas, resultan preferidas por su disponibilidad y
coste la lecitina de soja, la lecitina de semillas de nabina, la
lecitina de yema de huevo y productos purificados de dichas
lecitinas.
Los aceptores que contienen hidroxilo para su
utilización en la presente invención no están particularmente
limitados, siempre y cuando puedan recibir o aceptar un grupo
fosfatidilo del fosfolípido de materia prima en presencia de
fosfolipasa D. Dichos aceptores que contienen hidroxilo incluyen,
por ejemplo, serina, glicerol, ácido L-ascórbico,
glucosa, colina, etanolamina,
1-amino-2-propanol y
1-o-metil-glicósido.
De entre los mismos, resultan preferentes la serina, la colina, el
ácido L-ascórbico, la glucosa y el glicerol para un
mayor rendimiento del producto objetivo, siendo típicamente
preferidos entre los mismos la serina y el glicerol.
Las fosfolipasas D (en adelante, abreviadas como
"PLD") para su utilización en la presente invención no están
particularmente limitadas, siempre y cuando presenten actividad de
transfosfatidilación, y las mismas incluyen, por ejemplo, PLD
libres o químicamente modificadas, y enzimas inmovilizadas sobre un
portador, tal como resinas de intercambio iónico y gel de sílice.
De entre las mismas, resultan preferidas las PLD libres para un
mayor rendimiento del producto de reacción.
Más específicamente, se puede utilizar
ventajosamente cualquiera de las PLD derivadas de plantas o
vegetales, tales como col y zanahoria, PLD derivadas de
microorganismos, tales como micobacterias, bacterias, levaduras y
hongos (mohos), y PLD derivadas de animales. Las mismas pueden ser
productos preparados de acuerdo con un procedimiento convencional o
productos comercializados, tal como una PLD derivada de col (por
ejemplo, Product Number P 7758, Sigma Chemical Company), una PLD
derivada de cacahuete (por ejemplo, Product Number P 0515, Sigma
Chemical Company), y una PLD derivada de Streptomyces
chromofuscus.
Según la presente invención, el fosfolípido de
materia prima, el aceptor que contiene hidroxilo, la PLD y el agua
se mezclan inicialmente, y la mezcla resultante se somete
posteriormente a un procedimiento de homogeneización. En el presente
contexto, el procedimiento de homogeneización se refiere a una
dispersión homogénea de los cuatro componentes en la mezcla
mediante la aplicación de fuerza física, por ejemplo mediante
agitación física, tratamiento ultrasónico, etc. Más
específicamente, se pueden utilizar tratamientos de homogeneización
que utilizan un Vibromixer, un mortero automático, Homo Mixer,
Physcotron, procesador de alimentos o sonicador, individualmente o
combinados. Si la cantidad de la mezcla es pequeña, la misma se
puede amasar utilizando, por ejemplo, una microespátula. Los cuatro
componentes se pueden mezclar y homogeneizar en instantes separados
o simultáneamente. Por ejemplo, uno de los cuatro componentes se
pueden mezclar y homogeneizar junto con otro, y repetirse dicho
procedimiento. También resulta aceptable mezclar o disolver por
adelantado dos, tres o cuatro de los componentes y, a continuación,
homogeneizar definitivamente la mezcla o solución resultante.
Si el procedimiento de homogeneización no se
lleva a cabo en el método según la presente invención, el
rendimiento del fosfolípido objetivo disminuye significativamente.
Probablemente, esto se debe a las razones siguientes. El
fosfolípido de materia prima es generalmente una pasta dura a
temperatura ambiente, y la mezcla en su conjunto no puede tener una
estructura de cristal líquido liotrópico laminar simplemente
mezclando los otros componentes. En consecuencia, los componentes
individuales entran en contacto unos con otros con una frecuencia
más baja, disminuyendo de este modo el rendimiento del producto
objetivo. En consecuencia, la mezcla de los componentes se debe
someter a fuerza física hasta el punto de dispersar los componentes
individuales y se debe someter a un "procedimiento de
homogeneización".
El aceptor que contiene hidroxilo se puede
utilizar como una solución acuosa o como un polvo en el
procedimiento de homogeneización. La PLD se utiliza como solución
en una pequeña cantidad de agua o como polvo. En este
procedimiento, si los otros tres componentes (el fosfolípido de
materia prima, la PLD y el agua) distintos del aceptor se han
mezclado previamente, se produce ácido fosfatídico (en adelante,
designado "PA") como subproducto. En consecuencia, resulta
preferido mezclar previamente el fosfolípido de materia prima con el
aceptor, mezclando a continuación la mezcla resultante con los
otros componentes, o mezclar y homogeneizar los cuatro componentes
simultáneamente.
Tal como se ha descrito anteriormente, el
contenido de agua en el procedimiento de homogeneización afecta a
la separación de fases de la estructura de cristal líquido
liotrópico laminar y al rendimiento de fosfolípido como producto de
reacción, de tal modo que el mismo se debe preferentemente controlar
y ajustar con el fin de evitar la separación de fases. Aunque
depende del tipo de fosfolípido de materia prima, el contenido en
agua en la estructura de cristal líquido liotrópico laminar está
comprendido preferentemente entre el 10% en peso y el 100% en peso,
y más preferentemente entre el 20% en peso y el 60% en peso,
relativos a la cantidad de fosfolípido de materia prima, con el fin
de evitar sustancialmente la separación de fases. El término
"contenido de agua" en la estructura de cristal líquido
liotrópico laminar, tal como se utiliza en el presente documento,
se refiere a la cantidad de agua en la mezcla homogeneizada tras
eliminar el agua separada durante el procedimiento de
homogeneización, y la misma se puede determinar, por ejemplo,
mediante una técnica convencional de Karl Fischer. El agua separada
puede ser eliminada por decantación o por separación centrífuga, por
ejemplo, a 150 g durante aproximadamente 1 minuto.
No es necesariamente apropiado especificar una
cantidad preferida del aceptor, dado que varía en función del tipo
de aceptor. Para un mejor rendimiento del producto de reacción y una
mayor operabilidad, la cantidad está comprendida preferentemente
entre aproximadamente 0,3 moles y aproximadamente 10 moles, y más
preferentemente de aproximadamente 4 moles a aproximadamente 8
moles por 1 mol del fosfolípido de materia prima. Si se añade una
cantidad excesivamente grande (mayor de 10 moles) del aceptor, la
recuperación del aceptor no reaccionado puede requerir mayores
esfuerzos. En cambio, si la cantidad es excesivamente pequeña, el
rendimiento del producto objetivo puede disminuir.
Más específicamente, la cantidad de serina como
aceptor que contiene hidroxilo está comprendida preferentemente
entre 5% en peso y 150% en peso, y más preferentemente entre 50% en
peso y 100% en peso, relativos a la cantidad de fosfolípido de
materia prima. La cantidad de glicerol como aceptor que contiene
hidroxilo está preferentemente comprendida entre 10% en peso y 200%
en peso, y más preferentemente entre 20% en peso y 100% en peso.
La cantidad de PLD no está específicamente
limitada y puede ser determinada, por ejemplo, en función del tiempo
de reacción en la siguiente etapa de reacción, y generalmente está
comprendida entre aproximadamente 500 y 100.000 unidades por kg de
fosfolípido.
La temperatura en el procedimiento de
homogeneización no está específicamente limitada y está comprendida
preferentemente entre aproximadamente 15ºC y 65ºC. Si la temperatura
es inferior a 15ºC, enfriar el sistema de reacción puede requerir
energía adicional y la mezcla puede no homogeneizarse
suficientemente. Si la temperatura es mayor de 65ºC, el fosfolípido
se puede volver inestable.
Además de los componentes mencionados
anteriormente, se puede añadir un aceite y/o grasa comestible
durante el procedimiento de homogeneización dentro de intervalos
que no deterioren la estructura de cristal líquido liotrópico
laminar. Aunque la adición de dicho aceite y/o grasa comestible
aumenta la conversión de la estructura de cristal líquido
liotrópico laminar en un sistema bifásico como disolventes
orgánicos, una pequeña cantidad del aceite y/o grasa comestible
hace aumentar la fluidez de la mezcla homogeneizada, aumentando así
el rendimiento del fosfolípido objetivo. Dichos aceites y grasas
comestibles incluyen, sin limitarse a los mismos, aceite de
cártamo, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de semillas de
nabina, aceite de semillas de algodón, aceite de girasol, aceite de
cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de semilla de
cáñamo, aceite de perilla, aceite de teobroma (mantequilla de
coco), aceite de coco et al aceites vegetales; aceite de
mantequilla, aceite de pescado, manteca, sebo de vacuno et
al aceites animales; y triacilgliceroles de cadena mediana
(MCT). Cada uno de estos aceites y grasas se añade individualmente o
en combinación con el fosfolípido de materia prima con el fin de
conferir fluidez al mismo. Entre ellos, los MCT, el aceite de
teobroma y el aceite de soja resultan preferidos para mejorar
adicionalmente el rendimiento del producto objetivo.
Aunque depende del tipo de fosfolípido de
materia prima y el tipo de aceite y/o grasa comestible añadido, la
cantidad de aceite y/o grasa comestible es preferentemente inferior
o igual a una cantidad equivalente, y más preferentemente de 5% en
peso a 15% en peso relativo a la cantidad de fosfolípido de materia
prima.
Es posible añadir un disolvente orgánico tal
como hexano o éter con el mismo propósito, dentro de intervalos que
no deterioren la estructura de cristal líquido liotrópico laminar,
pero no resulta preferido, tal como se ha descrito
anteriormente.
\newpage
Algunas de las ventajas de la presente invención
se describen a continuación. Se han llevado a cabo reacciones
convencionales de transfosfatidilación según reacciones bifásicas,
reacciones de micela inversa y reacciones de fase homogénea. Las
reacciones bifásicas y las reacciones de micela inversa requieren
una cantidad de disolvente cinco o más veces mayor (volumen/peso)
que el fosfolípido con el fin de mantener sus sistemas de reacción.
En cambio, el procedimiento según la presente invención requiere
disolvente únicamente en una cantidad igual a la de fosfolípido y,
en consecuencia, puede utilizar un reactor con una capacidad menor
para la preparación del fosfolípido en la misma cantidad que en sus
equivalentes convencionales.
Las reacciones de fase homogénea requieren una
cantidad de disolvente dos o más veces mayor (volumen/peso) que la
de fosfolípido, y en consecuencia requieren un reactor con una
capacidad tres o más veces mayor (volumen/peso) que la cantidad de
fosfolípido. Además, la cantidad de aceptor está limitada con el fin
de mantener su fase homogénea, y resulta difícil obtener un
producto de reacción que contenga el compuesto objetivo en un
contenido elevado. Por ejemplo, con el fin de la producción de PS,
la cantidad de serina que se puede añadir a 1 kg del fosfolípido es
de 0,15 kg y el contenido en PS en los fosfolípidos productos de
reacción es, como mucho, del 35%. En cambio, de acuerdo con el
procedimiento según la presente invención, se puede añadir 1 kg de
serina o más a 1 kg del fosfolípido, pudiéndose obtener de este
modo productos de reacción que contienen 48% o más de PS en los
fosfolípidos. Específicamente, el procedimiento según la presente
invención puede reducir la capacidad del reactor para producir una
cantidad equivalente del fosfolípido objetivo y puede dar lugar a
productos de reacción que contienen compuesto objetivo en un
contenido elevado en comparación con las reacciones homogéneas.
Cada una de las reacciones convencionales de
transfosfatidilación se puede llevar a cabo en presencia de un
disolvente orgánico, tal como éter, tolueno,
n-hexano o acetato de etilo en su sistema de
reacción. Sin embargo, el procedimiento según la presente invención
no requiere disolventes orgánicos y, en consecuencia, resulta
ventajoso en la producción de fosfolípidos para alimentos y otras
sustancias en las que está restringida la utilización de
disolventes orgánicos. Además, según la presente invención, la
reacción tiene lugar incluso sin la adición de iones calcio, a
diferencia de los métodos convencionales. Aunque no se ha
establecido de forma clara, esto se debe probablemente a que la
reacción se lleva a cabo en un cristal líquido según la presente
invención y, en consecuencia, el fosfolípido de materia prima
resulta estructuralmente susceptible a reacciones de
transfosfatidilación, independientemente de la presencia o ausencia
de ion calcio. En cambio, la reacción bifásica convencional se
lleva a cabo en un líquido.
Según la presente invención, la mezcla
homogeneizada obtenida de este modo se somete a una reacción de
transfosfatidilación en ausencia de un disolvente orgánico con el
fin de obtener el fosfolípido objetivo. La reacción se lleva a cabo
a una temperatura comprendida preferentemente dentro del intervalo
de 15ºC a 65ºC, y más preferentemente de 45ºC a 55ºC. Si la
temperatura de reacción es menor de 15ºC, puede no facilitarse el
desarrollo de la reacción, disminuyendo de este modo el rendimiento
de fosfolípido objetivo. Si la temperatura de reacción es mayor de
65ºC, pueden tener lugar reacciones secundarias del fosfolípido,
tales como descomposición y/u oxidación de la fosfatidilserina
producida.
El tiempo de reacción no está particularmente
limitado y se puede seleccionar apropiadamente en función de la
temperatura de reacción y los tipos y cantidades de los componentes,
y está comprendido preferentemente entre aproximadamente entre 1 y
48 horas para un mejor rendimiento del fosfolípido objetivo y una
menor aparición del subproducto de PA.
La reacción de transfosfatidilación se puede
llevar a cabo dejándola en reposo o con agitación. Por ejemplo, la
reacción se puede llevar a cabo con agitación utilizando un
mezclador universal de sobremesa (por ejemplo, KINMIX MAJOR (marca
registrada), modelo KM-230).
En la producción de fosfolípidos según el
procedimiento de la presente invención, se forma una estructura de
cristal líquido laminar sin separación de fases enteramente en la
mezcla homogeneizada mezclando una cantidad apropiada de agua con
el fosfolípido de materia prima, y el agua se puede desplazar
libremente entre las capas de la estructura laminar del
fosfolípido, suministrándose de este modo eficientemente el aceptor
que contiene hidroxilo y/o la enzima, además de eliminar
eficientemente las cabezas polares liberadas del fosfolípido. En
consecuencia, es posible alcanzar la reacción de
transfosfatidilación en una actividad elevada, y el fosfolípido
objetivo se puede obtener fácilmente con un rendimiento elevado y un
coste bajo.
Los fosfolípidos obtenidos según el
procedimiento de la presente invención pueden contener impurezas
derivadas del fosfolípido de materia prima y el aceptor, y otras
sustancias además del subproducto PA. En consecuencia, el
fosfolípido obtenido es a menudo una mezcla de fosfolípidos que
contiene el fosfolípido objetivo, otros fosfolípidos e
impurezas.
El fosfolípido obtenido mediante la
transfosfatidilación se utiliza preferentemente tras la eliminación
de dichas impurezas sometiéndolo a un procedimiento apropiado de
purificación, aunque también puede ser utilizado mientras contiene
impurezas derivadas de las materias primas o formadas en los
procedimientos de producción, siempre y cuando dichas impurezas no
supongan problemas para su administración ni mermen las ventajas del
mismo. El producto se puede purificar mediante cualquier técnica,
tal como fraccionamiento utilizando un disolvente y cromatografía en
una combinación apropiada, de acuerdo con un procedimiento
convencional.
\newpage
Los fosfolípidos obtenidos según el
procedimiento de la presente invención pueden ser administrados, por
ejemplo, en forma de preparaciones farmacéuticas, alimentos o
cosméticos. Por ejemplo, para ser utilizados en forma de
preparaciones farmacéuticas con el fin de utilizar las funciones
biológicas de los fosfolípidos, se pueden administrar por vía oral
en una forma de dosificación, por ejemplo cápsulas, gránulos,
comprimidos, polvos y otras preparaciones sólidas; y jarabes u
otras preparaciones líquidas. Alternativamente, se pueden
administrar, por ejemplo, en forma de inyecciones, preparaciones
dermatológicas externas, infusiones rectales y otras preparaciones
no orales.
En la producción de dichas preparaciones, se
pueden utilizar otros componentes farmacéuticamente aceptables,
según se requiera. Dichos componentes incluyen, por ejemplo,
lactosa, almidones, celulosa cristalina, lactato de calcio,
aluminometasilicato de magnesio, anhídrido silícico et al
excipientes; sucrosa, hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona
et al aglutinantes; carboximetilcelulosa,
carboximetilcelulosa de calcio et al desintegrantes;
estearato de magnesio, talco et al lubricantes.
Cuando el fosfolípido obtenido según el
procedimiento de la presente invención se utiliza en alimentos con
la expectativa de obtener funciones biológicas similares, dicho
alimento puede ser apropiadamente producido de acuerdo con un
procedimiento convencional, añadiendo el fosfolípido intacto o tras
su purificación a aceites y grasas, productos de confitería en
forma de comprimidos o gránulos, leche fermentada, golosinas,
especias, copos de pescado y verduras para espolvorear sobre arroz
cocido, et al alimentos y bebidas.
Una cantidad apropiada de los fosfolípidos
obtenidos mediante el procedimiento según la presente invención
puede ser utilizada en forma de estas preparaciones farmacéuticas y
alimentos. Con el fin de obtener las funciones biológicas de los
fosfolípidos, la cantidad de los mismos puede ser tal que
proporcione dichas funciones a la vez que no provoque problemas
tales como una sobredosis. Por ejemplo, la cantidad en composición
de fosfatidilserina producida como fosfolípido es una cantidad tal
que se ingieran de aproximadamente 50 mg a 1.000 mg por día.
Los fosfolípidos obtenidos mediante el
procedimiento según la presente invención también pueden ser
utilizados como agentes emulsionantes. En este caso, el agente
emulsionante se puede añadir, por ejemplo, a preparaciones
farmacéuticas, alimentos y cosméticos en una cantidad comprendida
preferentemente entre 0,01% y 10%.
Entre los fosfolípidos obtenidos mediante el
procedimiento según la presente invención, una fosfatidilserina
puede ser fácilmente purificada y concentrada a partir de la mezcla
de fosfolípidos que contiene las fosfatidilserinas disolviendo la
mezcla de fosfolípidos en un alcohol con el fin de obtener una
solución, añadiendo una sal metálica a dicha solución con el fin de
insolubilizar las fosfatidilserinas, y separando la materia
insolubilizada.
Dichas sales metálicas para su utilización en el
presente procedimiento incluyen, sin limitarse a las mismas, sales
de litio, sales de sodio, sales de potasio, sales de calcio, sales
de magnesio y otras sales metálicas, así como productos naturales
que contienen cualquiera de estas sales metálicas en abundancia,
tales como sal común, agua madre, salmuera, dolomita y nácar en
polvo comestible. Entre estos, las sales de litio, las sales de
sodio y las sales de potasio son preferentes para una concentración
eficiente, siendo típicamente preferidas entre ellas el cloruro de
litio, el cloruro de sodio y el cloruro de potasio. Cada una de
estas sales metálicas puede ser utilizada individualmente o en
combinación.
La cantidad de sal o sales metálicas no está
particularmente limitada, siempre y cuando se pueda precipitar la
fosfatidilserina, y está comprendida preferentemente entre 0,15 y 10
mmoles, y más preferentemente entre 0,5 y 5 mmoles por gramo de
fosfolípido para una mayor relación de recuperación de las
fosfatidilserinas y un mayor contenido de fosfatidilserinas en el
precipitado.
En el presente procedimiento se puede utilizar
cualquier alcohol, siempre y cuando pueda disolver la mezcla de
fosfolípidos, siendo preferentes el alcohol metílico, el alcohol
etílico, el alcohol butílico, el alcohol propílico et al
alcoholes inferiores. También se pueden utilizar mezclas de dichos
alcoholes. El alcohol etílico se puede aplicar fácilmente a los
alimentos con menores problemas de seguridad, y es el que se utiliza
típicamente de forma ventajosa.
La concentración de la mezcla de fosfolípidos en
el alcohol no está particularmente limitada y es preferentemente
igual o mayor a la concentración a la cual dicha mezcla se puede
disolver completamente en el alcohol, y está comprendida
preferentemente entre 1 y 50%, y más preferentemente entre 2 y 20%,
relativos al peso del alcohol, para un procedimiento de
concentración eficiente de las fosfatidilserinas y para una mayor
operabilidad.
Las fosfatidilserinas se pueden concentrar a
partir de la mezcla de fosfolípidos, por ejemplo, del siguiente
modo. Inicialmente, la mezcla de fosfolípidos preparada por
transfosfatidilación y que contiene otros fosfolípidos además de
las fosfatidilserinas, se disuelve en un alcohol, tal como alcohol
etílico. En dicho procedimiento, las condiciones de disolución,
tales como la temperatura de disolución, no están particularmente
limitadas y se pueden seleccionar apropiadamente en función de los
tipos y cantidades de los componentes de la mezcla y de otros
parámetros.
En la solución resultante, las
fosfatidilserinas, PC, PA et al fosfolípidos se extraen en
una capa de disolvente, aunque pueden formarse algunas materias
insolubles. En consecuencia, la sal metálica se añade después de
eliminar dichos precipitados, agregados u otras materias insolubles
del disolvente, por ejemplo, mediante separación centrífuga y/o
filtración. Si las materias insolubles incluyen una pequeña cantidad
de fosfatidilserina, la operación de extracción con el alcohol se
puede repetir varias veces.
A continuación, la sal metálica se añade a la
solución de alcohol con el fin de fraccionar las fosfatidilserinas
extraídas en la capa de disolvente. Particularmente, la mayoría de
los otros fosfolípidos distintos de las fosfatidilserinas presentes
en la capa de disolvente no precipitan mediante la adición de la sal
metálica, pero la mayoría de fosfatidilserinas precipitan, de tal
modo que dichas fosfatidilserinas se pueden concentrar recuperando
la fosfatidilserina precipitada. La sal metálica se puede añadir en
forma de polvos o de solución en un disolvente, tal como agua o un
alcohol. Las condiciones del procedimiento no están particularmente
limitadas y se pueden seleccionar apropiadamente, por ejemplo, en
función de los tipos y cantidades de los componentes de la mezcla.
Más específicamente, la mezcla con la sal metálica se mantiene a una
temperatura de 10ºC a 30ºC durante 30 minutos o más, con el fin de
insolubilizar la PS.
Las fosfatidilserinas insolubilizadas como
resultado de la adición de la sal metálica pueden ser recuperadas
mediante un método tal como separación centrífuga, filtración o
separación en reposo. Las fosfatidilserinas pueden ser purificadas
adicionalmente mediante un medio convencional de purificación, tal
como cromatografía en columna. El concentrado de fosfatidilserinas
obtenido según la presente invención contiene cantidades
significativamente reducidas de otros fosfolípidos et al
componentes, y en consecuencia puede ser purificado de forma
relativamente sencilla.
La figura 1 es un diagrama de los resultados de
ensayo sobre cantidades óptimas de MCT con la ordenada A
representando la relación de producción de PS (%) y la abscisa B
representando la relación de cantidad añadida (%) de MCT a los
fosfolípidos,
la figura 2 es un diagrama de los resultados de
ensayo sobre cantidades óptimas de MCT con la ordenada C
representando la relación (%) de MCT con respecto a los fosfolípidos
y la abscisa D representando la relación de producción de PS
(%),
la figura 3 es un diagrama de resultados de
ensayo sobre relaciones molares de serina con respecto a
fosfolípidos en una mezcla homogeneizada con la ordenada E
representando la relación de producción de PS (%) y la abscisa F
representando la relación molar (mol/mol) de serina con respecto a
fosfolípidos,
la figura 4 es un diagrama de resultados de
ensayo sobre relaciones en peso de agua con respecto a fosfolípidos
en una mezcla homogeneizada con la ordenada G representando la
relación de producción de PS (%) y la abscisa H representando la
relación (% en peso) de agua con respecto a los fosfolípidos,
la figura 5 es un diagrama de resultados de
ensayo sobre relaciones en peso de agua con respecto a fosfolípidos
en una mezcla homogeneizada con la ordenada I representando la
relación de producción de PS (%) y la abscisa J representando la
relación (% en peso) de agua con respecto a los fosfolípidos,
la figura 6 es un diagrama de resultados de
ensayo sobre relaciones en peso de agua con respecto a fosfolípidos
en una mezcla homogeneizada con la ordenada K representando la
relación de producción de PS (%) y la abscisa L representando la
relación (% en peso) de agua con respecto a los fosfolípidos,
la figura 7 es un diagrama que muestra las
relaciones de producción de PS a diferentes temperaturas de reacción
con la ordenada M representando la relación de producción de PS (%)
y la abscisa N representando la temperatura (ºC).
A continuación se describe con detalle la
presente invención haciendo referencia a las formas de realización
preferidas siguientes, que no pretenden limitar el alcance de la
presente invención.
Se amasó (homogeneizó) una cantidad total de 97
g de solución acuosa de L-serina 6,7 M (con o sin
cloruro de calcio 0,18 M) con 100 g de una mezcla de lecitina de
soja y mantequilla de coco (NATHIN 250, marca registrada,
comercializada por Central Soya Company, Inc.) en un mortero
automático (modelo ANM-150) y se mantuvo a 55ºC.
Una cantidad total de 2,0 ml de una mezcla de enzimas que contiene
800 unidades de fosfolipasa D-Y1 derivada de un
actinomiceto que pertenece al género Streptomyces
(PLD-Y1, nombre de producto, comercializada por
Yakult Honsha Co., Ltd.) se amasó (homogeneizó) con la mezcla
amasada en un mortero automático, y se llevó a cabo una reacción en
ausencia de disolventes orgánicos. La reacción de
transfosfatidilación se llevó a cabo con agitación a 55ºC durante
17 horas, y resultó completa.
El análisis de los productos de reacción por
cromatografía de capa fina en gel de sílice puso de manifiesto que
el 47,9% en moles de fosfolípidos totales se convirtió en
fosfatidilserinas cuando se añadió cloruro de calcio 0,18 M, y que
el 44,5% en moles de fosfolípidos totales se convirtió en
fosfatidilserinas incluso en ausencia de cloruro de calcio. Estos
resultados muestran que la reacción de transfosfatidilación puede
proceder en este sistema de reacción incluso sin la adición de
calcio. La mezcla homogeneizada antes del inicio de la reacción fue
observada con un microscopio en nicoles cruzados, observándose que
presentaba una "estructura de cristal líquido liotrópico laminar
sustancialmente sin separación de fases".
Tal como se ha descrito anteriormente, la
presente invención da a conocer un procedimiento para llevar a cabo
una reacción de transfosfatidilación sin la utilización de
disolventes orgánicos. Específicamente, los productos
transfosfatidilados pueden ser producidos eficientemente
homogeneizando una solución acuosa que contiene el aceptor que
contiene hidroxilo y la fosfolipasa D con el fosfolípido antes de la
reacción.
Dicho procedimiento no requiere de ningún
disolvente orgánico. Sin embargo, se puede añadir una sustancia
soluble en aceite que no sea ningún disolvente orgánico al
fosfolípido con el fin de mejorar adicionalmente la operabilidad.
Dichas sustancias solubles en aceite incluyen, sin limitarse a las
mismas, aceite de cártamo, aceite de soja, aceite de maíz, aceite
de semillas de nabina, aceite de semillas de algodón, aceite de
girasol, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva,
aceite de semillas de cáñamo, aceite de perilla, aceite de
teobroma, (mantequilla de cacao), aceite de coco et al
aceites vegetales; aceite de mantequilla, aceite de pescado,
manteca, sebo de vacuno et al aceites animales; MCT, tal como
derivados glicéridos preparados a partir de ácidos grasos de cadena
mediana como materiales de partida; et al aceites y grasas
comestibles.
Los resultados del ejemplo 1 muestran que la
reacción de transfosfatidilación procede incluso sin la adición de
calcio. Sin embargo, se investigaron adicionalmente los efectos de
la adición de calcio. Específicamente, se mezclaron los componentes
individuales con o sin la adición de calcio, tal como se muestra en
la tabla 1, mientras que la relación molar de serina con respecto a
fosfolípido se ajustó a 1 ó 5. La mezcla resultante se amasó
(homogeneizó) utilizando una microespátula, y se dejó reaccionar a
55ºC durante 18 horas. En dicho procedimiento, una muestra con una
relación molar de 1 utilizaba solución acuosa de serina 2,5 M, y
otra con una relación molar de 5 utilizaba solución acuosa de
serina 4,5 M. Más específicamente, se mezclaron NATHIN 250 y la
solución acuosa de serina que contiene, si lo contiene, el calcio, y
la mezcla resultante se trató con la solución acuosa de
PLD-Y1 con el fin de iniciar la reacción.
Las cantidades de productos de reacción se
determinaron del mismo modo que en el ejemplo 1. La tabla 2 muestra
que la relación de producción de PS sin la adición de calcio fue
ligeramente menor aunque sustancialmente igual que con la adición
de calcio. Las mezclas homogeneizadas antes de la reacción fueron
sometidas a observación microscópica en nicoles cruzados,
observándose que presentaban una estructura de cristal líquido
liotrópico laminar sustancialmente sin separación de fases. En las
tablas, las abreviaciones PA, PE, y PI representan ácido
fosfatídico, fosfatidiletanolamina y fosfatidilinositol,
respectivamente.
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\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que se pueden obtener
buenos rendimientos de acuerdo con la presente invención,
independientemente de la presencia o ausencia de calcio. En
consecuencia, el procedimiento según la presente invención no
requiere la adición de calcio a su sistema de reacción, a diferencia
de la mayoría de reacciones convencionales de transfosfatidilación,
que utilizan un disolvente orgánico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron un total de 50 g de NATHIN 250
(comercializado por Central Soya Company, Inc.) en 500 ml de un
reactivo químico de acetona calentando a 60ºC, y la solución se
enfrió a 15ºC. El precipitado resultante se disolvió en 300 ml de
un reactivo químico de acetona calentando a 60ºC, a continuación se
enfrió la solución a 15ºC y de este modo se obtuvo un precipitado
que comprendía solo fosfolípidos, sin triglicéridos. Se amasaron
(homogeneizaron) 6 g de un producto seco del precipitado (en
adelante, designado "precipitado de NATHIN 250/acetona") con
5,8 g de de solución acuosa 4,5 M de L-serina (con o
sin la adición de cloruro de calcio 0,18 M), y el artículo amasado
se mantuvo a 55ºC. El artículo amasado se amasó (homogeneizó)
adicionalmente con 0,2 ml de una mezcla de enzimas que contenían
49,3 unidades de fosfolipasa DY-1 (comercializada
por Yakult Honsha Co., Ltd.) utilizando una microespátula, y el
artículo amasado se sometió inmediatamente a una reacción a 55ºC
durante 17 horas con el fin de completar la reacción de
transfosfatidilación.
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El análisis de los productos de reacción
obtenidos por cromatografía de capa fina en gel de sílice puso de
manifiesto que el 41,7% de fosfolípidos totales se convirtió en
fosfatidilserinas cuando se añadió cloruro de calcio 0,18 M. Sin
embargo, el 35,1% de fosfolípidos totales se convirtió en
fosfatidilserinas incluso sin adición de cloruro de calcio. Las
mezclas homogeneizadas antes del inicio de la reacción fueron
sometidas a observación microscópica en nicoles cruzados,
observándose que presentaban una "estructura de cristal líquido
liotrópico laminar sustancialmente sin separación de fases". Las
tablas 3 y 4 muestran composiciones de sustratos y los resultados de
las reacciones de transfosfatidilación de PS utilizando el
precipitado de acetona como sustrato, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon fosfolípidos de materia prima
amasando de 1 a 9% en peso de MCT (Panasate 810, marca registrada,
comercializada por Nippon Oil And Fats Co., Ltd.) en precipitado de
NATHIN 250/acetona. Cada uno de los fosfolípidos de material se
amasó adicionalmente con 200 mg de serina y 200 ml de agua (relación
molar de fosfolípidos con respecto a agua: 0,4) relativos a 500 mg
de precipitado de NATHIN 250/acetona. El artículo amasado se amasó
adicionalmente (homogeneizó) con una solución acuosa de
PLD-Y1 (4,1 unidades por 15 ml) utilizando una
microespátula y se dejó reaccionar a 55ºC durante 17 horas. Tras la
compleción de la reacción, las fosfatidilserinas se determinaron por
cromatografía de capa fina en gel de sílice.
La figura 1 es un diagrama que muestra los
resultados de ensayo en cantidades óptimas de MCT. Tal como se
muestra en la figura 1, añadiendo 50 mg (9% relativo a los
fosfolípidos) de MCT, la relación de producción de PS aumenta de
34,7% a 40,4% en comparación con el caso en el que no se añade MCT,
verificándose los efectos de la adición de MCT. Las reacciones se
llevaron a cabo del mismo modo con una relación variable de MCT del
10% al 40%. La figura 2 es un diagrama que representa los resultados
de ensayo en cantidades óptimas de MCT. Tal como se muestra en la
figura 2, la relación de producción de PS aumenta en todas las
muestras con entre 10% y 40% de MCT. Aparentemente, las figuras 1 y
2 indican que la cantidad de MCT está comprendida preferentemente
entre 9% y 40%. Las mezclas homogeneizadas antes del inicio de la
reacción fueron observadas con un microscopio en nicoles cruzados,
observándose que presentaban una "estructura de cristal líquido
liotrópico laminar sustancialmente sin separación de fases".
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A 500 mg de NATHIN 250 se le añadió una solución
acuosa de serina 2,5 M que contenía cloruro de calcio 0,18 M en una
relación molar variable de serina con respecto a fosfolípidos
comprendida entre 0,1 y 15, y dicha mezcla se mezcló en un
mezclador a la vez que se calentaba en un baño de agua a 60ºC. Tras
enfriar el baño de agua a 55ºC, el sustrato de reacción se mezcló y
homogeneizó adicionalmente con una solución acuosa de
PLD-Y1 utilizando la microespátula o el Vibromixer.
La mezcla homogeneizada se dejó reaccionar a 55ºC durante 17 horas,
y la composición de fosfolípidos de los productos de reacción se
analizó por cromatografía de capa fina de gel de sílice.
La figura 3 muestra que el contenido en PS en
los productos de reacción es del 20% o mayor para relaciones
molares de serina con respecto a fosfolípidos de 0,3 o mayores, lo
que indica que estas son condiciones adecuadas para la producción
de PS. En particular, relaciones molares de 4 o mayores pueden
alcanzar contenidos en PS del 45% o mayores y típicamente resultan
preferentes como composiciones de sustrato. Sin embargo, si la
relación molar es de 10 o mayor, la producción de PS no aumenta con
una cantidad creciente de serina, lo que indica que un límite
superior de la relación molar para la producción eficiente de
fosfatidilserinas es aproximadamente 10. Las mezclas homogeneizadas
(para relaciones molares comprendidas entre 0,3 y 10) antes de la
reacción fueron sometidas a observación microscópica en nicoles
cruzados, observándose que presentaban una "estructura de cristal
líquido liotrópico laminar sustancialmente sin separación de
fases".
La cantidad de agua relativa a fosfolípidos fue
de 100 partes en peso o mayor para relaciones molares de serina de
6 o mayores. Sin embargo, la cantidad de agua en las mezclas
homogeneizadas determinada por la técnica de Karl Fischer fue de
100 partes en peso o menor tras la eliminación del agua separada por
decantación.
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Una cantidad total, respectivamente, de 200 mg
de L-serina en polvo, se mezcló suficientemente con
500 mg de lecitina de soja (precipitado de NATHIN 250/acetona, o PC
80 disponible a través de Croklaan B.V.) o lecitina de yema de
huevo (PL-100LE, disponible a través de Q. P.
Corporation) en un mortero calentado a 60ºC. La mezcla se amasó
adicionalmente con agua destilada con los contenidos de agua
representados en las figuras 4 a 6 y se mantuvo a 55ºC. Un total de
0,015 ml de una mezcla de enzimas que contenía 4,1 unidades de
PLD-Y1 (disponible a través de Yakult Honsha Co.,
Ltd.) se amasó (homogeneizó) con el artículo amasado utilizando una
microespátula, y se llevó a cabo una reacción de
transfosfatidilación a 55ºC durante 17 horas dejándola en reposo
hasta compleción. Los contenidos de agua de las mezclas
homogeneizadas se determinaron mediante la técnica de Karl
Fischer.
Los productos de reacción obtenidos fueron
analizados por cromatografía de capa fina en gel de sílice. Las
figuras 4 a 6 son diagramas de resultados con la ordenada
representando contenidos de PS (%) en los productos de reacción y
la abscisa (representada logarítmicamente) representando la relación
(% en peso) de agua con respecto a la lecitina de soja.
La figura 4 muestra que cuando se utilizó el
precipitado de NATHIN 250/acetona como fosfolípido de materia
prima, no se produjo PS en una relación de pesos de agua con
respecto a fosfolípidos en la mezcla homogeneizada de 3%, sino que
el 10% o más del fosfolípido se convirtió en PS en relaciones de
pesos del 10% al 100%, lo que indica que dichas relaciones de pesos
son adecuadas para la producción de PS. Un total del 30% o más del
fosfolípido se convirtió en PS en relaciones de pesos con respecto a
fosfolípidos comprendidas entre 20% y 70%, lo que indica que dichas
relaciones de pesos son adecuadas para la producción de PS. Las
mezclas homogeneizadas fueron sometidas a observación microscópica
en nicoles cruzados, observándose que presentaban una "estructura
de cristal líquido liotrópico laminar sustancialmente sin separación
de fases" para relaciones de pesos de agua con respecto a
fosfolípidos del 10% al 100%, adecuadas para la producción de
PS.
La figura 5 muestra que cuando se utilizó PC 80
como fosfolípido de materia prima, no se produjo PS en una relación
de pesos de agua con respecto a los fosfolípidos en la mezcla
homogeneizada de 8%, sino que el 10% o más del fosfolípido se
convirtió en PS en relaciones de pesos del 10% al 60%, lo que indica
que dichas relaciones de pesos son adecuadas para la producción de
PS. Un total del 20% o más del fosfolípido se convirtió en PS en
relaciones de pesos con respecto a fosfolípidos comprendidas entre
20% y 40%, lo que indica que dichas relaciones de pesos son
adecuadas para la producción de PS. Las mezclas homogeneizadas
fueron sometidas a observación microscópica en nicoles cruzados,
observándose que presentaban una "estructura de cristal líquido
liotrópico laminar sustancialmente sin separación de fases" para
relaciones de pesos de agua con respecto a fosfolípidos del 10% al
60%, adecuadas para la producción de PS.
La figura 6 muestra que cuando se utilizó
lecitina de yema de huevo como fosfolípido de materia prima, no se
produjo PS en una relación de pesos de agua con respecto a los
fosfolípidos en la mezcla homogeneizada de 8%, sino que el 10% o
más del fosfolípido se convirtió en PS en relaciones de pesos del
15% al 40%, lo que indica que dichas relaciones de pesos son
adecuadas para la producción de PS. Un total del 20% o más del
fosfolípido se convirtió en PS en relaciones de pesos con respecto a
fosfolípidos comprendidas entre 20% y 35%, lo que indica que dichas
relaciones de pesos son adecuadas para la producción de PS. Las
mezclas homogeneizadas fueron sometidas a observación microscópica
en nicoles cruzados, observándose que presentaban una "estructura
de cristal líquido liotrópico laminar sustancialmente sin separación
de fases" para relaciones de pesos de agua con respecto a los
fosfolípidos del 15% al 40%, adecuadas para la producción de PS.
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Se mezclaron 490 mg de cada una de las
soluciones acuosas de receptores indicadas en la tabla 5 con 500 mg
de PC 80 en un baño de agua de 60ºC, la mezcla se amasó
(homogeneizó) con 50 ml de una solución acuosa que contenía 13,7
unidades de un PLD (PLD-Y1) utilizando una
microespátula, y el artículo amasado se dejó reaccionar a 55ºC
durante 18 horas. Los productos de reacción de transfosfatidilación
fueron analizados por cromatografía de capa fina en gel de
sílice.
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La tabla 5 muestra las relaciones de producción
de los productos transferidos tras las reacciones de transferencia
utilizando cada uno de los aceptores. La tabla 5 demuestra que se
produjeron los productos transfosfatidilados correspondientes
(fosfatidilglicerol: 42,7%, ácido fosfatidilascórbico: 9,4%,
fosfatidilglucosa: 13,3%) cuando se utilizaron glicerol, ácido
L-ascórbico y glucosa como aceptores. En cambio, no
se produjo ningún producto transfosfatidilado cuando se utilizaron
inositol, fosfatos de ascorbato y trealosa.
Un total de 490 mg de solución acuosa de serina
4,5 M se añadieron a 500 mg de precipitado de NATHIN 250/acetona
(PL) o de un sustrato de fosfolípido (PL+TG) que comprendía 450 mg
de precipitado de NATHIN 250/acetona y 50 mg de MCT, la mezcla
resultante se amasó a 60ºC, se amasó adicionalmente (homogeneizó)
con 15 ml de una solución acuosa que contenía 4,1 unidades de
PLD-Y1 utilizando una microespátula y se dejó
reaccionar a temperaturas comprendidas entre 15ºC y 65ºC con
incrementos de 10ºC durante 18 horas. Los productos
transfosfatidilados fueron analizados por cromatografía de capa
fina en gel de sílice.
La figura 7 es un diagrama que muestra las
relaciones de producción de PS para diferentes temperaturas de
reacción y muestra que la relación de producción de PS a 45ºC fue
del 43% y no cambió con una temperatura creciente cuando se utilizó
el sustrato que contenía precipitado de NATHIN 250/acetona y
MCT.
Cuando se utilizó únicamente el sustrato que
contenía precipitado de NATHIN 250/acetona, la relación de
producción de PS fue del 30,1% a 45ºC y del 38,7% a 65ºC, lo que
indicaba que se obtiene un resultado más satisfactorio con una
mayor temperatura de reacción. Sin embargo, se especula que el
límite superior para la temperatura de reacción es de 65ºC, ya que
la producción de PS disminuye y los fosfolípidos pueden resultar
dañados o descomponerse para temperaturas de reacción superiores a
65ºC.
Un total de 490 mg de solución acuosa de serina
4,5 M (que contenía, si contenía, 9,3 mg de calcio) se mezclaron
con 500 mg de NATHIN 250 a 55ºC. Tras enfriar a 45ºC, la mezcla de
reacción se trató con 200 ml de una mezcla líquida de enzimas (0,6
unidades por mililitro) de PLD de col de Bruselas a 45ºC durante 18
horas. La PLD de col de Bruselas se preparó separadamente según un
procedimiento convencional.
Como resultado, la reacción apenas avanzaba sin
la adición de calcio, pero con la adición del mismo avanzó y
produjo productos de reacción que contenían 6,2% de PS.
Con 200 g de lecitina de soja que contenían 40%
de PC se amasaron 190 g de una solución acuosa de serina que
contenía 70 g de serina en 120 g de agua y 10 ml de una solución
acuosa (24 mg/ml) de fosfolipasa D (PLD-Y1,
disponible a través de Yakult Honsha Co., Ltd.). El artículo amasado
se dejó reaccionar a 55ºC durante 5 horas, obteniéndose un producto
de reacción que contenía 46,7% de PS en fosfolípidos.
Un total de 5,0 g del producto de reacción se
extrajeron con 20 ml de alcohol etílico a 45ºC, y el residuo
(precipitado) se extrajo adicionalmente con dos partes de 5 ml de
alcohol etílico. Se mezclaron tres extractos, 5 ml de los cuales se
trataron con 0,20 ml de solución acuosa de sal común 25% (cloruro de
sodio), se calentaron a 45ºC, se dejaron en reposo hasta
temperatura ambiente y, de este modo, se obtuvo un precipitado. Como
resultado, el precipitado contenía 62,1% de PS sobre base de
materia sólida seca, mientras que el sobrenadante contenía 3,3% de
PS, lo que indicaba que la PS se concentró eficientemente en el
precipitado.
Un total de 50 mg de acetato de sodio en polvo
se añadieron a 5 ml de la mezcla de los extractos obtenidos en el
ejemplo 10, la mezcla se calentó a 45ºC, se dejó reposar hasta
temperatura ambiente y de este modo se obtuvo un precipitado. Como
resultado, el precipitado contenía 61,8% de PS sobre base de materia
sólida seca, mientras que el sobrenadante contenía 3,5% de PS, lo
que indicaba que la PS se concentró eficientemente en el
precipitado como en la utilización de la solución acuosa de sal
común.
Se añadió solución acuosa de sal común al 25% a
la mezcla de los extractos obtenidos en el ejemplo 10, y de este
modo se obtuvieron PS insolubilizadas. Se determinaron las
cantidades de PS en los fosfolípidos precipitados y el precipitado
recuperado. La tabla 6 muestra la relación entre la cantidad de sal
común, la relación de recuperación de PS en el precipitado y el
contenido de PS en los fosfolípidos.
Tal como se muestra en la tabla 6, la PS se
concentró en una fracción precipitada en cualquier condición y,
entre los distintos casos, el contenido de PS en los fosfolípidos
precipitados fue de 55% o mayor para cantidades de sal común de 10
mmol o menos por gramo de fosfolípidos en la mezcla de extractos, lo
que indicaba que la PS se concentró eficientemente en el
precipitado. La relación de recuperación de PS en el precipitado fue
del 60% o menor, y el 40% o más del mismo permanece en el
sobrenadante para cantidades de sal común de 0,05 mmoles o menores.
Estos resultados muestran que la PS se puede concentrar en un
precipitado para cualquier cantidad de sal común, pero se concentra
suficientemente de forma práctica para cantidades de sal común
comprendidas entre 0,15 y 10 mmoles por gramo de fosfolípidos
disueltos en un alcohol.
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Claims (11)
1. Procedimiento para la producción de un
fosfolípido por transfosfatidilación, que comprende las etapas que
consisten en:
- -
- mezclar un fosfolípido de materia prima, un aceptor que contiene hidroxilo, fosfolipasa D y agua en ausencia de un disolvente orgánico, para obtener una mezcla, siendo dicho aceptor que contiene hidroxilo una molécula que acepta un grupo fosfatidilo de dicho fosfolípido de materia prima en presencia de fosfolipasa D;
- -
- homogeneizar dicha mezcla en ausencia de un disolvente orgánico mediante la aplicación de una fuerza física para presentar una estructura cristalina líquida liotrópica laminar; y
- -
- someter dicha mezcla homogeneizada a una reacción de transfosfatidilación a una temperatura comprendida dentro del intervalo de 15ºC a 65ºC.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha mezcla homogeneizada presenta sustancialmente una
estructura cristalina líquida laminar sin separación de fases.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la relación de agua a fosfolípido de materia prima en
dicha mezcla homogeneizada está comprendida en el intervalo de 10%
en peso a 100% en peso.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el contenido de dicho aceptor que
contiene hidroxilo se ajusta dentro de un intervalo de 0,3 moles a
10 moles por 1 mol de fosfolípido de materia prima en dicha
homogeneización.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho aceptor que contiene
hidroxilo es por lo menos uno seleccionado de entre el grupo
constituido por serina, glicerol, ácido
L-ascórbico, glucosa, y colina.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la serina se utiliza como dicho
aceptor que contiene hidroxilo con el fin de obtener
fosfatidilserina.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que durante dicha homogeneización se
añade un aceite y/o grasa comestibles.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, que
comprende además las etapas que consisten en:
- -
- disolver el fosfolípido resultante que contiene fosfatidilserina en un alcohol con el fin de obtener una solución; e
- -
- insolubilizar la fosfatidilserina añadiendo una sal metálica a dicha solución y separando la fosfatidilserina insolubilizada.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que dicha sal metálica es por lo menos una seleccionada de entre
el grupo constituido por sales de litio, sales de potasio, y sales
de sodio.
10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9,
en el que la sal metálica es cloruro de litio, cloruro de potasio o
cloruro de sodio.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en el que se utiliza alcohol etílico como
alcohol.
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