JPS6391089A - リン脂質誘導体の固定化酵素法による製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、たとえばリポソーム形成基材、乳化剤、医薬
などの分野で注目されているリン脂Ｉｆ１ｙｉ導体の固
定化酵素法による顕著に改善された製法に関し、とくに
、他の固定化酵素法では達成し難い高い反応効率をもっ
て目的とするリン脂質誘導体を製造できるだけではなく
、長期間にわたって連続して安定に繰返し使用すること
が１１］能て・あるため、＾′４価な酵素を工業的に有
利１１つ効率よく利用することのできる利点があり、更
に、得られるリン脂質誘導体生成物中に使用酵素が残留
するおそれも回避できるなどの諸改善を達成できるリン
脂質誘導体の固定化酵素法による製法に関する。

更１こ詳しくは、本発明は、塩類及Ｖ／又は有は溶媒の
存在下もしくは不存在下に、リン脂質とアルコール性Ｏ
Ｉ“■基含有化合物（本発明におい一〇は、糖類を包含
する呼称である）とを水の存在ドでホスホリパーゼＤ類
と接触させることにより反応せしめて、対応するリン脂
質誘導体をＭ造するに際し、該反応を包括固定化したホ
スホリパーゼＤもしくは包括固定化したホスホリパーゼ
ＤＭと接触させることにより行なうことを特徴とするリ
ン脂質誘導体の固定化酵素法による製法に関橿−る。

従来、塩類及び／又は有ａｆｆ＃媒の存在ドもしくは不
存在ｒに、リン脂質とアルコール性０　［１基含有化合
物とを水の存在下でホスホリパーゼＤ類と接触させるこ
とにより反応せしめて、対応するリン脂質誘導体を製造
する方法に関しては、同−出願人の出願に係わるたとえ
ば特開昭５９−１８７７８６号（特願昭５８−６３３０
５号）、特開昭５４）−１８７７９２号（特願昭５８−
６３３０（３号）、特開昭５９１８７７８７号（特願昭
５８−６３３０７号）、特開昭６０−４１４９４号（特
願昭５８−６３３　（１４号）、特開Ｕ（イ６ｌ−８８
８８（３号（特願昭５９−２０９９３１号）、特開昭６
１−８８８８°ン号（特願昭５９−２０９９３２号）、
特ＩＩＮ昭６１−８８８８８号（特願昭５９−２０９９
３３号）、特開昭６１−８８８９０号（特願昭５９−２
０９９２９号）及び特開昭６１〜８８８９１号（特願昭
５９−２０９９３０号）を包含して、英国特許Ｎｏ、１
．５８１．８１０、同一出願人の出願に係わる特ＩＪＩ
（昭５１．１−６３３８８号及び特ｒｕｔ昭５８−６７
１８３号、その他の種々の提案及び報告が知られている
。

例えば、植物組織より分離採取されたホスホリパーゼＤ
１とくに、キャベツのホスホリパーゼＤ水溶液を用いて
、リンｒｒｆＩ質であるレシチンとアルコール性ＯＨ基
含有化合物であるグリセロール、エタノールアミンとを
、該キャベツのホスホリパーゼＤと接触させることによ
り反応せしめて、対応するリン脂質誘導体であるホス７
アチノルグリセａ−ルやホス７アチノルエタノールアミ
ンを誘導した報告が知られているｒＲｏＭ、Ｃ，Ｄ　Ａ
　Ｗ　Ｓ　ＯＮ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　　１０
２．２０５（１９（３７年）１゜ 更に、上記に例示した同一出願人の出願に係わる特許出
願公開公報には、各種のリン脂質と各種のアルコール性
０１１基含有化合物（糖類を包含する）とを、水の存在
下で、ホスホリパーゼＤもしくはホスホリパーゼＤＭ生
産性微生物が生産したホスホリパーゼＤもしくはホスホ
リパーゼＤＭと接触させることにより反応せしめて、対
応するリン脂′１１ｉ導体を製造する方法に関して開示
されている。

近年、リン脂ｆｆ１２１１導体の界面化学的特性や、生
理的、薬理的特性などから、たとえばリポソーム形成基
材、乳化剤、医薬などの分野で注Ｌ１され、酵素法によ
る各種リン＃質誘導体の開発が検討されているが、この
ような酵素法においては、酵素の再利用を町１１Ｂにし
且っ失活を少なくして酵素の利用効率を高める方法の開
発が望まれる。

同一出願人の出願に係わる・前記特許出願公開公報の提
案には、反応に際して利用゛するホスホリパーゼＤＭは
、適当な固定化担体たとえばポリプロピレン膜、セライ
ト本々、ガラスピーズなどの如き各種の重合体Ｏ（脂類
や無代材料の粒状物やフィルム状物に担持固定して利用
することもできると、固体組木表面に酵素を担持さ姑た
非包括固定化タイプの固定化酵素の形での使用が１り能
て゛ある１勺記載されているが、その具体例は示されて
いないし、丈に、包括固定化タイプでの使用に関しては
、全熱、言及されていない。

丈に、このような非包括固定化タイプの固定化酵素の形
での使用例として、キャベツの・れスホリパーゼＤをオ
クチルセフ７０−スＣＬ−４１３を担体として該担体に
固定化した固定化酵素を用いて、リン脂質であるレシチ
ンとアルコール性ＯＨ試合（ｆ化合物に属するグリセロ
ールとを転位反応させて、対応するリン脂質であるホス
７アチノルグリセロールを合成した報告が知られている
［Ｅ１本醗酵工字会講演要曾集、１５８頁（１９８５年
）１゜しかしながら、オクチルセファロースＣ１，、−
４Ｂを担体とした非包括固定化タイプの固定化酵素を用
いる」−記報前のノｊ法は、使用する担体が高価につく
難点の他に、この方法では、転位反応させるアルコール
性０１１基含有化合物をオクチルセファロースＣＬ−４
１３中に閉込めて反応を行なう方法であるため、成るア
ルコール性ＯＨ基含有化合物との反応を行なったのち、
他のアルコール性０１１ｊ＆含有化合物との反応に反応
を切替えて行なうことは困難であるイ；利益があり、更
に、固定化酵素のａ、ｉｋＬ使用可能な回数も僅かに数
回程度と極めて今一＜ない難点がある等、工業的実施に
不向きである。又更に、この報告の方法では＾デ索の固
定化が疎水結合による固定化であるため、基質となるリ
ン脂質との接触に際して酵素がはずれ易いといった不都
合な現象も見られる。

斯くて、従来法では、＾い反応効率をもって目的とする
リン脂質誘導体を製造することは困難で、固定化したホ
スホリパーゼｌ：ｌＩｔ期間にわたって連続して安定に
繰返し使用することができないため、高価なホスホリパ
ーゼＤを工業的に有利に且つ効率よく利用で外ない不利
益があり、更に、得られるリン脂質誘導体生成物中に使
用酵素が残留するおそれも回避し難いなどの諸本利益乃
至欠陥がある。

本発明者等は、ホスホリパーゼ＃）類を利用した固定化
酵素法によって、リン脂質とアルコール性０１１基含有
化合物から対応するリン脂質誘導体を製造する際の上述
の如き不利益乃至欠陥を克へできる改善製法を開発すべ
く研究を進めてきた。

その結果、ホスホリパーゼＤもしくはホスホリパーゼＤ
　Ｍを、それ自体公知の包括固定化手法を利用して、担
体内からの酵素の漏れのない状態に包括固定化すること
が可能であり、且つ形成された包括固定化したホスホリ
パーゼＤもしくはホスホリパーゼＤＭは、その酵素活性
の発現が良好で、しかも長期間繰返し使用が１１°能で
あることを発見した。

更に又、形成された包括固定化したホスホリパーゼＤも
しくはホスホリパーゼＤＭはリンＩＩｎ質とアルコール
性Ｏ１ｌ基合右化合物との転移反応に対して極めて効率
良く反応を進行させる能力を示し、斯くて、該反応を包
括固定化したホスホリパーゼＤもしくは包括固定化しホ
スホリパーゼＤＭを用いて行なうことによって、非包括
固定化タイプの固定化酵素を用いる前述した従来法によ
っては達成し難い高い反応効率をもっζ［１的と優るリ
ン脂質誘導体を製造できるだけではなく、Ｉ（期間にわ
たって連続的に安定にａＭして訊包括固定化したホスホ
リパーゼＤ類を使用できるため、歯価な酵素を生業的に
有利に且つ効率よく利用できる利、α、得られるリン＋
ｎｔ　′ｅｔｐ導体生成物中に使用酵素が残留するおそ
れが間近でさる利点、史には、成るアルコール性０１１
基含有化合物との反応を行ったのち、他のアルコール性
０１１基含有化合物との反応に反応を切替えて行なうこ
とも容易に几つ何等のトラブルも伴うことなしに実施で
きる等の諸利益も得られることを発見した。

酵素の固定化方法としては、例えば、活性炭、各４ｇＩ
粘土鉱物、ゼオライト、吸着性樹脂類などの如き固体担
体の表面に酵素を吸着固定化する方法、各種のイオン交
換体にＭ索をイオン結合させて固定化するイオン結合固
定化法、たとえばノアゾ化、カルボッイミド化、トリ７
シエル化、ゲルタールアルデヒド化などの如き化学反応
結合により担体に結合させて固定化ｒる固定化法、史に
は、本発明ぐ利用４−る包括固定化法など種々の酵素固
定化方法が知られているが、本発明者らの研究によれば
、包括固定化法以外の方法による固定化ホスホリパーゼ
ＤＭ″Ｃは酵素の固定化は出来ても活性発現が見られな
いか又は反応効率のあまり良くない程度の活性発現しか
見られず、又、活性発現の良い場合でもＭ’Ａの担体よ
りの溶出が見られ、本発明方法におけるリン脂質誘導体
の製造を［］的とする固定化Ｍ索としては適さないにも
拘わらず、本発明方法で用いる包括固定化したホスホリ
パーゼＤもしくはＤＭでは、担体からの酵素の漏れのな
い状態の包括固定化手法が容易に得られることがわかっ
た。

従って、本発明の目的は、リンｊ財質とアルコール性Ｏ
１ｌ試合有化合物かＣ）対応するリンｆＴＭ質ｆＪ導体
を固定化酵素法により製造する顕若に改善された製法を
提供するにある。

本発明の上記目的及び更に多くの他の［］的ならびに利
点は、以［の記載から−Ｒ４明らかとなるて゛あろう。

本発明によれば、塩類及（／／又は４１機溶媒の存在１
°もしくは不存在ｒに、リン脂質とアルコール性Ｏ１ｌ
試合有化合物とを水の存在下でホスホリパーゼＤ類と接
触させることにより反応させζ、対応するリン脂質誘導
体を製造するに際して、該反応を包括固定化法したホス
ホリパーゼＤもしくは包括固定化したホスホリパーゼＤ
Ｍと接触させることにより行なう。

すでに、同一出願人の出願に係わる特許出願公開公報を
包含Ｖる公知提案及び報告の先行技術をあげて説明した
ように、塩類及び／又は有へ溶媒の存在ドもしくはイ’
（ｆ在ドに、天然リン脂質及１合成リン脂質を含めて広
い範囲の各種のリン脂質と糖類及びその誘導体類を包含
して広い範囲の各種のアルコール性ＯＨＸ？￥有化合物
を、水の存在下で、例えばキャベツの如き植物ｍｍがら
分離採取したホスホリパーゼＤ或は例えば−上記特許出
願公開公報などに公知の全生物の生産したホスホリパー
ゼＤもしくはＤＭの如きホスホリパーゼＤ１と接触させ
ることにより反応せしめて、対応するリン用↑貿誘導体
を製造する、二とＩま知られており、これＣ）先行技部
ｆに公知の各種のリン脂質反り各種のアルコール性ＯＨ
基含有化合物は、本発明方法の実施に利用できる。

このようなリン脂質の例としては、たとえば卵黄リンチ
ン、大−ルシチン、オキアミレシチン、などの動植物組
織から得られる混合リンｍｔ質を初め、これ等から公知
の手段で抽出分離、又は合成されるリン脂質であっもよ
く例えばノアシル型のリン脂質としてはレシチン、ケフ
ァリン、ホス７アチジールグリセール、ホス７アチノン
酸アルキルエステル等のリンＩＪｆｆ質が又、グリセロ
リン脂質のアシル結合の一つがアルキルエーテル結合、
やアルケニルエーテル結合であるモノエーテル型リン脂
質としては例えば１−ｏ−アルキル−２−７セヂルーｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン、プラスマローデ
ン等が、又ジエーテルをリン脂質としては例えばＩ４−
α−レシチン、β、γ−ノへキサデシルが、又シクロア
ルキルエーテル型リン脂質として例えばＩ、−α−レシ
チン、β、γ−ヘキサデシリノンなどのα型やβ型りン
脂質を例示出来、又モノエーテル％ｌ　０１９２１ｍ質
としては例えばＬ−ａ−リゾレシチン−７−ヘキサデシ
ルが、又モノアシル型すゾリン＋ｍ質としては例えばリ
ゾレシチン、リゾケファリンなどを例示出来る。更に又
、スフィンゴリンｎＷ’ｌ’Ｊとしては、例えばスフィ
ンゴミエリン、又有機リン酸エステルとし′ζは例えば
ヘキサヂシルホスホリルフリン、オクグデシルホスホリ
ルコリンなどの如きリン脂質を例示することができる。

このようなリン脂質及びそれらの採取もしくは合成力法
それ自体は知られており、更に、それらの多くは市場で
も人手でき、本発明で利用できる。

更に、転位反応の受容体である１〕記アルコール性ＯＨ
基含有化合物の例としては、前記先行技術に開示された
ようなリン脂ｖ１誘導体形成性のアルコール性０１（基
金イ」化介物が任意に利用できるが、それらの中の数例
をあげると、例えばエタノール、ヘキサノール、ゲラニ
オール、ヘキサデカ／−ルのごとき一級アルコール類；
グリセロール、ンルビトール、ポリグリセリン、プロピ
レングリコール、ポリエチレングリコールのごときポリ
アルコ−／し類；Ｌ−セリン、Ｄ−セリン、エタノール
アミンのごとき置換基を持ったアルコール類；チアミン
、ピリドキシン、ウリノン、アデノシン、シチジンのご
とき複索環アルコール グルコース、ガラクトース、７ン７ース、７ラクトース
、リボース、グルコサミン、〃ラクトサミンのごとき糖
類；イソプロパツール、２−ペン９／−ルのごとき２級
アルコール類；シクロヘキサノール、シクロペンタ／−
ルのごときＩｆｆｌ環式アルコール類；等を例示孝°る
事がでさる３ 又更に、反応に際して必要に応じて利用する有機溶媒、
たとえば、反応）Ｒ分を溶解分散するのに利用する有機
溶媒の例としては、以下の如き溶媒を例示することがで
さる。

例えばｎ−ヘプタン、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、石
油エーテル、イソオクタンなどのごとき脂肪族ＩＡ　化
水１ｋ　ニジクロペンタン、シクロヘキサン、シクロブ
タンなどのごとき脂環式炭化水素；ベンゼン、トルエン
、キシレン、などのごとき７／香族炭化水索類；アセト
ニトリル、２−二）Ｕプロパン、ツメチルホルムアミド
などのごとき合窒索溶ＩｌｌＬＬ’ｌ　；ジメチルエー
テル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジ
オキサン、テ）ラヒドロ７うン、などのごときエーテル
類；四塩化炭素、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロ
ロエタンなどのごときハロゲン化炭化水素類、ジノチル
スルホキシドのごときスルホキシド溶媒類；第３級ブチ
ルアルコール、第３級７ミルアルコール、ジアセトンア
ルコールのごとき第３級アルコール類；ジエチルケトン
、ノイソプチルケトン、メチルエチルケトン ときケトン類；酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロ
ピルのごときエステル類を例示する事が出来る。反応に
用いて特に好ましい溶媒は芳香族炭化水素、エーテル類
、ケトンｖＡ，’　／Ｎロデン化炭化水素類、第３級ア
ルコール類、エステル類である。

又更に、リン脂Ｙ１誘導体を塩として回収したり反応効
率を高める上から反応系に塩を加える場合に用いる塩類
としては、例えば塩酸、硝酸、硫酸、燐酸等の無機酸と
の、シュウ酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、等の有機酸
との、グルタミン、アルギニン、等のアミノ酸との、ア
ンモニューム塩や、Ｎａ”、Ｋ十、等のアルカリ金属と
の塩、Ｍｇ２＋、Ｃ　ａ”、Ｂａ２＋、等のアルカリ土
類金属との塩、その他Ｆｅ’十〜】十、　Ｍｎ”、　Ａ
Ｉ２十〜コ＋、　７　ｎ２＋、Ｃ　ｕ”、等との塩など
を例示することが出来る。

更に、本発明において利用するホスホリパーゼＤもしく
はホスホリパーゼＤＭそれ自体は知られており、本発明
で利用できる．このようなホスホリパーゼＤもしくはホ
スホリパーゼＤＭとしては、ホスホリパーゼＤもしくは
ホスホリパーゼＤ　Ｍ　生産性微生物が生産した酵素及
び植物組織より分離摂取されたＭ．素のいづれも利用で
さる。曲者の微生物の由来のホスホリパーゼＤもしくは
ホスホリパーゼＤＭの具体例としては、特開昭５８　　
６３１）８８号に公知の７カルデイオプシス（Ｎｏｃａ
ｒｄｉ。

ｐｕｓｉｓ）属に属するホスホリパーゼＤＭ生産性微生
物たとえばノカルディオプシスＪＩ＄ＮＯ７７９株［Ｆ
Ｆ：ＲＭ−ＢＰ−５　１　２］が生産するホスホリパー
ゼ１１Ｍ，特開昭５８−６７１８３号に公知のアクチノ
マヂューラ（Ａｃｔｉｎｏ鶴ａｄｕｒａ）属に属するホ
スホリパーゼＤＭ生産性微生物たとえばアクチノマヂュ
ーラ属ＮＯ３６２株［Ｆ　Ｅ　ＲＭ−Ｂ　Ｐ−５　１　
１　Ｊが生産するホスホリパーゼＤＭ，特開昭６０−１
　６４４８３号に公知のフルカディア（Ｎ　ｏｃａｒｄ
ｉａ）属に属するホスホリパーゼＤ生産性微生物たとえ
ばメカルディア属ＮＯ１９２５株［ＦＥＲＭ　　Ｐ−７
３８１１が生産するホスホリパーゼＤ，更には、特開昭
５８−１５２４８１号に公知のストレプトマイセス（Ｓ
　ｔｒｅｐＬｏｌＩＩｙｃｅｓ）属に属するホスホリパ
ーゼ［）生産性微生物たとえばストレプトミセスＡＡ５
８６ｉが生産するホスホリパーゼＤ及び特公昭５Ｂ−５
２６３３号に公知のミクロモノスポラ（Ｍ　ｉｃｒｏｍ
ｏｎｏｓｐｏｒａ）属に属するホスホリパーゼＤ生産性
微生物たとえばミクロモノスポラ・チャルセアＫＹ１９
３６が生産するホスホリパーゼＤ等を例示することがで
きる。又、後者の植物組織由来のホスホリパーゼＤとし
ては、キャベツ、ニンノン等の植物組織より得られる公
知ホスホリパーゼｌ〕を例示することができる。本発明
においては、包括固定化しｊこ形態において、リンＩＮ
　’Ｅｌとアルコール性ＯＨ基含有化合物との転移反応
を触媒するからぎり、その起源に制約をうけることなし
に、これらホスホリパーゼＤもしくはホスホリパーゼ１
）　Ｍを適宜に選択利用することができる。

本発明方法に上れば、同一出願人の出願に係わる特許出
願公開公ｆＭを包含する公知提案及び報告の先行技術を
あげて説明したように、前記例示の如き塩類及Ｖ／又は
有機溶媒の存在下もしくは不存在下に、すでに例示した
ような各種のリン脂質と各種のアルコール性ＯＨ基含有
化合物とを、水の存在下で、前記例示の如きホスホリパ
ーゼＤＯと接触させることにより反応せしめて、対応す
るリン脂質誘導体を製造するに際して、該反応を包括固
定化したホスホリパーゼＤもしくは包括固定化したホス
ホリパーゼＤ　Ｍと接触させることにより行なう他は、
上記先行技術などに公知の手法を利用して反応を打なう
ことができる。

本発明方法で用いる包括固定化法による固定化酵素は酵
素の分子祉を４′え担体型今度を適正に選択して固定化
することができ、担体からの酵素の漏れのない固定化酵
素を得る事が出来る。この様にして得られる包括固定化
酵素ホスホリパーゼＤもしくはＤ　Ｍは活性発現が良く
、しかも長期間繰返し使用することが出来る。さらに又
、転移反応を極めて効率良く進行させる事が出来る。

包括固体化酵素の形成手法それ自体は知られており、本
発明で利用できる。この様な包括固定化法としてはゼラ
チン、カラギーナン、アルギン酸、寒天などを用いるポ
リマー法、アクリルアミドを用いたモア７−法や放射線
重合法、史には光硬化性Ｏ（脂等を用いるプレポリマー
法などがあるが、本発明においては、プレポリマー法の
利用が好ましく、中でも光硬化性樹脂を用いたプレポリ
マー法が特に好ましい。このような光硬化性＃（＋ｍ　
Ｍは市場でも入手でき、本発明における包括固定したホ
スホリパーゼＤもしくはＤＭの形成に利用できる。市場
で人手できる光硬化性０（脂の例としては、関西ペイン
ト社より市販されているＥＮＴＩＯｏｏ、２０００．３
４００、ＥＮＴＧ　　２０００．３８００、Ｉｇ　Ｎ　
ＴＰ　　１０００．２０００．３０００．４０００、Ｐ
ＥＧＭ　　１０００．２０００．４０００、等が例示で
き、いずれも利用できる。

本発明方法においては、包括固定化したホスホリパーゼ
ＤもしくはＤＭを使用するほかは、たとえばｉｉｉ述し
た先行技術に公知の反応態様に従って、リン脂質とアル
コール性０１ｉ基含有化介物よりリン脂質誘導体を生起
させる態様を適宜に選択して利用出来る。たとえば、リ
ンＩＩＷＩｆＩと任ゑ、のアルコール性ＯＨ基含有化介
物とに水を加え、更に必要に応じて塩や有機溶媒を選択
して加え、包括固定したホスホリパーゼＤもしくはＤＭ
と攪拌若しくは振どう条件下にこれらを接触させる回分
式反応であってもよいし、又、反応系が均一相を保ち得
る場合には、包括固定化酵素を充填塔反応器に入れ、こ
の中を反応液を循環させる４目こより行なってもよい。

回分式反応により行なった場合には反応後、たとえばか
過、遠心分離により反応系より包括固定化酵素を分離し
再利用する事が出来る。

本発明の反応方法に於いてリン脂質とアルコール性ＯＨ
基含有化介物のモル比や濃度、固定化酵素の使用量、塩
や有機溶媒の使用量などは適宜選択して最も良く反応を
促進し高い転移率が得られかつ反応毘作のし易し方法を
採用すればよい。基質モル比としては例えばリン脂質１
モルに月してアルコール性０１１基含有化合物約１〜約
１００モルの反応モル比を例示する事ｆ、を出来る。又
基質濃度として例えば約０．１〜５０％−１／ｖｏｌ程
度を用いれば良い。固定化酵素の使用量としては、例え
ばリン脂質１ｇ当り約１０〜約１０００単位程度の使用
量を例示する事ができ、又、固定化酵素の比活性として
は例えば１ｇ当り約１〜１０００単位程度を例ボできる
。反応系に塩を用いる場合の使用量としてはリン脂質１
ｇ当り約１〜５０モル程度の使用量を例示することが出
来る。又、反応に有機溶媒を用いる場合の水性溶媒に対
する有機溶媒添加量としては、水性溶媒：有Ｐｔ溶媒（
ｖ／ｖ）の比で約５０：１〜１：１０のごとき混合比を
例示する１工が出来る。反応は室温で進行するので、特
に冷却や加温の心安はないが、望ましい反応温度として
は例えば約２０゛Ｃ〜６０℃の反応温度を例示出来る。

反応時間もＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）などの手
法を利用し適宜に選択出来るが、例えば約１時間〜９６
時開を例示する事が出来る。

ヒ述のようにして反応を行なった後、形成されたリン脂
質誘導体はそのまま又は塩の形で沈澱させて分離し利用
することが出来る。更に溶媒分画、ケイ酸カラムクロマ
ト、アルミナ力ラケクロマト、ｄ′ｈ速液体クロマト、
自流分配、デル濾過、吸着クロマト等の方法を利用して
史に精製分ａする）１１も出来る。

本発明の反応力法によれば包括固定したホスホリパーゼ
ＤもしくはＤＭを用いることにより他の固定化＃索の利
用は達せられない高い反応効率を以てリン脂質誘導体が
得られるだけでなく長期間連続して繰返し安定に使用出
来る為、高価な酵素を経済的に有効に利用することがで
きる。又、本発明にもとすく反応力法によれば生成物中
に酵素が残存する恐れはほとんど無くこの点においてら
イ」川な反応方法である。本発明で得られるリン脂質誘
導体はリポソーム形成基材として、又、界面特性を生か
した各種乳化剤、各種薬剤としてその効果が期待出来る
。

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれにより何
重制限されるものではない。

なおホスホリパーゼＤＭの活性測定法としては、下記の
方法を用いた。５％卵黄レシチンエマルジョン（０，５
ｇ卵汝レシチン　１０ａ＋ｊ！蒸留水のｍ音波乳化Ｑ）
（１、１ｍｌ、　０　、　Ｉ　Ｍ　　Ｃ’ａＣＩ、２０
．０５１ｍ１．．７．５％ｉ’ｒｉｔｏｎＸ　　１００
溶ＩＯ，１５ｍ１゜ｐＨ５，５０，ＩＭ）リス−マレイ
ン酸緩衝液００１ｍ１を混合し、これに酵素液０　、１
　論１を加え、３７℃で１０分反応後、５０ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ−２Ｎａヲｆｔｒ　Ｉ　Ｍ　）　＋７　ＸＪｉ！
酸１ｉ液（ｐＨ８，０）０．２ａ＋１を加え、直ちに５
分間煮沸して反応を完全に停止した。次にコリンエステ
ラーゼ測定用試験［日本画Ｊ−■製造１のキットに含ま
れるコリン呈色剤を呈色溶解液に溶解した溶４飴１を加
え、；３７°Ｃで２（）分反応後、５０　（ｌ　ｎｎの
吸光度を測定した。

対照としては、あらかじめ熱失活した酵素液を用いて同
様に反応せなものの吸光度を測定した。

そして１分間に１μモルのコリンを’ｉｆｆ、離する酵
素活性を１単位（Ｕ）とした。

［実施例１１ アクチノマデユラ属Ｎｏ、３６２株の生産するホスホリ
パーゼｌ）　Ｍをすでに本発明者らによって特１ス１昭
５８−６７１８３　　実施例３（Ｐ、４５２）に示した
と同様な方法で培養及び精製を行い、１５１の培莢液（
ＩＯＵ／噛１）から１００論１の’ｌ＋１製ホスホリパ
ーゼＤ　Ｍ（５６０Ｕ　／　ｓｌ）溶液を得た。

ホスホリパーゼＤＭの固定化は下記の方法を用いた。

Ｍ賛ホスホリパーゼＤＭ溶液１糟＋（５６０Ｌｌ）、光
硬化樹脂（ＥＮＴ２０００、Ｅ　Ｎ　Ｔ　３４００、Ｅ
　Ｎ　ｉ’　Ｇ　２０００　、　Ｅ　Ｎ　Ｔ　Ｇ　３８
００又はＥ　Ｎ　’「Ｐ４Ｏ１０）１０ｇ、ベンゾイン
エチルエステル（重合１３１４始剤）０．２ｇをビーカ
ーに入れ良く攪拌した後、プラスチック製の透明な板の
」二に広げ、３６５ｍ＋＊の光を５分間両面照射し、シ
ート状の尤碩化樹脂包括固定化ホスホリパーゼＤＭを得
た。このシート状の光硬化樹脂包括固定化ホスホリパー
ゼＤＭを３　Ｘ　３　ａｒｍの大きさに切ってリン脂質
透導体の製造に使用した。

上記した光硬化樹脂包括固定化ホスホリパーゼ１）　Ｍ
を用いて下記の方法によりホス７アナノルグルコースを
調製した。

尤硬化曽（脂Ｅ　Ｎ　’ｒ　２０００、ＥＮＴ３４００
゜１ＥＮＴＧ２０００、ＥＮＴＧ３８００、又はＥＮ’
Ｉ’　Ｄ　４０００によって包括固定化したホスホリパ
ーゼＤＭｕ、５ｇ（５０Ｕ）、グルツース５ｇ１水５輸
１、ＮａＣｌ　　００２ｇ、１０％卵黄レシチン第３級
ブチルアルコール溶液５曽１を三角フラスコに取り、３
０℃にて２ｇ間攪拌反応を行い、ホス７７チジルグルコ
ースを調製し、ホス７アチンルグルコース生成檄を測定
した。

反応後、光硬化包括固定化ホスホリパーゼＤＭを水で洗
浄後、これを上記したと同−Ａｌｌ　ｒ＆の新たな反応
系に加え、以後」】記したと同様の程作を５０回繰返し
た時のホス７アチノルグルフースの生成量を第１ｋに示
した。

なお、リン脂質透導体の１＆号組成比はイアロトスキャ
ンにより求めた。即ち、クロマロッドＳ　ＩＩ（ヤトロ
ン社製シリカゲルロッド）にリン脂質の２％クロロホル
ム溶液１μｍをスポットし、クロロホルム−メタノール
−アンモニア−水（５０：２０：２：１ｖ／ｖ）を展開
溶媒として約１０ｃ１１１展開し、イアロトスキャン（
ヤトロン社製イアロトスキャン１゛Ｈ−１０）にがけ、
ピーク而積比がら成分の重量比を求めた。

第１表の結果からどの光硬化樹脂を用いて包括固定化し
たホスホリパーゼＤＭでも、ホス７アチノルグルコース
を生産するために、繰返し使用出来ることがわかる。

［実施例２Ｊ 実施例１と同様な方法によりｉ１！ｌ製したＥ　Ｎ　’
ｒ　ａ２０００包括固定化ホスホリパ一ゼＤＭ（１，５
ｇ（５０【」）、グリセロールＩＲｘ水５論１、ＮａＣ
ｌ　　Ｏ。

２げ、１０％卵黄レシしンノエチルエーテル溶液５−１
を三角フラスコに取り、３（）℃にて２　ＥＩ　Ｉｆｌ
ｌ攪袢反応を行いホス７アナノルグリセロールを１１！
ｌ製し、その生成量を調べた。次に実施例１と同様に同
一固定化ホスホリパーゼＤＭを用いて繰返し使用を行っ
た時のホス７アナノルグリセロールの生成量を第２表に
示した。

また、実施例１と同様な方法により培養、精製したアク
チノマデユラ属のホスホリパーゼ］）Ｍを、日本発重工
学会講演！＊Ｖ？（１’、　　１５　Ｂ、１９８５）に
示された方法によりオクチルセファロースＣＬ−４８に
固定化し、ノエチルエーテルを反応溶媒としてホス７ア
チンルグリセロールの生産を繰返し行いその生成量を第
２表に示した。

第２表の結果からＥＮＴＧ２０００包括固定化ホスホリ
パーゼＤＭはホス７アチシルグリセロール生産のために
繰返し使用出来るが、オクチルセファロースＣＬ−４Ｂ
固定化ホスホリパーゼＤ　Ｍは３回程度の繰返し使用し
か出来なかった。

１実施例３１ 実施例１と同様な方法により調製したＥ　Ｎ　Ｔ　Ｇ２
０００包括固定化ホスホリパ一ゼＤＭ０．５ｇ（ＳＯＵ
＞、グリセｔ７−ル１ｇ、水５ｍｇ、ＮａＣｌ０，２ｇ
、１０％卵黄レシしンｔｊＳ３級ブチルアルコール溶液
５ｍｌを三角フラスコに取り、３０°Ｃにて２０間攪拌
反応を行いホス７アチジルグリセロールを′ｌ１４”Ｊ
Ｉ　Ｌその生成量を調べた。次に実施例１と同様に同一
固定化酵素についてｆｉ返し使用を行った時のホス７ア
チジルグリセロールの生成量をｔｊＳ３表に示した。

また第３ｓ＆ブチルアルコールの代りにベンゼン、ジク
ロロメタン又は酢酸エチルを用いるがもしくは溶媒を用
いないで上記と同様に行いホス７アチジルグリセロール
を調製し、その生成量を第３表に示した。

ｔｔＳ３表の結果からＥＮ′ｒＧ２０００包括固定化ホ
スホリパーゼＤＭは第３級ブチルアルコール、ベンゼン
、ジクロロメタン、酢酸エチル中でホス７アチジルグリ
セロールを生産するために繰返し使用出来ることがわか
る。また、溶媒を添加しない場合でも、ホス７アチノル
グリセロールの生成量は低いが、繰返し使用出来ること
がわかる。なお反応溶媒として第３級ブチルアルコール
を用いた場合は、グリセロール、水、ＮａＣｌが完全に
第３級ブチルアルコールに溶解するので、Ｅ　Ｎ　”ｒ
Ｇ２０００包括固定化ホスホリパーゼＤＭをカラム（２
Ｘ　１０ｃｍ）につめ上記したと同様の組成の溶液１０
０Ｌ！ｇを流速１０ｍＪ／ｈｒでカラム中を４８時間循
環させ、ホス７アチジルグリセロールの生成量を調べた
ところ、９０％だった。このようにカラムに充填し反応
することも可能なことがわかる［実施例４１ 実施例１と同様な方法により調製したＥＮＴＧ２０００
包括固定化ホスホリパーゼＤＭ０．５８（５００）、グ
リセロールＩＲｓ水５ｍＡ、ＫＣｌ０．２ｇ、１０％卵
黄レシしンノエチルエーテル溶！５ｍＡを三角フラスコ
に取り、３０　’Ｃにて２０問攪拌反応を行いホス７ア
チジルグリセロールをｙ４製し、その生ｔ＆　ｔを調べ
た。次に実施例１と同様に同一固定化ホスホリパーゼＤ
Ｍを用いて繰返し使用を行った時のホス７アチジルグリ
セロールの生成量を第４表に示した。

またＫＣＩ　Ｏ，２ｇの代りにＣａＣＬ　０．２ｓ、Ｎ
ＨｌＣｌ　Ｏ，２ｇを用いるが又は塩を添加しないで一
上記と同様に行いホス７アナノルグリセロールを調製し
その生成量を第４表に示した。

第４表の結果がらＥＮＴＧ２０００包括固定化ホスホリ
パーゼＤＭは、ＫＣＩ、ＣａＣＬ、ＮＨ。

Ｃ１のどの塩を用いてもホス７７チジルグリセロールを
生産するために繰返し使用出来ることがわかる。また塩
を添加しない場合でも、ホス７アチノルグリセロール生
成量は低いが、繰返し使用出来ることがわかる。

［実施例５１ 実施例１と同様な方法により調製したＥ　Ｎ　Ｔ　Ｇ２
０００包括固定化ホスホリパ一ゼＤＭ０．５ｇ（５０Ｕ
）、エタノールアミンＨＣＩ　Ｏ，１５ｇ、水５ｍｌ　
、ＮａＣｌ　Ｏ，２ｇ、１０％卵黄レシチンジエチルエ
ーテル溶液５−２を三角フラスコに取り、３０℃にて２
日問攪拌反応を行いホス７アチノルエタ／−ルアミンを
調製し、その生成量を調べた。

次に実施例１と同様に同一固定化酵素について繰返し使
用を行った時のホス７アチジルエタノールアミンの生成
量をＰｔ５５表に示した。

また、エタノールアミンＩＣＩ　　Ｏ，１５ｇの代り１
こＬ−セリンＩＦｉ、デラニオール１ｇ又はチアミン・
ＨＣＩ　　Ｉｇを用いて上記と同様に行い、ホス７アチ
ジルーＬ−セリン、ホス７７チノルデラニオール又はホ
ス７アチジルチアミンを調製しその生成量を第５表に示
した。

ｔＩＳ５表の結果からＥＮＴＧ２０００包括固定化ホス
ホリパーゼＤＭはホス７７チノルエタ／−ル７ミン、ホ
ス７アチノルーＬ−セリン、ホス７７チノルデラニオー
ルやホス７７チノルチアミン１こついても生産するため
に繰返し使用小米ることがわかる。

［実施例６１ 実施例１と同様な方法により調製したＥ　Ｎ　Ｔ　Ｃｖ
２０００包括固定化本スホリパーゼＤＭ０．２ｇ（２０
Ｕ）、グルコース０．５ｇ、水０．５ｍｇ　、　ＮａＣ
ｌ　　０．０２ｇ、　Ｌ−０？シチン、β、７−ジヘキ
サデンル（カルビオケムーベーリング社製エーテル型リ
ン脂質）の１０％ｆｊＳ３級ブチルアルコール溶液０．
５＋ｅｌを共栓付き試験管に取り、３０℃にて２口振ト
ウ反応を行い、Ｌ−ａ−ホス７アナノルグルコース、β
、γ−ノへキサデシルを調製し、その生成量を調べた０
次に実施例１と同様に同一固定化酵素について繰返し使
用を行った時のし−ａ−ホス７７チノルグルコース、β
、γ−ジヘキサデシルの生成量を第６表に示した。

第６２！２　繰返し使用によるし一α−ホス７７チノル
グルフース、β、γ−ノヘキサデシルの生成量 第６表の結果からＥＮＴＧ２０００包括固定化ホスホリ
パーゼＤＭは、Ｌ−α−ホス７アチノルグルコース、β
−１γ−ノヘキサデシル生産のために繰返し使用小米る
ことがわかる。

「実施例７Ｊ ノカルディオプシス属Ｎｏ、７７９株の生産するホスホ
リパーゼＤＭをすでに本発明者らによって特開昭５８−
６３３８８実施例３（ｐ４４３）に示したと同様な方法
で培養及び精製を行い、１５２の培！！液（３０／ａｌ
ｌ）から３０−２の精製ホスホリパーゼＤＭ（５６０Ｕ
／ｍｇ）溶液を得た。

以後実施例１と同様に行い光硬化り１脂（ＥＮＴＧ２０
００）包括固定化ホスホリパーゼＤＭを得た後、ホス７
アチジルグルコース生成反応を繰返し行った。その結果
を第７表に示す。

第７表　繰返し使用によるホス７アチノルグルコースの
生成量 ＰｔＳ７表の結果から、Ｅ　Ｎ　Ｔ　Ｇ　２０００包括
固定化ホスホリパ一ゼＤＭ（ノカルディオプシスＨ４Ｎ
ｏ。

７７９株）はホス７７チノルグルコースを生産するため
に繰返し使用小米ることがわかる。

［比較例１ 包括固定化以外の固定化について天施した例をＦ記に示
す。

固定化方法１ 実施例１と同様にして調製した精製ホスホリパーゼＤＭ
ｉ−（５６０Ｕ）にｐＨ６，ＯＯ，ＩＭリン酸緩衝ａ９
ｍｊ！と活性白土１ｇ又は活性炭１ｇを加え室温で１０
分攪拌した後、遠心分離し、沈殿を集め活性白土吸着固
定化ホスホリパーゼＤ　Ｍ又は、活性炭＠着固定化ホス
ホリパーゼＤ　ｈｉを得た。

固定化方法２ 精製ホスホリパーゼＤＭ５ｍ１２（２８０Ｕ）をＩＩ。

ｘｉ、Ｗｅｅｔａｌｌのノアゾ化法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　４４、−．１４３
．１９７６＞によりデュオライ）　Ａ−３７８（住人化
学工業社製）３ｇに固定化し、デュオライ）Ａ−３７８
共有結合固定化ホスホリバーゼＤＭを得た。

固定化方法３ 精製ホスホリパーゼＤＭ２ＩＩＩＩ！（１１２Ｕ）を渡
辺らのドアノニル化法（Ａ　Ｆｉｒｉｃ、　Ｂ　ｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、　。

引上、５５３，１９７７）によりデュオライトＡ−７（
住人化学工業社製＞３ｇに固定化し、デュオライ）Ａ−
７共有結合固定化ホスホリパーゼＤＭを得た。

固定化方法４ 精製ホスホリパーゼＤＭ２１ｍ１！（１１２Ｕ）をＭ。

Ｍ　ｏｓｂａｃｈのカルボジイミド法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｖ　４−３−、６２
　、１９７６　）によりデュオライ）Ｃ−４６４（住人
化学工業社製）３ｇに固定化し、デュオライ）Ｃ−４６
４共有結合固定化ホスホリパーゼＤＭを得た。

固定化方法５ Ｍ製ホスホリパーゼＤＭ２ｍｊ！　（１１２Ｕ）にｐＨ
５，２０，０２Ｍ酢酸Ｉ＆衝液８１と７ンバーライトＣ
Ｇ５０（オルガノ社ＩＪＬ　）　３　ｇ又はＣＭ−）ヨ
パール（東洋ソーｒ社製）３ｇ（いずれもｐＨ５゜２．
０．０２Ｍ酢酸暖衝液で緩衝化）を加え、室温で３０分
攪袢した後、イオン交換樹脂を回収し、アンバーライ）
ＣＧ５０イオン吸着固定化ホスホリパーゼＤＭ又はＣＭ
−）ヨパールイオン吸着固定化ホスホリパーゼＤＭを得
た。

上記した１〜５の方法により？Ｉ４製した固定化ホスホ
リパーゼＤＭ（１００Ｕ）を用いて、実施例１に示した
と同様な方法によりホス７アチノルグルコース生成反応
を行いその結果を第８表に示す。

第８表　固定化ホスホリパーゼＤＭによるホス７アチジ
ルグルコースの生成量 第８表の結果より、活性白土、活性炭への吸着固定化や
、ジアゾ化（デュオライ）　Ａ−７４７）、Ｆリアノニ
ル化（デュオライトＡ−７）、カルボジイミド化（デュ
オライトＣ−４６４）による共有結合固定化ではホスホ
リパーゼＤＭはほとんどもしくはまったく活性を発現し
なかった。又アンバーライ）　ＣＧ　５０ヤＣＭ　−）
ヨパールへのイオン吸着固定化ではホス７アチジルグル
コースを生成したが、１〜２回程度のくり返し反応しか
出来なかった。

特許出願人名糖産業株式会社　。

一□−−１−−− 代　理　人　弁理士　小田島　平　吉　“　　′：外／
鳥

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、塩類及び／又は有機溶媒の存在下もしくは不存在下
   に、リン脂質とアルコール性ＯＨ基含有化合物とを水の
   存在下でホスホリパーゼＤ類と接触させることにより反
   応せしめて、対応するリン脂質誘導体を製造するに際し
   、該反応を包括固定化したホスホリパーゼＤもしくは包
   括固定化したホスホリパーゼＤＭと接触させることによ
   り行なうことを特徴とするリン脂質誘導体の固定化酵素
   法による製法。 ２、該ホスホリパーゼＤもしくはホスホリパーゼＤＭが
   、ホスホリパーゼＤもしくはホスホリパーゼＤＭ生産性
   微生物が生産した酵素である特許請求の範囲第１項記載
   の製法。 ３、該ホスホリパーゼＤが植物組織より分離採取された
   酵素である特許請求の範囲第１項記載の製法。