KR101949741B1 - 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법 - Google Patents

피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 효소촉매 반응을 이용하여 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤에 관한 것이다. 본 발명에 따른 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법은 특정 반응매질 및 특정 촉매 효소를 사용함으로써, 피놀렌산이 고농도로 함유된 모노갈락토실디아실글리세롤을 효과적으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 모노갈락토실디아실글리세롤은 다양한 기능성을 가진 피놀렌산을 높은 함량으로 포함하고 있는바, 건강보조를 위한 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법{Manufacturing method of monogalactosyldiacylglycerol containing high phenolic acid content}
본 발명은 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 효소촉매 반응을 이용하여 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤에 관한 것이다.
잣(pine nuts)은 소나무속(Pinus)에 속하는 잣나무(Pinus koraiensis)의 구과(毬果)에 들어있는 종자로 잣나무의 종명은 한국 고유종임을 의미한다. 소나무속에는 약 115종의 식물이 있지만 이 중에서 잣나무를 포함하여 20여 종만이 식용 가능한 종자를 만든다. 일반적으로 잣은 약 70%의 지방질을 함유하고 있고 그 외 단백질 15%, 탄수화물 5%, 회분 3% 등으로 구성되어 있다.
피놀렌산(pinolenic acid; c5,c9,c12-18:3)은 카르복시기와 가장 가까운 이중결합이 5번 탄소에 있고 이 이중결합과 카르복시기와 두 번째로 가까운 이중결합이 두 개 이상의 메틸렌기로 분리되어 있는(polymethylene-interrupted) Δ5-불포화지방산의 일종이다. 자연계에 존재하는 피놀렌산은 한국 고유종인 잣나무에서 얻어지는 잣과 시베리아 소나무(Pinus sibirica)에서 얻어지는 시베리아 잣에만 주로 함유되어 있으며 특히 이들 잣에서 얻은 잣기름(pine nut oil)에는 13~18%의 피놀렌산이 들어있다(Xie K et al., J. Funct. Foods 23, 464-473, 2016).
피놀렌산은 다른 18:3 지방산(탄소수 18개이며, 그 중 3개의 이중결합을 가지는 지방산)과는 달리 건강상의 효능 및 특성을 가지고 있다. 첫 번째로, 피놀렌산은 아포리포단백질 유전자(apo genes)의 발현 정도를 변화시킴으로써 혈중 내 지방 감소 효과를 가진다는 것이 알려져 있다. 두 번째로, 피놀렌산은 간에서 LDL 콜레스테롤의 흡수를 증가시켜 혈청 LDL 콜레스테롤 함량을 낮춘다고 보고 되었다. 마지막으로, 피놀렌산은 식욕 억제 효과를 가지고 있으며, 인체 내 소장에서 분비되는 식욕 조절 호르몬인 콜레시스토키닌(cholecystokinin)과 글루카곤 유사 펩타이드?1(glucagon like peptide-1)의 분비를 촉진시켜 식욕 억제 작용을 한다고 밝혀졌다(Pasman et al., Lipids Health Dis. 7, 10, 2008).
한편, 모노갈락토실디아실글리세롤(monogalactosyldiacylglycerols)은 1,2-디아실-sn-3-글리세롤의 sn-3 위치에 갈락토오스 1개가 결합되어 있는 글리세로당지질(glycoglycerolipids)의 일종이다. 모노갈락토실디아실글리세롤은 엽록체에 존재하는 지방질의 50%를 차지하고 있으며 특히 관다발 식물, 해조류 및 일부 세균의 광합성 조직에 많이 존재한다.
이러한 모노갈락토실디아실글리세롤을 포함한 당지질로 이루어진 엽록체의 틸라코이드 막(thylakoid membrane)의 섭취는 임상시험에서 콜레시스토키닌(cholecystokinin)과 글루카곤 유사 펩타이드?1(glucagon like peptide-1)의 분비를 촉진시키고 공복감을 느끼게 하는 호르몬인 그렐린(ghrelin)의 분비를 억제하여 식욕을 억제한다는 것이 알려졌다(Kohnke R et al., Scand. J. Gastroentero. 44, 712-719, 2009).당지질의 식욕 관련 호르몬의 분비 조절 기작은 당지질에 의해 유도되는 식이지방의 소화시간 증가와 밀접한 관련이 있다고 보여진다. 모노갈락토실디아실글리세롤은 인 비트로(in vitro) 실험에서 돼지 췌장 리파아제의 활성을 저해한다고 보고되었다(Banskota AH et al., J Appl. Phycol. 28, 169-175, 2016). 췌장 리파아제의 활성이 저해되면 소장에서 식이지방의 가수분해 속도를 감소시켜 소장의 말단(회장)에서 소화되지 않은 식이지방의 양을 늘려 포만감을 증가시킴으로써 식욕이 억제된다(Chu et al., Langmuir 25, 9352-9360, 2009).
결과적으로 상기 피놀렌산과 모노갈락토실디아실글리세롤은 모두 식욕 억제 효과를 나타내는 지방질들이다. 모노갈락토실디아실글리세롤은 지방산 아실기로 구성된 비극성 부위와 갈락토오스로 이루어진 극성 부위를 함께 갖고 있는 양친매성 물질로 포스파티딜콜린 등의 글리세로인지질과 유사하게 계면활성과 유화능도 갖고 있다.
이에 본 발명자들은 잣기름에서 얻은 피놀렌산 농축물과 모노갈락토실디아실글리세롤을 반응의 기질로 이용하여 식욕 억제 효능을 가진 유화제로 사용될 수 있는 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 효소촉매 반응에 의해 제조하고자 하였다. 이 때 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 증가시키는 반응 조건을 연구하던 중 특정 효소와 특정 유기용매를 각각 반응의 촉매와 매질로 이용하였을 때만 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤이 합성되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-1993-0009532호
따라서 본 발명의 목적은 효과적으로 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 방법으로 제조된 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 유효성분으로 포함하는 건강보조식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 중급지방산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 i) 피놀렌산 농축물을 준비하는 단계; 및 ⅱ) 상기 피놀렌산 농축물과 모노갈락토실디아실글리세롤에 아세톤과 효소를 첨가한 후 반응시키는 단계를 포함하는, 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피놀렌산 농축물은 30~90mol%의 피놀렌산을 함유할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 효소는 sn -1,3 위치 특이성 리파아제일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 sn -1,3 위치 특이성 리파아제는 리포자임 RM IM(Lipozyme RM IM) 또는 리포자임 TL IM(Lipozyme TL IM)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피놀렌산 농축물은 (a) 잣기름 지방산을 용매에 녹인 다음 요소를 첨가하여 용해시키는 단계; (b) 상기 용액을 상온에서 방냉 후 4℃ 내지 5℃에서 유지시키면서 결정화시킨 다음 결정화물을 제거하고 결정화되지 않은 여액을 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 여액에서 용매를 제거한 후 염산을 첨가하여 반응시킨 다음 헥산을 첨가하여 지방산을 추출하는 단계를 포함하는 과정을 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ⅱ) 단계는 기질로서 피놀렌산 농축물과 모노갈락토실디아실글리세롤이 1:30 내지 1:40의 몰비율로 구성되고, 상기 기질 대비 20중량%의 효소를 첨가한 후 25℃에서 반응시키는 단계일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤은 피놀렌산을 30~50mol% 농도로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 유효성분으로 포함하는 건강보조식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 탄소수 6~12개의 포화지방산과 모노갈락토실디아실글리세롤에 아세톤과 효소를 첨가한 후 반응시키는 단계를 포함하는, 중급지방산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 탄소수 6~12개의 포화지방산은 카프릭산(Capric Acid)일 수있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 효소는 sn -1,3 위치 특이성 리파아제일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 sn -1,3 위치 특이성 리파아제는 리포자임 RM IM(Lipozyme RM IM) 또는 리포자임 TL IM(Lipozyme TL IM)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 탄소수 6~12개의 포화지방산과 모노갈락토실디아실글리세롤은 기질로서 1:30 내지 1:40의 몰비율로 구성되고, 상기 기질 대비 20중량%의 효소를 첨가한 후 25℃에서 반응시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중급지방산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤은 중급지방산을 30~50mol% 농도로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법은 특정 반응매질 및 특정 촉매 효소를 사용함으로써, 피놀렌산이 고농도로 함유된 모노갈락토실디아실글리세롤을 효과적으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 모노갈락토실디아실글리세롤은 다양한 기능성을 가진 피놀렌산을 높은 함량으로 포함하고 있는바, 건강보조를 위한 소재로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤의 제조 과정을 간략하게 보여주는 반응식이다.
도 2는 리파아제 종류(Lipozyme® RM IM, Lipozyme® TL IM, Novozyme® 435, Candida rugosa lipase)에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 반응시간의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 3은 매질의 종류(Acetone, Toluene, Bemzene, Ethanol)에 따른 리포자임 RM IM 촉매 산분해 반응의 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 반응시간의 함수로 보여준 그래프이다.
도 4는 반응온도(25, 30, 35, 40℃)에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 반응시간의 함수로 보여준 그래프이다.
도 5는 모노갈락토실디아실글리세롤과 피놀렌산 농축물의 몰비율(1:10, 1:20, 1:30, 1:40)에 따른 리포자임 RM IM 촉매 산분해 반응의 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 반응시간의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 6은 효소량(5, 10, 15, 20중량%)에 따른 리포자임 RM IM 촉매 산분해 반응의 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 반응시간의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 7은 최적 반응조건 하에서 실시한 리포자임 RM IM 촉매 산분해 반응의 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 반응시간의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 8은 리포자임 RM IM 촉매 산분해 반응의 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 카프릭산 함량을 반응시간의 함수로 나타낸 그래프이다.
본 발명은 i) 피놀렌산 농축물을 준비하는 단계; 및 ⅱ) 상기 피놀렌산 농축물과 모노갈락토실디아실글리세롤에 아세톤과 효소를 첨가한 후 반응시키는 단계를 포함하는, 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 "피놀렌산(pinolenic acid)"은 잣나무에서 많이 발견되는 불포화지방산으로, EPA 또는 DHA와 같은 다불포화 지방산(polyunsaturated fatty acids)과 같은 활성 기능을 갖는 독특한 성분이다. 피놀렌산(5,9,12 C18:3 지방산, 즉 5,9,12 위치에 이중결합을 세개 갖는 탄소 원자수 18의 지방산)은 잣오일(pine nut oil)이나 그의 분획에 약 13~18중량% 양으로 존재한다는 것이 잘 알려져 있으며 하기 화학식 1로 표시된다.
[화학식 1]
Figure 112017040029085-pat00001
본 발명에서 "모노갈락토실디아실글리세롤(monogalactosyldiacylglycerol)"은 1,2-diacyl-sn-3-glycerol의 sn-3 위치에 갈락토오스 1개가 결합되어 있는 글리세로당지질(glycoglycerolipids)의 일종으로, 엽록체에 존재하는 지방질의 50%를 차지하고 있으며 특히 관다발 식물, 해조류 및 일부 세균의 광합성 조직에 많이 존재하는 것으로 알려져 있으며 하기 화학식 2로 표시된다.
[화학식 2]
Figure 112017040029085-pat00002
본 발명에서 "피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤"은 상기 화학식 2로 표시되는 모노갈락토실디아실글리세롤의 sn-1 위치에 있는 지방산이 화학식 1의 피놀렌산으로 대체된 화합물로서, 하기 반응식 1의 과정을 통해 제조될 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112017040029085-pat00003
본 발명의 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 제조하는 방법은 i) 피놀렌산 농축물을 준비하는 단계; 및 ⅱ) 상기 피놀렌산 농축물과 모노갈락토실디아실글리세롤에 아세톤과 효소를 첨가한 후 반응시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 i) 단계는 피놀렌산 농축물을 준비하는 단계로서, 피놀렌산 농축물을 직접 제조하거나 시중에서 판매되는 피놀렌산 농축물을 구입하여 준비할 수 있다.
피놀렌산 농축물을 직접 제조하여 사용하는 경우, 잣기름으로부터 피놀렌산을 다량으로 함유하는 농축물을 제조할 수 있으며, 상기 잣기름은 피놀렌산 함량이 13 mol% 이상이 함유된 것이 바람직하다. 따라서, 피놀렌산 함량이 13 mol% 이상 함유된 한국 고유 종의 잣나무(Pinus koraiensjs) 또는 18 mol%의 보다 높은 수준의 피놀렌산을 함유하고 있는 시베리아 소나무(Pinus sibirica)의 종자에서 수득한 잣기름을 이용할 수 있다.
상기 피놀렌산 농축물은 (a) 잣기름 지방산을 용매에 녹인 다음 요소를 첨가하여 용해시키는 단계; (b) 상기 용액을 상온에서 방냉 후 4℃ 내지 5℃에서 유지시키면서 결정화시킨 다음 결정화물을 제거하고 결정화되지 않은 여액을 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 여액에서 용매를 제거한 후 염산을 첨가하여 반응시킨 다음 헥산을 첨가하여 지방산을 추출하는 단계를 포함하는 과정을 통해 제조될 수 있다.
상기 (a) 단계에서 잣기름 지방산은 잣기름을 알칼리로 검화시켜 제조할 수 있다. 이때 상기 알칼리는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 사용할 수 있다. 검화 후 염산을 넣어 잣기름 지방산의 염을 유리지방산의 형태로 전환시키고 헥산으로 추출할 수 있다. 헥산은 감압농축 등의 방법으로 제거하고 액상 형태의 잣기름 지방산을 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 잣기름으로부터 수득되는 잣기름 지방산의 피놀렌산 함량은 13 mol% 이상일 수 있다.
본 발명의 피놀렌산 농축물은 상기 잣기름 지방산을 용매 중에서 요소(urea)와 반응시켜 포화지방산 또는 불포화도가 낮은 불포화지방산을 요소부가체(urea adduct)로 결정화시킨 후 여과하고 감압농축 등의 방법으로 용매를 제거해서 상대적으로 불포화도가 높은 피놀렌산을 액상으로 농축시켜 제조할 수 있다. 이때 상기 용매는 메탄올 또는 에탄올이다. 상기 잣기름 지방산과 요소의 혼합 비율은 1:1부터 1:5의 중량비이다. 상기 혼합 비율에서 요소의 비율이 낮을수록 농축물의 피놀렌산 함량이 감소하고 요소의 비율이 높을수록 농축물의 피놀렌산 함량은 증가하지만 피놀렌산의 회수율이 감소하는 문제점이 발생한다. 따라서 수득되는 피놀렌산 농축물의 피놀렌산 함량과 피놀렌산의 회수율을 모두 고려하였을 때 잣기름 지방산과 요소의 혼합비율은 약 1:4의 중량비인 것이 가장 바람직하다.
상기와 같은 방법으로 제조한 본 발명의 피놀렌산 농축물은 30 내지 90mol%의 농도로 피놀렌산을 함유할 수 있다.
본 발명의 ⅱ) 단계는 상기 피놀렌산 농축물과 모노갈락토실디아실글리세롤에 아세톤과 효소를 첨가한 후 반응시키는 단계로서, 피놀렌산 농축물과 모노갈락토실디아실글리세롤은 기질이며, 아세톤은 반응매질이고, 효소는 촉매로 작용한다.
상기 모노갈락토실디아실글리세롤은 시중에서 판매되는 것을 구입하여 사용하거나 또는 당업계의 공지된 방법으로 녹엽식물, 해조류 및 세균 배양액으로부터 직접 분리·정제하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 효소는 sn -1,3 위치 특이성 리파아제일 수 있으며, 바람직하게는 리조무코르 미에헤이(Rhizmucor miehei) 미생물 유래 리파아제 또는 써모마이세스 라누기노서스(Thermomyces lanuginosus) 미생물 유래 리파아제일 수 있다. 또한 상기 리파아제는 액제, 고상제제 및 고정화 제제 등의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 하기 실시예에서는 리조무코르 미에헤이(Rhizmucor miehei) 유래 리파아제로서 상업적으로 판매되는 리포자임 RM IM(Lipozyme® RM IM)과 써모마이세스 라누기노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제로서 상업적으로 판매되는 리포자임 TL IM(Lipozyme® TL IM)을 사용하였다.
본 발명에서, 용어 "sn-1, 3 위치 특이성"이란 잣기름을 구성하고 있는 중성지질의 sn-1, sn-2, sn-3 중 sn-1, 3에만 선택적으로 효소반응이 일어나는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 ⅱ) 단계는 기질로서 피놀렌산 농축물과 모노갈락토실디아실글리세롤이 1:30 내지 1:40의 몰비율로 구성되고, 아세톤을 반응매질로 하고, 상기 기질 대비 20중량%의 효소를 첨가한 후 25℃에서 반응시키는 단계일 수 있다.
또한, 본 발명 상기 방법으로 제조된 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 제공한다.
본 발명의 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤은 피놀렌산을 고농도(42 mol% 이상)로 함유하고 있기 때문에 피놀렌산이 가지는 다양한 생리학적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 피놀렌산은 저농도 지단백질(LDL cholestrol)을 낮춰주고, 혈전용해 효과를 갖고 있을 뿐만 아니라, 특히 공복감을 억제하고 포만감을 유도하는 작용을 지닌 호르몬으로 알려진, 콜레시스토키닌의 분비를 촉진한다고 알려져 있으므로, 본 발명의 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤은 그 생리학적 활성이 뛰어나 상기 효능을 포함하는 식품, 의약품, 화장품 등의 생산분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤은 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 체지방 및 체중을 조절하는 용도이거나 비만의 예방, 치료, 개선용 약제학적 조성물, 식품 조성물, 식품 첨가제 조성물 또는 건강보조식품 조성물일 수 있으며; 피부 보습 효과 또는 피부톤 개선을 위한 피부 외용제 조성물(화장료 조성물 포함)일 수 있다.
또한, 본 발명은 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤은 유효성분으로 포함하는 건강보조식품을 제공한다.
상기 건강보조식품은 체지방 및 체중 조절을 목적으로 한다.
본 발명에서 건강보조식품의 형태는 특별히 제한되지 않는다. 공지의 부재료, 식품 첨가물 등을 혼합하여 음료, 과립, 정제, 분말, 환, 캅셀, 선식, 면류, 과자류, 육류, 생선류, 나물류, 찌게류 또는 밥류 등을 포함하는 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강보조식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
식품 첨가물로 예를 들어 단당류, 이당류, 다당류, 당알콜 등의 당류와, 타우마틴, 스테비아 추출물, 사카린, 아스파르탐 등의 향미제와, 영양제, 비타민, 식용 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제(예, 치즈, 초콜릿 등), 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등이 이용될 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강보조식품은 본 발명의 유효성분(피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤)을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강보조식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강보조식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분(피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤)을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강보조식품은 본 발명의 유효성분(피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강보조식품은 본 발명의 유효성분(피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강보조식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공되어 휴대가 간편하고 언제 어디서나 수시로 섭취하기가 용이하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤은 유효성분으로 포함하는 건강보조식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 탄소수 6~12개의 포화지방산과 모노갈락토실디아실글리세롤에 아세톤과 효소를 첨가한 후 반응시키는 단계를 포함하는, 중급지방산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 "중급지방산"이란 탄소수 6~12개의 포화지방산을 의미한다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 탄소수 6~12개의 포화지방산은 카프릭산(Capric Acid)일 수 있으나, 특별히 그 종류를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 효소는 sn -1,3 위치 특이성 리파아제일 수 있으며, 바람직하게는 리포자임 RM IM(Lipozyme RM IM) 또는 리포자임 TL IM(Lipozyme TL IM)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중급지방산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법은 기질로서 탄소수 6~12개의 포화지방산과 모노갈락토실디아실글리세롤이 1:30 내지 1:40의 몰비율로 구성되고, 상기 기질 대비 20중량%의 효소를 첨가한 후 25℃에서 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법을 통해 제조된 모노갈락토실디아실글리세롤은 중급지방산을 30~50mol% 농도로 함유할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
시약
하기 실험에서 사용한 모노갈락토실디아실글리세롤(순도 >99%)는 Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL, USA)에서 구입하였으며; Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM 및 Novozym 435는 Novozymes A/S (Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하였고; 칸디다 루고사 리파아제(Candida rugoselipase immobilized on Immobead 150) 및 카프릭산(순도 >98%)은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
< 실시예 1>
잣기름으로부터 피놀렌산 농축물 제조
<1-1> 잣기름 추출
본 발명에서 원료로 이용한 잣기름은 국내에서 구입한/또는 수득한 한국 고유 종의 잣나무(Pinus koraiensjs)의 종자로부터 추출하였다.
자세하게는 잣을 믹서기로 분쇄한 후, 노르말헥산을 이용하여 원료와 용매 비율을 약 1:10 (w/v)으로 하고 약 6시간 동안 충분히 교반시켜 잣기름을 추출하였으며, 용매를 증발시켜 잣기름 추출물을 수득하였다.
<1-2> 잣기름 지방산 제조
상기 실시예 <1-1>을 통해 추출한 잣기름 100g에 10 wt% 수산화타트륨을 포함하는 75% 에탄올 400mL을 가한 후 30분간 환류 냉각기를 이용하여 250℃로 가열하면서 검화시켰다. 검화 후 반응산물을 분별 깔때기로 옮기고 증류수 200mL와 6N 염산 250 mL을 첨가하여 지방산의 염을 유리지방산의 형태로 전환하였다. 층 분리가 되면 지방산에 해당하는 윗층만 남긴 후, 헥산 500 mL과 증류수 300 mL을 첨가하고 층분리를 시켜 헥산층을 취하였다. 헥산층에 염산이 잔류할 수 있으므로 증류수 100mL로 5회 세척한 후 pH 시험지로 세척수의 pH가 중성인지 여부를 확인하였다. 헥산층에 잔류하는 수분을 제거하기 위해 무수황산나트륨에 한 번 여과시킨 후 회전식 감압 농축기를 이용하여 40℃에서 헥산을 제거하였다. 수득된 잣기름 지방산은 사용 전까지 -80℃에서 냉동 보관하였다.
<1-3> 피놀렌산 농축물의 제조
메탄올 1L에 상기 실시예 <1-2>를 통해 수득한 잣기름 지방산 100g을 넣어 먼저 용해시킨 후 400g의 요소를 넣고 환류장치에서 250℃로 가열하며 30분~1시간 교반하여 요소를 완전하게 용해시켰다. 상기 용액을 상온에서 30분간 천천히 방냉 후 다시 4℃에서 16시간 동안 방치하여 요소부가체로 결정화시키고 여과지(Whatman no.1)와 부흐너 깔대기를 이용해 제거하여 결정화되지 않은 지방산의 여액을 분리하였다. 상기 여액의 메탄올은 회전식 감압 농축기를 이용하여 40℃에서 제거하고 0.1N 염산 800mL을 첨가하여 잔류하는 요소를 용해시키고 분별 깔때기로 옮긴 뒤 결정화되지 않은 지방산은 헥산 1L을 이용해 2회 추출하였다. 헥산층에 염산이 잔류할 수 있으므로 증류수 200mL로 2회 세척한 후 pH 시험지로 세척수의 pH가 중성인지 여부를 확인하였다. 헥산층에 잔류하는 수분을 제거하기 위해 무수황산나트륨에 한 번 여과시킨 후 회전식 감압 농축기를 이용하여 40℃에서 헥산을 제거하였다. 수득된 피놀렌산 농축물은 사용 전까지 -80℃에서 냉동 보관하였다.
< 실시예 2>
잣기름, 잣기름 지방산, 피놀렌산 농축물 및 모노갈락토실디아실글리세롤의 지방산 조성 분석
상기 실시예 1을 통해 수득한 잣기름, 잣기름 지방산, 피놀렌산 농축물 각각의 지방산 조성과 더불어 본 발명에서 사용한 모노갈락토실디아실글리세롤(시금치에서 분리 정제한 상업용 모노갈락토실디아실글리세롤_순도 99 wt% 이상)의 지방산 조성은 하기 표 1 및 2에서 자세히 나타내었다.
잣기름 및 잣기름 지방산 조성 분석
지방산 잣기름(mol%) 잣기름 지방산(mol%)
16:0 5.3±0.0 4.5±0.0
16:1n-7 0.1±0.0 -
18:0 2.1±0.0 2.3±0.0
18:1n-9 25.7±0.1 27.1±0.1
18:1n-7 0.5±0.0 0.5±0.0
c5,c9-18:2 2.2±0.0 2.3±0.0
18:2n-6 46.0±0.1 45.3±0.2
c5,c9,c12-18:3 (피놀렌산) 13.7±0.0 13.0±0.1
18:3n-3 0.6±0.0 0.2±0.0
20:0 0.3±0.0 0.5±0.0
20:1 1.1±0.0 1.5±0.1
20:2 0.6±0.0 0.8±0.0
c5,c11,c14-20:3 1.1±0.0 1.3±0.0
Unidentified 0.7±0.1 0.7±0.0
피놀렌산 농축물 및 모노갈락토실디아실글리세롤의 지방산 조성 분석
지방산 피놀렌산 농축물(mol%) 모노갈락토실
디아실글리세롤(mol%)
16:0 - 1.4±0.0
16:3n-3 - 37.5±0.1
18:0 - 0.1±0.0
18:1n-9 0.2±0.0 0.4±0.0
18:1t - 0.1±0.0
18:2n-6 4.6±0.0 2.6±0.0
c5,c9,c12-18:3 (피놀렌산) 85.5±0.2 -
18:3n-3 - 57.7±0.3
18:3t - 0.2±0.0
20:0 0.9±1.2 -
c5,c11,c14-20:3 1.7±0.0 -
Unidentified 7.0±1.4 -
상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 피놀렌산을 포함한 모든 지방산의 함량은 원료 잣기름과 잣기름 지방산 간에 유의적인(p<0.05) 차이가 없었다. 잣기름 지방산의 주요 지방산은 45.3 mol%의 리놀레산(18:2n-6)과 27.1 mol%의 올레산(18:1n-9)이었다. 잣기름 지방산의 피놀렌산 함량은 13.0 mol%이었다.
한편, 상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, 피놀렌산 농축물의 지방산 조성은 잣기름 지방산의 주요 불포화지방산인 리놀레산과 올레산이 피놀렌산 농축물에서는 각각 4.6 mol%와 0.2 mol%로 감소하였고 팔미트산(16:0), 스테아르산(18:0), 아라키딘산(20:0) 등의 포화지방산은 모두 제거되었으며 피놀레산 함량은 85.5 mol%로 증가하였다. 이에 반해, 상업용 모노갈락토실디아실글리세롤(순도 99 wt% 이상)의 경우 주요 지방산으로 알파 리놀렌산(18:3n-3)과 헥사데카트리엔산(16:3n-3)의 함량이 높았으며, 피놀렌산은 함유되지 않은 것으로 나타났다.
< 실시예 3>
피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조
상기 실시예 <1-3>을 통해 제조한 피놀렌산 농축물과 모노갈락토실디아실글리세롤을 기질로 하고 유기용매(아세톤, 톨루엔, 벤젠, 에탄올 각각)를 반응매질로 하여 리파아제 효소(Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM, Novozym 435, Candida rugoselipase immobilized on Immobead 150 각각)를 촉매로 이용하는 산분해 반응을 통해 본 발명의 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 제조하였다. 본 발명에서는 시금치에서 분리 정제한 상업용 모노갈락토실디아실글리세롤(순도 99 wt% 이상)을 이용하였다.
<3-1> 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조에 적합한 효소의 선별
본 실험에서는 산분해 반응을 촉매로 적합한 상업용 고정화 리파아제를 선별하기 위해 모노갈락토실디아실글리세롤과 피놀렌산 농축물의 몰비율을 1:40으로 유지하면서 리파아제의 종류에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 측정하였다. 반응 적합성을 평가한 상업용 고정화 리파아제는 리포자임 RM IM(Lipozyme RM IM), 리포자임 TL IM(Lipozyme TL IM), 노보짐 435(Novozym 435), 칸디다 루고사 리파아제(Candida rugoselipase immobilized on Immobead 150)의 4종을 이용하였다. 상기 리파아제 중 리포자임 RM IM과 리포자임 TL IM은 중성지방의 sn -1,3 위치 특이성을 가지며 노보짐 435와 칸디다 루고사 리파아제는 중성지방의 sn위치에 특이성이 없는 리파아제이다.
자세하게는, 모노갈락토실디아실글리세롤 5mg과 상기 실시예 <1-3>을 통해 수득한 피놀렌산 농축물 74.7mg을 회분식 반응기(15cm×5cm i.d.)에 넣고 반응매질로 아세톤 4mL와 각각의 리파아제 효소 15.9mg(기질무게의 20%)를 첨가한 후 반응온도 25℃에서 500rpm의 속도로 교반하였다. 반응온도는 반응기의 물 재킷에 연결된 항온 순환 수조에 의하여 일정하게 유지하였다. 반응시간은 최소 3시간에서 60시간으로 설정하였고 반응산물의 시료는 반응시간 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 60시간에서 각각 0.2mL씩 취하였다.
한편, 리파아제의 종류에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 측정을 위해, 효소반응에 의해 생성된 반응산물을 TLC(Thin layer chromatography)를 이용하여 분리한 후 지방산 함량을 가스크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.
효소반응에 의해 생성된 반응산물을 TLC를 이용하여 분리하였다. 반응산물 0.2mL에 클로로포름/메탄올(1:2, v/v) 2mL을 가하고 0.45μm syringe filter (13mm)로 여과하여 효소를 제거하였다. 질소 기류 하에 용매를 제거하고 클로로포름/메탄올(1:2, v/v) 0.2mL에 녹인 후 TLC plate (silica gel 60 F254, Merck)에 spotting하여 클로로포름/메탄올/물/에틸아세테이트/2-프로판올(50:20:10:50:50, v/v/v/v/v)을 용매로 사용하여 전개하였다. TLC plate에서 분리된 모노갈락토실디아실글리세롤을 scrapping하여 회수하였다.
이후, 모노갈락토실디아실글리세롤의 지방산 조성 분석을 위해 지방산을 메틸에스테르화 한 후 가스크로마토그래피로 분석하였다. TLC plate에서 회수한 모노갈락토실디아실글리세롤과0.5N NaOH in 95vol% 메탄올 1.5mL을 50mL 튜브에 넣고 vortex 한 후 85℃ 수욕조에서 10분간 중탕하였다. 중탕 후 20℃에서 충분히 냉각한 튜브에 BF3용액 2mL을 넣고 vortex 한 후 85℃에서 10분간 중탕하였다. 중탕 후 튜브를 20℃에서 충분히 냉각하고 메틸에스테르화 된 지방산을 추출하기 위하여 isooctane 3mL과 포화NaCl 용액5mL을 첨가한 후 충분히 vortex 하였다. 상층액을 취하여 무수황산나트륨에 통과시켜 수분과 이물질을 제거한 후 수득된 isooctane층을 가스크로마토그래프(Agilent 7890A, Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, USA)에 주입하여 분석을 실시하였다. 컬럼으로 SP-2560(100m ×0.25mm i.d. ×0.2μm film thickness, Supelco, Bellefonte, PA, USA)을 사용하였고 불꽃 이온화 검출기를 이용하여 검출하였다. 컬럼의 온도는 100℃에서 4분간 유지시킨 후 240℃까지 분당 3℃씩 증가시켜 17분간 유지하였다. 운반 기체로는 헬륨을 사용하여 분당 1mL의 유속으로 흘려주었다. 주입부와 검출기의 온도는 각각 225℃와 285℃로 설정하였다. 각각의 시료는 1μL 주입하여 분석하였으며, 분할비율은 5:1이었다.
상기와 같은 방법으로 측정된 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량은 반응시간에 따른 함수로 나타내었다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 리포자임 RM IM과 리포자임 TL IM을 촉매로 사용한 경우에만 피놀렌산에 의한 모노갈락토실디아실글리세롤의 산분해 반응이 일어났으며 특히 리포자임 RM IM이 리포자임 TL IM 대비 전체 반응시간에서 두드러지게 높은 피놀렌산 함량을 보여주었다. 반면에 노보짐 435와 칸디다 루고사 리파아제의 경우 피놀렌산에 의한 모노갈락토실디아실글리세롤의 산분해 반응이 일어나지 않는 것으로 나타났다.
상기와 같은 결과를 통해, sn -1,3 위치 특이성 리파아제가 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조에 적합한 효소로 판단되었으며, 특히 가장 높은 활성을 나타낸 리포자임 RM IM이 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조에 가장 적합한 효소로 확인되었다.
이에, 하기 실험에서는 리포자임 RM IM 촉매 산분해 반응에 적합한 매질과 최적 반응조건을 추가로 조사하였다.
<3-2> 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조에 적합한 매질의 선별
피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤의 제조를 위해 상업용 모노갈락토실디아실글리세롤과 피놀렌산 농축물을 기질로 하고 반응 적합성이 가장 우수한 것으로 나타난 리포자임 RM IM을 촉매로 하여 산분해 반응을 실시하였다.
상기 반응의 매질로 적합한 용매를 선별하기 위해 모노갈락토실디아실글리세롤과 피놀렌산 농축물의 몰비율을 1:40으로 유지하면서 매질의 종류에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 측정하였다. 반응 적합성을 평가한 용매는 아세톤, 톨루엔, 벤젠, 에탄올의 4종을 이용하였다.
자세하게는, 모노갈락토실디아실글리세롤 5mg과 상기 실시예 <1-3>을 통해 수득한 피놀렌산 농축물 74.7mg을 회분식 반응기(15cm×5cm i.d.)에 넣고 매질로서 아세톤, 톨루엔, 벤젠, 에탄올 각각 4mL와 리포자임 RM IM 15.9mg(기질무게의 20%)를 첨가한 후 반응온도 25℃에서 500rpm의 속도로 교반하였다. 반응시간은 최소 12시간에서 최대 48시간으로 설정하였고 반응산물의 시료는 0, 12, 24, 36, 48시간에서 각각0.2mL씩 취하였다.
반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량 측정은 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방식으로 측정하였으며, 매질의 종류에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량은 반응시간에 따른 함수로 나타내었다.
그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 아세톤, 톨루엔 및 벤젠을 매질로 사용한 경우에만 피놀렌산에 의한 모노갈락토실디아실글리세롤의 산분해 반응이 일어났으며 특히 아세톤이 톨루엔 또는 벤젠 대비 전체 반응시간에서 두드러지게 우수한 피놀렌산 함량을 나타내었다. 반면에 에탄올에서는 피놀렌산에 의한 모노갈락토실디아실글리세롤의 산분해 반응이 일어나지 않는 것으로 나타났다.
상기와 같은 결과를 통해, 아세톤이 특이적으로 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조에 적합한 반응매질임을 확인할 수 있었다.
< 실시예 4>
피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조를 위한 최적 반응조건
상기 실시예 3을 통해 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조를 위해 반응매질로 아세톤을 사용하고, 리파아제 효소로 리포자임 RM IM을 촉매로 사용하는 것이 효과적인 것을 규명하였는바, 본 실험에서는 추가적으로 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조를 위한 최적 반응조건을 분석하였다.
<4-1> 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조를 위한 최적 반응 온도
본 실험에서는 리포자임 RM IM 촉매 산분해 반응의 최적 온도를 설정하기 위해 모노갈락토실디아실글리세롤과 피놀렌산 농축물의 몰비율을 1:40으로 유지하면서 각각의 반응온도에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 측정하였다.
자세하게는, 모노갈락토실디아실글리세롤 5mg과 상기 실시예 <1-3>을 통해 수득한 피놀렌산 농축물 74.7mg을 회분식 반응기(15cm×5cm i.d.)에 넣고 아세톤4mL와 리포자임 RM IM 15.9mg(기질무게의 20%)을 첨가한 후 반응온도 25, 30, 35, 40℃에서 각각 500rpm의 속도로 교반하였다. 반응시간은 최소 3시간에서 60시간으로 설정하였고 반응산물의 시료는 반응시간 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 60시간에서 각각 0.2mL씩 취하였다.
반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량 측정은 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방식으로 측정하였으며, 반응온도에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 반응시간의 함수로 나타내었다.
그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 조사한 모든 반응온도 조건에서 반응시간 12시간 만에 반응 정점에 도달하였으며 모든 반응시간에서 반응온도에 따른 피놀렌산 함량에는 유의적인(p<0.05) 차이가 없는 것으로 나타났다. 반응온도별 피놀렌산의 최대함량은 25℃에서 42.3 mol%, 30℃에서 42.1 mol%, 35℃에서 42.5 mol%, 40℃에서 42.8 mol%이었다.
따라서 에너지 절약 측면에서 상온인 25℃를 최적 반응온도로 선정하였다.
<4-2> 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조를 위한 기질 간 최적 몰비율
본 실험에서는 리포자임 RM IM 촉매 산분해 반응의 기질 간 최적 몰비율을 설정하기 위해 최적 반응온도로 선정된 25℃로 유지하면서 모노갈락토실디아실글리세롤과 피놀렌산 농축물의 몰비율에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 측정하였다.
자세하게는, 모노갈락토실디아실글리세롤과 상기 실시예 <1-3>을 통해 수득한 피놀렌산 농축물의 몰비율이 1:10, 1:20, 1:30 또는 1:40이 되도록 모노갈락토실디아실글리세롤 5mg과 피놀렌산 농축물 18.7mg, 37.3mg, 56.0 mg 또는74.7mg을 회분식 반응기(15cm×5cm i.d.)에 넣고 아세톤 4mL와 리포자임 RM IM 4.7mg, 8.5mg, 12.2mg 또는 15.9mg(각각 기질무게의 20%)를 각각 첨가한 후 반응온도 25℃에서 500rpm의 속도로 교반하였다. 반응시간은 최소 3시간에서 60시간으로 설정하였고 반응산물의 시료는 반응시간 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 60시간에서 각각 0.2mL씩 취하였다.
반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량 측정은 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방식으로 측정하였으며, 모노갈락토실디아실글리세롤과 피놀렌산 농축물의 몰비율에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 반응시간의 함수로 나타내었다.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 모든 반응시간에서 기질 간 몰비율이 증가함에 따라 피놀렌산 함량이 증가하는 경향을 나타내었다. 특히 반응시간 36시간 이후에는 기질 간 몰비율 1:30과 1:40은 1:10 또는 1:20보다 유의적으로(p<0.05) 높은 피놀렌산 함량을 나타내었다. 반응시간 6시간 이후에 기질 간 몰비율 1:30과 1:40의 피놀렌산 함량 간에는 유의적인 차이가 없었다.
상기와 같은 결과를 통해, 모노갈락토실디아실글리세롤과 피놀렌산 농축물의 최적 몰비율로 ‘1:30 또는 그 이상’을 선정하였다.
<4-3> 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조를 위한 최적의 효 소량
본 실험에서는 리포자임 RM IM 촉매 산분해 반응의 최적 효소량을 설정하기 위해 반응온도 25℃에서 모노갈락토실디아실글리세롤과 피놀렌산 농축물의 몰비율을 1:40으로 유지하면서 리포자임 RM IM의 첨가량에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 측정하였다.
모노갈락토실디아실글리세롤 5mg과 상기 실시예 <1-3>을 통해 수득한 피놀렌산 농축물 74.7mg을 회분식 반응기(15cm×5cm i.d.)에 넣고 아세톤 4mL와 리포자임 RM IM 4.0mg, 8.0mg, 12.0 mg 또는 15.9mg(각각 기질무게의 5, 10, 15 또는 20%)을 첨가한 후 반응온도 25℃에서 500rpm의 속도로 교반하였다. 반응시간은 최소 3시간에서 60시간으로 설정하였고 반응산물의 시료는 반응시간 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 60시간에서 각각 0.2mL씩 취하였다.
반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량 측정은 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방식으로 측정하였으며, 효소량에 따른 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 반응시간의 함수로 나타내었다.
그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, 반응 초기(3~24시간)에는 효소량이 증가함에 따라 피놀렌산 함량이 증가하고 반응 정점에 빨리 도달하는 경향을 나타내었다. 특히 반응시간 24시간에서 효소량15%와 20%는 5% 또는 10%보다 유의적으로(p<0.05) 높은 피놀렌산 함량을 나타내었다. 반응시간 12시간 이후에 효소량 15%와 20%의 피놀렌산 함량 간에는 유의적인 차이가 없었다. 따라서 최적 효소량으로 ‘15% 또는 그 이상’을 선정하였다.
< 실시예 5>
최적 반응조건 하에서 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤의 제조
상기 실시예 4를 통해 도출된 최적 반응온도, 기질 간 몰비율 및 효소량을 이용하여 아래 표 3과 같이 4개의 반응조건을 설정한 후, 상기 실시예 4의 방법에 따라 산분해 반응을 실시하고 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 측정하였다. 반응시간은 최소 3시간에서 60시간으로 설정하였고 반응산물의 시료는 반응시간 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 60시간에서 각각 0.2mL씩 취하였다.
반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량 측정은 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방식으로 측정하였다.
반응조건 설정
조건 반응온도 기질 간 몰비율 효소량
1 25℃ 1:30 15%
2 25℃ 1:40 15%
3 25℃ 1:30 20%
4 25℃ 1:40 20%
상기 4개의 반응 조건에서 수득된 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 피놀렌산 함량을 반응시간의 함수로 나타내었다.
그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 각각의 조건에서 최대 피놀렌산 함량이 나타나는 반응시간과 최대 피놀렌산 함량은 조건 1에서 60시간, 39.3 mol%; 조건 2에서 48시간, 41.9 mol%; 조건 3에서 36시간, 42.1 mol%; 조건 4에서 36시간, 42.3 mol%이었다.
반응조건별 최대 피놀렌산 함량이 나타나는 반응시간과 최대 피놀렌산 함량
조건 반응시간 최대 피놀렌산 함량
1 60시간 39.3 mol%
2 48시간 41.9 mol%
3 36시간 42.1 mol%
4 36시간 42.3 mol%
조건 1~4에서 나타난 피놀렌산 최대함량 간에는 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다. 하지만 생산 비용 측면을 고려하였을 때 반응시간이 짧고 기질 간 몰비율이 낮은 것이 바람직하다.
따라서 반응온도 25℃, 기질 간 몰비율 1:30, 효소량 20%(조건 3)를 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤의 제조를 위한 리포자임 RM IM 촉매 산분해 반응의 최적 조건으로 결정하였다.
상기 조건 3을 통해 제조된 본 발명의 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤의 지방산 조성 분석 결과
지방산 피놀렌산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤(mol%)
16:0 8.0 ± 1.0
16:3n-3 31.1 ± 0.8
18:0 2.6 ± 0.1
18:1n-9 1.4 ± 0.1
18:1t -
18:2n-6 7.3 ± 0.6
c5,c9,c12-18:3 (피놀렌산) 42.1 ± 0.5
18:3n-3 7.5 ± 0.3
18:3t -
20:0 -
c5,c11,c14-20:3 -
Unidentified -
< 실시예 6>
중급지방산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조
본 실험에서는 중급지방산 고함유 모노갈락토실디아실글리세롤의 제조를 위해 모노갈락토실디아실글리세롤과 카프릭산을 기질로 하고 리포자임 RM IM과 아세톤을 각각 촉매와 매질로 이용하여 산분해 반응을 실시하였다. 산분해 반응의 조건은 상기 실시예 5의 조건 4(반응온도25℃, 기질 간 몰비율 1:40, 효소량 20%)와 동일하였다.
자세하게는, 모노갈락토실디아실글리세롤 5mg과 카프릭산 45.0mg을 회분식 반응기(15cm×5cm i.d.)에 넣고 아세톤 4mL와 리포자임 RM IM 10.0mg(기질무게의 20%)을 첨가한 후 반응온도 25℃에서 각각 500rpm의 속도로 교반하였다. 반응시간은 최소 12시간에서 60시간으로 설정하였고 반응산물의 시료는 반응시간 0, 12, 24, 36, 48, 60시간에서 각각 0.2mL씩 취하였다.
반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 카프릭산 함량 측정은 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방식으로 측정하였으며, 리포자임 RM IM 촉매 산분해 반응의 반응산물 내 모노갈락토실디아실글리세롤의 카프릭산 함량을 반응시간의 함수로 나타내었다.
그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 반응시간 24시간 만에 반응 정점에 도달하였으며 최대 카프릭산 함량은 41.2 mol%이었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (15)

  1. i) 피놀렌산 농축물을 준비하는 단계; 및
    ⅱ) 상기 피놀렌산 농축물과 모노갈락토실디아실글리세롤에 아세톤 용매;와 리포자임 RM IM(Lipozyme RM IM) 또는 리포자임 TL IM(Lipozyme TL IM) 효소를 첨가한 후 반응시키는 단계를 포함하는, 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피놀렌산 농축물은 30~90mol%의 피놀렌산을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 피놀렌산 농축물은 (a) 잣기름 지방산을 용매에 녹인 다음 요소를 첨가하여 용해시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계를 통해 제조된 용액을 상온에서 방냉 후 4℃ 내지 5℃에서 유지시키면서 결정화시킨 다음 결정화물을 제거하고 결정화되지 않은 여액을 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 여액에서 용매를 제거한 후 염산을 첨가한 반응시킨 다음 헥산을 첨가하여 지방산을 추출하는 단계를 포함하는 과정을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는, 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 ⅱ) 단계는 기질로서 피놀렌산 농축물과 모노갈락토실디아실글리세롤이 1:30 내지 1:40의 몰비율로 구성되고, 상기 기질 대비 20중량%의 효소를 첨가한 후 25℃에서 반응시키는 것을 특징으로 하는, 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법.
  7. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤.
  8. 제7항에 있어서,
    피놀렌산을 30~50mol% 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤.
  9. 제7항의 피놀렌산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤을 유효성분으로 포함하는 건강보조식품.
  10. 탄소수 6~12개의 포화지방산과 모노갈락토실디아실글리세롤에 아세톤 용매;와 리포자임 RM IM(Lipozyme RM IM) 또는 리포자임 TL IM(Lipozyme TL IM) 효소를 첨가한 후 반응시키는 단계를 포함하는, 중급지방산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 탄소수 6~12개의 포화지방산은 카프릭산(Capric Acid)인 것을 특징으로 하는 중급지방산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제10항에 있어서,
    상기 탄소수 6~12개의 포화지방산과 모노갈락토실디아실글리세롤이 기질로서 1:30 내지 1:40의 몰비율로 구성되고, 상기 기질 대비 20중량%의 효소를 첨가한 후 25℃에서 반응시키는 것을 특징으로 하는, 중급지방산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 중급지방산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤은 중급지방산을 30~50mol% 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 중급지방산 함유 모노갈락토실디아실글리세롤 제조방법.
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