KR101742141B1 - 유리 오메가-３ 필수불포화지방산 dha 또는 epa 함량이 높은 발효 해양성 오일 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리조푸스속 미생물의 배양농축물로 해양성 오일(어류 오일 및 조류에서 채취한 조류 오일)을 화학적 공정과 인공 유화제를 전혀 사용하지 않고 발효시킴으로써 EPA와 DHA와 같은 유리 필수불포화지방산이 풍부한 발효 오일을 제조, 이들의 체내 흡수를 극대화함으로써 혈중중성지방, 혈압 그리고 아테롬성 동맥 경화증 감소, 골다공증, 허혈성 치매 등 오메가-3의 생리적 기능성을 최대로 끌어올릴 수 있는 유리 오메가-３ 필수불포화지방산 DHA 또는 EPA 함량이 높은 발효 해양성 오일 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 어류 오일, 조류에서 채취한 조류 오일 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 해양성 오일을 리조푸스속 미생물의 배양농축물로 발효시켜 수득됨을 특징으로 한다.

Description

유리 오메가-３ 필수불포화지방산 DHA 또는 EPA 함량이 높은 발효 해양성 오일 및 그 제조방법{Fermented marine oil having high omega-３ essential unsaturated fatty acids DHA or EPA and manufacturing method thereof}

본 발명은 유리 오메가-３ 필수불포화지방산 도코사헥사에논산(DHA) 또는 에이코사펜타에논산(EPA) 함량이 높은 발효 해양성 오일 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리조푸스속 미생물의 배양농축물로 해양성 오일(어류 오일 및 조류에서 채취한 조류 오일)을 화학적 공정과 인공 유화제를 전혀 사용하지 않고 발효시킴으로써 EPA와 DHA와 같은 유리 필수불포화지방산이 풍부한 발효 오일을 제조, 이들의 체내 흡수를 극대화함으로써 혈중중성지방, 혈압 그리고 아테롬성 동맥 경화증 감소, 골다공증, 허혈성 치매 등 오메가-3의 생리적 기능성을 최대로 끌어올릴 수 있는 유리 오메가-３ 필수불포화지방산 DHA 또는 EPA 함량이 높은 발효 해양성 오일 및 그 제조방법에 관한 것이다.

오메가-3 필수지방산 함유 오일은 1930년부터 정상적인 성장과 건강에 필수적이라고 알려져 있지만, 그 건강상의 유효성에 대한 과학적 지식은 1990년대부터 급격하게 증가하고 축적되기 시작하였다. 다양한 국내 기능성 식품들 중에 특히 오메가-3 함유 오일은 2009년 국내 판매량이 2004년 대비, 50배 이상 성장할 정도로 높은 성장율을 보였다. 또한, 오메가-3 함유 오일을 이용한 여러 제형의 건강기능식품은 2011년에만 국내 총생산실적이 500억 원을 상회할 정도로 큰 규모를 형성하였다. 태평양 아시아 지역의 오메가-3 필수지방산 함유 오일 판매 연간 성장율은 30% 정도이고, 세계시장의 성장율도 매년 15 내지 20% 정도로 매우 높으며, 오메가-3 필수지방산 함유 오일의 소비율은 앞으로도 꾸준히 증가할 것으로 예상된다.

DHA와 EPA와 같은 오메가-3 지방산은 혈소판의 응집을 억제하고, 혈중 중성지방 수준을 낮춤으로써 관상동맥 및 심혈관계 질환위험을 감소시킨다. 또한 혈압 상승을 억제하며 류머티스성 관절염의 염증 완화효과가 제시되었다. 특히, ALA(alpha-linolenic acid), EPA, DHA 등 긴사슬 다중불포화지방산(Long chain poly-unsaturated fatty acids)에 대해서는 영양학적 측면 뿐만 아니라 여러 가지 역학조사 및 인체와 동물을 대상으로 한 연구 결과, 이들 오메가-3 지방산들이 혈관확장작용, 혈소판응집 억제, 뇌경색방지작용, 혈중 HDL-콜레스테롤의 증가 및 LDL-콜레스테롤 감소작용, 심근경색방지작용 등 다양한 순환기 계통 질병의 예방 및 개선 등에 매우 필수적이고 그리고 큰 역할을 하는 것이 보고되면서 더욱 인체에 중요한 지방산으로 부각되기에 이르렀다. 이외에도 이들 오메가-3 지방산은 ADHD(Attention Deficit Hyperactivity Disorder, 주의력결핍 과잉행동장애)의 완화, 노화에 따른 인지능력장애의 개선, 우울증(depression) 개선, 심지어 최근에는 이들이 단순 칼슘보다 훨씬 더 골다공증(osteoporosis)의 예방 및 개선에 상당한 효과가 있음이 보고되고 있다.

체내에서는 탄수화물과 단백질 등이 복잡한 대사작용을 거쳐서 포화 혹은 이중결합이 포함된 불포화 지방산이 만들어진다. 필수지방산(essential fatty acids, EFAs)이란 정상적인 발육과 생체 건강을 위해 꼭 필요하지만, 인체 내에서 합성되지 않기 때문에 반드시 외부에서 음식의 형태로 섭취해야 하는 지방산을 말하며, 대체로 이들은 탄소사슬이 길고, 이중결합이 여러 개 존재하여 인체 내 생합성이 까다로운 것들이다. 인간에게는 ALA(alpha-linolenic acid, 18:3n-3)와 오메가-6 지방산인 LA(Linoleic acid, 18:2n-6)가 대표적인 필수지방산이다. 이들은 탄소사슬 길이가 그다지 길지 않아 보통 SC-PUFA(short chain-polyunsturated fatty acids)라고도 불리며, 이중에서 ALA는 아마씨유 같은 식물유에 많다. 조건부 필수지방산(Conditionally essential fatty acids)이란 ALA 혹은 LA에서 생합성할 수는 있지만, 활발한 발육과정에 있거나, 질병, 노화와 같은 조건에서는 외부에서 반드시 보충해 주어야 하는 지방산들을 의미하는데, 바로 여기에 오메가-3 지방산인 EPA(20:5n-3)와 DHA(22:6n-3), 그리고 오메가-6 지방산인 GLA(gamma-linolenic acid, 18:3n-6), DGLA(Dihomo-gamma-linolenic acid, 20:3n-6), AA(arachidonic acid, 20:4n-6)들이 속한다. 이들 지방산들은 탄소사슬의 길이도 상대적으로 길고, 이중결합이 여러 개 존재하여 보통 LC-PUFA(long chain-polyunsaturated fatty acids)라고 불린다. 일반적으로 이중에서 오메가-3 지방산(DHA와 EPA)의 섭취를 늘리는 가장 좋은 방법은 어류의 섭취를 늘리는 것이지만 현실적으로 쉽지 않다. 그러므로 이들 오메가-3 지방산 함유 오일을 평소에 우리가 먹는 빵과 우유, 마요네즈, 피자, 요구르트, 파스타, 과자류와 같은 보통 식품류에 보강함으로써 건강에 필요한 양을 자연스럽게 섭취하도록 하는 것이 미국, 유럽, 일본 등 여러 선진국에서 권장되며, 이외에도 연질캡슐 등의 제형으로 출시, 활발히 판매되고 있다. 특히, 2004년 미국 FDA(Food and Drug Administration)가 EPA, DHA의 오메가-3 지방산이 여러 생선(참치, 연어, 고등어, 정어리, 멸치, 청어 등)에 다량 함유되었다는 내용은 물론 이들 필수지방산이 혈중 중성지방수치를 낮추며, 심장병의 위험을 크게 줄이는데 큰 도움이 될 수 있다고 보고하였다. 이로써 미국에서는 어린이 우유에서부터 육류 가공품에 이르기까지 많은 종류의 오메가-3 지방산 함유오일 보강 식품이 판매되고 있으며, 그 판매량은 매년 꾸준히 증가하고 있다. 그러나, 최근 오메가-3 필수불포화지방산의 함량이 높아 일반적으로 가장 많이 소비되는 어유가 중금속(수은, 납, 니켈, 비소, 카드뮴 등)과 방사능에 오염되었을 가능성이 제기되었고, 이외에도 폴리염화비페닐(PCB), 퓨란(furan), 다이옥신(dioxin) 등과 같은 물질도 상당량 오염되어 있을 가능성이 높다고 보고되고 있다. 이 중에서 중금속들은 대개 어류의 단백질과 결합되어 있어 지방에 축적되어 있을 확률이 극히 낮다고 미국 식의약청이 발표하였다. 따라서, 최소의 어유를 섭취하면서 필수불포화지방산은 최대로 소화 흡수하는 것이 관건이 되었다.

DHA(Docosahexaenoic acid)는 탄소 원자의 개수가 22개(짝수)이며, 이중결합이 모두 6개인 불포화 지방산이다. 이 지방산은 유아의 두뇌와 신경 세포막 형성 및 유지, 정상적인 두뇌 성숙과 학습능력에 중요한 역할을 하며, 동맥경화, 심근경색 등의 심혈관 질환 예방에 효과가 있으며, 체내 지방이 축적되는 것을 감소시킨다.

EPA(Eicosapentaenoic acid)는 탄소 원자의 개수가 20개(짝수)이고, 이중결합이 모두 5개인 불포화 지방산이다. 항혈전효과와 동맥경화 방지효과를 나타내는 프로스타글란딘 13(prostagalandin 13)의 전구체로 심장혈관질환인 혈전색전합병증(thromboembolic complications)을 예방하는데 효과가 있다.

두 지방산의 구조적 공통점은 오메가 탄소 원자에서부터 셈을 해보면 3번째 탄소에 첫 번째 이중결합이 존재(오메가-3)한다는 것과 존재하는 이중결합이 모두 시스(cis) 구조를 하고 있다는 점이다.

식품으로 섭취하게 되는 이들 어류에 포함된 지질(어유)은 98% 이상 트리아실글리세롤(triacylglycerol or triglyceride, TG, 글리세롤 한 분자에 3분자의 지방산이 에스테르 결합되어 있는 구조로 보통 유지(지방(fat) 혹은 오일(oil))라고 불림)로 구성되어 있다. 이 중성지질의 분해는 일단 소화관의 물리적 작용과 간에서 합성, 담낭에 저장된 후 분비되는 다량의 쓸개즙에 의해 유화(emulsification)가 이루어진 후, 췌장에서 만들어져 십이지장으로 분비되는 췌장 리파아제(pancreatic lipase)의 작용에 의해 글리세롤과 지방산의 에스테르 결합이 가수분해되면서 이루어지며, 결과적으로 유리 지방산과 모노아실글리세롤들이 주로 생산된다. 중성지방이 이렇게 소화되어 장내로 확산되기 전에는 대체로 모노아실글리세롤, 유리지방산, 글리세롤의 형태로 되며 비로소 소장 상피로 확산, 흡수된다고 알려져 있다. 대체로 중성지방의 소화와 흡수는 탄수화물과 단백질 등 다른 영양분에 비해 더디고 흡수율 또한 상당히 낮으며, 지방을 소화하기 위한 다량의 쓸개즙 분비가 대장의 상피세포에 악영향을 미친다고 보고된 바 있다. 더구나, 본 발명에서 다루는 필수불포화지방산인 DHA 혹은 EPA를 글리세롤 골격분자에서 떼어내는 소화효소는 이들 필수불포화지방산을 가장 필요로 하는 발육이 왕성한 어린이와 노약자 층에서 젊고 건강한 사람들에 비해 덜 분비되기 때문에 원활한 소화 및 흡수가 더욱 어려운 면이 있다.

현재 시중에서 주로 판매되고 있는 오메가-3 지방산 함유 제품에는 크게 3가지가 있다. 첫 번째 형태는 어류 오일을 전혀 가공하지 않은 천연 트리글리세리드(natural triglyceride: nTG)형이다. 이것은 생선에서 추출, 정제한 후, 중성지방 형태 그대로 판매하는 것으로, 위에서 언급한 것처럼 생체이용율이 현저하게 떨어져 차츰 소비자들의 소비가 줄고 있다. 두 번째 형태는 미국에서 개발한 에스테르교환법(trans-esterification)으로서, 오일을 에탄올과 화학반응시켜 글리세롤과 지방산을 분리시킨 후, 에틸기가 유리된 지방산의 카르복실기에 결합되면서 지방산 에틸에스테르 분자(FAEE)를 만드는 것이다. 특히, 이렇게 제조된 EPA ethyl ester(EPA EE) 및 DHA ethyl ester(DHA EE)를 연질캅셀에 담아 미국에서는 혈중 중성지방수치 개선용 일반의약품(Lovaza)으로 판매하고 있다. 그러나, 이런 형태의 오메가-3 지방산의 에틸에스테르형은 생체 내에서 글리세롤 골격분자가 없는 대신 에틸기가 공유결합되어 있어 이를 제거하기 위해 다시 췌장 리파아제가 작동하여야 하는데, 이 경우는 nTG 형태의 글리세롤 골격분자에서 지방산을 떼어내는 경우보다 50배 가량 더 힘들다. 더구나, 창자벽을 구성하는 장세포(Enterocyte)에 의해 유리지방산이 흡수되어 온 후, 혈액 내에서 이동하기 위해서는 TG형으로 통상 바뀌어야 하는데, 글리세롤 골격분자가 없어 혈중 이동에도 많은 어려움을 가진다. 이를 극복하기 위해, 최근, 영국의 아스트라제네카사(AstraZeneca)는 어유에 이미 존재하는 유리 오메가-3 지방산 만을 따로 정제하는 방법을 개발하여 임상실험을 하고 있으나, 생산원가가 워낙 높아 후에 시장에서 경쟁력이 약화될 위험이 있다. 이외에도 에틸에스테르 형태의 지방산을 글리세롤에 다시 공유결합시킨 rTG(re-esterified TG)형도 판매되고 있다. 이것은 제조비용도 비쌀 뿐만 아니라 흡수율도 nTG(natural TG)에 비해 이들을 개발한 사람들 주장대로 더 나아진 것이 없다는 약점이 있다. 따라서, 글리세롤이나 에틸기 등과 공유결합 없이 독립된 1 분자의 유리지방산(FFA: free fatty acid)형이 흡수율, 복용효율, 생체이용율 면에서 가장 우월하지만, 이를 위해 어유에 미량 존재하는 유리 필수지방산을 정제하는 것은 경제적으로 현실적이지 않다. 만약, FFA를 발효과정을 통해 값싸게 대량 생산할 수 있다면 식품 및 의약품 시장에서 폭넓은 응용성을 제공할 수 있다.

이를 위해, 순수 FFA 형태의 오메가-3 지방산을 대량으로 생산하는 대신, 건강에 예민한 소비자들의 까다로운 요구를 충족하기 위해서는 몇몇 전제조건이 만족되어야 한다. 즉, 에스테르교환법처럼 에탄올이나 기타 화학적 촉매제를 사용하지 않아 공정이 비교적 친환경적으로 수행되는 것이 필요하고, 인공 유화제나 기타 화학적 촉매, 혹은 복잡한 화학적 공정을 되도록 이용하지 않아 건강을 도모하는 제품답게 제조공정에서 비롯된 화학물질의 오염 걱정이 없어야 하며, 생산된 유리 필수지방산의 회수가 수월하여야 하고, 동시에 그들의 회수율이 높아서 단가를 낮출 수 있어야 하며, 마지막으로 이렇게 만들어진 유리 필수지방산의 생체 흡수 및 이용율이 상기 언급한 다른 제형의 제품보다 월등하여야 한다.

본 발명의 목적은 위와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 창안한 것으로, 본 발명자들은 해양성 오일의 발효 과정을 통하여 복용효율, 생체이용율이 높은 유리 오메가-3 필수불포화지방산을 효율적으로 생산하기 위하여 먼저 해양성 오일을 발효시키기 위한 것으로서 미생물 그 자체를 사용하는 대신 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 이용하여 본 발명에 따른 최적조건에서 상기 해양성 오일을 발효시킴으로써 유리 오메가-3 필수지방산의 함량을 최대한 높이고, 그에 의하여 소화 흡수와 생체이용율을 대폭 향상시켜 혈행 개선 등의 생리적 효능효과를 극대화할 수 있는 발효 해양성 오일을 제조하는 것을 가능하게 하는 것이다.

이를 위해, 본 발명에서는 발효공정, 특히 미생물 자체를 이용하는 대신 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 사용하여 해양성 오일을 발효시키는 점에 특징이 있다.

본 발명에 따른 발효 해양성 오일은, 어류 오일, 조류에서 채취한 조류 오일 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 해양성 오일을 리조푸스속 미생물의 배양농축물로 발효시켜 수득된다.

상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물이 상기 리조푸스속 미생물을 배지에 배지 용적 대비 10용적%의 양으로 접종시키고, 호기조건, pH 5.5 내지 6.5, 25 내지 35℃의 배양조건에서 배양시킨 후, 1 내지 10℃에서 800 내지 1200rpm으로 원심분리시켜 수득된 상등액을 염석시켜 수득되는 석출물일 수 있다.

상기 배지는 2 내지 10중량%의 감자 전분, 0.5 내지 3중량%의 덱스트로즈 및 잔량으로서 물을 포함하는 PDB(Potato Dextrose Broth)일 수 있다. 상기 PDB를 사용하는 배양은 바람직하게는 5.1±0.2의 pH에서 그리고 호기조건에서 수행될 수 있으며, 상기 PDB는 PDB 총 중량을 기준으로 0.1 내지 10중량%의 오일을 더 포함할 수 있다.

상기 배양조건에서 배양시간은 80 내지 150시간의 범위 이내가 될 수 있다.

상기 해양성 오일의 발효는 상기 해양성 오일 10 내지 80중량%에 잔량으로서 상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 첨가하여 유화시킨 후, 5.0 내지 8.0의 범위 이내의 pH, 25 내지 50℃의 범위 이내의 온도를 포함하는 발효조건에서 발효시킨 후, 발효 해양성 오일을 정제하는 것으로 수행될 수 있다.

상기 리조푸스속 미생물은 바람직하게는 리조푸스 오리제(학명: Rhizopus oryzae, 미생물자원센터 수탁번호 KCTC6106)가 될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 발효 해양성 오일의 제조방법은, 해양성 오일을 발효시켜 발효 해양성 오일을 제조하는 방법에 있어서, (1) 어류 오일, 조류에서 채취한 조류 오일 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 해양성 오일 10 내지 80중량%에 잔량으로서 상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 첨가하고 혼합하여 혼합물을 수득하는 혼합단계; (2) 상기 혼합단계에서 수득되는 혼합물을 유화시키는 유화단계; (3) 상기 유화단계 이후, 유화된 혼합물을 5.0 내지 8.0의 범위 이내의 pH, 25 내지 45℃의 범위 이내의 온도를 포함하는 발효조건에서 24 내지 120시간 동안 50 내지 500rpm의 범위 이내에서 교반시키면서 발효시키는 발효단계; 및 (4) 상기 발효단계에서 수득되는 발효산물을 정제하는 정제단계;를 포함한다.

상기 유화단계에서의 유화는 상기 혼합단계에서 수득되는 혼합물을 5 내지 20분간 믹서기로 교반시킨 후, 초음파처리시키는 것으로 수행될 수 있다.

상기 정제단계에서의 정제는 상기 발효단계에서 수득되는 발효산물을 원심분리에 의하여 수성층으로부터 오일층을 분리해내고, 이를 여과시키는 것으로 수행될 수 있다.

상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물은 상기 리조푸스속 미생물을 배지에 배지 용적 대비 10용적%의 양으로 접종시키고, 호기조건, pH 5.5 내지 6.5, 25 내지 35℃의 배양조건에서 배양시킨 후, 1 내지 10℃에서 800 내지 1200rpm으로 원심분리시켜 수득된 상등액을 염석시켜 수득될 수 있다.

상기 배지는 2 내지 10중량%의 감자 전분, 0.5 내지 3중량%의 덱스트로즈 및 잔량으로서 물을 포함하는 PDB(Potato Dextrose Broth)일 수 있다.

상기 배양조건에서 배양시간은 80 내지 150시간의 범위 이내가 될 수 있다.

상기 리조푸스속 미생물은 바람직하게는 리조푸스 오리제가 될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발효 해양성 오일을 유효성분으로 함유하여 필수지방산 오메가-3의 복용효율, 생체이용율을 대폭 향상시킴으로 인하여 식품산업에서의 폭넓은 스펙트럼을 제공하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발효 해양성 오일을 유효성분으로 함유하여 필수지방산 오메가-3의 소화 흡수의 효과를 향상시킴으로써 혈중 중성지방 수치를 낮추고, 콜레스테롤 수치를 개선하는 등, 혈행 개선용 등과 같은 의약품, 의약외품 또는 건강식품을 제공한다.

물론, 본 발명에 따른 발효 해양성 오일의 용도는 위의 기능성에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 해양성 오일의 발효 과정을 통하여 복용효율, 생체이용율이 높은 유리 오메가-3 필수불포화지방산을 효율적으로 생산하기 위하여 먼저 해양성 오일을 발효시키기 위한 것으로서 미생물 그 자체를 사용하는 대신 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 이용하여 본 발명에 따른 최적조건에서 상기 해양성 오일을 발효시킴으로써 유리 오메가-3 필수지방산의 함량을 최대한 높이고, 그에 의하여 소화 흡수와 생체이용율을 대폭 향상시켜 혈행 개선 등의 생리적 효능효과를 극대화할 수 있는 발효 해양성 오일을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 어류 및 조류에서 채취한 오일을 본 발명에서 선택한 최적조건에서 1차 발효하여 제조된 발효 오일의 유리 지방산의 생성을 HPLC 분석 후 나타낸 그래프이다.
도 2는 어류 및 조류에서 채취한 오일을 본 발명에 따라 유화제를 사용하지 않고 물리적 유화(sonication과 blending)만을 시키고 수행한 발효와 유화제인 Tween-20(0.2%, v/v)를 첨가하여 유화시킨 오일을 발효하여 얻은 발효오일의 유리 지방산의 생성을 HPLC 분석 후 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 어류 및 조류에서 채취한 오일을 일단 10분 동안 믹서기로 블렌딩한 후, 다시 시간대별로 초음파(sonication) 공정을 거쳐 물리적 유화물을 만들고 이를 발효하여 제조된 발효 오메가-3 오일의 유리된 지방산의 생성을 HPLC 분석 후 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 어류 및 조류에서 채취한 오일을 1차 발효 후 2차 발효하여 제조된 발효 오메가-3 오일의 유리 지방산의 생성을 HPLC 분석 후 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 어류 및 조류에서 채취한 오일을 발효할 때 발효액의 pH별 유리 지방산의 생성 효율을 HPLC 분석 후 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 어류 및 조류에서 채취한 오일을 발효할 때 발효온도별 유리 지방산의 생성 효율을 HPLC 분석 후 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 어류 및 조류에서 채취한 오일을 발효할 때 전체 발효액의 물리적 유화물과 발효반응촉진을 위해 시행하는 발효공정 동안의 블렌딩 RPM(revolutions per minute)별 유리 지방산의 생성 효율을 HPLC 분석 후 나타낸 그래프이다.
도 8는 본 발명에 따른 어류 및 조류에서 채취한 오일을 발효 전과 후의 시료를 24시간 절식한 렛트(6주령)에 1㎖씩 섭취시킨 후 시간대별 DHA의 혈중 농도변화를 가스 크로마토그래피(gas chromatography)로 분석 후 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 어류 및 조류에서 채취한 오일을 발효 전과 발효 후의 시료를 24시간 절식한 렛트(6주령)에게 1㎖씩 섭취시킨 후 시간대별 EPA의 혈중 농도변화를 가스 크로마토그래피(gas chromatography)로 분석 후 나타낸 그래프이다.
도 10는 본 발명에 따른 어류 및 조류에서 채취한 오일을 발효하여 발효오일의 황색포도상구균에 대한 항균성을 보여준 그림이다.

이하, 본 발명의 구체적인 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 발효 해양성 오일은, 어류 오일, 조류에서 채취한 조류 오일 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 해양성 오일을 리조푸스속 미생물의 배양농축물로 발효시켜 수득되는 것임을 특징으로 한다.

즉, 본 발명은 해양성 오일 즉, 어류 및/또는 조류(algae, 藻類)에서 채취한 오일에 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 처리하여 발효시킨 발효 해양성 오일을 제공함을 특징으로 한다.

이를 위해 본 발명에서는 발효공정을 사용하였으며, 이를 위해 탐색 끝에 사용한 미생물은 글리세롤 골격분자에서 오메가-3 지방산을 선택적으로 가수분해하는 리파아제를 가장 많이 생산하는 균주로 인체에 전혀 해가 없음이 이미 확인된 미생물로서 리조푸스속 미생물을 사용하고, 특히 본 발명에서는 리파아제를 생산하는 미생물을 직접 해양성 오일에 첨가하여 발효하는 전통적 발효공법 대신, 이들 미생물을 선배양하여 유도생산된 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 사용함으로써 보통의 발효 오일에서 항상 발생하는 독특한 발효취를 최소화할 수 있었을 뿐만 아니라, 최종 생산된 발효 해양성 오일의 미생물 오염 가능성을 원천적으로 제거할 수 있었다.

상기 해양성 오일 중 어유의 생산에 사용될 수 있는 어류로는 고등어, 참치, 정어리, 꽁치, 연어, 삼치 또는 대구일 수 있으며, 상기 조류로는 클로렐라(Chlorella) 또는 시조카이트리움(Schizochytrium)인 것이 바람직하나, 본 발명이 이들로 한정되는 것으로 의도되는 것은 아니며, 오메가-3 지방산이 풍부한 다른 어종의 어유들의 사용도 가능함은 당연히 이해될 수 있는 것이다. 상기 어류 및/또는 조류에서 채취되는 해양성 오일은 DHA, EPA 등 오메가-3 지방산이 많이 함유되어 있으며, 고혈압, 동맥경화, 심장병, 뇌졸중 등 혈관 질환예방과 관절염의 염증을 감소시킨다고 알려져 있다.

상기 어류 및/또는 조류에서 채취한 오일은 그대로 사용하거나, 또는 초음파(sonification), 진동 또는 물리적 저음(physical stirring)을 통해 알갱이 형태로 사용할 수 있다.

하기 표 1은 본 발명에 사용한 오메가-3 오일(어유)의 여러 지방산 조성에 관한 자료로서, 화학적 처리를 거쳐 모든 지방산을 글리세롤 골격분자로부터 분리해 낸 다음 AOAC 방법으로 분석한 결과로서 판매사(Originates, USA)에 의해 제공된 것이다.

지방산	측정방법	결과
EPA	AOCS	33%
DHA	AOCS	22%
그 외 오메가-3 지방산 (18:3, 18:4, 20:4, 21:4, 21:5, 22:5)	AOCS	10.5%
기타 지방산	AOCS	32%

상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물은 상기 리조푸스속 미생물을 배지에 배지 용적 대비 10용적%의 양으로 접종시키고, 호기조건, pH 5.5 내지 6.5, 25 내지 35℃의 배양조건에서 배양시킨 후, 1 내지 10℃에서 800 내지 1200rpm으로 원심분리시켜 수득된 상등액을 염석시켜 수득되는 석출물일 수 있으며, 이러한 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 사용하는 것에 의해 직접 미생물로 사용하여 발효시키는 것에 비해 오메가-3 지방산의 생성량을 크게 증대시킬 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 확인되었다.

이때, 상기 배지는 2 내지 10중량%의 감자 전분, 0.5 내지 3중량%의 덱스트로즈 및 잔량으로서 물을 포함하는 PDB(Potato Dextrose Broth)일 수 있다. 상기 PDB를 사용하는 배양은 바람직하게는 5.1±0.2의 pH에서 그리고 호기조건에서 수행될 수 있으며, 상기 PDB는 PDB 총 중량을 기준으로 0.1 내지 10중량%의 오일을 더 포함할 수 있다.

특히, 본 발명에 따라 상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물의 배양조건에서 발효배양시간은 80 내지 150시간의 범위 이내에서 배양될 때 리파아제 활성이 가장 우수하다는 것이 본 발명자들에 의해 확인되었다.

리조푸스속(Rhizopus sp.) 미생물은 접합균아문 털곰팡이목(Mucorales)의 곰팡이의 1속(屬)으로서, 포복사(stolon)가 옆으로 퍼져 신장하여, 이것을 배지에 접하는 점, 즉 절부(node)로부터 1 내지 수 개의 포자낭병과 가근(rhizoid)이 총생한다. 포자낭은 크고, 보통 검은색이다. 주축(columella)은 반구상이고, 균사는 다량으로 발생하며, 또한 길게 신장하여 페트리접시 뚜껑까지 가득 찬다. 유성적으로는 2개의 배우자낭이 접촉융합하여 접합포자를 형성한다. 토양, 과실 등에 존재하며, 드물게 사람, 동물, 특정 종의 식물에 병원성이 있는 것도 있다. 전분당화력이 강하고, 극소량이지만 알코올 발효력, 단백질 분해력이 있으며, 젖산, 푸마르산 등 유기산생성능도 강하기 때문에 발효공업에 이용하는 종류도 많다. 예를 들어, 중국술의 양조나 동남아시아의 미주(米酒) 제조에 이용한다. 리조푸스 델레마르(R. delemar), 리조푸스 자포니쿠스(R. japonicus)는 알코올 제조용 아밀로균으로 중요하다. 리조푸스 니그리칸스(R. nigricans)는 복숭아, 딸기 등의 과실이나, 곡류, 빵에 잘 발생하고, 고구마 연부병의 원인도 되지만 푸말산 생성능이 강한 것으로도 알려져 있다.

상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물은 리파아제(Lipase)를 포함하며, 상기 리파아제는 글리세롤과 지방산으로 분해하는 효소를 의미한다.

상기 해양성 오일의 발효는 상기 해양성 오일 10 내지 80중량%에 잔량으로서 상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 첨가하여 유화시킨 후, 5.0 내지 8.0의 범위 이내의 pH, 25 내지 50℃의 범위 이내의 온도를 포함하는 발효조건에서 발효시킨 후, 발효 해양성 오일을 정제하는 것으로 수행될 수 있으며, 상기 리조푸스속 미생물은 바람직하게는 리조푸스 오리제가 될 수 있다.

상기한 바에 따라 수득되는 상기 발효 해양성 오일은 발효되기 전보다 유리된 필수불포화지방산 함량이 높은 특징을 가진다. 상기 유리 필수불포화지방산은 DHA 혹은 EPA를 포함한다. DHA는 두뇌와 신경 세포막 형성 및 유지, 정상적인 두뇌 성숙과 학습능력에 중요한 역할을 하며, 동맥경화, 심근경색 등의 심혈관 질환 예방에 효과가 있으며, 체내 지방이 축적되는 것을 감소시켜준다. EPA는 항혈전효과와 동맥경화 방지효과를 나타내는prostagalandin 13의 전구체로 심장혈관질환인 형전색전합병증(thromboembolic complications)을 예방하는데 효과가 있다.

따라서, 본 발명의 발효 오메가-3 오일은 글리세롤 골격분자에서 유리된 오메가-3 필수불포화지방산의 함량이 높아짐에 따라 소장에서 흡수율이 증가되어 혈행개선 등의 기능성 효능효과가 nTG 형태의 오일보다 적은 양을 섭취하고도 더욱 우수해지리라 예상된다. 또한, 유리 필수불포화지방산의 함량이 높아짐에 따라 발효 전 오메가-3 오일에 비해 끈적임이 줄어들고 복용효율, 생체이용율 등이 높아진다. 종래에는 오메가-3 지방산 DHA 또는 EPA를 그대로 복용하거나 에틸 알코올로 녹여서 복용하거나 정제하여 복용하였으나, 이런 경우, 유화제를 사용하는 등의 화학적 공정이 첨가되어 인체에 해로울 수 있으며, 제품 특성상 소화 및 흡수 효율이 낮은 문제점이 있다. 반면, 본 발명은 오메가-3 지방산 DHA 또는 EPA를 미리 발효시킴으로써, 화학적 공정에 비해 비용 및 시간을 줄일 수 있으며, 소화 흡수를 빠르게 하고, 이로 인해 적은 양을 복용하여도 동일한 효과를 얻을 수 있으며, 오메가-3 지방산 DHA 또는 EPA 내 공유결합을 유화제를 쓰지 않고 쉽게 끊어질 수 있게 함으로써 생체 내에서 분리가 쉬우며, 냄새를 탁월하게 제거할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 발효 해양성 오일의 제조방법은, 해양성 오일을 발효시켜 발효 해양성 오일을 제조하는 방법에 있어서, (1) 어류 오일, 조류에서 채취한 조류 오일 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 해양성 오일 10 내지 80중량%에 잔량으로서 상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 첨가하고 혼합하여 혼합물을 수득하는 혼합단계; (2) 상기 혼합단계에서 수득되는 혼합물을 유화시키는 유화단계; (3) 상기 유화단계 이후, 유화된 혼합물을 5.0 내지 8.0의 범위 이내의 pH, 25 내지 45℃의 범위 이내의 온도를 포함하는 발효조건에서 24 내지 120시간 동안 50 내지 500rpm의 범위 이내에서 교반시키면서 발효시키는 발효단계; 및 (4) 상기 발효단계에서 수득되는 발효산물을 정제하는 정제단계;를 포함한다.

상기 (1)의 혼합단계는 어류 오일, 조류에서 채취한 조류 오일 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 해양성 오일 10 내지 80중량%에 잔량으로서 상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 첨가하고 혼합하여 혼합물을 수득하는 것으로 이루어지며, 이때 상기 해양성 오일은 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위 이내의 온도로 예열될 수 있다.

상기 (2)의 유화단계는 상기 혼합단계에서 수득되는 혼합물을 유화시키는 것으로 이루어지며, 이 유화단계에서의 유화는, 바람직하게는, 상기 혼합단계에서 수득되는 혼합물을 5 내지 20분간 믹서기로 교반시킨 후, 초음파처리시키는 것으로 수행될 수 있다. 상기에서 초음파처리는 상기 혼합물에 초음파를 적용시키는 것으로 수행될 수 있으며, 이러한 초음파의 적용은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 국내외 유수의 초음파 발생기 제조업자들에 의해 상용적으로 공급되는 것을 구입하여 제조업자의 지시에 따라 적절하게 사용할 수 있을 정도로 공지된 것으로 이해될 수 있는 것이다.

상기 (3)의 발효단계는 상기 유화단계 이후, 유화된 혼합물을 5.0 내지 8.0의 범위 이내의 pH, 25 내지 45℃의 범위 이내의 온도를 포함하는 발효조건에서 24 내지 120시간 동안 50 내지 500rpm의 범위 이내에서 교반시키면서 발효시키는 것으로 이루어진다.

상기 (4)의 정제단계는 상기 발효단계에서 수득되는 발효산물을 정제하는 것으로 이루어지며, 바람직하게는 상기 정제는 상기 발효단계에서 수득되는 발효산물을 원심분리에 의하여 수성층으로부터 오일층을 분리해내고, 이를 여과시키는 것으로 수행될 수 있다. 여기에서, 상기 원심분리는 바람직하게는 8,000 내지 12,000rpm의 범위 이내로의 원심분리에 의하여 상기 발효산물을 오일층과 수성층을 분리시키고, 상기 오일층으로부터 수성층을 제거한 후, 잔류하는 오일층을 여과하는 것으로 수행될 수 있다. 또한, 여기에서, 상기 여과는 바람직하게는 한외여과(ultrafiltration, 限外濾過)일 수 있으며, 이는 막분리 기술의 하나로서, 큰 용질분자를 작은 용질분자나 용매분자로부터 체로 분리하는 분자수준의 여과를 의미한다. 상기 막분리 기술은 보통여과, 정밀여과, 한외여과, 역삼투 등으로 분류된다. 분리하는 물질의 크기에 따라 보통여과는 10㎛까지, 정밀여과는 30㎚까지, 한외여과는 2㎚까지, 그 이하는 역삼투의 관계에 있다. 셀룰로오스 아세테이트 등 합성폴리머로부터 만들어진 구멍이 없는 막을 이용하여, 가압에 의하여 소분자를 침투시킨다. 고분자용액의 농축, 탈염, 분획 등에 이용되며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 국내외 유수의 한외여과기 제조업자들에 의해 상용적으로 공급되는 것을 구입하여 제조업자의 지시에 따라 적절하게 사용할 수 있을 정도로 공지된 것으로 이해될 수 있는 것이다.

상기 방법에 있어서, 오일은 고등어, 참치, 정어리, 꽁치, 연어, 삼치 또는 대구 등의 어류, 또는 클로렐라(Chlorella) 또는 시조카이트리움(Schizochytrium) 등의 조류에서 추출한 오일인 것이 바람직하며, 상기 오일은 DHA, EPA 등 오메가-3인 필수불포화 지방산이 많이 함유되어 있는 것이 바람직하다.

특히, 상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물은 상기 리조푸스속 미생물을 배지에 배지 용적 대비 10용적%의 양으로 접종시키고, 호기조건, pH 5.5 내지 6.5, 25 내지 35℃의 배양조건에서 배양시킨 후, 1 내지 10℃에서 800 내지 1200rpm으로 원심분리시켜 수득된 상등액을 염석시켜 수득될 수 있으며, 여기에서 리파아제를 고역가로 생산할 수 있도록 상기 리조푸스속 미생물을 배지에서 일정 시간 배양하고 배양액을 원심분리하거나 필터하여 균체를 완전 제거하고, 남은 여액에 천천히 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)를 넣어 효소침전을 일으키고, 이를 다시 원심분리하여 고역가의 배양농축물을 수득하며, 상기 배양농축물은 인산나트륨(sodium phosphate) 완충용액(50mM, pH 5 내지 8)에 다시 녹이고 동일 완충용액에 투석한 후 사용할 수 있다.

상기 배지는 2 내지 10중량%의 감자 전분, 0.5 내지 3중량%의 덱스트로즈 및 잔량으로서 물을 포함하는 PDB(Potato Dextrose Broth)일 수 있다.

상기 배양조건에서 배양시간은 80 내지 150시간의 범위 이내가 될 수 있다.

상기 리조푸스속 미생물은 바람직하게는 리조푸스 오리제가 될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발효 해양성 오일을 유효성분으로 함유하는 필수지방산 오메가-3의 복용효율, 생체이용율, 안정성을 향상시킴으로 인하여 의약 또는 식품산업에서의 폭넓은 스펙트럼을 제공하는 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 발효 해양성 오일을 약제 또는 식품 등에 이용하는 경우, 유리 필수불포화지방산 EPA, DHA가 풍부한 발효 오메가-3 오일을 섭취시킴으로써, 복용효율, 생체이용율을 향상시켜 어린이와 노약자처럼 오일의 분해능과 흡수율이 떨어진 사람들을 위한 성장촉진, 허혈성 치매개선, 항염증, 혈중 콜레스테롤 수치 및 중성지방 수치를 개선하여 원활한 혈행을 도모할 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 발효 해양성 오일을 유효성분으로 함유하는 필수지방산 오메가-3의 복용효율, 생체이용율 및 안정성을 향상시킨 혈행 개선, 또는 혈중 콜레스테롤, 혈중 중성지방, 혈압 또는 아테롬성 동맥 경화증 감소, 또는 항염증용 약학적 조성물, 건강식품 또는 의약외품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 발효 해양성 오일을 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물, 건강식품 또는 의약외품을 제공한다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예들이 기술되어질 것이다.

이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어져서는 안될 것이다.

<실험예 1> 미생물 별 리파아제 활성의 비교 실험

본 발명에 따른 리조푸스속 미생물의 배양농축물의 리파아제 활성을 다른 미생물들과 비교하는 실험을 수행하였다.

대조 미생물들로서는 버크올데리아 멀티보란(Burkholderia multivorans)은 1중량% 펩톤(Peptone), 0.5중량% 효모 추출물(Yeast extract), 0.02중량% 황산마그네슘, 0.1중량% 인산칼륨(Potassium phosphate dibasic), 1중량% 올리브 오일(Olive oil)의 조성을 갖는 배지를 사용하였고, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence)는 영양배지(Nutrient borth: 수육 또는 어육의 추출액을 일반적으로 사용하는 세균배지의 일종으로, 주로 부생 유기영양의 세균배양에 사용하며, 보통 시판되는 스프용 또는 특히 세균학용 추출액 0.3중량%에 펩톤 0.5중량%, 경우에 따라서는 0.5중량% 효모 침출물, 0.8중량% 식염 등을 첨가하여 pH 7 정도로 조정한 것으로서, 기본배지로 사용됨)에 1중량% 올리브 오일(Olive oil)을 사용하였고, 칸디다 루고사(Candida rugosa)는 배지로서 YMB(효모 추출물 1.5g, 맥아 추출물 1.5g, 펩톤 2.5g, 덱스트로즈 5.0g 및 증류수 500㎖로 조성되는 배지)에 올리브 오일을 상기 배지 총량의 1중량%로 첨가한 것을 사용하였다. 슈도지마속(Pseudozima sp.)의 배지는 0.01중량% 글루코오즈, 0.1중량% 올리브 오일, 0.003중량% 효모 추출물, 0.003중량% 맥아 추출물, 0.003중량% 펩톤, 0.003중량% 콩가루, 0.02중량% 황산암모늄, 0.001중량% 인산칼륨, 0.005중량% 황산마그네슘, 0.001중량% 염화칼슘 및 0.0001중량% 염화나트륨의 조성을 사용하였다.

리파아제의 활성을 측정하기 위해서 비누화 반응을 통한 발색법을 사용하였다. 미생물을 배양 후, 12,000rpm에서 원심분리하여 상등액을 조효소액(crude enzyme solution)으로 사용하였다. 기질은 1% 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol)에 10% 올리브 오일(Olive oil)이 포함되도록 하여 조효소액과 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 생성된 유리 필수불포화지방산(fatty acid)을 구리-아세테이트-피리딘(Cu-acetate-pyridine)과 반응시켜 구리화 반응이 일어나면서 발색하게 되는데, 발색된 1분간 생성된 지방산의 μmol로 정의하였다.

각각의 미생물에 따라 리파아제의 활성이 가장 높은 pH와 시간을 하기 표 2에 나타내었다.

	pH	시간	리파아제 활성 (U/㎖)
리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae)	6.0	120	4.3
버크올데리아 멀티보란 (Burkholderia multivorans)	7.8	36	0.8
슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescence)	7.0	32	1.2
칸디다 루고사(Candida rugosa)	7.2	100	1.6
슈도지마 속(Pseudozima sp.)	7.0	24	2.8

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 리조푸스 오리제가 배양에 의해 가장 높은 리파아제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> 배양시간 별 리파아제 활성의 비교 실험

상기 실험예 1에서 가장 높은 리파아제 활성을 나타낸 리조푸스 오리제의 배양시간에 따른 리파아제 활성을 측정하였다. 배양시간을 달리하는 것을 제외하고는 상기 실험예 1에서와 같은 배양조건으로 실험하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

균주	배양시간	리파아제 활성 (U/㎖)
리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae)	90 시간	4.15
	120 시간	4.30
	140 시간	4.22

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 리조푸스 오리제의 경우, 배양시간 120시간에서 리파아제 활성이 가장 높게 나타나고, 그 이후에는 다시 시간의 경과에 따라 서서히 감소하는 것으로 나타났다.

<실험예 3> 배양액으로부터 생성된 리파아제의 농축 및 리파아제의 활성 측정

미생물로서 리조푸스 오리제를 배양 후, 8000rpm으로 원심분리하여 얻게 된 각각의 배양액을 20 내지 100중량% 포화농도의 황산암모늄(ammonium sulfate)으로 4℃ 조건에서 처리하여 리파아제(Lipase)를 포함한 단백질을 침전시켜 농축물을 수득하였다. 이후 4℃, 12,000rpm의 조건에서 20분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 침전물을 동일 부피의 0.05M 인산 완충용액(pH 7.0)에 녹인 후, 투석막을 이용하여 동일 완충용액(4℃) 조건에서 농축된 배양농축액을 얻었다.

리파아제 침전에 사용한 황산암모늄의 포화농도에 따른 리파아제의 활성은 하기 표 4와 같다.

황산암모늄의 농도	리파아제 활성 (U/㎖)
0 내지 20%	3.54
20 내지 40%	10.22
40 내지 60%	14.84
60 내지 80%	15.33
80 내지 100%	15.48

상기 표에서 알 수 있듯이, 리파아제 침전에 사용한 황산암모늄의 포화농도가 80 내지 100%일 때 리파아제의 활성이 가장 높았다. 그러나, 경제적인 측면을 고려할 때 황산암모늄의 농도는 60 내지 80%가 적당하다.

<제조예 1> 리조푸스속 미생물의 배양농축물의 제조

리조푸스속 미생물로서 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae)를 4중량%의 감자 전분, 1중량%의 덱스트로즈, 1중량% 올리브 오일 및 잔량으로서 물을 포함하는 PDB(Potato Dextrose Broth)에 배지 용적 대비 10용적%의 양으로 접종시키고, 호기조건, pH 6.0, 30℃의 배양조건에서 배양시킨 후, 1 내지 10℃에서 800 내지 1200rpm으로 원심분리시켜 수득된 상등액을 염석시켜 수득되는 석출물을 수득하고, 이를 리조푸스속 미생물의 배양농축물로 하였다.

<실시예 1 및 대조구 1 내지 2> 미생물들(슈도지마속 미생물 및 리조푸스 오리제) 및 리조푸스 오리제 배양농축물 간의 발효성능 비교 실험

상기 제조예 1의 본 발명에 따른 리조푸스속 미생물(리조푸스 오리제)의 배양농축물(실시예 1)과 대조군으로서 배양농축하지 않은 미생물 자체로서 슈도지마속 미생물(대조구 1: Pseudozima sp.)과 리조푸스 오리제(대조구 2)를 사용하여 해양성 오일로서 정어리에서 채취한 어유를 발효시켰을 때의 지방산 함량의 차이가 있는 지를 실험하였다. 단, 리조푸스 오리제의 배양농축물은 상기 제조예 1에서 수득된 것을 pH 7.0의 인산염 완충용액(Sodium phosphate buffer)(50mM)에 혼합시켜 사용하였다.

대조구들로서의 미생물 자체로 발효시킨 경우로서의 슈도지마속 미생물과 리조푸스 오리제는 분양 받은 상태의 미생물들을 상기 PDB 배지에 배지 용적 대비 10용적%의 양으로 접종시켜 확대배양한 후, 확대배양물 그리고 리조푸스 오리제 배양농축물 각 50중량%에 해양성 오일로서 정어리에서 채취한 어유 50중량%의 비율로 혼합하고, 회전수 300rpm, 37℃에서 72시간 동안 발효시켰으며, 발효를 마친 오일은 4000rpm으로 20분간 원심분리 후, 여과하여 발효 해양성 오일을 수득하였다. 발효 후의 지방산 함량을 측정하고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

	함량 (%)
	DHA	EPA
대조구 1	0.94	1.85
대조구 2	1.95	2.56
실시예 1	8.39	10.23

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 미생물 자체를 이용하여 발효시킨 경우에 비해, 본 발명에 따른 리조푸스 오리제의 배양농축물로 발효시킨 경우에서 동일한 해양성 오일을 발효시켜도 더 높은 오메가-3 지방산 함량을 포함(약 9배)하는 발효 해양성 오일을 수득할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예 4> 발효 온도에 따른 유리 필수지방산 생산 수율 측정

최적의 발효 조건을 설정하기 위해 해양성 오일로서 정어리에서 채취한 어유의 온도를 37℃로 설정한 후, <실험예 3>의 배양농축물(60 내지 80% 황산암모늄 사용)를 10℃, pH 5.0 내지 8.0의 인산 완충용액(Phosphate buffer)(50mM)에 혼합하였다. 그 후, 배양농축액 50중량% 대비 해양성 오일 50중량%의 비율로 혼합하고, 회전수 350rpm, 반응온도 25, 37, 45℃에서 각각 72시간 동안 발효시켰으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

발효온도(℃)	함량 (%)
	DHA	EPA
25	3.95	5.41
37	8.47	10.98
45	5.46	7.54

실험결과, 발효 온도가 37℃에서 가장 높은 필수지방산 생산 수율을 보였다.

<실험예 5> 시간대별 초음파(Sonication)에 따른 유리 필수지방산 생산 수율 측정

최적의 발효 조건을 설정하기 위해 해양성 오일로서 정어리에서 채취한 어유의 온도를 37℃로 설정한 후, <실험예 3>의 배양농축물(60 내지 80% 황산암모늄 사용)를 10℃, pH 5.0 내지 8.0의 인산 완충용액(Phosphate buffer)에 혼합하였다. 그 후, 배양농축액 50중량% 대비 해양성 오일 50중량%의 비율로 혼합하고, 시간대별로 초음파 처리기(제조회사: 화신테크, 모델명: POWERSONIC 250, 코드번호: 100-520-220)를 사용하여 초음파(sonication; 출력: 700W(220V, 60㎐)를 발생시킨 후, 회전수 350rpm, 반응온도 37℃에서 72시간 동안 발효시켰으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

초음파처리(분)	함량 (%)
	DHA	EPA
30	4.51	6.46
60	8.46	10.25
90	7.59	9.21
120	7.17	9.01

<실험예 6> 2차 발효에 따른 유리 필수지방산 생산 수율 측정

최적의 발효 조건을 설정하기 위해 해양성 오일로서 정어리에서 채취한 어유의 온도를 37℃로 설정한 후, <실험예 3>의 배양농축물(60 내지 80% 황산암모늄 사용)를 10℃, pH 5.0 내지 8.0의 인산 완충용액(Phosphate buffer)에 혼합하였다. 그 후, 배양농축액 50중량% 대비 해양성 오일 50중량%의 비율로 혼합하고, 회전수 350rpm, 반응온도 25, 37, 45℃에서 각각 72시간 동안 발효시키고, 여기서 회수된 발효오일을 다시 농축액과 상기와 동일한 조건에서 2차 발효를 하였다. 1차 발효 후 얻어진 시료와 2차 발효 후 얻어진 시료를 분석하여 유리된 필수 불포화지방산을 측정 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

함량 (%)
1차 발효		2차 발효
DHA	EPA	DHA	EPA
8.72	10.79	10.48	13.85

실험결과, 2차 발효에서 높은 필수지방산 생산 수율을 보였다.

<실험예 7> pH에 따른 필수지방산 생산 수율 측정

최적의 발효 조건을 설정하기 위해 해양성 오일로서 정어리에서 채취한 어유의 온도를 37℃로 설정한 후, <실험예 3>의 배양농축물(60 내지 80% 황산암모늄 사용)를 10℃, pH 5.0 내지 8.0의 인산 완충용액(Phosphate buffer)에 혼합하였다. 그 후, 배양농축액 50중량% 대비 해양성 오일 50중량%의 비율로 혼합하고, pH 만을 달리하면서 회전수 350rpm, 반응온도 37℃에서 72시간 동안 발효시켰으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

발효 pH	함량 (%)
	DHA	EPA
5.0	3.28	5.86
6.0	6.42	8.72
7.0	8.72	10.79
8.0	7.34	9.16

실험결과, 발효 pH가 7.0에서 가장 높은 필수지방산 생산 수율을 보였다.

<실험예 8> 발효와 유화제에 따른 필수지방산 생산 수율 측정

최적의 발효 조건을 설정하기 위해 해양성 오일로서 정어리에서 채취한 어유의 온도를 37℃로 설정한 후, <실험예 3>의 배양농축물(60 내지 80% 황산암모늄 사용)를 10℃, pH 7.0의 인산 완충용액(Phosphate buffer)에 혼합하였다. 그 후, 배양농축액 50중량% 대비 해양성 오일 50중량%의 비율로 혼합하고, 물리적 유화를 시킨 것과 유화제(Tween-20, 0.2%)를 혼합한 것을 회전수 350 rpm, 반응온도 37℃에서 72시간 동안 발효시켰으며, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

함량 (%)
물리적 유화		유화제(Tween-20, 0.2%)
DHA	EPA	DHA	EPA
8.47	10.98	9.84	11.94

실험결과, 유화제를 전혀 사용치 않고 초음파와 블렌딩 만을 이용하였을 경우 최종 유리 필수불포화지방산 생산 수율에 큰 차이가 없는 것으로 보였다.

<실험예 9> 효소액과 오일의 중량비에 따른 필수지방산 생산 수율 측정

최적의 발효 조건을 설정하기 위해 해양성 오일로서 정어리에서 채취한 어유의 온도를 37℃로 설정한 후, <실험예 3>의 배양농축물(60 내지 80% 황산암모늄 사용)를 10℃, pH 7.0의 인산 완충용액(Phosphate buffer)에 혼합하였다. 그 후, 배양농축액 20 내지 80중량% 대비 해양성 오일 80 내지 20중량%의 비율로 혼합하고, 회전수 350rpm, 반응온도 37℃에서 72시간 동안 발효시켰으며, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

효소액 : 오일 (중량비, %)	함량 (%)
	DHA	EPA
20 : 80	2.87	5.28
50 : 50	7.38	9.83
80 : 20	5.72	7.16

실험결과, 효소액과 오일의 중량비가 50 : 50에서 가장 높은 필수지방산 생산 수율을 보였다.

<실험예 10> 발효 시간에 따른 필수지방산 생산 수율 측정

최적의 발효 조건을 설정하기 위해 해양성 오일로서 정어리에서 채취한 어유의 온도를 37℃로 설정한 후, <실험예 3>의 배양농축물(60 내지 80% 황산암모늄 사용)를 10℃, pH 7.0의 인산 완충용액(Phosphate buffer)에 혼합하였다. 그 후, 배양농축액 50중량% 대비 해양성 오일 50중량%의 비율로 혼합하고, 회전수 350rpm, 반응온도 37℃에서 24 내지 120시간 동안 발효시켰으며, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

발효시간 (hour)	함량 (%)
	DHA	EPA
24	5.41	8.94
48	6.97	9.83
72	7.43	10.33
96	7.21	9.92
120	7.3	10.52

실험결과, 발효 시간이 길어질수록 가장 높은 필수지방산 생산 수율을 보였으나, 72시간 이후에는 필수지방산의 생산 수율 증가율이 별로 증가하지 아니하였다. 따라서 필수지방산 생산의 경제적인 면과 효율을 고려하여 발효 시간은 72시간이 적당하다.

<실험예 11> 발효 RPM에 따른 필수지방산 생산 수율 측정

최적의 발효 조건을 설정하기 위해 해양성 오일로서 정어리에서 채취한 어유의 온도를 37℃로 설정한 후, <실험예 3>의 배양농축물(60 내지 80% 황산암모늄 사용)를 10℃, pH 7.0의 인산 완충용액(Phosphate buffer)에 혼합하였다. 그 후, 배양농축액 50중량% 대비 해양성 오일 50중량%의 비율로 혼합하고, 반응온도 37℃에서 150 내지 450rpm으로 발효시켰으며, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

발효회전수 (RPM)	함량 (%)
	DHA	EPA
150	3.75	5.76
250	5.97	8.42
350	7.51	10.43
450	7.12	10.01

실험결과, 발효 rpm이 증가할수록 가장 높은 필수지방산 생산 수율을 보였으나 350rpm 이후에는 필수지방산의 생산 수율 증가율이 감소하였다. 따라서 필수지방산 생산의 경제적인 면과 효율을 고려하여 발효 시간은 350rpm이 적당하다.

<실험예 12> 발효전 오메가-3 오일과 발효후 오메가-3 오일을 섭취시킨 렛트의 혈중 DHA 및 EPA 농도 측정

5주령 된 렛트를 구입하여 1주 동안 새로운 사육환경에 적응시킨 후, 1일 동안 절식시켰다. 렛트 1마리당 1㎖의 발효 전 오메가-3 오일 혹은 발효 후 오메가-3 오일을 존대를 사용하여 섭취시켰다. 채혈하는 양은 1회당 1.5㎖로 하였으며 마리당 3회 이상 채혈수를 제한하였다. 따라서, 본 발명에 사용한 채혈시간을 만족시키기 위해 1회 샘플 검측당 3마리의 렛트를 사용하였다. 정맥채혈된 혈액은 5mM EDTA와 최종 20mM 구연산나트륨 완충용액에 맞춘 분말이 들어 있는 튜브에 넣어 부드럽게 흔들어주어 혈액응고를 방지한 다음 이를 섭씨 4도에서 5000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액인 혈장액을 얻었다. 이 혈장액(약 0.7㎖)에 0.15㎖의 클로로포름 : 메탄올(1:1 중량비) 용매 혼합액을 넣어 지질성분을 추출하였다. 이렇게 추출된 지질은 다시 2.5% 황산이 첨가된 메탄올에 녹여 2시간 동안 70℃에서 반응시켜 지방산 메틸에스테르(FAME)를 형성시켰다. 이들 지방산 메틸에스테르는 가스크로마토그래피로 분석되었으며 지방산 표준품은 뉴체크프렙사(NuChek Prep)에서 구매하여 사용하였다.

<실험예 13> 항균활성 측정

발효오일의 항균성을 측정하기 위해 일단 2가지 균주를 선택하였다. 여기에는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, ATCC 25923), 여드름유발균(Propionibacterium acnes, ATCC 49145)을 사용하였는데 이 균주들은 미국 ATCC(American Type Culture Collection)에서 동결건조된 것을 구입하여 뮐러힌톤 ㅂ브로스(eller Hinton Broth: MHB) 배지에 2 내지 3회 계대배양한 후 사용하였다.

항균성을 나타내는 시료의 P. acnes와 S. aureus에 대한 최소저해농도(Minimum Inhibition Concentration: MIC)의 결정은 표준액체배지 희석법을 이용하였다. 배지는 MHB를 이용하였다. P. acnes와 S. aureus은 생균수를 측정하여 107 cfu/㎖이 되도록 MHB 배지에 접종하여 준비하였다. 시료는 DMSO(Dimethylsulfoxide)를 용매로 사용하여 시료의 최종 농도가 10% DMSO에 2, 4, 8%가 되도록 하여 준비해 놓은 균에 혼합하여 16시간 동안 37℃에서 150rpm으로 배양하였다. 대조군으로는 10% DMSO만 들어간 배지를 사용하였다. 결과의 확인은 Agar를 1.5% 넣어 굳힌 MHB에 0.1㎖씩 도말하여 섭씨 37도에서 24시간 배양 후 콜로니를 확인하였다.

발효오일의 시료는 실시예 7에서 제조한 것으로 pH 7.0의 발효액을 사용한 발효시료, <실험예 9>에서 발효농축액과 오일의 중량비가 1:1로 하여 발효된 시료, 그리고 <실험예 10>에서 72시간 발효하여 얻은 발효시료를 사용하였다. 이들의 최종 농도는 2, 4, 8% 되게 상기한 대로 배양튜브에 첨가하여 16시간 동안 배양하였다.

실험결과, 도 10에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 <실험예 7, 9, 10>에 의해 제조된 발효오일은 공통적으로 최종 농도 4%에서 황색포도상구균(S. aureus)에 대하여 항균활성이 있음을 알 수 있었다. 그러나, 발효 오메가-3 오일의 최종농도 10%에서도 P. acnes에 대해서는 항균활성이 거의 없었다.

<실험예 14> 오메가-3 오일의 고지방 식이 쥐에 대한 고지혈증 개선 효과

1. 실험동물: 실험동물은 생후 4주령의 C57BL/6 수컷 마우스를 대한민국 서울 소재 샘타코㈜에서 분양 받아 사육하였다. 실험식이와 식수는 자유로 급여하였고 사육실은 온도 22±1℃, 상대습도 55±5%로 유지하였고, 명암은 12시간 주기(07:00 내지 19:00)를 유지하였다.

2. 군 분리 및 시료투여: 고지혈증 유도를 위하여 먼저 일반식이로 10일간 적응시킨 후, 60%kcal 지방 사료를 5주간 급여하였다. 그룹은 일반사료군(정상대조), 고지방사료군(High Fat Diet, 음성대조), 오마코군(Omaco, 양성대조), 정제어유군(Purified Oil), 발효오일 저농도군(Fermented Oil Low), 발효오일 고농도군(Fermented Oil High) 등 6그룹으로 나누고 각 군당 8마리로 하였다. 시료는 경구투여(1회/2일) 방법으로 급여하였고, 일반사료군과 고지방사료군에게는 음용수를 투여하였다(표 14: 군별 시료의 경구투여량).

군	식이	용량 (㎎/g 체중)	경구 투여
일반사료군	정상대조군	4	물
고지방사료군	고지방대조군	4	물
오마코군	고지방사료군	2	오마코(어유)1)
정제어유군	고지방사료군	4	정제어유
발효오일 저농도군	고지방사료군	2	발효오일
발효오일 고농도군	고지방사료군	4	발효오일
1) 오마코연질캡슐: 전문의약품, 건일제약(주)

3. 실험식이: 실험식이는 60% kcal 지방 사료(미합중국 뉴저지주 소재, 오픈소스다이어트, 리서치다이어트사(OpenSource Diets, Research Diets, Inc.)을 사용하였고, 그 조성은 하기 표 15(고지방식이 조성표 (g/kg diet))에 나타내었다.

성분	중량(㎎)	열량(kcal)
카제인(80메쉬)	200	800
L-시스틴	3	12
옥수수 녹말	0	0
말토덱스트린 10	125	500
슈크로스	68.8	275.2
셀룰로오스(BW200)	50	0
대두유	25	225
지방	245	2205
미네랄 믹스(S10026)	10	0
제2인산칼슘	13	0
탄산칼슘	5.5	0
시트르산칼륨(1수화물)	16.5	0
비타민 믹스(V10001)	10	40
타르타르산수소콜린	2	0
염료(FD&C blue dye #1)	0.05	0
합계	773.85	4057.2

4. 시료 수집: 실험기간 동안 체중은 주 1회, 식이섭취량은 주 2회 측정하였다. 실험동물을 희생시키기 12시간 전에 절식시키고, 디에틸에티르(diethyl ether)로 마취시킨 후, 파스퇴르 피펫으로 안와정맥에서 채혈하였다. 채혈 후, 3,000rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하였고, 분석 전까지 -80℃에서 냉동보관하였다.혈액을 채취한 후, 간, 신장, 부고환, 복부지방 및 부고환지방을 적출하여 멸균된 0.9% 염화나트륨용액으로 세척 후, 물기를 제거하고 무게를 측정하였고 분석 전까지 -80℃에서 냉동보관하였다.

5. 혈청 중 지질 분석: 혈청 중 중성지방(AM 157S-K), 총 콜레스테롤(AM 202-K), HDL 콜레스테롤(AM 203-K)의 농도는 효소시약 분석 킷트(대한민국 서울 소재, 아산파마슈티칼사(ASAN Pharmaceutical))를 사용하여 측정하였다. 혈청의 중성지방 농도는 500㎚에서 총 콜레스테롤과 HDL 콜레스테롤의 농도는 550㎚에서 분광분석기(영국 스톤 소재, 비비사이언티픽사(Bibby Scientific Ltd.) 제품, JENWAY 7315 Spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다.

6. 통계분석: 모든 결과는 3반복으로 측정하여 평균과 표준편차로 나타냈으며, SPSS 프로그램을 이용하여 통계처리를 진행하였다. 실험군 간의 유의성 검증은 아노바(ANOVA: Scheffe, p<0.05) 시험을 실행하였다.

실험결과

1. 체중 및 체중증가량

실험식이에 따른 실험동물의 체중 및 체중증가량의 변화를 표 16에 나타내었다. 5주 동안 고지방식이를 급여하여 고지혈증을 유발한 후, 오메가 3 오일을 4주간 급여한 결과, 증류수를 급여한 고지방사료군에 비해 체중증가량이 유의적으로 감소하였고, 특히 발효오일 고농도군에서는 체중증가량이 3.40g으로 가장 적은 체중증가량을 나타내었다.

군	초기체중(g)	최종체중(g)	체중증가(g/일)
고지방식이군	32.14±1.51a	39.27±1.23a	7.13±1.01a
오마코군	32.69±1.58a	37.89±1.62a	5.20±0.80b
정제어유군	33.15±1.65a	38.34±1.99a	5.20±0.77b
발효오일 저농도군	33.08±1.83a	39.06±1.64a	5.98±0.99ab
발효오일 고농도군	33.19±1.87a	36.59±1.51a	3.40±0.61c

2. 혈청 중 지질함량

오메가 3 오일을 4주간 급여한 마우스 혈청 중 지질함량을 측정하여 표 17에 나타내었다. 발효오일 저농도군, 발효오일 고농도군, 오마코군의 중성지방 함량 모두 고지방사료군에 비해 유의적으로 낮게 나타났다. 총콜레스테롤의 함량은 발효오일 고농도군에서 155.0㎎/㎗로 고지방사료군에 비해 유의적으로 낮은 함량을 나타내었고 기타 군에 비해 유의적인 차이는 없었다.

군	트리글리세리드 (㎎/㎗)	총콜레스테롤 (㎎/㎗)	HDL 콜레스테롤 (㎎/㎗)
고지방식이군	110.3±10.4a	184.3±19.6a	101.3±6.3a
오마코군	91.9±5.4b	160.6±18.7ab	93.5±5.6a
정제어유군	100.7±8.8ab	168.4±8.7ab	103.0±4.2a
발효오일 저농도군	92.3±8.7b	164.1±13.6ab	95.2±4.2a
발효오일 고농도군	91.6±7.5b	155.0±19.8b	94.3±11.3a

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (19)

1. 어류 오일, 조류에서 채취한 조류 오일 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 해양성 오일을 리조푸스속 미생물의 배양농축물로 발효시켜 수득되되, 여기에서 상기 배양농축물이 상기 리조푸스속 미생물을 배지에 배지 용적 대비 10용적%의 양으로 접종시키고, 호기조건, pH 5.5 내지 6.5, 25 내지 35℃의 배양조건에서 배양시킨 후, 1 내지 10℃에서 800 내지 1200rpm으로 원심분리시켜 수득된 상등액을 황산암모늄으로 염석시켜 수득되는 석출물임을 특징으로 하는 발효 해양성 오일.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 배지가 2 내지 10중량%의 감자 전분, 0.5 내지 3중량%의 덱스트로즈 및 잔량으로서 물을 포함하는 PDB(Potato Dextrose Broth)임을 특징으로 하는 발효 해양성 오일.
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 PDB가 PDB 총 중량을 기준으로 0.1 내지 10중량%의 오일을 더 포함함을 특징으로 하는 발효 해양성 오일.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 배양조건에서 배양시간이 80 내지 150시간의 범위 이내임을 특징으로 하는 발효 해양성 오일.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 해양성 오일의 발효가 상기 해양성 오일 10 내지 80중량%에 잔량으로서 상기 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 첨가하여 유화시킨 후, 5.0 내지 8.0의 범위 이내의 pH, 25 내지 50℃의 범위 이내의 온도를 포함하는 발효조건에서 발효시킨 후, 발효 해양성 오일을 정제하는 것으로 수행됨을 특징으로 하는 발효 해양성 오일.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 리조푸스속 미생물이 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae)임을 특징으로 하는 발효 해양성 오일.
8. 해양성 오일을 발효시켜 발효 해양성 오일을 제조하는 방법에 있어서,
   (1) 어류 오일, 조류에서 채취한 조류 오일 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 해양성 오일 10 내지 80중량%에 잔량으로서 리조푸스속 미생물의 배양농축물을 첨가하고 혼합하여 혼합물을 수득하되, 여기에서 상기 배양농축물이 상기 리조푸스속 미생물을 배지에 배지 용적 대비 10용적%의 양으로 접종시키고, 호기조건, pH 5.5 내지 6.5, 25 내지 35℃의 배양조건에서 배양시킨 후, 1 내지 10℃에서 800 내지 1200rpm으로 원심분리시켜 수득된 상등액을 황산암모늄으로 염석시켜 수득되는 석출물인 혼합단계;
   (2) 상기 혼합단계에서 수득되는 혼합물을 유화시키되, 여기에서 상기 유화가 상기 혼합단계에서 수득되는 혼합물을 5 내지 20분간 믹서기로 교반시킨 후, 초음파처리시키는 것으로 수행되는 유화단계;
   (3) 상기 유화단계 이후, 유화된 혼합물을 5.0 내지 8.0의 범위 이내의 pH, 25 내지 45℃의 범위 이내의 온도를 포함하는 발효조건에서 24 내지 120시간 동안 50 내지 500rpm의 범위 이내에서 교반시키면서 발효시키는 발효단계; 및
   (4) 상기 발효단계에서 수득되는 발효산물을 정제하는 정제단계;
   를 포함함을 특징으로 하는 발효 해양성 오일의 제조방법.
9. 삭제
10. 제 8 항에 있어서,
    상기 정제단계에서의 정제가 상기 발효단계에서 수득되는 발효산물을 원심분리에 의하여 수성층으로부터 오일층을 분리해내고, 이를 여과시키는 것으로 수행됨을 특징으로 하는 발효 해양성 오일의 제조방법.
11. 삭제
12. 제 8 항에 있어서,
    상기 배지가 2 내지 10중량%의 감자 전분, 0.5 내지 3중량%의 덱스트로즈 및 잔량으로서 물을 포함하는 PDB(Potato Dextrose Broth)임을 특징으로 하는 발효 해양성 오일의 제조방법.
13. 제 8 항에 있어서,
    상기 배양조건에서 배양시간이 80 내지 150시간의 범위 이내임을 특징으로 하는 발효 해양성 오일의 제조방법.
14. 제 8 항에 있어서,
    상기 리조푸스속 미생물이 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae)임을 특징으로 하는 발효 해양성 오일의 제조방법.
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 제 1 항, 제3항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 따른 발효 해양성 오일을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물.
    
19. 삭제

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