JPH0573390B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 大豆レシチン、卵黄レシチン等のリン脂質は、
その界面活性や生理作用を活かして、食品、化粧
品、塗料、潤滑油、磁性材料、試料、医薬品、農
薬等の製造に広く利用されているが、リン脂質と
水酸基含有化合物にホスフアチジル基転移作用を
有する酵素を作用させて得られる新たなホスフア
チジン酸誘導体も、原料のリン脂質以上に有利な
性質を示す有用物質であることが多い。本発明
は、リン脂質を原料にして上記ホスフアチジル基
転移反応によりホスフアチジン酸誘導体を製造す
る方法の改良に関するものである。 従来の技術 ホスフアチジン酸の誘導体であるリン脂質に水
の存在下でホスホリパーゼＤを作用させると、加
水分解を起こしてホスフアチジン酸を生じるが、
その際、ホスフアチジル基の受容体となり得るア
ルコール性水酸基含有化合物および２価の金属イ
オンを共存させると、下記のようなホスフアチジ
ル基転移反応を起こして新たなホスフアチジン酸
誘導体を生じることが知られている。

【化】 （リン脂質） （式中、R₁、R₂はアシル基、アルキル基等、X₁
は糖またはアルコール性水酸基含有塩基の水酸基
部分の水素原子１個を除いた後に残る有機基、
X₂は直鎖脂肪族多価アルコール、糖などの水酸
基含有化合物からその水酸基部分の水素原子１個
を除いた後に残る有機基を表わす。） ２価金属イオンは、ホスホリパーゼＤにホスフ
アチジル基転移反応活性を発現させるのに不可欠
のものと考えられており（但し、ホスフアチジル
グリセロールという同一リン脂質分子間でのホス
フアチジル基転移反応においては例外的に２価金
属イオンの添加を必要としなかつたという報告−
Can.J.Biochem.、51、747、1973−がある）、し
たがつて、従来、一般的な異種分子間ホスフアチ
ジル基転移反応によりホスフアチジン酸誘導体を
製造する場合は必ず２価金属イオン（普通はCa
イオン）によつてホスホリパーゼＤの活性化を行
なつていた（特開昭58−63388号、同58−67183
号、同59−187792号、同62−36195号等）。 ホスホリパーゼＤの活性化にCaイオンを用い
た場合、反応系にはイオンと反応性ある物質を加
えることができないし、また、水酸基含有化合物
であつてもCaイオンと化合して反応性を失うよ
うなものはホスフアチジル基受容体として使うこ
とができない。たとえば、転移反応の至適PHが６
〜７付近にある酵素を用いる場合、最も使い易く
且つ安価なリン酸緩衝液はCaイオンと反応して
沈殿を生じるため使うことができず、より高価な
緩衝液を使用せざるを得ない。また、目的物の一
部にCa塩型のものができるから、Na塩型など他
の塩型のものを製造する場合はキレート剤を用い
たりして目的とする塩に変換するなどの操作が必
要である。 発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、リン脂質とホスホリパーゼＤ
を用いる従来のホスフアチジン酸誘導体の製法が
上述のように２価金属イオンの使用にともなう
種々の制約あるものであつたことに鑑み、２価金
属イオンを用いないホスホリパーゼＤの活性化法
による製法を提供して、ホスフアチジン酸誘導体
の製造を従来よりも容易にすることにある。 問題点を解決するための手段 上記目的を達成することに成功した本発明の製
法は、ホスホリパーゼＤの活性化に２価金属イオ
ンを用いず、かわりに炭素数４〜12のエステル
類、炭素数５〜９のケトン類、炭素数５〜８の炭
化水素、炭素数１〜２のハロゲン化炭化水素、炭
素数４〜８の脂肪族エーテル類もしくは環状エー
テル類、またはフエニルメルカプタンを用いて活
性化を行うことを特徴とするものである。 有機溶媒たとえばジエチルエーテルは、従来の
製法においてもしばしば反応系構成成分として用
いられている。しかしながら、従来の製法におい
ては、有機溶媒は水に難溶性のリン脂質を溶かし
て酵素およびホスフアチジル基受容体の水溶液と
接触させるための単なる溶媒として使われてお
り、酵素の活性化には必ずCaイオン等の２価金
属イオンが別に使われている。 ２価金属イオンを用いず有機化合物による酵素
活性化を行うこの発明は、本発明者らによる次の
ような新規な知見に基づくものである。 (a) ある種の有機化合物（たとえば酢酸エチル、
４−ヘプタノン等）は、反応系にある比率以上
に加えられた場合、２価金属イオンが存在しな
くてもホスホリパーゼＤを活性化する。 (b) ある種の有機化合物（たとえば低級脂肪族一
級アルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド等）は、ホスホリパーゼＤをほ
とんど活性化せず、むしろ失活させる。 (c) ホスホリパーゼＤを活性化する化合物の中に
も、ある濃度以上ではホスホリパーゼＤを失活
させるものが多い（たとえば四塩化炭素、ｎ−
ヘキサン、ベンゼン、２−ブタノール、ジオキ
サン等）。 (d) ホスホリパーゼＤに対して事実上不活性な有
機化合物、すなわちホスホリパーゼＤを活性化
せず、また失活もさせない化合物もある。 したがつて、本発明においては、ホスホリパー
ゼＤにホスフアチジル基転移反応活性を発現させ
る作用を有する有機化合物を、上記活性化作用の
ほうが酵素失活作用よりも強く現われるような条
件で用いて、ホスホリパーゼＤを活性化する。 適量使用した場合にホスホリパーゼＤを活性化
するとともにリン脂質を溶解もしくは分散させる
能力の点でもすぐれ、したがつて本発明の製法に
おいて使用する酵素活性化用有機化合物として好
ましいものの具体例を示すと、次のようなものが
ある。 エステル類：炭素数２〜10の脂肪族カルボン酸
および同じ炭素数範囲の脂肪族アルコールから得
られる炭素数４〜12のエステル類が特に好まし
い。たとえば酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸アミ
ル、酢酸デシル、プロピオン酸エチル、プロピオ
ン酸プロピル、酪酸エチル、酪酸ブチル、イソ酪
酸イソブチル、イソ吉草酸エチルなどである。な
かでも酢酸エチルは、２価金属塩を用いる従来の
製法ではとうてい不可能であつたような高率（約
90％以上）でホスフアチジル基転移反応を生起さ
せ、ホスフアチジン酸の幅成が少ないだけでな
く、取扱いが容易で価格も低廉であるから、本発
明の製法で用いるホスホリパーゼＤ活性化剤とし
て最も好ましい。ギ酸メチルやギ酸エチルは酵素
失活作用がやや強く、使い難い。炭素数11以上の
高級脂肪族カルボン酸やアルコールから得られる
エステル、あるいはヒドロキシカルボン酸類（た
とえば乳酸、フマル酸、クエン酸等）のエステル
は、ホスホリパーゼＤ活性化作用が弱い。 ケトン類：炭素数５〜９の脂肪属ケトン、たと
えば３−ペンタノン、メチルイソブチルケトン、
４−ヘプタノン、ジイソブチルケトンが、特に好
ましい。プロパノンやブタノンなど、炭素数が５
未満のものは、酵素失活作用が強い。 ハロゲン化炭化水素：ジクロルメタン、トリク
ロルメタン、ジクロルエタン等が好ましい。 前述のように、これら好ましい有機化合物とい
えども使用量によつては酵素を失活させることが
あり、また失活作用が強く現れる濃度もそれぞれ
異なるから、好適使用量は化合物によつて異なる
が、多くの場合、好適使用量は水１容量部に対し
て酵素活性化用有機化合物0.05〜50容量部の範囲
にある。個々の有機化合物についての最適使用量
は、実験により容易に確認することができる。 本発明の製法において、原料のリン脂質として
はグリセロリン脂質であればいかなるリン脂質も
使用することができ、たとえば大豆レシチン、卵
黄レシチンなど天然のもののほか、ホスフアチジ
ルコン、ホスフアチジルエタノールアミンなどの
合成品を用いることができる。 いま一つの反応原料である“ホスフアチジル基
受容体”となり得る化合物は、水酸基を有する化
合物、すなわちメタノール、エタノール、プロパ
ノール、２−プロパノール、ブタノール、２−ブ
タノール、イソアミルアルコール、ヘキサノー
ル、ヘプタノール、オクタノール、デカノール、
グリセリン、エチレングリコール等のアルコール
類；グリコース、キシロース、アラビノース、フ
ルクトース、β−Ｄ−グリコース、マンノース、
スクロース、ラクトース、セロビオース、メリド
オース等の糖類；グルコサミン、ガラクトサミ
ン、アセチルガラクトサミン等のアミノ糖；ソル
ビトール、マンニトール等のアルコール；アミグ
ダリン、サリシン等の配糖体；フエノール、ニト
ロフエノール、ジニトロフエノール等のフエノー
ル類；その他（たとえばアデノシン）の中から任
意に選ばれる。 なお、本発明の目的は反応方法の改良にあり、
特定のホスフアチジン酸誘導体を提供することに
あるのではないから、いかなるリン脂質とホスフ
アチジル基受容体とを組合せて反応させるかは全
く自由である（本発明の方法においてのみホスフ
アチジル基転移反応を生じ得ないリン脂質は見い
だされていない）。 ホスホリパーゼＤとしては、キヤベツ、ニンジ
ン、ピーナツなどの植物体から抽出されたもの
と、微生物由来のものとがあり、本発明において
はそのいずれを用いてもよいが、微生物、特に放
線菌由来のホスホリパーゼＤは、熱安定性にすぐ
れるとともに活性が強いので好ましい。本発明の
製法において、ホスホリパーゼＤは反応系に溶解
させて用いるほか、固定化酵素の形で用いてもよ
い。 リン脂質、ホスフアチジル基受容体となる化合
物、ホスホリパーゼＤおよびその活性化剤となる
有機化合物を混合してホスフアチジル基転移反応
を生起させる場合、混合順は特に限定されない
が、体表的な方法は次のとおりである。 Ａ リン脂質を水中に分散、懸濁させ、そこにホ
スフアチジル基受容体となる化合物、ホスホリ
パーゼＤ溶液および酵素活性化剤とする有機化
合物を加えて攪拌、混合する。 Ｂ 酵素活性化剤とする有機化合物にリン脂質を
溶解し、ホスフアチジル基受容体となる化合物
およびホスホリパーゼＤの水溶液と混合する。 Ｃ 酵素活性化剤とする有機化合物にリン脂質お
よびホスフアチジル基受容体となる化合物を溶
解し、ホスホリパーゼＤの水溶液と混合する。 反応系には、必要に応じて他に任意の補助的成
分、たとえばPH調整のため緩衝剤、リン脂質また
はその溶液を分散させるための界面活性剤等を、
酵素作用の妨げとならない範囲で加えることがで
きる。但し２価金属イオンは、有機化合物による
ホスホリパーゼＤ活性化の妨げとなるわけではな
いが、本発明では使用しない。 ホスホリパーゼＤを固定化酵素の形で用いる場
合は、反応系を攪拌不要の安定な均一相にしてお
くことが望ましい。その場合は、反応系構成成分
が特定の比率で配合されたときに形成される透明
な均一相を固定化酵素と接触させるとよい。上記
透明な均一相は、酵素活性化用の有機化合物にリ
ン脂質を比較的高濃度に溶解し、そこにホスフア
チジル基受容体となる化合物の水溶液を一定の限
度内で加えて攪拌したときリン脂質の界面活性が
関与して形成される。この均一相は、酵素活性化
剤としての有機化合物以外の親水性溶媒を少量加
えると形成され易くなることがある。たとえば、
卵黄レシチン20重量％、グリセリン５重量％、酢
酸エチル60重量％、２−プロパノール５重量％、
水10重量％の組成の混合物は、容易に、透明な均
一相を形成する。 用いた酵素の至適温度付近で充分時間反応させ
たのち、反応液からアセトンやエタノールを用い
た溶媒分別法、シリカゲルやアルミナあるいは逆
相担体等を用いたカラムクロマトグラフイー、薄
相クロマトグラフイー等の方法により、目的とす
るホスフアチジン酸誘導体を分取することができ
る。 実施例 以下、実施例を示して本発明を説明する。 実施例 １ 卵黄レシチンから調製されたホスフアチジルコ
リン５mg（シグマ社）に、ホスフアチジル基受容
体としてグリセリン100μ、PH6.0のリン酸緩衝
液400μ、放線菌由来のホスホリパーゼD1ユニ
ツトを加え、混合する。 上記のようにして得られる混合物に、０〜
100μの酢酸エチルを加え、50℃に保つて振と
うしながら、ホスフアチジル基転移反応によるホ
スフアチジルグリセロールの生成量を経時的に定
量した。この結果は表１のとおりであつて、２価
金属イオンを加えなくても、酢酸エチル添加量
30μ以上の場合にホスフアチジルグリセロール
が生成した。 表１ ホスフアチジルグリセロール生成速度酢酸エチル添加 生成速度 （μ） （μg／unit・min） ０ ０ 10 ０ 30 35 50 124 75 143 100 101 実施例 ２ ホスフアチジルコリン含有量が約90％である大
豆レシチン2.5ｇ、濃度30％（ｗ／ｖ）のホスフ
アチジル基受容体水溶液100ml、放線菌由来のホ
スホリパーゼＤ溶液２ml、酢酸エチル375mlを混
合し、攪拌しながら50℃で60分間反応させる。 受容体を種々変更して上記製造法を実施した結
果を表２に示す。なお、表中の「％」は、反応液
中の未反応リン脂質を含む全ホスフアチジン酸誘
導体基準の重量％である。 表２受容体 転移反応生成物（％） キシロース 72.2 ガラクトース 1.3 アミグダリン 8.6 ソルビトール 74.2 セリン 46.5 グリセリン 83.8 実施例 ３ ホスフアチジルコリン含有量約90％の大豆レシ
チン2.5ｇ、ホスフアチジル基受容体としてのグ
リセリン30ml、PH5.5の緩衝液40ml、放線菌由来
のホスホリパーゼＤ溶液２mlおよびその活性化剤
としての有機化合物を混合し、50℃で20分間反応
させる。 上記製法において、有機化合物の種類および添
加量を種々変更し、ホスフアチジル基移転反応生
成物であるホスフアチジルグリセロールの収率を
調べた。その結果、下記Ａ群の化合物を用いた場
合は、実験した範囲内（有機化合物添加量10〜
400ml）のいずれかの添加水準において20％をこ
える収率が達成され、またＢ群の化合物の場合も
10〜20％の収率が達成された。 Ａ：イソプロピルエーテル、２−ペンタノン、３
−ペンタノン、メチルイソブチルケトン、４−
ヘプタノン、ジイソブチルケトン、ギ酸メチ
ル、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピ
ル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸
イソブチル、酢酸sec−ブチル、酢酸ｎ−アミ
ル、酢酸イソアミル、酢酸ｎ−デシル、プロピ
オン酸エチル、酪酸エチル、イソ酪酸エチル、
吉草酸エチル、イソ吉草酸エチル、プロピオン
酸ｎ−プロピル、酪酸ｎ−ブチル、ベンゼン、
トルエン、キシレン、ジクロルエタン、フエニ
ルメルカプタン Ｂ：エチルエーテル、ブチルエーテル、テトラヒ
ドロフラン、ジオキサン、アセチルアセトン、
オクタン酸エチル、フマル酸ジエチル、マレイ
ン酸ジエチル、コハク酸ジエチル、酒石酸ジエ
チル、クエン酸トリエチル、イソ吉草酸イソア
ミル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、イソオ
クタン、シクロヘキサン、ジクロルメタン、ト
リクロルメタン、テトラクロルメタン 実施例 ４ ホスフアチジルコリン約85％を含む卵黄レシチ
ン５mgを50μの酢酸エチルに溶解し、グリセロ
ール5μ、100mMグリシン緩衝液（PH９）5μ、
およびキヤベツ由来のホスホリパーゼＤ（シグマ
社製）0.8unitの水溶液20μを加８て、26℃で30
分間反応させた。 反応液をクロロホルム抽出して得られたリン脂
質画分の組成を薄層クロマトグラフイーで調べた
ところ、36.5％の収率でホスフアチジルグリセロ
ールが生成していた。 実施例 ５ 酢酸エチルの代わりにジエチルエーテルを用い
たほかは実施例４と同様にして卵黄レシチンとグ
リセロールを反応させたところ、39.2％の収率で
ホスフアチジルグリセロールが得られた。 発明の効果 ホスホリパーゼＤのホスフアチジル基転移反応
活性を２価金属イオンによらずに有機化合物で発
現させる本発明の製法は、反応系に２価金属イオ
ンが入り込まないことによりリン酸塩緩衝液の使
用も自由になり、ホスホリパーゼＤや反応条件の
選択の幅が広くなつて容易に最適条件での反応を
行わせることができるようになるほか、反応液か
らの目的物の分離・精製も容易である。また、２
価金属イオンが転移反応を直接妨害するために従
来は使用不可能であつたようなリン脂質やアルコ
ール性水酸基含有化合物も反応原料にすることが
できるから、本発明により新規なホスフアチジン
酸誘導体を提供する途が開けたことになる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ホスフアチジル基受容体の存在下、リン脂質
   にホスホリパーゼＤを作用させてホスフアチジル
   基転移反応を生起させることによりホスフアチジ
   ン酸誘導体を製造するに当り、ホスホリパーゼＤ
   にホスフアチジル基転移反応活性を発現させるた
   めの２価金属イオンを用いず、炭素数４〜12のエ
   ステル類、炭素数５〜９のケトン類、炭素数５〜
   ８の炭化水素、炭素数１〜２のハロゲン化炭化水
   素、炭素数４〜８の脂肪族エーテル類もしくは環
   状エーテル類、またはフエニルメルカプタンによ
   りホスホリパーゼＤの活性化を行うことを特徴と
   するホスフアチジン酸誘導体の製造法。 ２ ホスホリパーゼＤの活性化を酢酸エチルによ
   り行う特許請求の範囲第１項記載の製造法。