KR100820657B1 - 인지질의 제조법 - Google Patents

Abstract

포스파티딜기 전이반응을 이용하여 인지질을 제조하는 방법으로서, 원료 인지질과, 수산기를 갖는 수용체와, 포스포리파제D와 물을 유기용매의 부존재하에서 혼합하고, 또한 균질화 처리에 회부함으로써 균질화 혼합물을 얻는 균질화공정과, 얻어진 균질화 혼합물을 15℃∼65℃에서 반응시키는 반응공정을 구비한다. 균질화 혼합물은 라메라형 리오트로픽 액정구조를 갖는다. 이 균질화 혼합물로부터 전이반응에 의해서 유기용매나 칼슘을 사용하지 않고, 목적으로 하는 인지질이 생성된다.

Description

인지질의 제조법{PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PHOSPHOLIPIDS}

본 발명은, 포스파티딜기 전이반응(인지질 염기교환반응)을 이용하여 목적으로 하는 인지질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

포스파티딜세린(PS), 포스파티딜글리세롤(PG) 등의 인지질은, 각각 유용한 생리작용이나 특이한 물성을 갖고 있어, 의약품이나 식품소재, 유화제 등의 용도로 사용되고 있다. 예를 들면, 포스파티딜세린은 노인성 치매증이나 기억장해 등의 예방이나 치료 등을 목적으로 한 약제, 포스파티딜글리세롤은 유화제, 포스파티딜 아스코르빈산은 유화제, 과산화지질 억제제로서의 이용이 기대되고 있다.

이들 인지질의 제조법으로서는, 종래, 화학합성법이나 포스포리파제D를 사용한 포스파티딜기 전이반응이 이용되고 있고, 최근에는 비교적 저렴하고 또한 간편하게 인지질을 제조할 수 있는 효소법이 범용되고 있다.

포스파티딜기 전이반응(인지질 염기교환반응)을 이용하여 목적으로 하는 인지질을 생성시키는 방법에 대해서는 옛부터 알려져 있다(Yang, S.F. et al., J. Bio1. Chem., 242, p.477, '67). 예를 들면, 코쿠쇼 등(Agric. Bio1. Chem., 51, p.2515, '87)은 이소프로필에테르에 용해한 난황 포스파티딜콜린에 L-세린 수용액(염화칼슘을 포함함)을 첨가한 혼합물에 포스포리파제D를 작용시키는 2상계 반응에 의해 포스파티딜세린을 함유하는 반응물이 얻어지는 것을 서술하고 있다. 2상계 반응에 있어서는, 원료 인지질을 포함하는 유상(油相)과 수용체를 포함하는 수상(水相)이 2상을 이루고, 양자의 계면에 있어서, 포스파티딜기 전이반응이 일어난다고 일반적으로 여겨지고 있다.

또한, 일본국 특허 제2942302호에는, 대두 레시틴을 분획해서 얻은 포스파티딜콜린을 약 85% 함유하는 인지질 표품(標品)을 초산에틸에 용해하고, 또한 아스코르빈산을 함유하는 수용액을 첨가한 혼합물에, 포스포리파제D를 작용시킴으로써 포스파티딜 아스코르빈산을 함유하는 반응물을 얻는 균일상 반응법이 서술되어 있다.

그러나, 2상계 반응에 있어서는, 인지질에 대하여 5배(용량/중량) 이상의 용매(유기용매 + 물)를 첨가할 필요가 있었기 때문에, 인지질량에 대하여 6배 이상의 용량을 가지는 반응장치를 사용할 필요가 있었다. 더욱이, 반응의 진행을 촉진시키기 위해서 칼슘의 첨가가 이루어지고 있지만, 이 칼슘은 인지질과 빠르게 염을 형성해 버린다. 이렇게 해서 생성하는 칼슘염은, 일본이나 유럽에 있어서는 화학합성 품의 범주에 들어가기 때문에 식품으로의 이용은 어렵다.

한편, 균일상 반응에서는, 반응계에 다량의 물이 존재하기 때문에, 반응을 계속하면 포스포리파제D가 갖는 가수분해활성에 의해, 부반응생성물로서의 포스파티드산이 생성되어 버린다. 이 때문에, 목적 인지질의 분리정제가 곤란하게 되는 것이 문제이었다. 또한, 균일상 반응에서는, 인지질에 대한 수용체의 첨가량이 한정되어 버리기 때문에, 목적으로 하는 반응생성물(인지질)의 생산량이 한계점에 도달하는 문제가 있었다.

또한, 후지타 등의 특허(일본 특허공고 평7-16426호 공보)에는, 원료 인지질을 용해한 유기용매(디이소프로필에테르, 이소옥탄, 시클로헥산, 벤젠, 클로로포름-이소옥탄, n-헥산, 디클로로메탄-이소옥탄)중에, 수산기를 갖는 수용체와 포스포리파제D를 함유하는 수상(염화칼슘을 포함함)을 역미셀중에 봉입한 형태로 반응시키는 역미셀 반응에 의해, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤 등을 제조하는 것이 서술되어 있다.

역미셀 반응에 있어서는, 사용되는 수분량이 적기 때문에, 상기 방법의 문제점이었던 포스파티드산의 생성은 억제되고 있다고 보고되고 있지만, 목적 인지질의 생성량은 약 20%전후로 반드시 충분하다고는 말할 수 없고, 또한, 초음파처리 등 번잡한 작업도 필요하게 되기 때문에, 작업성, 가격면에서의 문제도 발생하게 된다. 또한, 인지질에 대하여 10배(용량/중량)이상의 유기용매를 첨가할 필요가 있기 때문에, 인지질량에 대하여 대용량의 반응장치를 사용할 필요가 있었다.

또한, 이상과 같은 종래부터 알려져 있는 포스파티딜기 전이반응에 있어서는, 모두 반응계중에 유기용매를 첨가할 필요가 있었다. 그러나, 인지질을 식품, 의약품 등의 용도로 사용할 경우에는, 유기용매의 잔존은 허용되지 않고, 완전히 제거하는 것이 필수적이다. 이 때문에, 제조공정에 있어서는, 유기용매 제거를 위한 설비 등이 필요하게 되어, 작업성, 가격면 등의 불이익이 생겨버린다. 특히, 식품제조를 목적으로 했을 경우에는, 유기용매를 반응에 이용하는 것은 식품위생법상에서 실질상 불가능하다.

그래서, 유기용매나 칼슘염을 사용하지 않고, 각종의 인지질을 제조하는 방 법이 기대되었지만, 당업자의 일반적 상식은, 원료 인지질이 되는 포스파티딜콜린 등은 유용성이기 때문에, 유기용매를 사용하지 않으면 반응을 원활하게 진행시키는 것이 불가능하고, 생성되는 인지질의 수율, 작업성 등이 저하되는 것이라고 하는 것이었다.

본 발명은, 포스포리파제D를 사용한 인지질의 제조를 행할 경우에, 유기용매나 칼슘을 사용하지 않고, 간편하고 동시에 고수율로 목적으로 하는 인지질을 얻을 수 있는 제조법을 확립하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명에 의하면, 상술의 목적은, 포스파티딜기 전이반응을 이용해서 인지질을 제조하는 방법에 있어서, 원료 인지질과, 수산기를 갖는 수용체와, 포스포리파제D와, 물을 유기용매의 부존재하에서 혼합하고, 또한, 균질화 처리에 회부함으로써 균질화 혼합물을 얻는 "균질화 공정"과, 얻어진 균질화 혼합물을 15℃∼65℃에서 반응시키는 "반응공정"을 구비한 것을 특징으로 하는 인지질의 제조법에 의해 달성된다.

본 발명에 있어서는, 상기 원료 인지질과, 수산기를 갖는 수용체와, 포스포리파제D와, 물의 4성분을 잘 혼합하고, 또한 이것을 균질화 처리에 회부한다. 얻어진 균질화 혼합물은, 그 구조로서 라멜라(lamellar)형 리오트로픽(lyotropic) 액정구조를 갖고 있는 것이라 생각된다. 라멜라형 리오트로픽 액정이란, 인지질에 물을 첨가해서 형성되는 인지질 2분자막의 액정을 말한다. 본 발명에 있어서는 이 2분자막(때로는 다분자막 구조도 취한다)과 수층이 교대로 연속된 배열을 취하고 있는 것이라고 추정된다. 이 라멜라형 리오트로픽 액정구조는, 예를 들면 균질화 혼합물을 직교 니콜하에서 현미경 관찰함으로써 확인할 수 있다.

덧붙여서, 후술하는 "주로 상분리가 없는 라멜라형 리오트로픽 액정구조"는 연속한 층상의 구조물로서, "상분리된 라멜라형 리오트로픽 액정구조"는 수상에 부유된 폐환형의 구조물로서 각각 관찰된다.

이 라멜라형 리오트로픽 액정구조는, 균질화시에 원료 인지질에 물이 첨가되는 것으로, 인지질의 친수기간의 상호작용이 약해져서 결정구조가 붕괴되고, 라멜라형의 액정이 형성되는 것에 의해 발생한다. 그리고, 라멜라형 리오트로픽 액정구조를 형성함으로써, 인지질의 층상구조의 사이를 수분이 자유롭게 이동할 수 있게 되어, 수용체나 효소의 공급, 혹은 인지질로부터 유리된 극성 두부(頭部)의 제거가 효율적으로 행하여져, 전이반응이 가능하게 되는 것이라고 생각된다.

따라서, 반응생성물의 수율을 높이기 위해서는, 라멜라형 리오트로픽 액정구조를 균질화 혼합물 전체에 널리 퍼지게 하는 것이 필요하게 되지만, 그것을 위해서는 단지 각 성분을 혼합하는 것 뿐만 아니라, 균질화 처리를 행할 필요가 있다. 즉, 균질화에 의해, 라멜라형 리오트로픽 액정구조가 구조중 전체에 걸쳐 관찰되는 상태(주로 라멜라형 리오트로픽 액정구조를 갖는 상태)로 하는 것이, 높은 반응생성물량을 얻기 위해서는 바람직한 것이다.

또한, 이 라멜라형 리오트로픽 액정구조의 형성에는, 균질화 혼합물중의 수분함량이 영향을 준다. 수분함량이 일정한 범위내(예컨대, 대두 인지질에 대하여 10중량%∼100중량% 정도)일 경우에는, 균질화 혼합물은 거의 상분리가 없는 라멜라 형(니트 상)의 액정으로 되지만, 수분이 많아지면, 액체와 액정으로 이루어지는 2상으로 분리(상분리)된다. 본 발명의 방법에서는, 이 상분리가 없는 상태, 혹은 거의 상분리가 일어나지 않은 상태(양자 모두 "주로 상분리가 없는 라멜라형 리오트로픽 액정구조"라고 한다.)에서 반응을 행하면, 특히 높은 전이활성이 이루어지기 때문에 바람직하다.

한편, 균질화 혼합물중의 수분량이 많고 상분리를 일으킨 상태(상분리된 라멜라형 리오트로픽 액정구조)에서는, 액정은 불연속인 소포상태가 되어서 용매중에 표류하게 되어, 상분리가 없을 경우에 비해서 수분과 인지질의 접촉효율이 저하되고, 그 때문에 전이활성도 저하해버린다. 또한, 수분량이 지나치게 적으면, 인지질의 결정구조가 유지되어, 라멜라형 리오트로픽 액정구조를 전체에 걸쳐 형성시킬 수 없고, 결과적으로 효소반응의 장소가 없어져 버리거나, 혹은 유동성이 저하되어 기질과 효소의 접촉효율이 악화되어, 효소가 효율적으로 작용할 수 없게 되어 버린다고 생각된다.

다른 한편, 균질화 처리시에 유기용매를 첨가해버리면, 종래법인 부분의 2상계 반응과 같은 상분리(라멜라형 리오트로픽 액정구조중에서의 상분리가 아니고, 유상과 수상의 분리)가 조장될 가능성이 있다. 또한, 상기와 같이 유기용매의 첨가는 각종의 불이익을 발생하는 것이기 때문에, 균질화 처리시에도 유기용매를 사용하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 원료 인지질로서는, 인지질을 함유하는 천연물, 천연물로부터의 추출물 또는 상기 추출물을 정제한 것, 혹은 합성 인지질 등 어느 것을 사용해도 좋다. 구체적으로는, 대두 레시틴, 유채 레시틴, 난황 레시틴, 옥수수 레시틴 혹은 면실 레시틴이나, 그들의 정제물, 혹은 포스파티딜콜린(이하, "PC"라고 기재한다.), "포스파티딜에탄올아민"(이하, "PE"라고 기재한다.) 등 또는 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 그중에서도, 대두 레시틴, 유채 레시틴, 난황 레시틴, 혹은 이들의 정제물을 사용하는 것이 원료확보의 용이함이나 비용면에서 바람직하다.

또한, 본 발명의 수산기를 갖는 수용체로서는, 포스포리파제D의 존재하에서, 상기 원료 인지질의 포스파티딜기를 수용하는 것이면 된다. 예를 들면, 세린, 글리세롤, L-아스코르빈산, 글루코오스, 콜린, 에탄올아민, 1-아미노-2-프로판올, 1-오르소메틸-글루코시드 등을 들 수 있다. 목적생성물의 수율 등의 점에서 세린, 콜린, L-아스코르빈산, 글루코오스 또는 글리세롤 등이 바람직하고, 특히 세린 및 글리세롤을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 포스포리파제D(이하, "PLD"라고 기재한다.)로서는, 포스파티딜기 전이 활성을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않고, 그 형태는 유리(遊離) 혹은 화학수식한 PLD, 혹은 이온교환수지나 실리카겔 등의 담체에 고정화된 고정화 효소 등으로서 사용하는 것도 가능하다. 그중에서도 유리의 PLD를 사용했을 경우에, 반응생성물의 수율이 특히 높아지기 때문에 바람직하다.

더욱이, PLD로서는, 구체적으로는, 양배추나 당근 등의 식물유래의 PLD를 비롯하여, 방선균(放線菌), 세균, 효모, 곰팡이 등의 미생물유래의 PLD, 혹은, 동물유래의 PLD등 모두 바람직하게 사용할 수 있고, 공지의 방법에 의해 조제한 것이여 도, 시판물, 예를 들면, 양배추 유래 PLD(시그마사 제품, P7758), 땅콩 유래 PLD(시그마사 제품, P0515), 스트렙트마이세스 크로모휴스커스(Streptmyces Chromofuscus)유래의 PLD 등이여도 관계없다.

본 발명에 있어서는, 우선, 원료 인지질과, 수산기를 갖는 수용체와, PLD와, 물을 혼합하고, 또한 이 혼합물을 균질화 처리에 회부한다. 여기에서, 균질화 처리란, 최종적으로 상기 4자의 혼합물에, 물리적인 힘을 더해서 성분을 동등하게 분산시키는 것이며, 그 방법으로서는 물리적 교반, 초음파처리 등의 수단을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 바이브로믹서, 자동유발, 호모믹서, 히스코트론, 푸드프로세서, 혹은, 초음파 처리장치 등을 단독 또는 조합시켜서 사용한 균질화 처리를 채용할 수 있고, 또한, 처리량이 소량이면 마이크로스파튤라 등을 사용해서 이겨넣어도 좋다. 4성분의 혼합과 균질화 처리는 시간적으로 각각으로 해도 동시에 해도 좋고, 예를 들면, 4자를 하나씩 차례로 혼합하면서 그때마다 균질화 처리를 행하거나, 2∼4를 미리 섞거나 용해하거나 하고나서 최종적으로 균질화해도 좋다.

본 발명의 방법에 있어서, 가령 이 균질화 처리를 행하지 않으면, 생성되는 목적 인지질의 수율은 현저하게 저하되어 버린다. 이것은, 원료 인지질이 일반적으로는 실온에서 단단한 페이스트상으로 되어 있기 때문에, 단지 그 밖의 성분을 섞는 것 만으로는, 전체에 걸쳐서 라멜라형 리오트로픽 액정구조를 발생시키는 것이 곤란하고, 그 결과, 각 성분이 접촉하는 비율이 저하되어, 목적으로 하는 생성물의 수율이 저하해버리기 때문이라 생각된다. 이 때문에, 각 성분의 분산을 행할 수 있는 정도까지 물리적인 힘을 더할 필요가 있어, 소위 "균질화 처리"라 불리우는 처 리가 필요하게 되는 것이다.

균질화 처리의 때는, 수산기를 갖는 수용체는 물에 용해시켜서 사용해도 좋고, 분말로서 사용할 수도 있다. 또한, PLD도 소량의 물에 용해해서 사용하거나 혹 분말로서 사용한다. 이 때, 수용체를 제외한 3자(원료 인지질, PLD 및 물)를 미리 섞어버리면, 부생물인 포스파티드산(이하, "PA"라고 기재한다)이 생성되어 버리기 때문에, 미리 원료 인지질과 수용체를 섞고나서, 나머지의 성분을 첨가 혼합하거나, 혹은 4자 동시에 균질화 처리하는 것이 바람직하다.

또한, 상기와 같이, 균질화 처리시의 수분량은, 라멜라형 리오트로픽 액정구조의 상분리, 나아가서는 반응생성물인 인지질의 수율에 영향을 주기 때문에, 이것을 조정해 상기 상분리를 억제하는 것이 바람직하다. 수분량으로서 바람직한 범위는, 원료 인지질의 종류에 따라 다르지만, 라멜라형 리오트로픽 액정구조중의 수분함량을 원료 인지질에 대하여 l0중량%∼100중량%로 하면 상분리를 대강 억제할 수 있고, 특히 20중량%∼60중량%가 바람직하다. 한편, 여기에서 말하는 라멜라형 리오트로픽 액정구조중의 수분함량이란, 균질화 처리시에 분리한 수분을 제거한 후의 균질화 혼합물중의 수분량을 가리키고, 그 측정은 공지의 칼피셔법 등에 의해 행할 수 있다. 또한, 분리한 수분의 제거는, 상층액분리 혹은 원심분리(예컨대, 150×g, 1분간 정도)에 의해 행하면 된다.

또한, 수용체의 첨가량에 대해서도, 사용하는 수용체의 종류에 따라서 바람직한 첨가량의 범위가 다르기 때문에, 이것을 일반화하는 것은 곤란하지만, 대강 원료 인지질 1몰에 대하여, 0.3몰∼10몰, 특히, 4몰∼8몰로 하는 것이, 반응생성 물의 수율이나 작업성의 점에서 바람직하다. 다시 말해, 다량(10몰을 넘는 양)의 수용체를 첨가하면 미반응의 수용체를 회수하기 위한 노력이 늘어버리고, 한편으로, 첨가량이 적으면 목적으로 하는 생성물의 수율이 저하해버리는 것이다.

보다 구체적으로는, 수산기를 갖는 수용체로서 세린을 사용할 경우에는, 원료 인지질에 대하여 5중량%∼150중량%, 특히, 50중량%∼100중량%로 하는 것이 바람직하고, 글리세롤을 사용할 경우에는, 10중량%∼200중량%, 특히, 20중량%∼100중량%로 하는 것이 바람직하다.

또한, PLD의 첨가량은 특별히 한정되지 않고, 후의 반응공정에 있어서의 반응 시간 등을 감안하여 결정하면 되지만, 일반적으로는, 인지질 1㎏당 500∼100000units 정도이다.

또한, 균질화 처리시의 온도조건은 특별히 한정되지 않지만, 15℃∼65℃의 범위 내로 하는 것을 목표로 하는 것이 바람직하다. 15℃미만에서는 냉각에는 여분의 에너지를 필요로 하고, 균질화가 불충분하게 된다. 65℃이상에서는 인지질이 불안정하게 된다.

더욱, 균질화 처리시에는, 상기 각 성분 외에, 라멜라형 리오트로픽 액정구조를 파괴하지 않는 범위 내에서, 식용유지를 첨가할 수 있다. 유기용매와 마찬가지로 식용유지의 첨가에 의해서도 라멜라형 리오트로픽 액정구조의 2상계로의 이행이 조장되어 버리지만, 소량의 첨가이면 오히려 균질화 혼합물의 유동성이 증가하여, 목적 인지질의 수율이 향상되는 것이다. 식용유지로서는, 예를 들면 사플라워유, 대두유, 콘유, 채종유, 면실유, 해바라기유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 아마 씨유, 들깨유, 카카오버터, 야자유 등의 식물유, 혹은 버터유, 어유, 라드, 우지 등의 동물유, 중쇄 트리아실글리세롤(MCT) 등을 들 수 있고, 이들을 1종 또는 2종이상 조합시켜서 원료 인지질에 첨가혼합하고, 유동성을 부여할 수 있다. 그중에서도 MCT, 카카오버터, 대두유 등을 사용하면, 목적으로 하는 생성물의 수율이 향상되기 때문에 바람직하다.

식용유지의 첨가량은, 원료 인지질이나 첨가하는 식용유지의 종류에 따라 다르지만, 원료 인지질에 대하여 등량이하로 하는 것이 수율의 면에서 바람직하고, 특히 5중량%∼15중량%로 하는 것이 바람직하다.

또한, 헥산이나 에테르 등의 유기용매를 라멜라형 리오트로픽 액정구조를 파괴하지 않는 범위 내에서 첨가하는 것도 같은 취지에서 가능하지만, 상기한 바와 같이 유기용매의 첨가는 바람직하지 못하다.

또한, 여기에서 본 발명의 유익한 점을 지적하면, 종래, 포스파티딜기 전이반응은, 2상계 반응, 역미셀 반응, 균일상 반응의 어느 하나로 행하여져 왔지만, 이 중 2상계 반응 및 역미셀 반응에 있어서는, 반응계를 유지하기 위해서, 인지질에 대하여 5배(용량/중량)이상의 용매를 첨가할 필요가 있었다. 이것에 대하여 본 발명에서는, 인지질에 대하여 1배이하의 용매를 첨가하면 되기 때문에, 동량의 인지질을 제조하는데 필요한 장치의 용량을 작게 할 수 있다.

균일상 반응에서는, 인지질에 대하여 2배(용량/중량)이상의 용매를 첨가하기 때문에, 인지질에 대하여 3배(용량/중량)이상의 용량을 갖는 반응장치를 사용할 필요가 있는 것에 더해, 균일상을 유지하기 위해서 수용체의 첨가량이 제한되기 때문 에, 목적물을 고함량으로 함유하는 반응생성물을 얻는 것이 어려웠다. 예를 들면, PS를 제조할 경우, 인지질 1㎏에 첨가할 수 있는 세린량은 0.15㎏이며, 반응생성물 인지질중의 PS함량은 35%가 한계이었다. 이것에 대하여 본 발명의 방법에서는, 인지질 1㎏에 1㎏이상의 세린을 첨가하는 것도 가능해서, 결과적으로 인지질중에 48%이상의 PS를 함유하는 반응생성물을 얻을 수 있었다. 즉, 균일상 반응에 비해서 본 발명에 따르면, 동량의 인지질을 제조하는데 필요한 장치의 용량을 작게 할 수 있는 것에 더해서, 목적물의 함량이 높은 반응생성물을 얻을 수 있는 이점이 있다.

더욱, 종래의 포스파티딜기 전이반응은 모두 반응계에 에테르, 톨루엔, n-헥산, 초산에틸 등 유기용매를 사용할 필요가 있었지만, 본 발명에서는 유기용매를 사용할 필요가 없어, 식품등, 유기용매의 사용이 제한된 물질의 제조에 적합하다. 또한, 본 발명에 따르면, 종래법에서 사용되고 있었던 칼슘이온을 첨가하지 않더라도 반응이 진행된다. 그 이유는 명확하지 않지만, 2상계 반응 등에서는, 반응이 액체중에서 행해지고 있는 것에 대해, 본 발명에서는 액정중에서 행해지고 있기 때문에, 칼슘의 유무에 관계없이 원료 인지질이, 전이반응을 받기 쉬운 구조를 취하는 것이라고 추정된다.

본 발명에 있어서는, 상기와 같이 해서 얻어진 균질화 혼합물을 유기용매의 부존재하에서 반응시켜, 목적으로 하는 인지질을 제조한다. 반응은 15℃∼65℃, 특히 45℃∼55℃에서 행하는 것이 바람직하다. 15℃미만에서는, 반응의 진행이 촉진되지 않아 목적 인지질의 수율이 저하해버리고, 65℃이상에서는, 인지질, 예를 들면 생성된 포스파티딜세린이 분해나 산화 등의 부반응을 일으킬 가능성이 있기 때 문이다.

반응시간은 특별히 한정되지 않고, 반응온도나 사용하는 성분의 종류, 그들의 양 등에 맞추어 바람직한 조건을 선택하면 되고, 목적 인지질의 수율이나 부생물인 PA의 생성량 등의 점에서는 1∼48시간 정도가 바람직하다.

반응은, 정치 혹은 교반하 등 어떤 상태에서 행해도 좋고, 예를 들면 탁상형 만능믹서(KINMIX MAJOR, KM-230)를 사용하여, 교반하면서 행할 수 있다.

본 발명 방법에 의한 인지질의 제조에 있어서, 원료 인지질에 적량의 물이 혼합됨으로써, 상분리가 없는 라멜라형 액정상태가 형성되어, 인지질의 층상구조의 사이를 수분이 자유롭게 이동할 수 있다. 따라서, 수산기를 갖는 수용체나 효소의 공급, 혹은 인지질로부터 유리된 극성 두부의 제거가 효율적으로 행하여지기 때문에, 높은 전이활성이 달성되어 저렴, 간편하며 수율이 좋게, 목적으로 하는 인지질을 얻는 것이 가능하게 된 것이다.

본 발명에 의해 얻어진 인지질은, 부생물인 PA 외에도, 원료 인지질이나 수용체중의 불순물 등이 포함될 경우가 있고, 얻어진 인지질은 대부분의 경우에 목적 인지질 이외의 다른 인지질을 비롯해서 불순물이 혼입되어 있는 혼합물이다.

그 때문에, 전이반응으로 얻어진 전이형 인지질은 적당한 정제처리공정에 회부하여, 불순물을 제거하여 사용하는 것이 바람직하지만, 투여상의 문제나 효과를 저해하는 것 같은 문제가 없는 한, 원료유래나 제조공정에서의 불순물을 포함한 채 사용해도 좋다. 정제의 방법은 특별히 한정되지 않고, 통상적 방법에 따라 용제에 의한 분획이나, 크로마토그래피 등을 적당히 조합시켜서 행하면 된다.

이렇게 해서 얻어지는 본 발명의 인지질은 의약품, 식품, 화장품 등의 형태로 투여하는 것도 가능하다. 예를 들면 인지질의 생리효과를 소구(訴求)하는 의약품 형태로 사용할 경우이면, 캡슐제, 과립제, 정제, 가루약 등의 고형제제, 혹은 시럽제 등의 액상제제로서 경구투여 할 수 있다. 또한, 경구투여제가 아니더라도, 주사제, 피부외용제, 직장투여제 등 비경구형태로 투여하는 것도 가능하다.

각 제제의 제조시에는, 유당, 전분, 결정셀룰로스, 유산칼슘, 메타규산알루민산마그네슘, 무수규산 등의 부형제(賦形劑), 백당, 히드록시프로필셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제, 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스칼슘 등의 붕괴제, 스테아린산마그네슘, 탤크 등의 윤활제나 기타 의약적으로 허용되는 성분을 적절히 사용하면 된다.

또, 같은 생리효과를 기대해서 식품형태로 사용할 경우에는, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 인지질을 그대로 혹은 적당히 정제처리한 것을 유지, 입상과자, 발효유, 엿, 조미료, 뿌려먹는 식품 등의 음식품에 첨가하여, 통상적인 방법을 사용해서 제조하면 된다.

이들 의약품, 식품 등의 형태에서의 사용시에는, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 인지질을 적당히 배합할 수 있다. 또, 인지질의 생리효과를 소구할 경우라면, 그 효과를 얻을 수 있고 또한 과잉섭취 등의 문제가 생기지 않을 정도의 양을 배합하면 된다. 예를 들면, 인지질로서 포스파티딜세린을 생성시켰을 경우에는, 50㎎∼1000㎎/일 정도의 섭취가 예상되는 양을 적당히 배합해 두면 되는 것이다.

또한, 본 발명의 인지질은 유화제로서 사용해도 좋고, 그 때에는, 의약품, 식품, 화장품 등으로 0.01∼10% 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 의해 얻어진 인지질 중, 특히 포스파티딜세린을 함유하는 인지질 혼합물로부터 포스파티딜세린을 정제하는 처리방법으로서는, 포스파티딜세린을 함유하는 인지질 혼합물을 알콜류에 용해한 후, 그 용해액중에 금속염을 첨가함으로써 포스파티딜세린을 불용화시키고, 그 불용부를 분리함으로써, 본 발명에 의해 얻어진 포스파티딜세린을 함유하는 인지질 혼합물로부터 포스파티딜세린을 간편하게 농축할 수 있다.

사용할 수 있는 금속염으로서는, 리튬염, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 금속염, 혹은 이들을 풍부하게 함유하는 천연물, 예를 들면, 식염, 간수, 함수, 돌로마이트, 식용 진주층분말 등 어느 것을 사용해도 좋지만, 리튬염, 나트륨염 또는 칼륨염을 사용하는 것이 농축효율의 점에서 바람직하고, 특히 염화 리튬, 염화나트륨 또는 염화칼륨이 바람직하다. 이들 금속염은, 1종 또는 2종이상을 조합시켜서 사용할 수 있다.

이들 금속염의 첨가량은, 포스파티딜세린을 침전시킬 수 있는 양이면 특별히 한정되지 않지만, 인지질 1g당, 0.15∼10밀리몰, 특히 0.5∼5밀리몰인 것이, 포스파티딜세린의 회수율 및 침전중의 포스파티딜세린 함량이 높은 점에서 바람직하다.

또한, 알콜류로서는, 인지질 혼합물을 용해가능한 알콜류이면 모두 바람직하게 사용할 수 있지만, 그중에서도 메틸알콜, 에틸알콜, 부틸알콜, 프로필알콜, 이소프로필알콜 등의 저속 알콜류가 바람직하다. 또한, 이들의 혼합물을 이용하는 것도 가능하지만, 에틸알콜은 식품으로 이용하기 쉽고, 안전면에서의 문제도 적기 때 문에, 이것을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

인지질 혼합물을 알콜류에 용해할 때의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 이 혼합물을 완전히 용해할 수 있는 이상의 양으로 하는 것이 바람직하고, 알콜류의 중량에 대하여 1∼50%, 특히 2∼20%로 하는 것이, 포스파티딜세린 농축효율이나 조작성의 점에서 바람직하다.

인지질 혼합물로부터의 포스파티딜세린의 농축은, 예를 들면 이하와 같이 해서 행할 수 있다. 우선, 포스파티딜기 전이반응법 등에 의해 조제되어, 포스파티딜세린 이외의 인지질을 성분중에 포함하는 인지질 혼합물을, 에틸알콜 등의 알콜류에 용해한다. 이 때, 용해온도 등의 용해의 조건은 특별히 한정되지 않고, 혼합물의 성분의 종류, 그들의 양 등에 맞추어 바람직한 조건을 선택해서 사용하면 된다.

이렇게 해서 얻어진 용액중에서는, 포스파티딜세린이나 PC, PA 등의 인지질은 용매층으로 추출되지만, 경우에 따라서는 일부의 불용성 성분이 생성된다. 이 때문에, 원심분리, 여과 등의 수단에 의해 용매로부터 불용성 성분(침전물, 응집물 등)을 제거하고나서 금속염의 첨가를 행한다. 불용성 성분중에도 소량의 포스파티딜세린이 잔존하고 있는 경우에는, 상기 알콜류에 의한 추출처리는, 몇번 반복하여 행하여도 좋다.

다음에, 알콜 용액에 대하여 금속염을 첨가하고, 용매층에 추출된 포스파티딜세린을 분획한다. 다시 말해, 용매층중의 포스파티딜세린 이외의 인지질의 대부분은, 금속염의 첨가에 의해서도 침전되지 않지만, 포스파티딜세린은 그 대부분이 침전되기 때문에, 이것을 회수함으로써 포스파티딜세린의 농축을 행할 수 있다. 이 때, 금속염은 분말인채로 첨가해도, 물이나 알콜 등의 용매에 녹이고나서 첨가해도 좋다. 그 때의 각종 조건도 특별히 한정되지 않고, 혼합물의 성분의 종류, 그들의 양 등에 맞추어 바람직한 조건을 선택하면 된다. 구체적으로는 10℃∼30℃에서 30분이상 유지해서 PS를 불용화시키면 된다.

금속염의 첨가에 의해 불용화된 포스파티딜세린은, 원심분리, 여과, 정치분리 등의 수단에 의해 회수할 수 있다. 또한, 공지의 정제수단, 예를 들면 칼럼크로마토그래피 등의 수단에 의해, 더욱 정제하는 것도 가능하다. 본 발명의 포스파티딜세린 농축물은 다른 인지질 등의 함량이 현저하게 저하되어 있기 때문에, 이러한 정제수단도 비교적 간편하게 행할 수 있다.

도 1은 MCT의 최적첨가량을 검토한 결과를 나타내는 선도이며, 종축 A는 PS생성율(%), 횡축 B는 인지질에 대한 MCT 첨가량(%)이다.

도 2는 MCT의 최적첨가량을 검토한 결과를 나타내는 그래프이며, 종축 C는 인지질에 대한 MCT 첨가비율(%), 횡축 D는 PS생성율(%)이다.

도 3은 균질화 혼합물중의 인지질에 대한 세린의 몰비를 검증한 결과를 나타내는 선도이며, 종축 E는 PS생성율(%), 횡축 F는 인지질에 대한 세린의 몰비다.

도 4는 균질화 혼합물중의 인지질에 대한 물의 중량비를 검증한 결과를 나타내는 선도이며, 종축 G는 PS생성율(%), 횡축 H는 물/인지질(중량%)이다.

도 5는 균질화 혼합물중의 인지질에 대한 물의 중량비를 검증한 결과를 나타내는 선도이며, 종축 I은 PS생성율(%), 횡축 J는 물/인지질(중량%)이다.

도 6은 균질화 혼합물중의 인지질에 대한 물의 중량비를 검증한 결과를 나타내는 선도이며, 종축 K는 PS생성율(%), 횡축 L은 물/인지질(중량%)이다.

도 7은 각 반응온도에 있어서의 PS생성율을 나타내는 선도이며, 종축 M은 PS생성율(%), 횡축 N은 온도(℃)이다.

이하에, 실시예를 들어서 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것이 아니다.

실시예 1(기본)

대두 레시틴과 코코아버터의 혼합물(NATHIN 250, 센트랄소야사 제품) 100g에 6.7M의 L-세린 수용액(0.18M 염화칼슘 첨가 혹은 비첨가) 97g을 자동유발(ANM-150형)을 사용해서 이겨넣어(균질화 처리) 55℃에서 보온했다. 또한, 스트렙트마이세스속 방선균 유래의 포스포리파제D-Y1(PLD-Y1, (주)야쿠루트 혼샤 제품) 800units를 함유하는 효소액 2.0㎖를 혼합하여, 자동유발을 사용해서 이겨넣고(균질화 처리), 유기용매가 전혀 존재하지 않는 조건하에서 반응을 개시했다. 반응중은 교반하, 55℃에서 17시간 행하여, 포스파티딜기 전이반응을 완료시켰다.

얻어진 반응물을 실리카겔 박층 크로마토그래피로 분석한 결과, 0.18M 염화칼슘 첨가의 경우, 전체 인지질중의 47.9%(몰%)가 포스파티딜세린으로 변환되어 있었다. 한편, 염화칼슘 비첨가의 경우에도 전체 인지질중의 44.5%는 포스파티딜세린으로 변환되고 있어, 이 반응계에 있어서 칼슘을 첨가하지 않더라도 포스파티딜기 전이반응이 진행되는 것이 명확하게 되었다. 또한, 반응개시전의 균질화 혼합물을 직교 니콜하에서 현미경 관찰한 결과, "주로 상분리가 없는 라멜라형 리오트로픽 액정구조"가 관찰되었다.

이상과 같이, 본 발명은 유기용매를 사용하지 않고 포스파티딜기 전이반응을 행하는 방법을 제공하는 것이다. 즉, 인지질에 수산기를 갖는 수용체와 포스포리파제D를 함유하는 수용액을 균질화해서 반응시킴으로써, 효율적으로 포스파티딜기 전이반응물을 만드는 것이 가능하다.

이때에 유기용매는 일체 첨가할 필요는 없지만, 인지질에 유기용매 이외의 지용성 물질, 예를 들면, 사플라워유, 대두유, 콘유, 채종유, 면실유, 해바라기유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 아마씨유, 들깨유, 카카오퍼터, 야자유 등의 식물유, 혹은, 버터유, 어유, 라드, 우지 등의 동물유, 혹은 중쇄 지방산을 출발재료로 해서 합성된 글리세리드 유도체 등인 MCT 등의 식용유지를 첨가함으로써, 조작성을 향상시키는 것은 가능하다.

실시예 2(칼슘 첨가의 유무)

실시예 1에서 나타낸 바와 같이, 칼슘을 첨가하지 않더라도 포스파티딜기 전이반응이 진행되는 것이 명확하게 되었지만, 칼슘 첨가의 유무를 다시 검증했다. 인지질에 대한 세린의 몰비를 1 또는 5로 하고, 표 1에 나타내는 바와 같은 칼슘 첨가, 비첨가의 조건으로 각 성분을 혼합하고, 마이크로스파튤라를 사용해서 이겨넣어서(균질화 처리), 55℃에서 18시간의 반응을 행하였다. 또한, 몰비 1은 2.5M의 세린 수용액, 몰비 5는 4.5M의 세린 수용액을 사용했다. 구체적으로는, NATHIN 250과 세린 수용액(칼슘 첨가의 경우는 세린 수용액에 용해)을 혼합후, PLD-Y1 수용액을 첨가해서 반응을 개시했다.

반응생성물의 양을 실시예 1과 마찬가지로 측정했다. 표 2에 나타내는 바와 같이, 칼슘 비첨가의 경우, PS생성율은 첨가했을 경우에 비해 다소 적었지만 거의 동등한 값을 얻을 수 있었다. 또한, 반응개시전의 균질화 혼합물을 각각 직교 니콜하에서 현미경 관찰한 바, 모두 "주로 상분리가 없는 라멜라형 리오트로픽 액정구조"가 관찰되었다. 한편, 표에 있어서, PA는 포스파티드산, PE는 포스파티딜에탄올아민, PI는 포스파티딜이노시톨을 나타낸다.

세린/인지질(몰비)	1		5
칼슘 첨가	무	유	무	유
NATHIN 250 (g)	10	10	10	10
세린 (g)	0.8	0.8	4.0	4.0
염화칼슘 (g)	-	0.04	-	0.19
물 (g)	2.6	2.6	5.7	5.7
PLD-Y1 (units)	82.2	82.2	82.2	82.2

칼슘첨가의 유무

세린/인지질(몰비)	1		5
칼슘 첨가	무	유	무	유
PA (몰%)	13.0	11.8	10.9	11.0
PE (몰%)	4.7	3.3	3.2	2.7
PS (몰%)	34.5	35.5	44.2	47.4
PC (몰%)	31.0	32.2	25.0	21.4
기타 인지질(몰%)	16.9	17.1	16.7	17.5

이상의 것으로부터, 본 발명에 있어서는, 칼슘 첨가의 유무에 관계없이 좋은 수율을 얻을 수 있는 것이 판명되었다. 이것으로부터, 본 발명의 방법에서는, 유기용매를 사용한 포스파티딜기 전이반응에서 많은 경우 사용되고 있던, 반응계중으로의 칼슘 첨가를 필요로 하지 않는 것을 알았다.

실시예 3(트리글리세리드를 함유하지 않는 인지질을 기질로 했을 때의 반응)

NTHIN 250(센트랄소야사 제품) 50g에 특급 아세톤 500㎖를 첨가하고, 60℃로 가온하여 용해한 후, 15℃로 냉각했다. 생긴 침전에 특급 아세톤 300㎖를 첨가하고, 60℃로 가온하여 용해한 후, 15℃로 냉각함으로써, 트리글리세리드를 전혀 포함하지 않고 인지질만으로 이루어지는 침전물을 얻었다. 이 침전물의 건조 품(NATHIN 250 아세톤침전물이라고 칭한다) 6g에 4.5M의 L-세린 수용액(0.18M 염화칼슘 첨가 혹은 비첨가) 5.8g을 이겨넣어(균질화 처리), 55℃에서 보온했다. 또한, 포스포리파제D Y-1((주)야쿠루트 혼샤 제품) 49.3units를 함유하는 효소액 0.2㎖를 혼합하고, 마이크로스파튤라를 사용해서 이겨넣어(균질화 처리), 즉시 반응을 개시해서 17시간 55℃로 유지하고, 포스파티딜기 전이반응을 완료시켰다.

NATHIN 250 아세톤침전물을 기질로 사용한 PS 산생반응(기질조성)

세린/인지질 (몰비)	5
칼슘 첨가	무	유
NATHIN 250 아세톤침전물 (g)	6.0	6.0
세린 (g)	2.4	2.4
염화칼슘 (g)	-	0.1
물 (g)	3.4	3.4
PLD-Y1 (units)	49.3	49.3

얻어진 반응물을 실리카겔 박층 크로마토그래피로 분석한 결과, 0.18M 염화칼슘 첨가의 경우, 전체 인지질중의 41.7%가 포스파티딜세린으로 변환되어 있었다. 한편, 염화칼슘 비첨가의 경우에도 전체 인지질중의 35.1%는 포스파티딜세린으로 변환되어 있었다. 또한, 반응개시전의 균질화 혼합물을 직교 니콜하에서 현미경관찰한 결과, "주로 상분리가 없는 라멜라형 리오트로픽 액정구조"가 관찰되었다. 표 3은 기질조성을, 표 4는 아세톤침전물을 기질에 사용한 PS 전이반응의 결과를 나타낸다.

NATHIN 250 아세톤침전물을 기질로 사용한 PS산생반응(반응정제물 인지질 조성)

세린/인지질 (몰비)	5
칼슘 첨가	무	유
PA (몰%)	9.0	10.2
PE (몰%)	2.7	1.9
PS (몰%)	35.1	41.7
PC (몰%)	35.3	28.8
기타 인지질 (몰%)	17.9	17.4

실시예 4

NATHIN 250 아세톤침전물에 MCT(파나세이트 810; 글리세린 지방산에스테르, 일본유지(주) 제품)를 중량비로 1∼9% 이겨넣은 혼합물을 원료 인지질로 하고, NATHIN 250 아세톤침전물 500㎎에 대하여 세린 200㎎과, 물 200㎕(인지질과 물의 중량비 0.4)를 더 이겨넣고, PLD-Y1 수용액(4.1units/15㎕)을 첨가하여, 마이크로스파튤라를 사용해서 이겨넣어(균질화 처리), 55℃, 17시간 반응시켰다. 반응 종료후의 포스파티딜세린을 실리카겔 박층 크로마토그래피에 의해 측정했다.

도 1은 MCT의 최적첨가량을 검토한 결과를 나타내는 선도이다. 도 1에 나타내는 바와 같이, MCT를 50㎎(인지질에 대하여 9%) 첨가하는 것에 의해, 무첨가의 경우에 비해서 PS생성율이 34.7%에서 40.4%로 증가하여, MCT의 첨가효과가 확인되었다. MCT의 혼합비를 10%∼40%로 해서 마찬가지로 반응시켰다. 도 2는 MCT의 최적첨가량을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2에 나타낸 바와 같이 10%∼40%의 MCT를 첨가한 모든 경우에 PS산생율이 향상되었다. 도 1 및 도 2로부터, MCT의 첨가량은 9%∼40%가 바람직한 범위로 생각되었다. 또한, 반응개시전의 균질화 혼합물 각각을 직교 니콜하에서 현미경 관찰한 바, 모두 "주로 상분리가 없는 라멜라형 리오트로픽 액정구조"가 관찰되었다.

실시예 5(인지질에 대한 세린의 몰비)

500㎎의 NATHIN 250에 2.5M 세린 수용액(0.18M 염화칼슘 함유)을 인지질에 대한 세린의 몰비가 0.1∼15로 되도록 첨가하고, 60℃의 수욕중에서 따뜻하게 하면서 믹서로 교반혼합했다. 수욕의 온도를 55℃로 낮춘 후에, 반응기질에 PLD-Y1 수용액을 첨가하고, 마이크로스파튤라 또는 바이브로믹서로 혼합, 및 균질화 처리를 행했다. 55℃에서 17시간 반응하고, 반응물의 인지질 조성을 실리카겔 박층 크로마토그래피에 의해 분석하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이 인지질에 대한 세린의 몰비가 0.3이상일 때에는 반응 생성물중의 PS함량은 20%이상이며, PS의 제조에 적합한 조건인 것을 알았다. 특히 몰비가 4이상인 경우는 PS함량이 45%이상이며, 특히 적합한 기질조성이라 생각된다. 단, 몰비가 10이상인 경우, 세린량을 증가시켜도 PS생성량은 향상되지 않고, 몰비 10까지가 효율적으로 포스파티딜세린을 제조하는 점에서의 상한이라 생각되었다. 또한, 반응개시전의 균질화 혼합물(몰비 0.3∼10의 것)을 직교 니콜하에서 현미경 관찰한 바, 모두 "주로 상분리가 없는 라멜라형 리오트로픽 액정구조"가 관찰되었다.

또한, 세린의 몰비가 6이상인 경우에는, 첨가하는 수분량은 인지질에 대하여 100중량부 이상이 되었지만, 첨가한 수분 중 분리된 것을 상층액분리에 의해 제외하였더니, 실제의 균질화 혼합물중의 수분량은 100중량부 이하이었다(칼피셔법에 의해 측정).

실시예 6(인지질에 대한 물의 중량비)

대두 레시틴(NATHIN 250 아세톤침전물 또는 PC80:크로크란사 제품) 혹은 난황 레시틴(PL-100LE:큐피(주) 제품) 500㎎에 L-세린 분말 200㎎을 첨가하고, 약 60℃로 가온한 유발로 잘 혼합한 후, 도 4∼6에 나타낸 수분함량으로 증류수를 이겨넣고, 55℃에서 보온했다. 또한, PLD-Yl((주)야쿠루트 혼샤 제품) 4.1 units를 포함하는 효소액 0.015㎖를 혼합해서 마이크로스파튤라를 사용해서 이겨넣어(균질화 처리), 반응을 개시하고, 정치상태로 17시간 55℃로 유지해 포스파티딜기 전이반응을 완료시켰다. 한편, 균질화 혼합물중의 수분함량은 칼피셔법에 의해 측정했다.

얻어진 반응물을 실리카겔 박층 크로마토그래피로 분석하고, 횡축을 물/대두 레시틴 중량%(대수 눈금), 종축을 반응생성물의 PS함량(%)으로서 도시하였다. 도 4∼6은 그 결과를 나타내는 선도이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, NATHIN 250 아세톤침전물을 원료 인지질로 사용했을 경우에는, 균질화 혼합물중의 물/인지질 중량%가 3%인 때에는 PS는 전혀 산생되지 않지만, 10%∼100%의 범위에서는 인지질의 10%이상이 PS로 변환되고 있어, PS 의 산생에 적합한 물/인지질 중량%인 것을 알 수 있었다. 또한, 물/인지질 중량%가 20%∼70%의 범위에서는 인지질의 30%이상이 PS로 변환되고 있어, PS의 산생에 가장 적합한 물/인지질 중량비인 것을 알 수 있었다. 각 균질화 혼합물을 직교 니콜하에서 현미경 관찰한 결과, PS의 산생에 적합한 물/인지질 중량%인 10%∼100%의 범위에서는, "주로 상분리가 없는 라멜라형 리오트로픽 액정구조"가 관찰되는 것이 확인되었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, PC80을 원료 인지질에 사용했을 경우에는, 균질화 혼합물중의 물/인지질 중량%가 8%일 때에는 PS는 거의 산생되지 않지만, 10%∼60%의 범위에서는 인지질의 10%이상이 PS로 변환되고 있어, PS의 산생에 적합한 물/인지질 중량%인 것을 알 수 있었다. 또한, 물/인지질 중량%가 20%∼40%의 범위에서는 인지질의 20%이상이 PS로 변환되고 있어, PS의 산생에 가장 적합한 물/인지질 중량비인 것을 알 수 있었다. 각 균질화 혼합물을 직교 니콜하에서 현미경관찰한 결과, PS의 산생에 적합한 물/인지질 중량%인 10%∼60%의 범위에서는, "주로 상분리가 없는 라멜라형 리오트로픽 액정구조"가 관찰되는 것이 확인되었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 난황 레시틴을 원료 인지질로 사용했을 경우에는, 균질화 혼합물중의 물/인지질 중량%가 8%일 때에는 PS는 거의 산생되지 않지만, 15%∼40%의 범위에서는 인지질의 10%이상이 PS로 변환되고 있어, PS의 산생에 적합한 물/인지질 중량%인 것을 알 수 있었다. 한편, 물/인지질 중량%가 20%∼35%의 범위에서는 인지질의 20%이상이 PS로 변환되고 있어, PS의 산생에 가장 적합한 물/인지질 중량비인 것을 알 수 있었다. 각 균질화 혼합물을 직교 니콜하에서 현미경관찰한 결과, PS의 산생에 적합한 물/인지질 중량%인 15%∼40%의 범위에서는, "주로 상분리가 없는 라멜라형 리오트로픽 액정구조"가 관찰되는 것이 확인되었다.

실시예 7(PS 이외)

60℃로 한 수욕하에서, 500㎎의 PC80에 표 5에 기재한 각 수용체 수용액 490㎎을 혼합하고, 13.7 units의 PLD(PLD-Y1) 수용액 50㎕를 첨가하여 마이크로스파튤라를 사용해서 이겨넣고(균질화 처리), 이어서 55℃ 18시간 반응하여, 포스파티딜기 전이반응물의 생성을 실리카겔 박층 크로마토그래피에 의해 조사했다.

세린 이외의 수용체에서의 전이반응

사용한 수용체	수용액 농도 %(W/W)	pH	수용체 전이 레시틴 생성율(%)
글리세롤	50	5.9	42.7
L-아스코르빈산	41	5.0	9.4
아스코르빈산 인산에스테르 마그네슘염	17	6.7	0.0
아스코르빈산 인산에스테르 나트륨염	50	7.0	0.0
이노시톨	17	6.5	0.0
글루코오스	50	5.0	13.3
트레할로스	50	5.3	0.0

표 5는 각 수용체에서의 전이반응 후의 전이반응물의 생성율을 나타낸다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 수용체로서 글리세롤, L-아스코르빈산, 글루코오스를 사용했을 때에는, 각각에 대한 포스파티딜기 전이반응물이 생성되었다(포스파티딜글리세롤 42.7%, 포스파티딜아스코르빈산 9.4%, 포스파티딜글루코오스 l3.3%). 한편, 이노시톨, 아스코르빈산 인산에스테르, 트레할로스를 사용했을 경우에는 포스파티딜기 전이반응물은 생성하지 않았다.

실시예 8(반응온도)

NATHIN 250 아세톤침전물(PL) 500㎎, 혹은 NATHIN 250 아세톤침전물 450㎎에 MCT 50㎎을 첨가해서 조제한 인지질 기질(PL+TG)에 4.5M 세린 수용액을 490㎎ 첨가해서 60℃에서 이겨넣고, 또한 4.1 units의 PLD-YI 수용액 15㎕ 첨가후, 마이크로스파튤라를 사용해서 이겨넣으며(균질화 처리), 이어서 15℃∼65℃까지 10℃ 간격의 각종 온도로 각각 18시간 반응시켰다. 포스파티딜기 전이반응물의 생성은 실리카겔 박층 크로마토그래피에 의해 해석하였다.

도 7은 각 반응온도에 있어서의 PS생성율을 나타내는 선도이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, NATHIN 250 아세톤침전물에 MCT를 첨가한 것을 기질로 사용했을 경우에는, 45℃에서의 PS생성율은 43%이며 그 이상 온도를 올려도 변화가 없었다.

한편, NATHIN 250 아세톤침전물을 기질로 사용했을 경우에는 45℃에서의 PS생성율은 30.1%이었던 것에 대해, 65℃에서는 38.7%이며, 반응온도가 높을수록 좋은 성적이 얻어졌다. 또한, 반응온도가 65℃를 초과하면 PS산생량이 저하하는데다가, 인지질이 변성·분해될 우려가 있으므로, 65℃가 상한이라고 생각되었다.

실시예 9(아기양배추(brussels sprouts) PLD)

500㎎의 NATHIN 250에 4.5M 세린 수용액(칼슘첨가의 계에서는 염화칼슘 9.3㎎을 첨가)을 490㎎ 첨가하여 55℃로 혼합했다. 반응액의 온도를 45℃로 냉각하고 나서, 공지의 순서에 의해 따로 얻은 아기양배추 PLD의 효소액(0.6units/㎖)을 200㎕ 첨가하고, 45℃에서 18시간 반응시켰다.

그 결과, 칼슘을 첨가하지 않았을 경우, 반응은 거의 진행되지 않은 것에 대하여, 칼슘을 첨가했을 경우에는 진행하여 PS함량 6.2%의 반응생성물이 얻어졌다.

실시예 10(포스파티딜세린의 농축1)

PC함량 40%의 대두 레시틴 200g에 세린 수용액 190g(세린 70g + 물 120g)과 포스포리파제D(PLD-Y1, (주)야쿠루트 혼샤 제품) 수용액(24㎎/㎖)을 10㎖ 이겨넣어서 55℃에서 5시간 반응시킨 결과, 인지질중의 PS함량이 46.7%인 반응생성물을 얻을 수 있었다.

반응생성물 5.0g에 에틸알콜 20㎖를 첨가해서 45℃로 추출후, 잔사(침전)를 더욱 에틸알콜 5㎖로 2회 추출하였다. 3회의 추출액을 혼합하고, 그 중의 5㎖에 25% 식염수 0.20㎖를 첨가해서, 45℃로 가온한 후, 실온에 방치해서 침전을 형성시켰다. 그 결과, 상청중의 PS함량은 건조고형분중 3.3%이었던 것에 대해서, 침전물에서는 62.1%이며, PS는 침전부에 효율적으로 농축되는 것을 알았다.

실시예 11(포스파티딜세린의 농축2)

실시예 10에서 조제한 추출액의 혼합물 5㎖에 초산나트륨분말 50㎎을 첨가하여 45℃로 가온한 후, 실온에 방치해서 침전을 형성시켰다. 그 결과, 상청중의 PS함량은 건조고형분중 3.5%이었던 것에 대해서, 침전물에서는 61.8%이며, 식염수를 사용했을 경우와 같이, PS는 침전부에 효율적으로 농축되는 것을 알았다.

실시예 12(포스파티딜세린의 농축3)

실시예 10에서 조제한 추출액의 혼합물에 대하여 25% 식염수를 첨가하여 PS의 불용물을 형성시키고, 침전 인지질중의 PS함량과, 침전부에 회수되는 PS양을 측정했다. 그 결과로서, 식염첨가량과 침전에의 PS회수율 및 인지질중의 PS함량의 관계를 표 6에 나타낸다.

표 6에 나타낸 바와 같이, 어느 조건에서도 PS는 침전획분으로 농축되었지만, 특히 추출액 혼합물중의 인지질 1g당 첨가하는 식염의 양이 10밀리몰 이하의 범위에 있어서, 침전 인지질중의 PS함량은 55%이상이며, 침전부에 PS가 효율적으로 농축되어 있었다. 한편, 식염첨가량이 0.05밀리몰 이하의 경우에는, 침전에의 PS의 회수율은 60%이하이며, 40%이상이 상청부에 존재하고 있었다. 이상의 결과로부터, 어느 첨가량에서도 PS를 침전에 농축하는 것이 가능하지만, 알콜에 용해한 인지질 1g에 대한 식염의 첨가량이 0.15∼10밀리몰의 범위가 특히 실용에 적합한 첨가량이라 생각되었다.

식염첨가량과 침전에의 PS회수율 및 인지질중 PS함량의 관계

식염첨가량 (m ㏖/g 인지질)	침전획분으로의 PS 회수율(%)	침전 인지질중 PS함량(%)	상청 인지질중 PS함량(%)
무첨가 0.05 0.15 0.25 0.50 1.25 2.5 5 10 25 50	- 53.7 73.8 80.4 96.2 97.4 96.6 97.1 95.7 97.8 97.7	- 64.7 66.7 69.3 63.8 63.5 62.7 59.8 55.0 47.2 46.6	43.2 33.4 28.2 18.0 6.2 4.3 6.1 6.4 10.5 12.0 13.5

Claims (11)

1. 포스파티딜기 전이반응을 이용해서 인지질을 제조하는 방법에 있어서, 원료 인지질과, 수산기를 갖는 수용체와, 포스포리파제D와, 원료 인지질에 대하여 10중량%~100중량%의 물을, 유기용매의 부존재하에서 혼합하고, 또한 균질화 처리에 회부함으로써 균질화 혼합물을 얻는 균질화 공정; 및

   얻어진 균질화 혼합물을 15℃∼65℃에서 반응시키는 반응공정을 구비한 것을 특징으로 하는 인지질의 제조법.
2. 제1항에 있어서, 상기 균질화 공정에 있어서 얻어지는 균질화 혼합물이, 라멜라형 리오트로픽 액정구조를 갖는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조법.
3. 삭제
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 균질화 공정에 있어서의 수산기를 갖는 수용체의 첨가량이, 원료 인지질 1몰에 대하여 0.3몰∼10몰인 것을 특징으로 하는 인지질의 제조법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 수산기를 갖는 수용체가, 세린, 글리세롤, L-아스코르빈산, 글루코오스 및 콜린으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 인지질의 제조법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 수산기를 갖는 수용체가 세린이고, 생성되는 인지질이 포스파티딜세린인 것을 특징으로 하는 인지질의 제조법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 균질화 공정에 있어서의 균질화 처리시에, 식용유지를 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조법.
8. 제6항에 있어서,

   얻어진 포스파티딜세린을 함유하는 인지질 혼합물을 알콜류에 용해하는 용해 공정; 및

   상기 용해액중에 금속염을 첨가함으로써 포스파티딜세린을 불용화시키고, 그 불용부를 분리하는 불용화공정을 더 구비한 것을 특징으로 하는 인지질의 제조법.
9. 제8항에 있어서, 상기 금속염으로서, 리튬염, 칼륨염 및 나트륨염으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조법.
10. 제8항에 있어서, 상기 금속염으로서, 염화리튬, 염화칼륨 또는 염화나트륨을 사용하는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조법.
11. 제8항에 있어서, 상기 알콜류로서 에틸알콜을 사용하는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조법.

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