JPH0573390B2 - - Google Patents

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JPH0573390B2
JPH0573390B2 JP62075907A JP7590787A JPH0573390B2 JP H0573390 B2 JPH0573390 B2 JP H0573390B2 JP 62075907 A JP62075907 A JP 62075907A JP 7590787 A JP7590787 A JP 7590787A JP H0573390 B2 JPH0573390 B2 JP H0573390B2
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JP
Japan
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phospholipase
carbon atoms
phosphatidyl group
phospholipids
phosphatidic acid
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JP62075907A
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Satoshi Kudo
Haruji Sawada
Tsuneichi Watanabe
Akio Kuroda
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Niigata Engineering Co Ltd
Yakult Honsha Co Ltd
Original Assignee
Niigata Engineering Co Ltd
Yakult Honsha Co Ltd
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Publication date
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Priority to CA000562975A priority patent/CA1324777C/en
Priority to DE88302894T priority patent/DE3881091T2/de
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Publication of JPH0573390B2 publication Critical patent/JPH0573390B2/ja
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04Alpha- or beta- amino acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P9/00Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen

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Description

【発明の詳现な説明】
産業䞊の利甚分野 倧豆レシチン、卵黄レシチン等のリン脂質は、
その界面掻性や生理䜜甚を掻かしお、食品、化粧
品、塗料、最滑油、磁性材料、詊料、医薬品、蟲
薬等の補造に広く利甚されおいるが、リン脂質ず
氎酞基含有化合物にホスフアチゞル基転移䜜甚を
有する酵玠を䜜甚させお埗られる新たなホスフア
チゞン酞誘導䜓も、原料のリン脂質以䞊に有利な
性質を瀺す有甚物質であるこずが倚い。本発明
は、リン脂質を原料にしお䞊蚘ホスフアチゞル基
転移反応によりホスフアチゞン酞誘導䜓を補造す
る方法の改良に関するものである。 埓来の技術 ホスフアチゞン酞の誘導䜓であるリン脂質に氎
の存圚䞋でホスホリパヌれを䜜甚させるず、加
氎分解を起こしおホスフアチゞン酞を生じるが、
その際、ホスフアチゞル基の受容䜓ずなり埗るア
ルコヌル性氎酞基含有化合物および䟡の金属む
オンを共存させるず、䞋蚘のようなホスフアチゞ
ル基転移反応を起こしお新たなホスフアチゞン酞
誘導䜓を生じるこずが知られおいる。
【化】 リン脂質 匏䞭、R1、R2はアシル基、アルキル基等、X1
は糖たたはアルコヌル性氎酞基含有塩基の氎酞基
郚分の氎玠原子個を陀いた埌に残る有機基、
X2は盎鎖脂肪族倚䟡アルコヌル、糖などの氎酞
基含有化合物からその氎酞基郚分の氎玠原子個
を陀いた埌に残る有機基を衚わす。 䟡金属むオンは、ホスホリパヌれにホスフ
アチゞル基転移反応掻性を発珟させるのに䞍可欠
のものず考えられおおり䜆し、ホスフアチゞル
グリセロヌルずいう同䞀リン脂質分子間でのホス
フアチゞル基転移反応においおは䟋倖的に䟡金
属むオンの添加を必芁ずしなか぀たずいう報告−
Can.J.Biochem.、51、747、1973−がある、し
たが぀お、埓来、䞀般的な異皮分子間ホスフアチ
ゞル基転移反応によりホスフアチゞン酞誘導䜓を
補造する堎合は必ず䟡金属むオン普通はCa
むオンによ぀おホスホリパヌれの掻性化を行
な぀おいた特開昭58−63388号、同58−67183
号、同59−187792号、同62−36195号等。 ホスホリパヌれの掻性化にCaむオンを甚い
た堎合、反応系にはむオンず反応性ある物質を加
えるこずができないし、たた、氎酞基含有化合物
であ぀おもCaむオンず化合しお反応性を倱うよ
うなものはホスフアチゞル基受容䜓ずしお䜿うこ
ずができない。たずえば、転移反応の至適PHが
〜付近にある酵玠を甚いる堎合、最も䜿い易く
䞔぀安䟡なリン酞緩衝液はCaむオンず反応しお
沈殿を生じるため䜿うこずができず、より高䟡な
緩衝液を䜿甚せざるを埗ない。たた、目的物の䞀
郚にCa塩型のものができるから、Na塩型など他
の塩型のものを補造する堎合はキレヌト剀を甚い
たりしお目的ずする塩に倉換するなどの操䜜が必
芁である。 発明が解決しようずする問題点 本発明の目的は、リン脂質ずホスホリパヌれ
を甚いる埓来のホスフアチゞン酞誘導䜓の補法が
䞊述のように䟡金属むオンの䜿甚にずもなう
皮々の制玄あるものであ぀たこずに鑑み、䟡金
属むオンを甚いないホスホリパヌれの掻性化法
による補法を提䟛しお、ホスフアチゞン酞誘導䜓
の補造を埓来よりも容易にするこずにある。 問題点を解決するための手段 䞊蚘目的を達成するこずに成功した本発明の補
法は、ホスホリパヌれの掻性化に䟡金属むオ
ンを甚いず、かわりに炭玠数〜12の゚ステル
類、炭玠数〜のケトン類、炭玠数〜の炭
化氎玠、炭玠数〜のハロゲン化炭化氎玠、炭
玠数〜の脂肪族゚ヌテル類もしくは環状゚ヌ
テル類、たたはプニルメルカプタンを甚いお掻
性化を行うこずを特城ずするものである。 有機溶媒たずえばゞ゚チル゚ヌテルは、埓来の
補法においおもしばしば反応系構成成分ずしお甚
いられおいる。しかしながら、埓来の補法におい
おは、有機溶媒は氎に難溶性のリン脂質を溶かし
お酵玠およびホスフアチゞル基受容䜓の氎溶液ず
接觊させるための単なる溶媒ずしお䜿われおお
り、酵玠の掻性化には必ずCaむオン等の䟡金
属むオンが別に䜿われおいる。 䟡金属むオンを甚いず有機化合物による酵玠
掻性化を行うこの発明は、本発明者らによる次の
ような新芏な知芋に基づくものである。 (a) ある皮の有機化合物たずえば酢酞゚チル、
−ヘプタノン等は、反応系にある比率以䞊
に加えられた堎合、䟡金属むオンが存圚しな
くおもホスホリパヌれを掻性化する。 (b) ある皮の有機化合物たずえば䜎玚脂肪族䞀
玚アルコヌル、ゞメチルホルムアミド、ゞメチ
ルスルホキシド等は、ホスホリパヌれをほ
ずんど掻性化せず、むしろ倱掻させる。 (c) ホスホリパヌれを掻性化する化合物の䞭に
も、ある濃床以䞊ではホスホリパヌれを倱掻
させるものが倚いたずえば四塩化炭玠、−
ヘキサン、ベンれン、−ブタノヌル、ゞオキ
サン等。 (d) ホスホリパヌれに察しお事実䞊䞍掻性な有
機化合物、すなわちホスホリパヌれを掻性化
せず、たた倱掻もさせない化合物もある。 したが぀お、本発明においおは、ホスホリパヌ
れにホスフアチゞル基転移反応掻性を発珟させ
る䜜甚を有する有機化合物を、䞊蚘掻性化䜜甚の
ほうが酵玠倱掻䜜甚よりも匷く珟われるような条
件で甚いお、ホスホリパヌれを掻性化する。 適量䜿甚した堎合にホスホリパヌれを掻性化
するずずもにリン脂質を溶解もしくは分散させる
胜力の点でもすぐれ、したが぀お本発明の補法に
おいお䜿甚する酵玠掻性化甚有機化合物ずしお奜
たしいものの具䜓䟋を瀺すず、次のようなものが
ある。 ゚ステル類炭玠数〜10の脂肪族カルボン酞
および同じ炭玠数範囲の脂肪族アルコヌルから埗
られる炭玠数〜12の゚ステル類が特に奜たし
い。たずえば酢酞゚チル、酢酞ブチル、酢酞アミ
ル、酢酞デシル、プロピオン酞゚チル、プロピオ
ン酞プロピル、酪酞゚チル、酪酞ブチル、む゜酪
酞む゜ブチル、む゜吉草酞゚チルなどである。な
かでも酢酞゚チルは、䟡金属塩を甚いる埓来の
補法ではずうおい䞍可胜であ぀たような高率玄
90以䞊でホスフアチゞル基転移反応を生起さ
せ、ホスフアチゞン酞の幅成が少ないだけでな
く、取扱いが容易で䟡栌も䜎廉であるから、本発
明の補法で甚いるホスホリパヌれ掻性化剀ずし
お最も奜たしい。ギ酞メチルやギ酞゚チルは酵玠
倱掻䜜甚がやや匷く、䜿い難い。炭玠数11以䞊の
高玚脂肪族カルボン酞やアルコヌルから埗られる
゚ステル、あるいはヒドロキシカルボン酞類た
ずえば乳酞、フマル酞、ク゚ン酞等の゚ステル
は、ホスホリパヌれ掻性化䜜甚が匱い。 ケトン類炭玠数〜の脂肪属ケトン、たず
えば−ペンタノン、メチルむ゜ブチルケトン、
−ヘプタノン、ゞむ゜ブチルケトンが、特に奜
たしい。プロパノンやブタノンなど、炭玠数が
未満のものは、酵玠倱掻䜜甚が匷い。 ハロゲン化炭化氎玠ゞクロルメタン、トリク
ロルメタン、ゞクロル゚タン等が奜たしい。 前述のように、これら奜たしい有機化合物ずい
えども䜿甚量によ぀おは酵玠を倱掻させるこずが
あり、たた倱掻䜜甚が匷く珟れる濃床もそれぞれ
異なるから、奜適䜿甚量は化合物によ぀お異なる
が、倚くの堎合、奜適䜿甚量は氎容量郚に察し
お酵玠掻性化甚有機化合物0.05〜50容量郚の範囲
にある。個々の有機化合物に぀いおの最適䜿甚量
は、実隓により容易に確認するこずができる。 本発明の補法においお、原料のリン脂質ずしお
はグリセロリン脂質であればいかなるリン脂質も
䜿甚するこずができ、たずえば倧豆レシチン、卵
黄レシチンなど倩然のもののほか、ホスフアチゞ
ルコン、ホスフアチゞル゚タノヌルアミンなどの
合成品を甚いるこずができる。 いた䞀぀の反応原料である“ホスフアチゞル基
受容䜓”ずなり埗る化合物は、氎酞基を有する化
合物、すなわちメタノヌル、゚タノヌル、プロパ
ノヌル、−プロパノヌル、ブタノヌル、−ブ
タノヌル、む゜アミルアルコヌル、ヘキサノヌ
ル、ヘプタノヌル、オクタノヌル、デカノヌル、
グリセリン、゚チレングリコヌル等のアルコヌル
類グリコヌス、キシロヌス、アラビノヌス、フ
ルクトヌス、β−−グリコヌス、マンノヌス、
スクロヌス、ラクトヌス、セロビオヌス、メリド
オヌス等の糖類グルコサミン、ガラクトサミ
ン、アセチルガラクトサミン等のアミノ糖゜ル
ビトヌル、マンニトヌル等のアルコヌルアミグ
ダリン、サリシン等の配糖䜓プノヌル、ニト
ロプノヌル、ゞニトロプノヌル等のプノヌ
ル類その他たずえばアデノシンの䞭から任
意に遞ばれる。 なお、本発明の目的は反応方法の改良にあり、
特定のホスフアチゞン酞誘導䜓を提䟛するこずに
あるのではないから、いかなるリン脂質ずホスフ
アチゞル基受容䜓ずを組合せお反応させるかは党
く自由である本発明の方法においおのみホスフ
アチゞル基転移反応を生じ埗ないリン脂質は芋い
だされおいない。 ホスホリパヌれずしおは、キダベツ、ニンゞ
ン、ピヌナツなどの怍物䜓から抜出されたもの
ず、埮生物由来のものずがあり、本発明においお
はそのいずれを甚いおもよいが、埮生物、特に攟
線菌由来のホスホリパヌれは、熱安定性にすぐ
れるずずもに掻性が匷いので奜たしい。本発明の
補法においお、ホスホリパヌれは反応系に溶解
させお甚いるほか、固定化酵玠の圢で甚いおもよ
い。 リン脂質、ホスフアチゞル基受容䜓ずなる化合
物、ホスホリパヌれおよびその掻性化剀ずなる
有機化合物を混合しおホスフアチゞル基転移反応
を生起させる堎合、混合順は特に限定されない
が、䜓衚的な方法は次のずおりである。  リン脂質を氎䞭に分散、懞濁させ、そこにホ
スフアチゞル基受容䜓ずなる化合物、ホスホリ
パヌれ溶液および酵玠掻性化剀ずする有機化
合物を加えお攪拌、混合する。  酵玠掻性化剀ずする有機化合物にリン脂質を
溶解し、ホスフアチゞル基受容䜓ずなる化合物
およびホスホリパヌれの氎溶液ず混合する。  酵玠掻性化剀ずする有機化合物にリン脂質お
よびホスフアチゞル基受容䜓ずなる化合物を溶
解し、ホスホリパヌれの氎溶液ず混合する。 反応系には、必芁に応じお他に任意の補助的成
分、たずえばPH調敎のため緩衝剀、リン脂質たた
はその溶液を分散させるための界面掻性剀等を、
酵玠䜜甚の劚げずならない範囲で加えるこずがで
きる。䜆し䟡金属むオンは、有機化合物による
ホスホリパヌれ掻性化の劚げずなるわけではな
いが、本発明では䜿甚しない。 ホスホリパヌれを固定化酵玠の圢で甚いる堎
合は、反応系を攪拌䞍芁の安定な均䞀盞にしおお
くこずが望たしい。その堎合は、反応系構成成分
が特定の比率で配合されたずきに圢成される透明
な均䞀盞を固定化酵玠ず接觊させるずよい。䞊蚘
透明な均䞀盞は、酵玠掻性化甚の有機化合物にリ
ン脂質を比范的高濃床に溶解し、そこにホスフア
チゞル基受容䜓ずなる化合物の氎溶液を䞀定の限
床内で加えお攪拌したずきリン脂質の界面掻性が
関䞎しお圢成される。この均䞀盞は、酵玠掻性化
剀ずしおの有機化合物以倖の芪氎性溶媒を少量加
えるず圢成され易くなるこずがある。たずえば、
卵黄レシチン20重量、グリセリン重量、酢
酞゚チル60重量、−プロパノヌル重量、
æ°Ž10重量の組成の混合物は、容易に、透明な均
䞀盞を圢成する。 甚いた酵玠の至適枩床付近で充分時間反応させ
たのち、反応液からアセトンや゚タノヌルを甚い
た溶媒分別法、シリカゲルやアルミナあるいは逆
盞担䜓等を甚いたカラムクロマトグラフむヌ、薄
盞クロマトグラフむヌ等の方法により、目的ずす
るホスフアチゞン酞誘導䜓を分取するこずができ
る。 実斜䟋 以䞋、実斜䟋を瀺しお本発明を説明する。 実斜䟋  卵黄レシチンから調補されたホスフアチゞルコ
リンmgシグマ瀟に、ホスフアチゞル基受容
䜓ずしおグリセリン100Ό、PH6.0のリン酞緩衝
液400Ό、攟線菌由来のホスホリパヌれD1ナニ
ツトを加え、混合する。 䞊蚘のようにしお埗られる混合物に、〜
100Όの酢酞゚チルを加え、50℃に保぀お振ず
うしながら、ホスフアチゞル基転移反応によるホ
スフアチゞルグリセロヌルの生成量を経時的に定
量した。この結果は衚のずおりであ぀お、䟡
金属むオンを加えなくおも、酢酞゚チル添加量
30Ό以䞊の堎合にホスフアチゞルグリセロヌル
が生成した。 衚 ホスフアチゞルグリセロヌル生成速床酢酞゚チル添加 生成速床 Ό Όgunit・min   10  30 35 50 124 75 143 100 101 実斜䟋  ホスフアチゞルコリン含有量が玄90である倧
豆レシチン2.5、濃床30のホスフ
アチゞル基受容䜓氎溶液100ml、攟線菌由来のホ
スホリパヌれ溶液ml、酢酞゚チル375mlを混
合し、攪拌しながら50℃で60分間反応させる。 受容䜓を皮々倉曎しお䞊蚘補造法を実斜した結
果を衚に瀺す。なお、衚䞭の「」は、反応液
䞭の未反応リン脂質を含む党ホスフアチゞン酞誘
導䜓基準の重量である。 衚受容䜓 転移反応生成物 キシロヌス 72.2 ガラクトヌス 1.3 アミグダリン 8.6 ゜ルビトヌル 74.2 セリン 46.5 グリセリン 83.8 実斜䟋  ホスフアチゞルコリン含有量玄90の倧豆レシ
チン2.5、ホスフアチゞル基受容䜓ずしおのグ
リセリン30ml、PH5.5の緩衝液40ml、攟線菌由来
のホスホリパヌれ溶液mlおよびその掻性化剀
ずしおの有機化合物を混合し、50℃で20分間反応
させる。 䞊蚘補法においお、有機化合物の皮類および添
加量を皮々倉曎し、ホスフアチゞル基移転反応生
成物であるホスフアチゞルグリセロヌルの収率を
調べた。その結果、䞋蚘矀の化合物を甚いた堎
合は、実隓した範囲内有機化合物添加量10〜
400mlのいずれかの添加氎準においお20をこ
える収率が達成され、たた矀の化合物の堎合も
10〜20の収率が達成された。 む゜プロピル゚ヌテル、−ペンタノン、
−ペンタノン、メチルむ゜ブチルケトン、−
ヘプタノン、ゞむ゜ブチルケトン、ギ酞メチ
ル、ギ酞゚チル、酢酞゚チル、酢酞−プロピ
ル、酢酞む゜プロピル、酢酞−ブチル、酢酞
む゜ブチル、酢酞sec−ブチル、酢酞−アミ
ル、酢酞む゜アミル、酢酞−デシル、プロピ
オン酞゚チル、酪酞゚チル、む゜酪酞゚チル、
吉草酞゚チル、む゜吉草酞゚チル、プロピオン
酞−プロピル、酪酞−ブチル、ベンれン、
トル゚ン、キシレン、ゞクロル゚タン、プニ
ルメルカプタン ゚チル゚ヌテル、ブチル゚ヌテル、テトラヒ
ドロフラン、ゞオキサン、アセチルアセトン、
オクタン酞゚チル、フマル酞ゞ゚チル、マレむ
ン酞ゞ゚チル、コハク酞ゞ゚チル、酒石酞ゞ゚
チル、ク゚ン酞トリ゚チル、む゜吉草酞む゜ア
ミル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、む゜オ
クタン、シクロヘキサン、ゞクロルメタン、ト
リクロルメタン、テトラクロルメタン 実斜䟋  ホスフアチゞルコリン玄85を含む卵黄レシチ
ンmgを50Όの酢酞゚チルに溶解し、グリセロ
ヌル5Ό、100mMグリシン緩衝液PH5Ό、
およびキダベツ由来のホスホリパヌれシグマ
瀟補0.8unitの氎溶液20Όを加お、26℃で30
分間反応させた。 反応液をクロロホルム抜出しお埗られたリン脂
質画分の組成を薄局クロマトグラフむヌで調べた
ずころ、36.5の収率でホスフアチゞルグリセロ
ヌルが生成しおいた。 実斜䟋  酢酞゚チルの代わりにゞ゚チル゚ヌテルを甚い
たほかは実斜䟋ず同様にしお卵黄レシチンずグ
リセロヌルを反応させたずころ、39.2の収率で
ホスフアチゞルグリセロヌルが埗られた。 発明の効果 ホスホリパヌれのホスフアチゞル基転移反応
掻性を䟡金属むオンによらずに有機化合物で発
珟させる本発明の補法は、反応系に䟡金属むオ
ンが入り蟌たないこずによりリン酞塩緩衝液の䜿
甚も自由になり、ホスホリパヌれや反応条件の
遞択の幅が広くな぀お容易に最適条件での反応を
行わせるこずができるようになるほか、反応液か
らの目的物の分離・粟補も容易である。たた、
䟡金属むオンが転移反応を盎接劚害するために埓
来は䜿甚䞍可胜であ぀たようなリン脂質やアルコ
ヌル性氎酞基含有化合物も反応原料にするこずが
できるから、本発明により新芏なホスフアチゞン
酞誘導䜓を提䟛する途が開けたこずになる。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  ホスフアチゞル基受容䜓の存圚䞋、リン脂質
    にホスホリパヌれを䜜甚させおホスフアチゞル
    基転移反応を生起させるこずによりホスフアチゞ
    ン酞誘導䜓を補造するに圓り、ホスホリパヌれ
    にホスフアチゞル基転移反応掻性を発珟させるた
    めの䟡金属むオンを甚いず、炭玠数〜12の゚
    ステル類、炭玠数〜のケトン類、炭玠数〜
    の炭化氎玠、炭玠数〜のハロゲン化炭化氎
    玠、炭玠数〜の脂肪族゚ヌテル類もしくは環
    状゚ヌテル類、たたはプニルメルカプタンによ
    りホスホリパヌれの掻性化を行うこずを特城ず
    するホスフアチゞン酞誘導䜓の補造法。  ホスホリパヌれの掻性化を酢酞゚チルによ
    り行う特蚱請求の範囲第項蚘茉の補造法。
JP62075907A 1987-03-31 1987-03-31 ホスフアチゞン酞誘導䜓の補造法 Granted JPS63245684A (ja)

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