JPS63245685A - リン脂質にホスホリパーゼを作用させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 大豆レシチン、卵黄レシチン等のリン脂質は、その界面
活性や生理作用を活かして、食品、化粧品、塗料、潤滑
油、磁性材料、飼料、医薬品、農薬等の製造に広く利用
されているが、リン脂質にホスホリパーゼを作用させて
得られる各種加水分解生成物やホスファチジン酸誘導体
も、原料のリン脂質以上に有利な性質を示したり原料リ
ン脂質にはない独特の性質を示したりする有用物質であ
ることが多い６本発明は、かかる有用物質製造の目的で
リン脂質に各種ホスホリパーゼを作用させる場合におけ
る反応方法の改良に関するものである。

従来の技術 ホスファチジン酸の誘導体であるリン脂質に水の存在下
でホスホリパーゼを作用させると、加水分解反応が起こ
る。リン脂質の加水分解を生じさせるホスホリパーゼと
しては、大別してホスホリパーゼＡ１同Ｂ、同Ｃおよび
同りの４種類があり、リン脂質分子に対する作用部位を
それぞれ異にしている。そしてホスホリパーゼＤは、単
なる加水分解反応だけでなく、２価金属イオン等で活性
化した状態で、且つホスファチジル基受容体となり得る
水酸基含有化合物の存在下に、グリセロリン脂質に作用
させると、ホスファチジル基転移反応を生起させて新た
なホスファチジン酸誘導体を生じさせる。

これらホスホリパーゼを利用するリン脂質の加水分解反
応またはホスファチジル基転移反応によりなんらかの物
質を製造しようとすると、反応成分としての水とそれに
難溶性のリン脂質とを温和な条件で反応させることにな
るため、工業的実施には幾つかの困難が伴う、たとえば
、従来、ホスホリパ、　−ゼその他の水溶性反送成分は
水に溶解させ、水に溶は難いリン脂質は有機溶媒（たと
えばエーテル、ヘキサン等）に溶解させ、得られる二つ
の反応成分溶液を強撹拌して混合しながら目的とする反
応を生起させる方法がありなか、この方法は、酵素と基
質成分とを充分接触させるための強い撹拌を続けなけれ
ばならず（攪拌を中止すれば水溶液層と有機溶媒層との
２層に分離して反応がほとんど進行しなくなる）、また
攪拌しても、液−液接触界面における反応となるため、
反応効率が悪いという問題があった。これらの問題を解
決するため、反応系にトリトンＸのような界面活性剤を
加えて水中油型の安定な乳化状態を形成させる方法も提
案されているが、反応終了後に生成物と界面活性剤とを
分離しなければならず、工程の複雑化が避けられない。

微孔性隔膜型バイオリアクターを用いて水溶液中のホス
ファチジル基受容体と有機溶媒溶液中のリン脂質とを反
応させる方法（Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、
ｗ６３．３７〜４４．１９８５）も強撹拌不要でしかも
連続化が可能な方法であるが、基質濃度を高くすること
ができず（好適濃度は約１％以下）、反応効率が悪い。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、リン脂質にホスホリパーゼを作用させる場合
における上述の問題点を解決し、従来よりも反応効率が
良（、工程・装置が簡単ですむ方法を提供しようとする
ものである。

問題点を解決するための手段 上記課題を解決するために本発明において採択された手
段は、リン脂質にホスホリパーゼを作用させて加水分解
反応またはホスファチジル基転移反応を生起させるに当
り、水、リン脂質、リン脂質の溶媒としての有機溶媒、
およびホスファチジル基転移反応を生起させる場合にお
けるホスファチジル基受容体の比率を選書ことによりこ
れらの成分から透明な均　　　。

−相を形成させ、この均一相中でリン脂質にホスホリパ
ーゼを作用させることにある。

ここで透明な均一相とは、静置しても層分離を起こさず
、また乳化状態でもない、溶液状の透明な状態を意味す
る。

この透明な均一相の形成は、主としてリーン脂質の界面
活性に依存すると思われ、リン脂質の種類と濃度に強く
影響されるが、温度、水と有機溶媒の比率、有機溶媒の
種類等によっても左右される。したがって、いかなる反
応成分の組合せにも通用する透明な均一相形成のための
充分条件を示すことは困難である。しかしながら、本発
明者らが調べた範囲内では、いかなるリン脂質も、条件
を選べば透明な均一相を形成する能力を持つ、透明な均
一相を形成する組成は多くの反応系構成成分の組合せに
ついて確認されており、その例を第１図〜第４図に示し
た。

本発明の方法においてリン脂質溶解用の有機溶媒として
は、リン脂質を高濃度まで溶解し得るものを用いること
が望ましい。なお、有機溶媒の中にはホスホリパーゼを
失活させるものがあり、そのような溶媒は当然使用する
ことができない。

たとえば低級脂肪族−価アルコール、ジメチルスルホキ
シド、ジメチルホルムアミド、ジオキサン等は、リン脂
質溶解能や透明な均一相を形成する能力の点ではすぐれ
ているが、ホスホリパーゼを失活させる作用があり、使
用できないか、使用量が制限されることが多い０本発明
の方法において好ましい溶媒は、°炭素数がそれぞれ２
〜１０のカルボン酸とフル叶ルから形成されたエステル
類（たとえば酢酸エチル、酢酸ブチル）、炭素数５以上
のケトン類（たとえば３−ペンタノン、メチルイソブチ
ルケトン、４−ヘプタノン、ジイソブチルケトン）など
である、有機溶媒は、２種以上を混合して用いてもよい
。

水、リン脂質、有機溶媒、およびホスファチジル基転移
反応を生起させる場合１こおけるホスファチジル基受容
体等から透明な均一相を形成させる手順は任意であるが
、通常は、次のような方法が最も容易に透明均一相を与
えるので好ましい。

まずリン脂質の良溶媒である有機溶媒に、必要ならば加
温しながら、リン脂質を溶解する。リン脂質は、溶液粘
度が過大にならない範囲で、なるべく高い濃度本で溶解
するのが透明な均一相形成には有利である。別に、ホス
ファチジル基転移反応を行わせる場合におけるホスファ
チジル基受容体、ホスホリパーゼを溶液状で用いる場合
におけるホスホリパーゼ、必要に応じて用いる酵素活性
化剤等、すべての水溶性成分を水に溶かす。得られた水
溶液を、上述のリン脂質溶液に徐々に加えながら撹拌す
る。水溶液の量が少ない間は、簡単な撹拌だけで透明な
均一相が形成される。簡単な撹拌では透明にならなくな
った場合でも、ある限度までは（図面が示す透明な均一
相形成領域にある間は）、高速回転ミキサー処理、超音
波処理等を施すと、透明な均一相が形成される。限度を
こえて水溶液が加えられた場合、いかなる処理を加えて
も透明な均一相にはならず、乳化状態になったり層分離
を起こしたりする。透明な均一相を形成し難い原料の場
合、あるいは透明な均一相を形成する組成範囲がせます
ぎるか反応に適当でない場合、リン脂質溶解用の有機溶
媒とは別に少量の親水性有機溶媒（たとえば２−プロパ
ツール、２−ブタノール、ジオキサン等）を加えると、
状況が改善されることがある。

本発明の方法において、リン脂質としてはいかなるリン
脂質も使用することができるが、たとえば大豆レシチン
、卵黄レシチンなどの天然リン脂質や、ホス７アチジル
コリン、ホス７７チシルエタノールアミンなどの合成品
は、透明な均一相を形成させ易く、本発明の方法におけ
る原料リン脂質として有利なものである。

ホスホリパーゼＤとしては、キャベツ、ニンジン、ピー
ナツなどの植物体から抽出されたものと、微生物由来の
ものとがあり、本発明はそのいずれを用いる方法にも適
用できる６本発明の方法において、ホスホリパーゼＤは
反応系に溶解させて用いるほか、固定化酵素の形で用い
てもよい。

なお、ホスホリパーゼＤをホスファチジル基転移反応に
用いる場合は、一般に水溶性カルシウム塩等を加えて活
性化することが必要とされている。本発明の方法におい
て、活性化のためのカルシウム塩は水溶液にして反応系
に混合すればよいが、用いる有機溶媒の種類によっては
、カルシウム塩等金属塩による活性化を必要としないこ
とがわかっている（たとえば酢酸エチルのような脂肪族
エステル類、メチルイソブチルケトンのような脂肪族ケ
トン類などは、顕著なホスホリパーゼＤ活性化作用を示
す。）。したがって、本発明の方法においてホスホリパ
ーゼＤ活性化のためのカルシウム塩は必須のものではな
い。

ホスホリパーゼＤを用いるホスファチジル基転移反応に
おいては、“ホスファチジル基受容体”となり得る化合
物、すなわち直鎖脂肪族アルコール（たとえばグリセリ
ン、エチレングリコール、ブタノール、アミルアルコー
ル等）、糖（りとえばグルコース、キシロース、ラクト
ース）、その他アミノ糖、糖アルコール、配糖体、フェ
ノール類などの水酸基含有化合物も反応系に添加される
が、この成分は、水溶性であることが多いから普通には
水に溶かして透明な均一相に導入すればよいが、リン脂
質とともに有機溶媒に溶かしたほうが有利な場合もあり
、添加方法は任意である。

反応系には、必要に応じて・池に任意の補助的成分、た
とえば反応系を酵素の至適ｐＨ１：調整するための緩衝
剤、ホスホリパーゼの活性化剤としての各種塩類、界面
活性剤等を加えることができる。

すべての反応系構成成分から透明な均一相を形成させた
後は、用いた酵素の至適温度付近に保って、目的とする
反応に充分な時間、反応させる０反応系が安定な均一相
を形成しているため、反応中強い撹拌は不要である。し
たがって、反応は種型反応器を用いる回分式反応ｊシけ
でなく、管状反応器や固定化酵素充填塔を用いる連続式
反応の形で実施することができる。

反応終了後、反応系から目的とする反応生成物を分取す
るには、アセトンやエタノールを用いた溶媒分別法、シ
リカデノ呟アルミナデル、逆相担体等を用いたカラムク
ロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等を適用す
ればよい。

ヌ１囮 以下、実施例を示して本発明を説明する。

実施例　１ 大豆レシチン、ホスファチジル基受容体としてのグリセ
リン、ｐＨ５，０の酢酸緩衝液、酢酸エチル、２−プロ
パツールおよび放線菌由来のホスホリパーゼＤを表１に
示した比率で混合した（いずれも全液量が１２００＋ａ
ｌとなる）。本発明例の場合は透明な均一相が形成され
るが、対照例の場合は水溶液層と有機溶媒層の２層に分
れる。その後、本発明例の場合は静置し対照例の場合は
振とうしなが呟いずれも５０°Ｃで６０分間反応させた
。

表１ −】引Δ四−一　　本発明例 大豆レシチン（ｇ）　　　　　　　　６　　　、　　　
３００グリセリン（ｎｌ）　　　　　　１２０　　　　
１２０酢酸緩衝液（＋ＩＩ＋）　　　　　　　１２０達
’　　　　　２ＳＯ＊２酢酸エチル（ｍｌ）　　　　　
　　９６０　　　　　４５０２−プロパツール（＋ｌ）
　　　　　　　　　　　　５０ホスホリパーゼＤ（ｕｎ
ｉｔ）　　１２００　　　３００００連１　濃度２０ｍ
Ｍ、　　　　”　　濃度６０ｍＭ反応後、ホス７アチジ
ルグリセロールの生成量を調べたところ、いずれの場合
も、原料のリン脂質基準の収率は６８％（ｗ／ｗ）であ
った。

この結果か駄本発明の方法は静置反応を可能にするだけ
でなく、従来法と比べて飛躍的に高い装置利用効率を達
成し得ることがわかる。

実施例　２ 卵黄レシチン（ホス７アチジルコリン二ホス７１チシル
エタノールアミン＝１６：３）、グリセリンおよび水（
放線菌由来のホスホリパーゼＤを溶かしたもの）を表２
に示したような比率で混合し、さらに、酢酸エチルと２
−プロパツールの９：１混合液を、全量が１００ａ＋ｌ
になるように添加して撹拌・した。いずれの場合も、透
明な均一相が形成された。これらを５０℃に加熱して静
置し、６０分間反応させたときのホスファチジル基転移
反応率を表２にあわせて示した。

表２ 卵黄レシチン（ｇ）　　２．３　７，４　１５，５　２
４，７　３１，６　３９．５グリセリン（ｍｌ）　　　
２．９　３．０　５．２　５，８　９，５　９．５水（
ｍｌ）　　　　　３．２　５．２　６，３１１，５１１
，１１１．１実施例　３ 大豆レシチン（ホス７アチジルコリン’＆［ｆｆ１８０
％）３００ＩＩ１ｇを５０℃のｎ−ヘキサン３７５ｕｌ
に溶解し、放線菌由来のホスホリパーゼＤを５ユニット
含む酢酸緩衝液（ｐＨ４）１２０．１およびグリセリン
７５ｖ１を超音波処理しながら添加混合して、透明な均
一相を形成させた。５０℃で６０分間静置してホスファ
チジル基転移反応を行わせた結果、ホス７アチシルコリ
ンの７１．０％が転移反応を起こした。

実施例　４ ｎ−ヘキサンのかわりに同量のベンゼンを用いたほかは
実施例３と同様にして、ホスファチジル基転移反応を行
なった。

転移率は３３．５％であった。

実施例　５ ホス７アチジルコリン含有量８０％の大豆レシチン３０
０−Ｉｌ１ｇヲ５０℃の酢酸エチル３７５μｌに溶解し
、これにホスホリパーゼＡ２（シグマ社）を１００ユニ
ット含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）１２０１１１を添
加混合して、透明な均一相を形成させた。５０℃で５時
間静置したのち、反応液を分析したところ、８．１％の
脂肪酸と１４％のリン型リン脂質が生成し、ホスホリパ
ーゼＡ２の作用による加水分解反応が起こったことが確
認された。

実施例　６ 弱塩基性陰イオン交換樹脂１ｇに放線菌由来のホスホリ
パーゼＤ　　１８５０ユニツトを、グルタルアルデヒド
を用いた共有結合法により固定し、ガラス製カラム（内
径６．６ｍ＋ｅ）に詰めた。これに、５％（、／いの大
豆レシチン、３．３％のグリセリンおよび３．３％の酢
酸緩衝液（ｐＨ５）を含む酢酸エチル・２−プロパツー
ル（９：１）混合液（温度５０℃；透明な均一相を形成
している）をＳＶ２／Ｈｒで通した。この処理により、
リン脂質の約５０％が転移反応を起こしてホスファチジ
ルグリセロールとなった。

発明の効果 透明な均一相を形成させて酵素を作用させる本発明の方
法は、従来の方法と違って強力な撹拌をしなくても反応
が円滑に進行するので、静置反応またはそれに近い反応
が可能になり、反応装置が簡単なものですむ。また、管
状反応器や固定化酵素充填塔を用いる連続的反応も容易
である。

さらに、事実上溶液に近い透明な均一相には、リン脂質
を高濃度に溶解して反応させることができるか呟反応装
置の利用効率が従来よりもはるかにすぐれている。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は、リン脂質を溶解した有機溶媒と水か
ら透明な均一相が形成される組成例を示す３成分組成図
であって、図中の曲線の下側が、透明な均一相を形成し
得る領域である。なお大豆レシチンＡ−Ｃおよび卵黄レ
シチンは下記組成のものである。 ＰＣ：ホス７アチジルコリン ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミンＰＩ　：ホスフ
ァチジルイノシトール ＰＡ：ホス７アチジン酸

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質にホスホリパーゼを作用させて加水分解
   反応またはホスファチジル基転移反応を生起させるに当
   り、水、リン脂質、リン脂質の溶媒としての有機溶媒、
   およびホスファチジル基転移反応を生起させる場合にお
   けるホスファチジル基受容体の比率を選ぶことによりこ
   れらの成分から透明な均一相を形成させ、この均一相中
   でホスホリパーゼを作用させることを特徴とするリン脂
   質にホスホリパーゼを作用させる方法。
2. （２）透明な均一相を形成させるために、有機溶媒とは
   別の親水性有機溶媒を併用する特許請求の範囲第１項記
   載の方法。
3. （３）ホスホリパーゼとしてホスホリパーゼＤを用い、
   ホスファチジン酸誘導体を生成させるためのホスファチ
   ジル基受容体の存在下に該酵素を作用させる特許請求の
   範囲第１項記載の方法。
4. （４）ホスホリパーゼＤにホスファチジル基転移反応活
   性を発現させる能力を有する有機溶媒によりホスホリパ
   ーゼＤを活性化し、活性化のために２価金属イオンを用
   いない特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）ホスホリパーゼを固定化酵素の形で用いる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。