JPH09234095A - モノシアロガングリオシドｇｍ１の製造方法 - Google Patents
モノシアロガングリオシドｇｍ１の製造方法Info
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- JPH09234095A JPH09234095A JP8071246A JP7124696A JPH09234095A JP H09234095 A JPH09234095 A JP H09234095A JP 8071246 A JP8071246 A JP 8071246A JP 7124696 A JP7124696 A JP 7124696A JP H09234095 A JPH09234095 A JP H09234095A
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- ganglioside
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】ガングリオシド粗製物をシアリダーゼ生産
能を有する微生物と接触させることを特徴とするモノシ
アロガングリオシドＧＭ１の製造方法、及びシアリダー
ゼ生産能を有するシュードモナス(Pseudomonas) 属の細
菌。 【効果】本発明の製造方法により、効率よく安価にモノ
シアロガングリオシドＧＭ１を大量調製することが可能
となった。
能を有する微生物と接触させることを特徴とするモノシ
アロガングリオシドＧＭ１の製造方法、及びシアリダー
ゼ生産能を有するシュードモナス(Pseudomonas) 属の細
菌。 【効果】本発明の製造方法により、効率よく安価にモノ
シアロガングリオシドＧＭ１を大量調製することが可能
となった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はモノシアロガングリ
オシドＧＭ１の製造方法に関する。
オシドＧＭ１の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ガングリオシドは、シアル酸を有するス
フィンゴ糖脂質であり、魚類、哺乳類等の脳や神経系に
多く存在している。モノシアロガングリオシドであるＧ
Ｍ１の持つ生理機能についてはこれまで多くの研究がな
されており、モノシアロガングリオシドＧＭ１がある種
の酵素、イオンチャンネル、血小板由来増殖因子（ＰＤ
ＧＦ）等の増殖因子受容体の機能をモジュレートすると
いった報告がなされている。また、モノシアロガングリ
オシドＧＭ１がヘルパーＴ細胞におけるＣＤ４と結合
し、抗ＨＩＶ効果を示す事から抗ＨＩＶ剤としての可能
性も示唆されている。さらに最近ではアルツハイマー病
やパーキンソン病をはじめとする様々な神経系疾患の治
療薬として脚光を浴びており、実際にヨーロッパや南ア
メリカを中心にモノシアロガングリオシドＧＭ１を含む
ガングリオシド混合物が末梢神経疾患治療薬として臨床
応用されている。
フィンゴ糖脂質であり、魚類、哺乳類等の脳や神経系に
多く存在している。モノシアロガングリオシドであるＧ
Ｍ１の持つ生理機能についてはこれまで多くの研究がな
されており、モノシアロガングリオシドＧＭ１がある種
の酵素、イオンチャンネル、血小板由来増殖因子（ＰＤ
ＧＦ）等の増殖因子受容体の機能をモジュレートすると
いった報告がなされている。また、モノシアロガングリ
オシドＧＭ１がヘルパーＴ細胞におけるＣＤ４と結合
し、抗ＨＩＶ効果を示す事から抗ＨＩＶ剤としての可能
性も示唆されている。さらに最近ではアルツハイマー病
やパーキンソン病をはじめとする様々な神経系疾患の治
療薬として脚光を浴びており、実際にヨーロッパや南ア
メリカを中心にモノシアロガングリオシドＧＭ１を含む
ガングリオシド混合物が末梢神経疾患治療薬として臨床
応用されている。
【０００３】ガングリオシドは、通常牛の脳からカンフ
ァー（Kanfer,J.N.)らの方法［メソッズ イン エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology) 第１４巻、第６
６０〜６６４頁、１９６９年］により調製されており、
シアル酸の数によりＧＭ１、ＧＤ１、ＧＴ１、ＧＱ１等
に分類されている。ＧＭ１のＭはモノシアロ、つまりシ
アル酸を１個持っているガングリオシドで、ＧＤ１は２
個、ＧＴ１は３個、ＧＱ１は４個のシアル酸を有してい
る。
ァー（Kanfer,J.N.)らの方法［メソッズ イン エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology) 第１４巻、第６
６０〜６６４頁、１９６９年］により調製されており、
シアル酸の数によりＧＭ１、ＧＤ１、ＧＴ１、ＧＱ１等
に分類されている。ＧＭ１のＭはモノシアロ、つまりシ
アル酸を１個持っているガングリオシドで、ＧＤ１は２
個、ＧＴ１は３個、ＧＱ１は４個のシアル酸を有してい
る。
【０００４】モノシアロガングリオシドＧＭ１の調製方
法としては、牛脳から調製したガングリオシド混合物
をアルコール或いはクロロホルムを含む溶媒中で酸性条
件下５０℃以上に加温することによってモノシアロガン
グリオシドＧＭ１を調製する方法（ＵＳ Patent No.
４８６８２９２）、及び牛脳を破砕した後界面活性剤
存在下でオートリシスを行うことによってモノシアロガ
ングリオシドＧＭ１を調製する方法（ＥＰ ０３１９８
９０Ａ１）が示されているが収率及び純度の点で決して
満足できる方法ではない。
法としては、牛脳から調製したガングリオシド混合物
をアルコール或いはクロロホルムを含む溶媒中で酸性条
件下５０℃以上に加温することによってモノシアロガン
グリオシドＧＭ１を調製する方法（ＵＳ Patent No.
４８６８２９２）、及び牛脳を破砕した後界面活性剤
存在下でオートリシスを行うことによってモノシアロガ
ングリオシドＧＭ１を調製する方法（ＥＰ ０３１９８
９０Ａ１）が示されているが収率及び純度の点で決して
満足できる方法ではない。
【０００５】また、糖脂質に作用してシアル酸を遊離す
る酵素であるシアリダーゼを利用する方法として、 C
lostridium perfringens由来のシアリダーゼ（Sigma Ty
pe VIA) をアガロースゲルに固定化したものをガングリ
オシド混合物とともに加温することによってモノシアロ
ガングリオシドＧＭ１を調製する方法（ＥＰ ０５４０
７９０Ａ１）、 Arthrobacter ureafaciens 由来のシ
アリダーゼ アイソザイムＳを用いてガングリオシド混
合物からＧＤＩｂ及び／又はＧＭ１を調製する方法（特
開平１−２８１０８２号公報）、 Arthrobacter urea
faciens 由来のシアリダーゼ アイソザイムＬを用いて
ガングリオシド混合物からＧＭ１及び／又はアシアロＧ
Ｍ１を調製する方法（特開平１−２８１０８３号公報）
等が示されている。
る酵素であるシアリダーゼを利用する方法として、 C
lostridium perfringens由来のシアリダーゼ（Sigma Ty
pe VIA) をアガロースゲルに固定化したものをガングリ
オシド混合物とともに加温することによってモノシアロ
ガングリオシドＧＭ１を調製する方法（ＥＰ ０５４０
７９０Ａ１）、 Arthrobacter ureafaciens 由来のシ
アリダーゼ アイソザイムＳを用いてガングリオシド混
合物からＧＤＩｂ及び／又はＧＭ１を調製する方法（特
開平１−２８１０８２号公報）、 Arthrobacter urea
faciens 由来のシアリダーゼ アイソザイムＬを用いて
ガングリオシド混合物からＧＭ１及び／又はアシアロＧ
Ｍ１を調製する方法（特開平１−２８１０８３号公報）
等が示されている。
【０００６】しかしながら、これらの方法はいずれも精
製酵素を用いているため製造コストが高くなる問題があ
る上に、或いはの方法では酵素量や反応時間など反
応条件によって反応生成物中のＧＭ１の純度が変化する
為、これらの方法はモノシアロガングリオシドＧＭ１を
効率よく安価に調製する方法としては決して満足できる
ものではなかった。
製酵素を用いているため製造コストが高くなる問題があ
る上に、或いはの方法では酵素量や反応時間など反
応条件によって反応生成物中のＧＭ１の純度が変化する
為、これらの方法はモノシアロガングリオシドＧＭ１を
効率よく安価に調製する方法としては決して満足できる
ものではなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、効率よく安価にモノシアロガングリオシドＧＭ１を
大量調製することの可能なモノシアロガングリオシドＧ
Ｍ１の製造方法を提供することにある。本発明の他の目
的は、本発明の製造方法に使用する、シアリダーゼ生産
能を有するシュードモナス属の細菌を提供することにあ
る。
は、効率よく安価にモノシアロガングリオシドＧＭ１を
大量調製することの可能なモノシアロガングリオシドＧ
Ｍ１の製造方法を提供することにある。本発明の他の目
的は、本発明の製造方法に使用する、シアリダーゼ生産
能を有するシュードモナス属の細菌を提供することにあ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本明細書では２個以上の
シアル酸を持つガングリオシドをポリシアロガングリオ
シドと呼ぶが、牛脳ガングリオシド中に存在するモノシ
アロガングリオシドＧＭ１の割合は約２０％しかなく、
そのまま精製してもわずかなモノシアロガングリオシド
ＧＭ１しか得ることが出来ないのが実情である。そこ
で、この点に着目して本発明者らはモノシアロガングリ
オシドＧＭ１の大量調製法について検討を行った結果、
シアリダーゼを生産する微生物をポリシアロガングリオ
シドと共に培養すればポリシアロガングリオシドがモノ
シアロガングリオシドＧＭ１に変換されて最終的に大量
のモノシアロガングリオシドＧＭ１が得られる事を見い
だし本発明に到達した。
シアル酸を持つガングリオシドをポリシアロガングリオ
シドと呼ぶが、牛脳ガングリオシド中に存在するモノシ
アロガングリオシドＧＭ１の割合は約２０％しかなく、
そのまま精製してもわずかなモノシアロガングリオシド
ＧＭ１しか得ることが出来ないのが実情である。そこ
で、この点に着目して本発明者らはモノシアロガングリ
オシドＧＭ１の大量調製法について検討を行った結果、
シアリダーゼを生産する微生物をポリシアロガングリオ
シドと共に培養すればポリシアロガングリオシドがモノ
シアロガングリオシドＧＭ１に変換されて最終的に大量
のモノシアロガングリオシドＧＭ１が得られる事を見い
だし本発明に到達した。
【０００９】なお、シアリダーゼ生産菌については、現
在までにいくつかは知られているが、これらのシアリダ
ーゼ生産微生物は、例えばコレラ菌、肺炎双球菌、ニュ
ーカッスル病ウイルス等のように病原性の微生物が多い
ことからこれらの微生物を使用することは好ましくない
と判断される。そこで、本発明者らは、比較的ヒトに対
する病原性が少なく、未利用の有用微生物が多く存在し
ていると考えられている海洋環境からシアリダーゼ生産
菌の検索を行った。その結果、ある種の細菌がモノシア
ロガングリオシドＧＭ１の大量調製に最適なシアリダー
ゼを生産することを見いだし本発明を完成するに至っ
た。
在までにいくつかは知られているが、これらのシアリダ
ーゼ生産微生物は、例えばコレラ菌、肺炎双球菌、ニュ
ーカッスル病ウイルス等のように病原性の微生物が多い
ことからこれらの微生物を使用することは好ましくない
と判断される。そこで、本発明者らは、比較的ヒトに対
する病原性が少なく、未利用の有用微生物が多く存在し
ていると考えられている海洋環境からシアリダーゼ生産
菌の検索を行った。その結果、ある種の細菌がモノシア
ロガングリオシドＧＭ１の大量調製に最適なシアリダー
ゼを生産することを見いだし本発明を完成するに至っ
た。
【００１０】即ち、本発明の要旨は、（１） ガングリ
オシド粗製物をシアリダーゼ生産能を有する微生物と接
触させることを特徴とするモノシアロガングリオシドＧ
Ｍ１の製造方法、（２） ガングリオシド粗製物を添加
した培地中で該微生物を培養することを特徴とする前記
（１）記載の製造方法、（３） 該微生物がシュードモ
ナス(Pseudomonas) 属の細菌である前記（１）又は
（２）記載の製造方法、（４） シアリダーゼ生産能を
有するシュードモナス(Pseudomonas) 属の細菌、並びに
（５） 細菌がシュードモナス(Pseudomonas) エスピー
（sp.) ＹＦ−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５５）である
前記（４）記載の細菌、に関する。
オシド粗製物をシアリダーゼ生産能を有する微生物と接
触させることを特徴とするモノシアロガングリオシドＧ
Ｍ１の製造方法、（２） ガングリオシド粗製物を添加
した培地中で該微生物を培養することを特徴とする前記
（１）記載の製造方法、（３） 該微生物がシュードモ
ナス(Pseudomonas) 属の細菌である前記（１）又は
（２）記載の製造方法、（４） シアリダーゼ生産能を
有するシュードモナス(Pseudomonas) 属の細菌、並びに
（５） 細菌がシュードモナス(Pseudomonas) エスピー
（sp.) ＹＦ−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５５）である
前記（４）記載の細菌、に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明はガングリオシド粗製物をシアリダーゼ生
産能を有する微生物と接触させることによりモノシアロ
ガングリオシドＧＭ１を製造する方法であるが、本発明
に使用される微生物は、シアリダーゼの生産能を有する
菌株であればいかなる微生物でもよく、またそれらの微
生物の変異株でもよい。この場合、産生されるシアリダ
ーゼはモノシアロガングリオシドＧＭ１には作用しない
ものが好ましい。このような微生物の単離方法として
は、例えば、海藻や海水、海砂などのサンプルを、ガン
グリオシドを唯一の炭素源とする合成培地に加え、２５
℃で３〜４日培養する。その後、培養上清の基質の分解
をＴＬＣで確認し、シアリダーゼ活性のあるものを同培
地に植え継ぎ、これを３〜４回繰り返したのち、平面培
地で各コロニーを単離することにより得ることができ
る。
する。本発明はガングリオシド粗製物をシアリダーゼ生
産能を有する微生物と接触させることによりモノシアロ
ガングリオシドＧＭ１を製造する方法であるが、本発明
に使用される微生物は、シアリダーゼの生産能を有する
菌株であればいかなる微生物でもよく、またそれらの微
生物の変異株でもよい。この場合、産生されるシアリダ
ーゼはモノシアロガングリオシドＧＭ１には作用しない
ものが好ましい。このような微生物の単離方法として
は、例えば、海藻や海水、海砂などのサンプルを、ガン
グリオシドを唯一の炭素源とする合成培地に加え、２５
℃で３〜４日培養する。その後、培養上清の基質の分解
をＴＬＣで確認し、シアリダーゼ活性のあるものを同培
地に植え継ぎ、これを３〜４回繰り返したのち、平面培
地で各コロニーを単離することにより得ることができ
る。
【００１２】モノシアロガングリオシドＧＭ１に作用し
ないシアリダーゼの生産能を有する菌株の具体例として
は、シュードモナス属の細菌、例えば、シュードモナス
エスピー ＹＦ−２株などが挙げられる。本菌株は博
多湾の海水中から本発明者らが新たに検索して得た好塩
性の菌株で、その菌学的性質は次の通りである。透過型
電子顕微鏡による観察の結果、本菌株はグラム陰性の短
桿菌で非常に長い単極極鞭毛を有し、体長は０．９〜
１．２μｍ、体幅は約０．５μｍであった。表１に本菌
株の同定結果を示す。
ないシアリダーゼの生産能を有する菌株の具体例として
は、シュードモナス属の細菌、例えば、シュードモナス
エスピー ＹＦ−２株などが挙げられる。本菌株は博
多湾の海水中から本発明者らが新たに検索して得た好塩
性の菌株で、その菌学的性質は次の通りである。透過型
電子顕微鏡による観察の結果、本菌株はグラム陰性の短
桿菌で非常に長い単極極鞭毛を有し、体長は０．９〜
１．２μｍ、体幅は約０．５μｍであった。表１に本菌
株の同定結果を示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】以上のような菌学的性質を有する菌株につ
いて、バージーズ マニュアル オブ ディターミネー
ティブ バクテリオロジー（Bergey's Manual of Deter
minative Bacteriology)（第８版）、ウィリアムズ ア
ンド ウィルキンス カンパニー（Williams & Wilkins
Company）、1974年発行、の分類法に基づいて同定を行
ったところ、本菌株はシュードモナス (Pseudomonas)属
に属するが、本菌株の特徴に十分合致する公知の種は見
いだせず、本菌株を新種の海洋性シュードモナスと同定
した。本菌株はPseudomonas sp. ＹＦ−２と表示され、
工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−
１５３５５として寄託されている。
いて、バージーズ マニュアル オブ ディターミネー
ティブ バクテリオロジー（Bergey's Manual of Deter
minative Bacteriology)（第８版）、ウィリアムズ ア
ンド ウィルキンス カンパニー（Williams & Wilkins
Company）、1974年発行、の分類法に基づいて同定を行
ったところ、本菌株はシュードモナス (Pseudomonas)属
に属するが、本菌株の特徴に十分合致する公知の種は見
いだせず、本菌株を新種の海洋性シュードモナスと同定
した。本菌株はPseudomonas sp. ＹＦ−２と表示され、
工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−
１５３５５として寄託されている。
【００１５】本菌株によって培養液中に生産されるシア
リダーゼの酵素化学的及び理化学的性質は次の通りであ
る。 （１）作用 シアロシル結合に作用してシアル酸を遊離する。 （２）基質特異性 ＧＭ３、ＧＤ１ａ、シアリルラクトース（ＳＡ−Ｌａ
ｃ）に作用してそのシアル酸を遊離するが、ＧＭ１、Ｇ
Ｍ２のシアル酸には全く作用しない。つまり本酵素はガ
ングリオシドの糖鎖の非還元末端側に存在するシアル酸
に良く作用するが、糖鎖の内側に結合したシアル酸には
全く作用しない（表２）。このことから、ポリシアロガ
ングリオシドに作用してモノシアロガングリオシドＧＭ
１に変換する作用を有することが示される。
リダーゼの酵素化学的及び理化学的性質は次の通りであ
る。 （１）作用 シアロシル結合に作用してシアル酸を遊離する。 （２）基質特異性 ＧＭ３、ＧＤ１ａ、シアリルラクトース（ＳＡ−Ｌａ
ｃ）に作用してそのシアル酸を遊離するが、ＧＭ１、Ｇ
Ｍ２のシアル酸には全く作用しない。つまり本酵素はガ
ングリオシドの糖鎖の非還元末端側に存在するシアル酸
に良く作用するが、糖鎖の内側に結合したシアル酸には
全く作用しない（表２）。このことから、ポリシアロガ
ングリオシドに作用してモノシアロガングリオシドＧＭ
１に変換する作用を有することが示される。
【００１６】
【表２】
【００１７】（３）至適ｐＨ及び温度安定性 本酵素の至適ｐＨは５．５でｐＨ４．５〜６．０の間で
比較的高い活性を示す（図１）。また、本酵素をｐＨ
５．０、２０ｍＭ酢酸緩衝液中、種々の温度で２時間保
温した場合、本酵素は４０℃以上ではほぼ失活してお
り、比較的低い温度域（３７℃以下）で安定である（図
２）。
比較的高い活性を示す（図１）。また、本酵素をｐＨ
５．０、２０ｍＭ酢酸緩衝液中、種々の温度で２時間保
温した場合、本酵素は４０℃以上ではほぼ失活してお
り、比較的低い温度域（３７℃以下）で安定である（図
２）。
【００１８】（４）金属塩の影響 本酵素における各種の金属塩の影響を調べた。銅は硫酸
塩、亜鉛は酢酸塩を用い、それら以外はすべて塩化物を
用い、２ｍＭの濃度になるように反応系に加えた結果、
表３に示すように本酵素はマンガン、バリウム等によっ
て強く活性化され、水銀、銅、鉄によって活性が強く阻
害された。
塩、亜鉛は酢酸塩を用い、それら以外はすべて塩化物を
用い、２ｍＭの濃度になるように反応系に加えた結果、
表３に示すように本酵素はマンガン、バリウム等によっ
て強く活性化され、水銀、銅、鉄によって活性が強く阻
害された。
【００１９】
【表３】
【００２０】本発明のモノシアロガングリオシドＧＭ１
の製造法においては、特に限定されるものではないが、
例えば上述した菌株を栄養培地中で培養した後、培地に
ガングリオシド粗製物を加えるか、あるいはあらかじめ
ガングリオシド粗製物を加えた栄養培地中で培養する方
法によりガングリオシド粗製物と菌株を接触させること
ができる。いずれの場合においても、ガングリオシド粗
製物の添加量は特に限定されるものではなく適宜決定さ
れる。
の製造法においては、特に限定されるものではないが、
例えば上述した菌株を栄養培地中で培養した後、培地に
ガングリオシド粗製物を加えるか、あるいはあらかじめ
ガングリオシド粗製物を加えた栄養培地中で培養する方
法によりガングリオシド粗製物と菌株を接触させること
ができる。いずれの場合においても、ガングリオシド粗
製物の添加量は特に限定されるものではなく適宜決定さ
れる。
【００２１】ここでガングリオシド粗製物とは牛脳など
から調製された各種のガングリオシドを含むガングリオ
シドの混合物である。ガングリオシド粗製物は、例えば
カンファー（Kanfer,J.N.)らの方法［メソッズ イン
エンザイモロジー（Methodsin Enzymology) 第１４
巻、第６６０〜６６４頁、１９６９年］に従って調製す
ることが出来る。
から調製された各種のガングリオシドを含むガングリオ
シドの混合物である。ガングリオシド粗製物は、例えば
カンファー（Kanfer,J.N.)らの方法［メソッズ イン
エンザイモロジー（Methodsin Enzymology) 第１４
巻、第６６０〜６６４頁、１９６９年］に従って調製す
ることが出来る。
【００２２】培地としては、本菌株が生育し、シアリダ
ーゼが生産され、培地中に存在するガングリオシド粗製
物から効率よくモノシアロガングリオシドＧＭ１が生成
するようなものであればよく、特に限定されるものでは
ない。かかる培地において炭素源としては、例えばガン
グリオシド粗製物、ガングリオテトラオース系のポリシ
アロガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ａ、
ＧＴ１ｂ）が利用できる。好ましくはＧＤ１ａである。
また、窒素源としては例えば塩化アンモニウム、ポリペ
プトン等が適当である。その他にリン酸塩、カリウム
塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などの無機質及び金属塩類
を加えてもよい。
ーゼが生産され、培地中に存在するガングリオシド粗製
物から効率よくモノシアロガングリオシドＧＭ１が生成
するようなものであればよく、特に限定されるものでは
ない。かかる培地において炭素源としては、例えばガン
グリオシド粗製物、ガングリオテトラオース系のポリシ
アロガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ａ、
ＧＴ１ｂ）が利用できる。好ましくはＧＤ１ａである。
また、窒素源としては例えば塩化アンモニウム、ポリペ
プトン等が適当である。その他にリン酸塩、カリウム
塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などの無機質及び金属塩類
を加えてもよい。
【００２３】本菌株を培養するにあたり、シアリダーゼ
の生産量、モノシアロガングリオシドＧＭ１の生成量は
培養条件により大きく変動するが、一般的に培養温度は
２０〜３５℃、培地のｐＨは７．２〜７．４が良く、１
日〜７日の通気攪拌培養でモノシアロガングリオシドＧ
Ｍ１が生産される。
の生産量、モノシアロガングリオシドＧＭ１の生成量は
培養条件により大きく変動するが、一般的に培養温度は
２０〜３５℃、培地のｐＨは７．２〜７．４が良く、１
日〜７日の通気攪拌培養でモノシアロガングリオシドＧ
Ｍ１が生産される。
【００２４】培養終了後、目的のモノシアロガングリオ
シドＧＭ１を含む培養液から遠心分離等によって菌株を
除去し、得られた培養上清から通常用いられる方法でタ
ンパク質や塩類を除去する。例えば、培養上清をＣ18の
逆相カラム等に負荷してタンパク質を除去し、同時に脱
塩を行う方法が効果的である。脱塩した培養上清から通
常用いられる方法、例えばメソッズ イン エンザイモ
ロジー第８３巻、第１３９〜１９１頁、１９８２年に記
載の方法でモノシアロガングリオシドＧＭ１を精製する
ことが出来る。精製したモノシアロガングリオシドＧＭ
１の構造の確認は、薄層クロマトグラフィーや液体クロ
マトグラフィー、質量分析、核磁気共鳴スペクトルなど
の分析法によって行うことが出来る。このようにしてガ
ングリオシド粗製物を本発明に用いる微生物と共に培養
することにより、ガングリオシド粗製物から目的のモノ
シアロガングリオシドＧＭ１に変換することが出来る。
シドＧＭ１を含む培養液から遠心分離等によって菌株を
除去し、得られた培養上清から通常用いられる方法でタ
ンパク質や塩類を除去する。例えば、培養上清をＣ18の
逆相カラム等に負荷してタンパク質を除去し、同時に脱
塩を行う方法が効果的である。脱塩した培養上清から通
常用いられる方法、例えばメソッズ イン エンザイモ
ロジー第８３巻、第１３９〜１９１頁、１９８２年に記
載の方法でモノシアロガングリオシドＧＭ１を精製する
ことが出来る。精製したモノシアロガングリオシドＧＭ
１の構造の確認は、薄層クロマトグラフィーや液体クロ
マトグラフィー、質量分析、核磁気共鳴スペクトルなど
の分析法によって行うことが出来る。このようにしてガ
ングリオシド粗製物を本発明に用いる微生物と共に培養
することにより、ガングリオシド粗製物から目的のモノ
シアロガングリオシドＧＭ１に変換することが出来る。
【００２５】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す
が、本発明は実施例に限定されるものではない。
が、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２６】実施例１ シアリダーゼ生産能を有するシュードモナス属菌株の単
離 博多湾の海水０．０１ｍＬを採取し、ガングリオシドを
唯一の炭素源とする合成培地（ガングリオシド粗製物：
０．１重量％、ＮａＣｌ：１重量％、ＮＨ4 Ｃｌ：０．
０５重量％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．０５重量％、ｐＨ７．
４）０．１ｍＬに加え、２５℃で３日間培養した。な
お、ここで用いたガングリオシド粗製物は、牛脳からカ
ンファーらの方法（メソッズ イン エンザイモロジ
ー、第１４巻、第６６０〜６６４頁、１９６９年）によ
り得られたものである。その後、培養上清の基質の分解
をＴＬＣで確認し、シアリダーゼ活性のあるものを同培
地に植え継ぎ、これを３回繰り返したのち、平面培地で
各コロニーを単離した。その結果、２８株のシアリダー
ゼ生産菌が分離された。その内の１株について菌学的性
質を検査し、バージーズ マニュアル オブ ディター
ミネーティブ バクテリオロジー（Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology)（第８版）、ウィリアム
ズ アンド ウィルキンス カンパニー、1974年発行、
の分類法に基づいて同定を行ったところ、本菌株はシュ
ードモナス (Pseudomonas)属に属する、新種の海洋性シ
ュードモナスと同定され、シュードモナス エスピー
ＹＦ−２と命名され、Pseudomonas sp. ＹＦ−２と表示
され、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ
Ｐ−１５３５５として寄託されている。
離 博多湾の海水０．０１ｍＬを採取し、ガングリオシドを
唯一の炭素源とする合成培地（ガングリオシド粗製物：
０．１重量％、ＮａＣｌ：１重量％、ＮＨ4 Ｃｌ：０．
０５重量％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．０５重量％、ｐＨ７．
４）０．１ｍＬに加え、２５℃で３日間培養した。な
お、ここで用いたガングリオシド粗製物は、牛脳からカ
ンファーらの方法（メソッズ イン エンザイモロジ
ー、第１４巻、第６６０〜６６４頁、１９６９年）によ
り得られたものである。その後、培養上清の基質の分解
をＴＬＣで確認し、シアリダーゼ活性のあるものを同培
地に植え継ぎ、これを３回繰り返したのち、平面培地で
各コロニーを単離した。その結果、２８株のシアリダー
ゼ生産菌が分離された。その内の１株について菌学的性
質を検査し、バージーズ マニュアル オブ ディター
ミネーティブ バクテリオロジー（Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology)（第８版）、ウィリアム
ズ アンド ウィルキンス カンパニー、1974年発行、
の分類法に基づいて同定を行ったところ、本菌株はシュ
ードモナス (Pseudomonas)属に属する、新種の海洋性シ
ュードモナスと同定され、シュードモナス エスピー
ＹＦ−２と命名され、Pseudomonas sp. ＹＦ−２と表示
され、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ
Ｐ−１５３５５として寄託されている。
【００２７】実施例２ （１）微生物の培養ならびにガングリオシド粗製物のモ
ノシアロガングリオシドＧＭ１への変換 牛脳からカンファーらの方法（メソッズ イン エンザ
イモロジー、第１４巻、第６６０〜６６４頁、１９６９
年）に従って糖脂質の混合物であるガングリオシド粗製
物を調製した。得られたガングリオシド粗製物５００ｍ
ｇを含む１００ｍＬの液体培地（Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．０
５重量％；ＮＨ4 Ｃｌ：０．０５重量％；ＮａＣｌ：１
重量％；ｐＨ７．４）中で、シュードモナス エスピー
ＹＦ−２を２５℃で３日間培養した。培養液を遠心分
離した後、培養上清中のガングリオシドを薄層クロマト
グラフィーで分析したところ、ガングリオシド粗製物中
のモノシアロガングリオシドＧＭ１含量は約２０％であ
るのに対して、３日間培養後の培養上清中のガングリオ
シド中に占めるモノシアロガングリオシドＧＭ１の割合
は９０％以上に上昇していた（図３）。なお、各成分の
定量は次のようにして実施した。薄層クロマトグラフィ
ーで展開〔クロロホルム／メタノール／０．２％ＫＣｌ
＝５：４：１（ｖ／ｖ）〕後、オルシノール硫酸液を噴
霧し、１００〜１１０℃のオーブンで１０分間加熱し
た。ＧＭ１（ヤトロン社製）、ＧＤ１ａ（ヤトロン社
製）、ＧＤ１ｂ（ヤトロン社製）、ＧＴ１ａ（バイオカ
ーブ社製）をそれぞれ標品として、ＴＬＣクロマトスキ
ャナーＣＳ９３００（島津製作所社製）により、５４０
ｎｍにおける吸収を測定することにより定量を行った。
ノシアロガングリオシドＧＭ１への変換 牛脳からカンファーらの方法（メソッズ イン エンザ
イモロジー、第１４巻、第６６０〜６６４頁、１９６９
年）に従って糖脂質の混合物であるガングリオシド粗製
物を調製した。得られたガングリオシド粗製物５００ｍ
ｇを含む１００ｍＬの液体培地（Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．０
５重量％；ＮＨ4 Ｃｌ：０．０５重量％；ＮａＣｌ：１
重量％；ｐＨ７．４）中で、シュードモナス エスピー
ＹＦ−２を２５℃で３日間培養した。培養液を遠心分
離した後、培養上清中のガングリオシドを薄層クロマト
グラフィーで分析したところ、ガングリオシド粗製物中
のモノシアロガングリオシドＧＭ１含量は約２０％であ
るのに対して、３日間培養後の培養上清中のガングリオ
シド中に占めるモノシアロガングリオシドＧＭ１の割合
は９０％以上に上昇していた（図３）。なお、各成分の
定量は次のようにして実施した。薄層クロマトグラフィ
ーで展開〔クロロホルム／メタノール／０．２％ＫＣｌ
＝５：４：１（ｖ／ｖ）〕後、オルシノール硫酸液を噴
霧し、１００〜１１０℃のオーブンで１０分間加熱し
た。ＧＭ１（ヤトロン社製）、ＧＤ１ａ（ヤトロン社
製）、ＧＤ１ｂ（ヤトロン社製）、ＧＴ１ａ（バイオカ
ーブ社製）をそれぞれ標品として、ＴＬＣクロマトスキ
ャナーＣＳ９３００（島津製作所社製）により、５４０
ｎｍにおける吸収を測定することにより定量を行った。
【００２８】（２）モノシアロガングリオシドＧＭ１の
精製 培養液を遠心分離して得た培養上清（ガングリオシド約
２００ｍｇ分）を、メタノールで洗浄後脱イオン水で平
衡化されたＣ18逆相カラム〔Preparative Ｃ18125Å
（ミリポア社製）充填量３０ｇ、カラム直径３０ｍｍ、
オープンカラム〕に負荷した。カラムに脱イオン水３０
０ｍＬを流して脱塩を行った後、クロロホルム／メタノ
ール（２／１：ｖ／ｖ）５００ｍＬを流して糖脂質を溶
出した。溶出画分をエバポレーターで濃縮して次の陰イ
オン交換クロマトグラフィーに供した。
精製 培養液を遠心分離して得た培養上清（ガングリオシド約
２００ｍｇ分）を、メタノールで洗浄後脱イオン水で平
衡化されたＣ18逆相カラム〔Preparative Ｃ18125Å
（ミリポア社製）充填量３０ｇ、カラム直径３０ｍｍ、
オープンカラム〕に負荷した。カラムに脱イオン水３０
０ｍＬを流して脱塩を行った後、クロロホルム／メタノ
ール（２／１：ｖ／ｖ）５００ｍＬを流して糖脂質を溶
出した。溶出画分をエバポレーターで濃縮して次の陰イ
オン交換クロマトグラフィーに供した。
【００２９】ＤＥＡＥ Sephadex Ａ２５（ファルマシア
社製）陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによるモ
ノシアロガングリオシドＧＭ１の精製は、以下に示すよ
うに行った。溶出溶媒は、溶媒Ｉとしてクロロホルム／
メタノール／脱イオン水＝３０：６０：８（ｖ／ｖ）、
溶媒IIとしてクロロホルム／メタノール／０．８Ｍ酢酸
ナトリウム水溶液＝３０：６０：８（ｖ／ｖ）を用い
た。溶媒Ｉで平衡化したＤＥＡＥ Sephadex Ａ２５（７
５ｍＬ）をカラム（直径２５ｍｍ、オープンカラム）に
充填した。ガングリオシド約２００ｍｇを５０ｍＬの溶
媒Ｉに溶かして超音波処理を行い、得られたサンプルを
そのカラムに負荷した。溶媒Ｉを３００ｍＬ流した後、
溶媒Ｉと溶媒IIそれぞれ４００ｍＬで直線濃度勾配をつ
くり、モノシアロガングリオシドＧＭ１を溶出した。溶
出液は１０ｍＬずつ分画し、各フラクションについて薄
層クロマトグラフィーでガングリオシドの分析を行っ
た。
社製）陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによるモ
ノシアロガングリオシドＧＭ１の精製は、以下に示すよ
うに行った。溶出溶媒は、溶媒Ｉとしてクロロホルム／
メタノール／脱イオン水＝３０：６０：８（ｖ／ｖ）、
溶媒IIとしてクロロホルム／メタノール／０．８Ｍ酢酸
ナトリウム水溶液＝３０：６０：８（ｖ／ｖ）を用い
た。溶媒Ｉで平衡化したＤＥＡＥ Sephadex Ａ２５（７
５ｍＬ）をカラム（直径２５ｍｍ、オープンカラム）に
充填した。ガングリオシド約２００ｍｇを５０ｍＬの溶
媒Ｉに溶かして超音波処理を行い、得られたサンプルを
そのカラムに負荷した。溶媒Ｉを３００ｍＬ流した後、
溶媒Ｉと溶媒IIそれぞれ４００ｍＬで直線濃度勾配をつ
くり、モノシアロガングリオシドＧＭ１を溶出した。溶
出液は１０ｍＬずつ分画し、各フラクションについて薄
層クロマトグラフィーでガングリオシドの分析を行っ
た。
【００３０】薄層クロマトグラフィーはクロロホルム／
メタノール／０．２％ＫＣｌ＝５：４：１（ｖ／ｖ）で
展開し、オルシノール硫酸液を噴霧した後１００〜１１
０℃のオーブンで１０分間加熱してガングリオシドを検
出した。発色後のプレートをＴＬＣクロマトスキャナー
ＣＳ９３００（島津製作所社製）に供し、５４０ｎｍに
おける吸収を測定することによって、ガングリオシドの
定量を行った。その結果、グラディエント溶出画分のフ
ラクション２６−４３にモノシアロガングリオシドＧＭ
１が溶出された（図４）。このようにして精製されたモ
ノシアロガングリオシドＧＭ１の量は、ＴＬＣで定量す
ると１７５ｍｇであった。得られたＧＭ１についてＦＡ
Ｂ−ＭＳを用いて質量分析を行った結果、分子量１５４
５の結果が得られ、得られたガングリオシドは間違いな
くモノシアロガングリオシドＧＭ１であることが確認で
きた。
メタノール／０．２％ＫＣｌ＝５：４：１（ｖ／ｖ）で
展開し、オルシノール硫酸液を噴霧した後１００〜１１
０℃のオーブンで１０分間加熱してガングリオシドを検
出した。発色後のプレートをＴＬＣクロマトスキャナー
ＣＳ９３００（島津製作所社製）に供し、５４０ｎｍに
おける吸収を測定することによって、ガングリオシドの
定量を行った。その結果、グラディエント溶出画分のフ
ラクション２６−４３にモノシアロガングリオシドＧＭ
１が溶出された（図４）。このようにして精製されたモ
ノシアロガングリオシドＧＭ１の量は、ＴＬＣで定量す
ると１７５ｍｇであった。得られたＧＭ１についてＦＡ
Ｂ−ＭＳを用いて質量分析を行った結果、分子量１５４
５の結果が得られ、得られたガングリオシドは間違いな
くモノシアロガングリオシドＧＭ１であることが確認で
きた。
【００３１】以上のデータを要約すると、次のとおりで
ある。ガングリオシド粗製物５００ｍｇ中にはガングリ
オシドは約２１５ｍｇ含まれており、その中でモノシア
ロガングリオシドＧＭ１は約４０ｍｇであった。ガング
リオシド粗製物をシュードモナス エスピー ＹＦ−２
とともに培養し、培養上清を逆相カラムに供した後の溶
出液ではモノシアロガングリオシドＧＭ１の含量は約２
００ｍｇにまで上昇していた。さらに陰イオン交換クロ
マトグラフィーによる精製を行うことによって最終的に
１７５ｍｇの純粋なモノシアロガングリオシドＧＭ１を
原料のガングリオシド粗製物からの収率８１％で得るこ
とが出来た。
ある。ガングリオシド粗製物５００ｍｇ中にはガングリ
オシドは約２１５ｍｇ含まれており、その中でモノシア
ロガングリオシドＧＭ１は約４０ｍｇであった。ガング
リオシド粗製物をシュードモナス エスピー ＹＦ−２
とともに培養し、培養上清を逆相カラムに供した後の溶
出液ではモノシアロガングリオシドＧＭ１の含量は約２
００ｍｇにまで上昇していた。さらに陰イオン交換クロ
マトグラフィーによる精製を行うことによって最終的に
１７５ｍｇの純粋なモノシアロガングリオシドＧＭ１を
原料のガングリオシド粗製物からの収率８１％で得るこ
とが出来た。
【００３２】試験例 精製モノシアロガングリオシドＧＭ１の神経突起伸展作
用 実施例２で得られた精製モノシアロガングリオシドＧＭ
１を３３μＭ、１００μＭの濃度で血清含有培地（１０
％ＦＣＳ（牛胎児血清）含有ＭＥＭ培地（日水製薬社
製））に加え、神経芽腫瘍細胞Ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１３１）を３７℃で２４時間培養
した。培養後の細胞をランダムに写真に撮り、そのうち
１００個の細胞のうち突起をもった細胞数を測定し、神
経細胞への分化の度合いを検討した。その結果、精製モ
ノシアロガングリオシドＧＭ１を１００μＭ加えた場
合、突起を有する細胞の割合の顕著な増加が見られた
（図５）。このことから、実施例２で調製したモノシア
ロガングリオシドＧＭ１は血清含有培地においても神経
突起の伸展能を有していること分かった。
用 実施例２で得られた精製モノシアロガングリオシドＧＭ
１を３３μＭ、１００μＭの濃度で血清含有培地（１０
％ＦＣＳ（牛胎児血清）含有ＭＥＭ培地（日水製薬社
製））に加え、神経芽腫瘍細胞Ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１３１）を３７℃で２４時間培養
した。培養後の細胞をランダムに写真に撮り、そのうち
１００個の細胞のうち突起をもった細胞数を測定し、神
経細胞への分化の度合いを検討した。その結果、精製モ
ノシアロガングリオシドＧＭ１を１００μＭ加えた場
合、突起を有する細胞の割合の顕著な増加が見られた
（図５）。このことから、実施例２で調製したモノシア
ロガングリオシドＧＭ１は血清含有培地においても神経
突起の伸展能を有していること分かった。
【００３３】
【発明の効果】本発明の製造方法により、効率よく安価
にモノシアロガングリオシドＧＭ１を大量調製すること
が可能となった。
にモノシアロガングリオシドＧＭ１を大量調製すること
が可能となった。
【図１】図１は、本発明のシュードモナス属菌の産生す
るシアリダーゼの至適ｐＨを示す図である。
るシアリダーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図２】図２は、本発明のシュードモナス属菌の産生す
るシアリダーゼの温度安定性を示す図である。
るシアリダーゼの温度安定性を示す図である。
【図３】図３は、実施例２におけるガングリオシド粗製
物からのモノシアロガングリオシドＧＭ１への変換を示
す図である。
物からのモノシアロガングリオシドＧＭ１への変換を示
す図である。
【図４】図４は、実施例２におけるDEAE Sephadex A25
によるクロマトグラムを示す図である。
によるクロマトグラムを示す図である。
【図５】図５は、精製モノシアロガングリオシドＧＭ１
の神経突起伸展作用を示す図である。
の神経突起伸展作用を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38）
Claims (5)
- 【請求項１】 ガングリオシド粗製物をシアリダーゼ生
産能を有する微生物と接触させることを特徴とするモノ
シアロガングリオシドＧＭ１の製造方法。 - 【請求項２】 ガングリオシド粗製物を添加した培地中
で該微生物を培養することを特徴とする請求項１記載の
製造方法。 - 【請求項３】 該微生物がシュードモナス(Pseudomona
s) 属の細菌である請求項１又は２記載の製造方法。 - 【請求項４】 シアリダーゼ生産能を有するシュードモ
ナス(Pseudomonas)属の細菌。 - 【請求項５】 細菌がシュードモナス(Pseudomonas) エ
スピー（sp.) ＹＦ−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５５）
である請求項４記載の細菌。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07124696A JP3703199B2 (ja) | 1996-03-01 | 1996-03-01 | モノシアロガングリオシドｇｍ１の製造方法 |
| US08/719,211 US5756314A (en) | 1996-03-01 | 1996-09-25 | Method for preparation of monosialoganglioside GM1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07124696A JP3703199B2 (ja) | 1996-03-01 | 1996-03-01 | モノシアロガングリオシドｇｍ１の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09234095A true JPH09234095A (ja) | 1997-09-09 |
| JP3703199B2 JP3703199B2 (ja) | 2005-10-05 |
Family
ID=13455158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07124696A Expired - Fee Related JP3703199B2 (ja) | 1996-03-01 | 1996-03-01 | モノシアロガングリオシドｇｍ１の製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5756314A (ja) |
| JP (1) | JP3703199B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10308885A1 (de) * | 2003-02-28 | 2004-09-23 | Syha, Klaus, Dr. | Verwendung glycosidasehaltiger Lösungen zur Behandlung von neuronalen Zellen |
| CN109721632A (zh) * | 2017-10-27 | 2019-05-07 | 齐鲁制药有限公司 | 一种高纯度神经节苷脂gm1及其制备方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7943750B2 (en) * | 2007-06-18 | 2011-05-17 | Laboratoire Medidom S.A. | Process for obtaining pure monosialoganglioside GM1 for medical use |
| EP2116139A1 (en) * | 2008-05-08 | 2009-11-11 | Nestec S.A. | Sialic acid to support brain health in the elderly |
| CN102154416B (zh) * | 2011-01-18 | 2013-06-12 | 山东新时代药业有限公司 | 一种固定化微生物细胞转化神经节苷脂的方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0653764B2 (ja) * | 1985-07-31 | 1994-07-20 | 三井東圧化学株式会社 | モノシアロガングリオシドの製造法 |
| IT1223408B (it) * | 1987-12-09 | 1990-09-19 | Crinos Industria Farmaco | Procedimento per la preparazione di monosialoganglioside |
| JP2726898B2 (ja) * | 1988-05-02 | 1998-03-11 | 丸金醤油株式会社 | ノイラミニダーゼ・アイソザイムｌ及びガングリオシド類の製造法 |
| JP2724588B2 (ja) * | 1988-05-02 | 1998-03-09 | 丸金醤油株式会社 | ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法 |
| DE69122105T2 (de) * | 1991-11-05 | 1997-02-06 | Technochemical Corp S A | Verfahren zur Erlangen von Monosialogangliosiden |
-
1996
- 1996-03-01 JP JP07124696A patent/JP3703199B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-25 US US08/719,211 patent/US5756314A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10308885A1 (de) * | 2003-02-28 | 2004-09-23 | Syha, Klaus, Dr. | Verwendung glycosidasehaltiger Lösungen zur Behandlung von neuronalen Zellen |
| CN109721632A (zh) * | 2017-10-27 | 2019-05-07 | 齐鲁制药有限公司 | 一种高纯度神经节苷脂gm1及其制备方法 |
| CN109721632B (zh) * | 2017-10-27 | 2023-10-31 | 齐鲁制药有限公司 | 一种高纯度神经节苷脂gm1及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3703199B2 (ja) | 2005-10-05 |
| US5756314A (en) | 1998-05-26 |
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| JP2699078B2 (ja) | ムシン分解酵素及びその製造法 |
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