WO2007069603A1 - 生理活性を有する糖脂質 - Google Patents

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WO2007069603A1
WO2007069603A1 PCT/JP2006/324756 JP2006324756W WO2007069603A1 WO 2007069603 A1 WO2007069603 A1 WO 2007069603A1 JP 2006324756 W JP2006324756 W JP 2006324756W WO 2007069603 A1 WO2007069603 A1 WO 2007069603A1
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WO
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ptdglc
glycolipid
cells
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present
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PCT/JP2006/324756
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Yasuko Nagatsuka
Yoshio Hirabayashi
Hiroyuki Kamiguchi
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Riken
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
    • G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides
    • G01N2405/06—Glycophospholipids, e.g. phosphatidyl inositol

Definitions

  • the present invention relates to phosphatidyldarcoside, a acetylated glycolipid, which is a novel physiologically active glycolipid, and use thereof.
  • An anti-i antibody that recognizes the fetal antigen i-sugar chain which is related to the Ii system, is a natural autoantibody belonging to the VH-4 family of immunoglobulins and has a broad cross-reactivity.
  • the present inventors have previously found the presence of phosphoglycerolipid containing glucose as the sole sugar in umbilical cord blood cells (non-patented) of human anti-i monoclonal antibody mAb GL-1, GL-2. Reference 1 and non-patent reference 2).
  • Non-special literature 1 Yasuko Nagatsu a, Shinobu Watarai, Tatsuji Yasuda, Hiaeyoshi Higas hi, Tatsuya Yamagata and Yasushi Ono (1995). Production of human monoclonal anti bodies to i blood group by EBV— induced transformation. Possible presence of a new glycolipia in cord red cell membranes and human hematopoietic cell lines.Immunol. Lett. 46, 93-100.
  • Non-Patent Document 2 Yasuko Nagatsuka, Takeshi Kasama, Jun Uzawa, Yoko Ohashi, Yasus hi Ono and Yoshio Hirabayashi. (2001). A new phosphoglycerolipid, "phosphatidyl g lucose, found in human cord red cells, by multi-reactive monoclonal anti — I cold agg lutinin, mAb GL— 1 / GL— 2. FEBS Lett. 497, 141-147.
  • Non-Patent Document 3 Yasuko Nagatsuka, Miki Hara- Yokoyama, Takeshi Kasama, Masataka Takekoshi, Fumiko Maeda, Seiji Ihara, Shigeyoshi Fujiwara, Eriko Ohshima, Kumiko Ishii, Toshihide Kobayashi, Kazulumi bhimizu and Yoshio Hirabayashi. (2003) Carbo hydrate-dependent Signaling from the phosphatidyl glucoside based microdomain ind uces differentiation of HL60 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.100, 7454—7459.
  • the present invention solves the problem of isolating phosphatidyldarcoside and its acetylated glycolipid, which are physiologically active glycolipids, from rat embryonic brain, determining their structures, and further evaluating their physiological activities. It should be a problem.
  • the present inventors have succeeded in obtaining a preparation of phosphatidyl darcoside (PtdGlc) that has been purified to a single component of brain power in the rat embryonic period, and has completely isolated PtdGlc derived from the isolated central nervous system.
  • the structure was determined. That is, in the present invention, phosphatidyl darcoside (PtdGlc) and its derivative 6-0-acetyl phosphatidyl darcoside (6-O-Ac-PtdGlc), which are novel bioactive glycolipids, are isolated from rat fetal brain. The structure was clarified (Fig. 1).
  • the mouse monoclonal antibody DIM21 that specifically recognizes PtdGlc specifically stains radial glia in the developmental process of the brain, thus identifying the glycolipid as a marker molecule for radial glia.
  • PtdGlc and its phospholipase A2 digestion product Lyso-P tdGlc have activities such as degenerating the growth cone at the tip of the axon of mouse dorsal root ganglia (DRG) -euron.
  • DRG dorsal root ganglia
  • glycolipid represented by any of the following formulas (1) to (4).
  • the medicament of the present invention is a regulator of nerve axon migration.
  • a method for detecting radial glia comprising detecting a glycolipid represented by the following formula (1) or (2).
  • glycolipid of the present invention is represented by any of the following formulas (1) to (4).
  • glyce mouth type phospholipid contains an unsaturated fatty acid at the 2-position of the glycerol skeleton, and therefore it is not considered to be a member of a raft-like microdomain with a low melting point.
  • DA Brown and E. London 1998. Structure and origin of ordered lipid domains in biological membranes. J. Memb. Biol. 164, 103-114; Ostermeyer AG, Beckrich BT, Iverson KA, Grove K. E and Brown D. A (1999). Glycos phingolipids are not essential for formation of detergent-resistant membrane rafts in melanoma cells. J. Biol. Chem. 274, 34459-34466.).
  • the newly isolated glyce oral glycolipid according to the present invention contains only a saturated fatty acid of C18: 0 at the 1st position and C20: 0 at the 2nd position as a constituent fatty acid, and contains an unsaturated fatty acid.
  • This unity of fatty acids and the presence of C20: 0 are entirely new and meet the requirements for forming raft-like microdomains. That is, the glycolipid represented by the formula (1) of the present invention has a fatty acid fatty acid composed only of C18: 0 / C20: 0! /, Unity, and the presence of saturated fatty acid C20: 0. It is characterized by.
  • the glycolipid represented by the formula (2) of the present invention is characterized in that the 6-position of glucose is modified with an acetyl group.
  • the PtdGlc of the present invention has not been known to exist in the mammalian brain nervous system. The reason is that it is a fetal antigen, it is a minor component in adults, its solubility in various solvents differs due to its unique fatty acid composition, and the main component phosphatidylcholine The behavior on TLC is very similar.
  • the inventors succeeded in isolating and purifying for the first time by devising a device not found in conventional phospholipids.
  • the glycolipid represented by the above formula (1) or (2) of the present invention is the brain immediately before birth (for example, E21, 22 brain immediately before birth) as described in Example 1 of the present specification.
  • PLC phosphilipase C
  • the non-adsorbed fraction was washed with 5 times the column volume of C: M 4: 1 (PB-1 fraction), and the column was washed with the same volume of C: M 2: 1 (PB-1 fraction). After that, elute the lipid adsorbed to PBA with 5 volumes of C: M: W 5: 5: 1 (PB-2 fraction).
  • PtdGlc which is a glycolipid represented by the formula (1) of the present invention, is eluted in the PB-2 fraction.
  • PtdGlc The PB-2 fraction contained is distilled off under nitrogen gas and injected onto a Q-sepharose column equilibrated with C: M: W 30: 60: 8.
  • the Q Sepharose eluate was distilled off with nitrogen gas, then Folch partitioned to desalinate, dissolved in C: M 2: 1, and injected into a Sensing one-pack acyl column attached to the HPLC system. Wash with C: M 9: 1 for 1 minute, then C: M 9: 1 force C: M 7: 3, elute at 90 min gradient, lml / min flow rate. Monitor the eluted fraction by TLC. If the state of separation is good, a single spot can be obtained at this stage. Two types of DIM21-reactive 'olcinol-positive spots are obtained.
  • PtdGlc that is, the glycolipid represented by the formula (1)
  • PtdGlc is eluted at a position close to Ptdlns, and the TLC mobility is slightly higher than that of PtdGlc.
  • PtdGlc is acetylated at the 6-position of glucose (ie, glycolipid represented by formula (2)).
  • the glycolipid represented by the above formula (3) or (4) according to the present invention is obtained by converting the glycolipid represented by the formula (1) or (2) into a phospholipase A2 derived from venom, snake venom or phospholipase A2 derived from snake venom. It can be prepared by digestion. By purifying the digested product with a Yiaguchi bead column or the like, the glycolipid represented by the formula (3) or (4) can be obtained.
  • the glycolipid represented by any one of formulas (1) to (4) of the present invention can be used as a medicine. Specifically, the glycolipid represented by any one of the formulas (1) to (4) of the present invention can be used as a control agent for nerve axon migration.
  • the glycolipid of the present invention when used as a medicine, the above glycolipid can be used alone. It is preferable to prepare and use a pharmaceutical composition containing the above glycolipid.
  • the glycolipid of the present invention can be formulated in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the pharmaceutical composition containing the glycolipid of the present invention is administered orally or parenterally (for example, intravenously). It can be administered by internal injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection or intraperitoneal injection.
  • the pharmaceutical composition can be made into an appropriate dosage form depending on the administration route selected. Specific examples of the dosage form include tablets, powders, granules, capsules, syrups, elixirs, suspensions, emulsions, suppositories, injections, inhalants, and aerosols. However, it is not limited to these.
  • Tablets, powders, granules, and capsules can be formulated by formulating the glycolipid of the present invention together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers such as ratatoses, mannitol, corn starch or potato starch; binders such as crystalline cellulose, cellulose derivatives, corn starch or gelatin; tablets such as corn starch, potato starch or carboxymethylcellulose sodium Disintegrants: Lubricants such as talc or magnesium stearate can be used, and it is possible to add sardines, diluents, buffers, wetting agents, preservatives or flavoring agents as appropriate. .
  • the syrup, elixir and suspension'emulsion can be prepared using the glycolipid of the present invention and a pharmaceutically acceptable solvent such as sterile water for injection or physiological saline.
  • a pharmaceutically acceptable solvent such as sterile water for injection or physiological saline.
  • the glycolipid of the present invention can also be formulated as a preparation for inhalation in the form of a liquid or a fine powder. Inhalation preparations can be supplemented with a propellant and, if necessary, auxiliary agents such as an infiltrating agent.
  • the glycolipid of the present invention is dissolved or suspended in a solvent such as vegetable oil, synthetic succinic glyceride, higher fatty acid ester or propylene glycol.
  • a solvent such as vegetable oil, synthetic succinic glyceride, higher fatty acid ester or propylene glycol.
  • an injectable preparation can be prepared and administered by adding additives such as a solubilizer, an osmotic pressure regulator, an emulsifier, a stabilizer and a preservative as necessary.
  • the dosage of the glycolipid of the present invention can be appropriately determined according to the patient's age, sex, weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, and the like.
  • 10 / ⁇ to 100111 8 713 ⁇ 4 body weight 7 days Preferably, the force that can be set to about g to 50 mg Zkg body weight Z days is not limited to this range.
  • the antibody specifically recognizing the glycolipid represented by the formula (1) or (2) may be a polyclonal antibody, or a monoclonal antibody may be used to produce the antibody.
  • HL60 cells were stimulated with rGL-7, 24 hours later, the cells were lysed in Tris buffer containing 1% Triton X-100, and sucrose density
  • a raft-like microdomain that has been levitated and isolated by gradient centrifugation can be used.
  • a polyclonal antibody can be obtained by immunizing a mammal with the raft-like microdomain as an antigen, collecting blood from the mammal, and separating and purifying the antibody from the collected blood. it can.
  • mammals such as mice, mice, mussels, guinea pigs, chickens, rats, rabbits, nu, goats, hidges, and ushi can be immunized.
  • a conventional immunization method known to those skilled in the art can be used, for example, by administering an antigen one or more times.
  • Antigen administration can be performed, for example, 2 to 3 times at intervals of 7 to 30 days, particularly 12 to 16 days.
  • the dosage should be about 0.05 to 2 mg of antigen per administration, for example.
  • subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, etc. can be selected as appropriate, but the injection should be intravenous, intraperitoneal or subdermal. Is preferably administered.
  • the antigen is usually used in an appropriate buffer, such as complete Freund's adjuvant, RAS (MPL (Monophosphoryl Lipid A) + TDM (Synthetic Trehalose Dicorynomycolate) + CWS (Cell Wall Skeleton) adjuvant system), aluminum hydroxide, etc.
  • RAS MPL (Monophosphoryl Lipid A) + TDM (Synthetic Trehalose Dicorynomycolate) + CWS (Cell Wall Skeleton) adjuvant system
  • an adjuvant means a substance that, when administered together with an antigen, nonspecifically enhances the immune response to the antigen.
  • a small amount of the mammal's serum can be sampled from the ear vein or the like, and the antibody titer can be measured. If the antibody titer rises, administer the antigen as many times as necessary. For example, booster immunization can be performed using an antigen of ⁇ / zg ⁇ : LOOO / zg.
  • an antigen immobilized on Affigel or the like can be used as the affinity carrier.
  • the blood is separated by a conventional method such as centrifugation, precipitation using ammonium sulfate or polyethylene glycol, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chromatography such as affinity chromatography, and the like.
  • a polyclonal antibody can be obtained as a polyclonal antiserum.
  • Serum may inactivate the complement system, for example by treatment at 56 ° C for 30 minutes.
  • the monoclonal antibody can be prepared, for example, using a hyperidoma obtained by cell fusion between an antibody-producing cell and a myeloma cell line.
  • Hypridoma producing a monoclonal antibody can be obtained by the following cell fusion method.
  • antibody-producing cells spleen cells, lymph node cells, B lymphocytes and the like from immunized animals are used.
  • antigen the same antigen as in the case of the polyclonal antibody can be used.
  • animals to be immunized mice, rats and the like are used, and administration of antigen to these animals is performed according to a conventional method.
  • an animal is prepared by preparing a suspension or emulsion of an adjuvant such as complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant and an antigen, and administering this suspension several times into the vein, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, etc. of the animal. Immunize.
  • Examples of myeloma cell lines used for cell fusion include the P3X63Ag8, P3U1 and Sp2Z0 strains in mice.
  • a fusion promoter such as polyethylene glycol or Sendai virus is used.
  • hypoxanthine'aminobuterin-thymidine (HAT) medium can be used according to a conventional method.
  • Cells and hybridomas obtained by cell fusion can be cloned by the limiting dilution method or the like.
  • screening by enzyme immunoassay or the like can obtain an Itoda cyst strain producing a monoclonal antibody capable of specifically recognizing the glycolipid of the present invention.
  • the hybridoma is cultured by a usual cell culture method or ascites formation method, and the monoclonal antibody is then cultured from the culture supernatant or ascites. If you refine it. Purification of the monoclonal antibody from the culture supernatant or ascites can be performed by a conventional method. For example, ammonium sulfate fractionation, gel filtration, ion exchange chromatography, and affinity chromatography can be used in appropriate combinations.
  • the detection or measurement of the glycolipid represented by the formula (1) or (2) is performed by immunostaining and staining, ELISA, Western plot, immunoprecipitation, slot.
  • dot blot assay, radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay, avidin-piotin or immunoassay using a streptavidin-piotin system, etc. are well known to those skilled in the art. .
  • Brain power PtdGlc was isolated and purified by fetal, postnatal and adult rat brain power. In postnatal and adult brains, the PtdGlc content was extremely reduced and the lipid composition was complicated!
  • the lipid thread is relatively simple and suitable as a starting material for purification.
  • DIM21 that detects PtdGlc
  • the content per unit weight is the highest in brain tissue from E14, and decreases in E18 and E19. Content increased again at E21, 22 just before birth The tendency to do was seen. Since the actual amount of brain obtained just before birth was the largest, PtdGlc was also isolated from E21 and 22 brain forces just before birth, and the properties and structures were analyzed.
  • Rats on gestation day 21 or 22 were laparotomized under ether anesthesia, the fetus was removed, the head was opened immediately, the brain was removed and snap frozen in liquid nitrogen. This was freeze-dried, extracted with C: M 2: 1, C: M: W 5: 8: 3 using polytron, evaporated with an evaporator, and dried to remove phosphatidylinositol (PI). It was treated overnight with 500 mU of PI-specific phosphilipase C (PLC) per lg. C: M 2: 1 was added to the reaction solution 3001 at a ratio of 1.2 ml, and an organic layer was obtained by Folch distribution. The aqueous layer was partitioned again by adding C: M 2: 1 and the resulting organic layer was combined with the previous one.
  • PLC PI-specific phosphilipase C
  • the PB-2 fraction containing PtdGlc is evaporated under nitrogen gas and injected onto a Q-Sepharose column (10 mm (8 cm)) equilibrated with C: M: W 30: 60: 8.
  • C: M: W 30: 60: 8 As in the case of PBA, insoluble matter may be suspended well and the entire volume is injected into the column as much as possible C: M: W 30: 60: 8, wash away the non-adsorbed fraction, and then add 0.1M acetic acid in water.
  • PtdGlc is eluted with C: M: W containing sodium
  • PtdGlc, Ptdlns (remaining after cutting with PIPLC) and Gandarioside GM3 are eluted with C: M: W containing 0.1M sodium acetate in water.
  • Phosphatidylserine (PS) is eluted with C: M: W containing NaOAc, and the fraction containing PtdGlc is collected while monitoring the elution fraction by thin layer chromatography (TLC) -immuno staining.
  • TLC thin layer chromatography
  • PtdGlc-X was the one in which the 6th position of glucose in PtdGlc was acetylenic.
  • Fig. 7 shows the TLC patterns of both substances. Both can show sugar and phosphorus coloring (not shown) Phosphorous coloring is weaker than Ptdlns and PC 6-O-Ac-PtdGlc is particularly weak
  • Example 3 PtdGlc, 6-0-Ac- PtdGlc as a radial glial marker
  • the obtained DIM fraction (1 x 2 x 10 8 cells, 6) was diluted with Tris-buffered saline to lower the sucrose density, and then ultracentrifuged at 50,000 rpm for 1 hour. Precipitated, resuspended in 400 1 buffer, dispensed 100 1 aliquots, and stored frozen.
  • RIBI adjuvant system three BALB / C mice were injected intraperitoneally with 100 1 DIM stock at a time, divided into 3 portions every 2.5 weeks. One month later, final immunization was carried out without adjuvant.
  • Hypridoma is supplemented with HAT (Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine) growth medium with 10% Hypridor Macroeung Factor (Igen, Gaithersburg, MD) at 37 ° C, 10% CO. Maintained.
  • Hypridoma culture supernatant uses DIM fraction as antigen
  • Monoclonal antibody DIM21 reacts with HL60-derived crude PtdGlc fraction on TLC. This immunoreactive spot was transferred to a PVDF membrane, extracted, methanolized, trimethylsilylated, and analyzed by GC / MS to detect glucose as a monosaccharide. In addition, it reacted with the molybdenum dend reagent which detects phosphorus on TLC and was shown to react with “phospholipid containing glucose”. However, no reactivity was observed in Western blotting using the DIM fraction protein as an antigen.
  • DIM21 reacts not only with PtdGlc but also with phosphatidylinositol (Ptdlns) and phosphatidylglycerol (PtdGly) on TLC, but reacts best with PtdGlc at the same antigen concentration (quantitative in P).
  • Ptdlns phosphatidylinositol
  • PtdGly phosphatidylglycerol
  • PI increases from the analysis of the synthetic gene after birth. In contrast, this antigen decreases on the contrary In contrast, PI is present in many tissues, but the possibility of PI can be ruled out considering that this glycolipid is highly cell-specific. Therefore, PtdGlc responds to DIM21 in brain slices.
  • Example 3b Properties of PtdGlc positive cells
  • Example 3 also suggested a strong possibility that PtdGlc-positive cells in the brain were radial glia. Recently, radial glia has been shown to be neural stem cells or function as neural progenitor cells (Nature 414, 112-117, 2001; Nature Reviews Neuro science 2, 287-293, 2001). In order to clarify the properties of PtdGlc-positive cells, the following studies were further advanced.
  • Embryo 14 The telencephalon was removed from the mouse fetus on the fifth day, and the brain tissue was dispersed in 900 ⁇ l of Hank's balanced salt solution (HBSS) by pipetting five or six times. The resulting cell dispersion was collected and centrifuged at 1300 rpm for 3 minutes at room temperature to sediment the cells. The cell pellet obtained here was washed once with HBSS and passed through a 40 ⁇ m nylon cell strainer (BD Falcon TM REF 352340). The volume of the cell dispersion was adjusted to 15 ml, and the cells were stained with about 10 g / ml Alexa 488-labeled DIM21 antibody for 2 hours on ice.
  • HBSS Hank's balanced salt solution
  • BSA-HBSS BSA-containing HBSS
  • DIM21-positive cells are immediately transferred to D-MEM / F 12 mixed medium supplemented with EGF (20 ng / ml) and (FGF) 10 ng / ml and cultured for several days.
  • EGF 20 ng / ml
  • FGF 10 ng / ml
  • neurospheres (nerve mass) was able to be formed.
  • the cells forming the neurosphere were transplanted to a new differentiation medium (purchased from Stem Cell Technologies Inc. Vancouver, BC) containing EGF and FGF, and covered for several days. Differentiated with.
  • glial cell acidic protein is a marker for astrocytes
  • type III j8 tubulin-1 is a neuron.
  • Cells were stained with galactocerebroside (Ga :) as an oligodendrocyte marker to confirm the presence of positive cells.
  • Ga : galactocerebroside
  • FIG. 11 the appearance of GFAP positive cells (astrocytes), Tujl positive cells (neurons), and GC positive cells (oligodend mouth site) was observed, and PtdGlc positive cells were pluripotent It was shown to be a neural stem cell with
  • PtdGlc has an essential function for neural stem cells and that Pt dGlc can be used as a promising marker for neural stem cells or neural progenitor cells.
  • Example 4 Axon growth cone degeneration-inducing activity
  • the PtdGlc represented by the formula (1) of the present invention was digested with bee venom-derived phospholipase A2, and this denatured product was purified with a bead neck bead column to obtain Lyso-PtdGlc (LPG).
  • LPG Lyso-PtdGlc
  • the PtdGlc fraction obtained using an aqua acyl column was dried under a nitrogen stream, dissolved in 20m MTris-HCl buffer solution (pH 7.6) to a concentration of 1mg / ml, and derived from bee venom that had been stored frozen.
  • Phospholipase A2 251
  • Triton X-100 25 ⁇ 1
  • This LPG had the activity of degenerating the growth cone of mouse dorsal root ganglion-euron at low concentrations (Fig. 9). That is, dorsal root ganglia were isolated from embryonic day 12.5 mouse fetuses and cultured overnight in glass bottom dishes coated with 100 ⁇ g / ml poly-L-lysine and 20 ⁇ g / ml laminin. Stretch the cord. The next day, the medium was changed to serum-free DMEM, starved for 3 hours, and added to LPG 0, 10, 100 / z M. After 30 minutes, the growth cone was observed and counted, and lysophosphatidine, a positive control, was added.
  • LPA lysophosphatidic acid
  • S1P sphingosine-1-phosphate
  • GPCRs coupled receptors
  • Example 5 In vitro growth cone turning a ssay
  • LPG PtdGlc or its metabolite lysosome
  • DRG Dorsal root ganglia
  • DRG sensation-Euron was released into individual cells
  • NGF and N2 were added.
  • the cells were cultured at 37 ° C in L15 medium. Then, with respect to the growing cone at the tip of the axon, add a concentration gradient of PtdGlc or LPG with the tip of the pipette at a position of 45 ° and 100 ° under the microscope, and observe the response of the axon. did.
  • glycolipid of the present invention is a novel bioactive lipid molecule that controls the elongation of nerve axons.
  • the phosphatidyl darcoside and its acetylenic glycolipid of the present invention is a novel bioactive glycolipid isolated from the brain.
  • the phosphatidyl darcoside of the present invention and its acetylenic glycolipid are useful as marker molecules for radial glia, and radial glia can be detected by detecting these.
  • the phosphatidyl darcoside of the present invention, its acetylenic glycolipid, and digested products obtained by digesting them with phospholipase can control the movement of nerve axons, such as a regulator of nerve axon movement It is useful as a medicine.
  • FIG. 1 shows the chemical structure of phosphatidyldarcoside isolated from rat embryonic brain of day 21 and 6-0-acetyl-phosphatidylglucoside modified with a acetyl group at the 6-position of glucose. .
  • Vector analysis, electrospray ionization accurate mass spectrometry, and product ounce vector analysis by MS-MS were used to determine the complete structure.
  • FIG. 2 shows the elution pattern of DIM 21 antigen from phosphatidyldarcoside Q-Sepharose (A) and Sensyu Paquaquail column (B). Embryonal rat fetus on the 21st day The brain was immediately put into liquid nitrogen after excision, snap frozen, and lyophilized. This was extracted with a mixture of chloroform (C): methanol (M) (2: 1) and C: M: water (W) (5: 8: 3), and the solvent was removed to remove PIPLC (500 mU).
  • C chloroform
  • M methanol
  • W water
  • phosphatidylinositol (Ptdlns) was cut off by PIPLC.
  • PIPLC phosphatidylinositol
  • Fractions were similarly monitored by TLC and TLC-Immunostaining. By this chromatography, a purified sample showing a single spot on TLC could be obtained (Fig. 7).
  • FIG. 3 shows gas chromatographic analysis of constituent sugars and fatty acids.
  • Methanol was added and the bottle was sealed and subjected to overnight methanolysis at 80 ° C. After cooling to room temperature, it was partitioned with hexane, and the hexane layer was subjected to fatty acid analysis.
  • the methanol layer (including methyldaricoside) was distilled off with a vacuum pump in a desiccator after the solvent was distilled off and dried well.
  • FIG. 4 shows the one-dimensional proton NMR ⁇ vectors of Fr. No. 29 and No. 37.
  • the obtained fraction containing PG and PGx was evaporated, dissolved in deuterated methanol 1001, and injected into a 3 mm NMR tube (SHIGEMI, Tokyo) washed with deuterated methanol to a depth of 4 cm. .
  • One-dimensional proton NMR vector was measured with a magnetic resonance absorption measuring device (JEOL, JNM-ECA600).
  • JEOL, JNM-ECA600 magnetic resonance absorption measuring device
  • FIG. 5 shows proton-P correlations of Fr. No. 29 and No. 37. In both samples, P was correlated with protons at the 1st position in Darcos and the 3rd position in glycerol.
  • FIG. 6 shows accurate mass spectrometry of PG and PGx.
  • FIG. 7 shows a TLC developed image of PtdGlc, 6-O-Ac-PtdGlc using acidic, neutral and alkaline developing solvents.
  • PtdGlc and 6-O-Ac-PtdGlc are equivalent to 1 nanomolar (calculated as P) LacCer, CSE as glycosphingolipid, applied to HPTLC with PI and PC as phospholipid,
  • Lane 1 Lane 1 (LacCer), Lane 2 (CSE), Lane 3 (6-0-Ac-PtdGlc (PGXl)), Lane 4 (PtdGlc (PGX2)), Lane 5 (Ptdlns), Lane 6 (PC), Developing solvent System (I) C: M: 2.5N NH OH (60: 35: 8), (II) C: M: W (60: 35: 8), (III) C: A: M: HOAc: W ( 5: 2: 1: 1:
  • FIG. 8 shows the results showing that PtdGlc is a cell surface marker molecule for radial glia.
  • Embryonic 14.5 day mouse embryonic brains were fixed by immersing in PBS containing 4% paraformaldehyde for 3 days and sliced into 40 ⁇ m with a microslicer.
  • This antibody is divided into mAb DIM 21 (10 ⁇ g / ml) and radial glia marker BLBP or GLAST antibody (guinea pig anti-BLBP IgG 1 ⁇ g / ml, guinea pig anti-GLAST IgG 0.5 ⁇ g / ml Hokkaido University) Double-stained with 'Professor Masahiko Watanabe) and allowed to float for one day. After washing with PBS (2 X 5 min., 1 x 15 min.), Fluorescent secondary antibodies (Alexa 488 anti-mouse IgM, Alexa 568 anti-guinea pig IgG 2 ⁇ g / ml,
  • Fig. 9 shows the results showing that Lyso-PtdGlc degenerates the growth cone of mouse DRG-euron.
  • Embryo Remove spinal cords from 12.5 day mouse embryos, isolate dorsal root ganglia, and coat with laminin (20 ⁇ g / ml) at 37 ° C for 3 hours in a glass bottom dish with 10% FCS and 100 ng / ml NGF Axons were elongated by overnight culture in added DMEM medium. The next day, replace this with starvation medium without NGF and serum, and incubate for 3 hours, add lipid to a final concentration of 100 and 10 M, react at 37 ° C for 30 minutes, and add 20% sucrose. It was fixed with 3.7% formalin in PBS, and the growth cone was counted around the DRG and the degeneracy rate was calculated.
  • FIG. 10 shows the structure of bioactive lipid.
  • A Lysophosphatidic acid
  • B Sphingosine 1-phosphate
  • C Lysophosphatidyl darcoside and possible bioactive lipids
  • D Lysophosphatidyl (-6-0-acetyl) -darcoside
  • FIG. 11 is a drawing showing how PtdGlc positive cells form -eurosphere and further differentiate.
  • Figure 12 is a drawing showing a repulsive response to the growth cone force SLPG of the axon

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Description

明 細 書
生理活性を有する糖脂質
技術分野
[0001] 本発明は、新規な生理活性糖脂質であるホスファチジルダルコシド及びそのァセチ ル化糖脂質、並びにそれらの利用に関する。
背景技術
[0002] 血液型抗原抗体系の一つ Ii系に関わる、胎児性抗原 i-糖鎖を認識する抗 i抗体は 一般にィムノグロブリンの VH-4ファミリーに属する自然自己抗体で、広い交叉反応性 が報告されている。本発明者らは先に、ヒト抗 i単クローン抗体 mAb GL-1, GL-2の交 叉反応性力 臍帯血球にグルコースを唯一の糖として含むホスホグリセロリピドの存 在を見出した (非特許文献 1及び非特許文献 2)。
[0003] ところで、前骨髄球系白血病細胞株 HL60は様々な刺激により顆粒球およびモノサ イトへと分ィ匕していくことが知られている。本発明者らは、この抗体を組み換えて 1価 の Fab抗体 rGL-7とし、これにより HL60細胞を刺激するとこのリピドを介して HL60細胞 は顆粒球分ィ匕へのシグナルを引き起こすことを見出した。この現象はホスファチジル ダルコシドを含む従来報告されていなカゝつた新たなラフト様膜マイクロドメインが関与 している (非特許文献 3)。しかしながら、このホスファチジルダルコシドについては、こ れまでの所、直接完全構造を決定できるほど高純度で一定量の標品としては得られ ていなかった。
[0004] 非特干文献 1： Yasuko Nagatsu a, Shinobu Watarai, Tatsuji Yasuda, Hiaeyoshi Higas hi, Tatsuya Yamagata and Yasushi Ono (1995). Production of human monoclonal anti bodies to i blood group by EBV— induced transformation. Possible presence of a new glycolipia in cord red cell membranes and human hematopoietic cell lines. Immunol. Lett. 46, 93-100.
非特許文献 2 : Yasuko Nagatsuka, Takeshi Kasama, Jun Uzawa, Yoko Ohashi, Yasus hi Ono and Yoshio Hirabayashi. (2001). A new phosphoglycerolipid, "phosphatidyl g lucose , found in human cord red cells, by multi-reactive monoclonal anti— i cold agg lutinin, mAb GL— 1/GL— 2. FEBS Lett. 497, 141-147.
非特許文献 3 : Yasuko Nagatsuka, Miki Hara- Yokoyama, Takeshi Kasama, Masataka Takekoshi, Fumiko Maeda, Seiji Ihara, Shigeyoshi Fujiwara, Eriko Ohshima, Kumiko Ishii, Toshihide Kobayashi, Kazulumi bhimizu and Yoshio Hirabayashi. (2003) Carbo hydrate-dependent signaling from the phosphatidyl glucoside based microdomain ind uces differentiation of HL60 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.100, 7454—7459. 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、ラット胎生期の脳から生理活性糖脂質であるホスファチジルダルコシド 及びそのァセチル化糖脂質を単離し、その構造を決定し、さらにその生理活性を評 価することを解決すべき課題とした。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは今回、ラット胎生期の脳力 単一成分にまで精製したホスファチジル ダルコシド（PtdGlc)の標品を得ることに成功し、単離された中枢神経系由来 PtdGlcの 完全な構造を決定した。即ち、本発明においては、ラット胎児脳から新規な生理活性 糖脂質であるホスファチジルダルコシド (PtdGlc)及びその誘導体 6-0-ァセチルホスフ ァチジルダルコシド (6-O-Ac-PtdGlc)が単離され、その構造が明らかにされた (図 1)。 また、 PtdGlcを特異的に認識するマウス単クローン抗体 DIM21は、脳の発生過程にあ る放射状グリアを特異的に染色することから、本糖脂質は、放射状グリアのマーカー 分子であると同定された。さらに、 PtdGlc及びそのホスホリパーゼ A2消化産物 Lyso-P tdGlcは、マウス後根神経節 (DRG)-ユーロンの軸索先端の成長円錐を縮退させるな どの活性を有することから、本糖脂質は、超微量で神経軸索移動を制御する生理活 性脂質であることが判明した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである
[0007] 即ち、本発明によれば、下記の式（1)から (4)の何れかで表される糖脂質が提供さ れる。
[化 1]
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000006_0001
[0009] 好ましくは、本発明の医薬は、神経軸索移動の制御剤である。
[0010] 本発明のさらに別の側面によれば、下記の式（1)又は（2)で表される糖脂質を検出 することを含む、放射状グリアを検出する方法が提供される。
[化 9]
Figure imgf000006_0002
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
[0012] (1)本発明のホスファチジルダルコシド
本発明の糖脂質は、下記の式（1)から (4)の何れかで表されることを特徴とする。
[化 11]
Figure imgf000006_0003
Figure imgf000007_0001
[化 13]
Figure imgf000007_0002
[0013] 従来、グリセ口型のリン脂質はグリセロール骨格の 2位に不飽和脂肪酸を含むもの が大半であり、このため融点が低ぐラフト様マイクロドメインの構成員にはならないと 考 られてい 7こ (D. A. Brown and E. London (1998). Structure and origin of ordered lipid domains in biological membranes. J. Memb. Biol. 164, 103-114；及ひ Ostermey er A. G., Beckrich B. T., Iverson K. A., Grove K. E and Brown D. Aズ 1999). Glycos phingolipids are not essential for formation of detergent-resistant membrane rafts in melanoma cells. J. Biol. Chem. 274, 34459-34466.)。し力し、今回、本発明により新た に単離されたグリセ口糖脂質は構成脂肪酸として 1位に C18:0、 2位に C20:0の飽和脂 肪酸のみを含み、不飽和脂肪酸は含んでいない。この構成脂肪酸の単一性と C20:0 の存在はまったく新規のものであり、ラフト様のマイクロドメインを形成する必要条件を みたすものである。即ち、本発明の式 (1)で表される糖脂質は、構成脂肪酸脂肪酸 が C18:0/C20:0のみで構成されると!/、う単一性、並びに飽和脂肪酸 C20:0の存在を 特徴とする。また、本発明の式（2)で表される糖脂質は、グルコースの 6位がァセチ ル基により修飾されて ヽることを特徴とする。
[0014] また、 rGL-7刺激 HL60細胞のラフト様マイクロドメインを調べて 、る過程で、本発明 者らはここにホスファチジルダルコシドが動員されることを見出した。そこで、 2 X 108 の HL60細胞を 200 μ g rGL-7で刺激して 24時間後、細胞を l%Triton X-100を含む Tris緩衝液中でリシスさせ、ショ糖密度勾配遠心法でラフト様マイクロドメインを浮上 させて単離し、これを免疫原として単クローン抗体 DIM21を作製した。この単クローン 抗体 DIM21を使うことにより、マウス中枢神経系における PtdGlcの発現はステージ及 び細胞種特異的で、神経幹細胞のひとつと考えられて 、るラジアル (放射状)グリア に強力に発現していることが判明した。以上の結果から、 PtdGlcは放射状グリアの新 しい細胞表面マーカー分子であると同定した。
[0015] 本発明の PtdGlcは極めてシンプルな構造であるにも拘らず、哺乳類の脳神経系に おいてその存在が知られていな力つた。その理由としては、胎児性の抗原であり、成 体では微量成分であること、特異な脂肪酸組成のため各種溶媒に対する溶解性が 通常のグリセ口リン脂質とは異なること、並びに主要成分のホスファチジルコリンと TL C上の挙動が極めて類似していることなどが挙げられる。本発明では、この糖脂質を 単離及び精製するに際し、従来のリン脂質には無い工夫を施すことによって、単離及 び精製することに初めて成功した。
[0016] 本発明の上記式（1)又は（2)で表される糖脂質は、本明細書の実施例 1に記載の 通り、出生直前の脳 (例えば、出生直前の E21, 22脳)から単離 ·精製することができる 。先ず、妊娠 21日または 22日めのラットを開腹し、胎仔を取り出し、直ちに開頭して脳 を摘出し液体窒素で瞬間凍結させる。これを凍結乾燥し、 C:M 2:1, C:M:W 5: 8: 3で ポリトロンを用いて抽出、エバポレーターにて溶媒留去後、ホスファチジルイノシトー ル (PI)を除く目的で PI特異的ホスフオリパーゼ C (PLC)で一昼夜処理する。反応液 3 00 1に 1.2mlの割合で C:M 2:1を加え、 Folch分配により有機層を得る。水層を再度 C ： M 2:1を加えて分配し、得られた有機層を先のものと合わせる。有機層を窒素ガス気 流下で溶媒を留去し、少量の C: M 2: 1に再び溶解して C: M 4:1で平衡ィ匕したフエ- ルポ口ネートァガロース（PBA)カラムに注入する。更に、ガラス容器に残った残渣を C:M 4:1を用いてカラムに洗い込む。非吸着画分をカラム容積の 5倍容の C: M 4: 1で 洗い流し (PB-1画分)、カラムと等容の C: M 2: 1でカラムを洗った (PB-1画分に合わせ る)のち、 PBAに吸着した脂質を 5倍容の C: M: W 5: 5: 1で溶出する (PB-2画分)。本 発明の式（1)で表される糖脂質である PtdGlcは、 PB-2画分に溶出される。 PtdGlcを 含む PB-2画分は窒素ガス下で溶媒を留去し、 C: M: W 30: 60: 8で平衡化した Q-セ ファロースカラム注入する。 C: M: W 30: 60: 8で非吸着画分を洗い流したのち， 水 に 0.1M酢酸ナトリウムを含む、 C: M: Wで PtdGlcを溶出する。水に 0.1M酢酸ナトリ ゥムを含む C: M: Wでは PtdGlc, PtdIns (PIPLCで切れ残ったもの），ガンダリオシド G M3が溶出され、 0.2M NaOAcを含む C:M:Wでホスファチジルセリン（PS)が溶出され る。溶出画分は、薄層クロマトグラフィー (TLC) -ィムノスティユングでモニターしなが ら、 PtdGlcを含む画分を集める。 Qセファロース溶出物は窒素ガスで溶媒を留去した のち、 Folch分配して脱塩し、 C:M 2:1に溶解して、 HPLCシステムに装着したセンシュ 一パックアクアシルカラムに注入し、 10分間 C:M 9: 1で洗ったのち C: M 9:1力 C: M 7:3, 90分のグラジェント、流速 lml/minで溶出する。溶出画分は TLCでモニターす る。分離の状態が良ければこの段階で単一のスポットが得られる。 DIM21反応性'ォ ルシノール陽性のスポットが 2種類得られる。このうち Ptdlnsに近い位置に溶出される ものが PtdGlc (即ち、式（1)で表される糖脂質)であり、これよりやや早く溶出され TLC の移動度が PtdGlcに比較しやや高いものは、 PtdGlcのグルコースの 6位がァセチル 化されたもの (即ち、式 (2)で表される糖脂質)である。
[0017] 本発明の上記式（3)または (4)で表される糖脂質は、式（1)または（2)で表される 糖脂質をノ、チ毒由来ホスホリパーゼ A2または蛇毒由来ホスホリパーゼ A2で消化す ること〖こよって調製することができる。この消化産物をィアト口ビーズカラムなどで精製 することによって式 (3)または (4)で表される糖脂質を取得することができる。
[0018] (2)本発明の医薬
本発明の式（1)から (4)の何れかで表される糖脂質は、医薬として用いることがで きる。具体的には、本発明の式（1)から (4)の何れかで表される糖脂質は、神経軸索 移動の制御剤として用いることができる。
[0019] 本発明の糖脂質を医薬として用いる場合、上記糖脂質を単独で用いることもできる 力 上記糖脂質を含む医薬組成物を調製して用いることが好ましい。医薬組成物に おいて、本発明の糖脂質は、薬学的に許容される担体または希釈剤等と組み合わせ て製剤化することができる。
[0020] 本発明の糖脂質を含む医薬組成物は、経口投与又は非経口投与 (例えば、静脈 内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射又は腹腔内注射など）により投与すること 力 Sできる。医薬組成物は、選択された投与経路に応じて、適切な剤形とすることがで きる。剤形の具体例としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキ シル剤、懸濁剤'乳剤、坐剤、注射剤、吸入剤、又はエアロゾルなどを挙げることがで きるが、これらに限定されるものではない。
[0021] 錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤は、本発明の糖脂質を薬学的に許容される担体 と共に処方することにより製剤化することができる。薬学的に許容される担体としては 、例えばラタトース、マン-トール、コーンスターチ又は馬鈴薯デンプンなどの担体； 結晶セルロース、セルロース誘導体、コーンスターチ又はゼラチンなどのバインダー； コーンスターチ、馬鈴薯デンプン又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの錠 剤崩壊剤；タルク又はステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤等を使用することがで き、さら〖こ、希釈剤、緩衝剤、浸潤剤、保存剤又はフレーバー剤等を適宜添加するこ とちでさる。
[0022] シロップ剤、エリキシル剤及び懸濁剤'乳剤には、本発明の糖脂質と、注射用滅菌 水又は生理食塩水などの薬学的に許容される溶媒を用いて調製することができる。 本発明の糖脂質は、液体又は微細粉末の形態で吸入用製剤として処方することもで きる。吸入用製剤には、噴霧剤と共に、必要に応じて浸潤性付与剤などの助剤を添 カロすることがでさる。
[0023] 本発明の医薬組成物を非経口投与する場合、本発明の糖脂質は、植物性油、合 成榭脂酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル又はプロピレングリコールなどの溶媒中 に溶解、懸濁又は乳化し、さらに、必要に応じて可溶化剤、浸透圧調節剤、乳化剤、 安定剤及び保存料などの添加剤を添加することにより注射用製剤を調製し、投与す ることがでさる。
[0024] 本発明の糖脂質の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与 方法など応じて適宜決定することができ、例えば、 10 /^〜100111871¾体重7日、 好ましくは g〜50mgZkg体重 Z日程度とすることができる力 この範囲に限定 されるものではない。
[0025] (3)本発明による放射状グリアの検出方法 以下の実施例 3に示した通り、本発明の糖脂質は、放射状グリアの細胞表面マーカ 一分子となり得ることから、本発明によれば、式（1)又は（2)で表される糖脂質を検出 することによって放射状グリアを検出することができる。式（1)又は（2)で表される糖 脂質を検出するためには、式 (1)又は (2)で表される糖脂質を特異的に認識する抗 体を用いて組織を染色して、式（1)又は（2)で表される糖脂質の存在を検出すれば よい。
[0026] 式（1)又は（2)で表される糖脂質を特異的に認識する抗体はポリクローナル抗体で もよいし、モノクローナル抗体でもよぐ抗体の作製は常法により行なうことができる。
[0027] 抗体を作製する際に使用する抗原としては、 HL60細胞を rGL-7で刺激して 24時間 後、細胞を l%Triton X-100を含む Tris緩衝液中でリシスさせ、ショ糖密度勾配遠心 法でラフト様マイクロドメインを浮上させて単離したものを使用することができる。例え ば、ポリクローナル抗体は、上記のラフト様マイクロドメインを抗原として哺乳動物を免 疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離'精製するこ とにより得ることができる。例えば、マウス、ノ、ムスター、モルモット、 -ヮトリ、ラット、ゥ サギ、ィヌ、ャギ、ヒッジ、ゥシ等の哺乳動物を免疫することができる。免疫感作の方 法としては、当業者に公知の通常の免疫感作の方法を用いて、例えば抗原を 1回以 上投与すること〖こより行うことができる。
[0028] 抗原投与は、例えば、 7から 30日、特に 12から 16日間隔で 2または 3回投与するこ とができる。投与量は 1回につき、例えば抗原約 0. 05から 2mg程度を目安とすること 力 Sできる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈 内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮 下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば 完全フロイントアジュバント、 RAS [MPL(Monophosphoryl Lipid A)+TDM(Synthetic T rehalose Dicorynomycolate)+CWS(Cell Wall Skeleton)アジュバントシステム〕 、水酸 化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して 用いることができる力 投与経路や条件等によっては、上記したアジュバントは使用し ない場合もある。ここでアジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異的にその抗 原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。 [0029] 免疫感作した哺乳動物を 0. 5から 4ヶ月間飼育した後、該哺乳動物の血清を耳静 脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定することができる。抗体価が上昇してきた ら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば ΙΟ /z g〜： LOOO /z gの抗 原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から 1〜2ヶ月後に免疫感作 した哺乳動物力 通常の方法により血液を採取して、 56°Cで 30分間処理して補体 系を不活性ィ匕した後、ァフィユティークロマトグラフィーで特異抗体の精製を行なう。 ァフィユティー担体としては、例えば、抗原を Affigelなどに固相化したものを用いるこ とができる。該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモ-ゥムまたはポリエチレングリコ ールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ 二ティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離.精製す ることにより、ポリクローナル抗血清として、ポリクローナル抗体を得ることができる。な お血清は、たとえば、 56°Cで 30分間処理することによって補体系を不活性ィ匕しても よい。
[0030] モノクローナル抗体は、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合に より得られるハイプリドーマを用いて作製することができる。モノクローナル抗体を産 生するハイプリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。
[0031] 抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、 Bリンパ球等 を使用する。抗原としては、ポリクローナル抗体の場合と同様の抗原を使用すること ができる。免疫される動物としてはマウス、ラット等が使用され、これらの動物への抗 原の投与は常法に従って行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインド アジュバントなどのアジュバントと抗原との懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動 物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免 疫化した動物力 抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞 とをそれ自体公知の方法（G.Kohler et al .,Nature,256 495(1975))により融合すること により、ハイプリドーマを作製することができる。
[0032] 細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスでは P3X63Ag8、 P 3U1株、 Sp2Z0株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレング リコール、センダイウィルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイプリドーマの 選抜にはヒポキサンチン'アミノブテリン ·チミジン (HAT)培地を常法に従つて使用す ることができる。細胞融合により得られたノ、イブリドーマは限界希釈法等によりクロー ニングすることができる。更に、酵素免疫測定法等によりスクリーニングを行なうことに より、本発明の糖脂質を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を産生す る糸田胞株を得ることがでさる。
[0033] このようにして得られたノヽイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造す るには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清 あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればょ 、。培養上清もしくは腹水か らのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画 、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィーなどを適 宜組み合わせて使用できる。
[0034] 本発明による放射状グリアを検出する方法における式（1)又は（2)で表される糖脂 質の検出又は測定は、免疫糸且織染色、 ELISA、ウェスタンプロット、免疫沈降、スロッ ト或いはドットブロットアツセィ、ラジオィムノアッセィ（RIA)、蛍光ィムノアツセィ、アビ ジン一ピオチン又はストレプトアビジン一ピオチン系を用いるィムノアッセィなどにより 行うことができ、これらの分析は当業者に周知の方法である。
[0035] 以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する力 本発明は実施例によって 限定されるものではない。
実施例
[0036] 実施例 1： PtdGlcの単離精製
(1)材料の選択
脳力 PtdGlcを単離精製するため胎児期、出生後および成体のラット脳力 精製を 試みた。出生後および成体脳では PtdGlc含量が極めて減少している上に、脂質組成 が複雑ィ匕して!/、て単離精製が極めて困難であった。
[0037] 胎児期のミエリン形成以前の脳では脂質糸且成が比較的単純であり、精製の出発物 質として適している。 PtdGlcを検出する単クローン抗体 DIM21 (DIM21の作製方法は 、実施例 3に記載した）による免疫染色の結果、単位重量あたりの含量は E14からの 脳組織力もっとも高ぐ E18, E19では減少し、出生直前の E21, 22で含量が再び増加 する傾向がみられた。出生直前の時期の脳が得られる実量が最も多いので、出生 直前の E21, 22脳力も PtdGlcを単離し、性状及び構造解析を行った。
[0038] (2)単離精製
妊娠 21日または 22日めのラットをエーテル麻酔下で開腹、胎仔を取り出し、直ちに 開頭して脳を摘出し液体窒素で瞬間凍結させた。これを凍結乾燥し、 C:M 2:1, C:M: W 5: 8: 3でポリトロンを用いて抽出、エバポレーターにて溶媒留去後、ホスファチジ ルイノシトール（PI)を除く目的で乾燥重 lgあたり 500 mUの PI特異的ホスフオリパーゼ C (PLC)で一昼夜処理した。反応液 300 1に 1.2mlの割合で C:M 2:1を加え、 Folch分 配により有機層を得た。水層を再度 C:M 2:1を加えて分配し、得られた有機層を先の ものと合わせた。
[0039] 有機層を窒素ガス気流下で溶媒を留去し、少量の ： M 2: 1に再び溶解して C: M 4:1で平衡化したフエ-ルポ口ネートァガロース（PBA)カラム（10 mm ( 6 cm )に注入 した。この時、不溶物が生じるが、音波およびボルテックスを用いてよく懸濁しできる だけ全量を注入するように心がけた。更に、ガラス容器に残った残渣を C:M 4:1を用 いてカラムに洗い込む。非吸着画分をカラム容積の 5倍容の C: M 4: 1で洗い流し (PB -1画分)、カラムと等容の C: M 2: 1でカラムを洗った (PB-1画分に合わせる)のち、 PB Aに吸着した脂質を 5倍容の C: M: W 5: 5: 1で溶出する (PB-2画分)。 PtdGlcは PB-2 画分に溶出される。 PBAカラムはメタノールでよく洗浄したのち、カラム上部に残った 不溶物などのよごれを取り除いて再利用できる。
[0040] PtdGlcを含む PB-2画分は窒素ガス下で溶媒を留去し、 C: M: W 30: 60: 8で平衡 化した Q-セファロースカラム（10 mm (8 cm)に注入する。 PBAの場合と同様、不溶物 があってもよく懸濁してできるだけ全量をカラムに注入する。 C: M: W 30: 60: 8で非 吸着画分を洗い流したのち， 水に 0.1M酢酸ナトリウムを含む、 C: M: Wで PtdGlcを 溶出する。水に 0.1M酢酸ナトリウムを含む C: M: Wでは PtdGlc, Ptdlns (PIPLCで切 れ残ったもの），ガンダリオシド GM3が溶出され、 0.2M NaOAcを含む C:M:Wでホスフ ァチジルセリン (PS)が溶出される。溶出画分は、薄層クロマトグラフィー (TLC) -ィムノ ステイニングでモニターしながら、 PtdGlcを含む画分を集める。
[0041] Qセファロース溶出物は窒素ガスで溶媒を留去したのち、 Folch分配して脱塩し、 lm 1の C:M 2:1に溶解して、 HPLCシステムに装着したセンシユーパックアクアシルカラム (6 mm ( 25 cm)に注入し、 10分間 C:M 9: 1で洗ったのち C: M 9:1力 C: M 7:3, 90 分のグラジェント、流速 lml/minで溶出する。溶出画分は TLCでモニターする。分離 の状態が良ければこの段階で単一のスポットが得られる（図 2)。 DIM21反応性'オル シノール陽性のスポットが 2種類得られた。このうち Ptdlnsに近い位置に溶出されるも のが PtdGlc,これよりやや早く溶出され TLCの移動度が PtdGlcに比較しやや高!、もの は PtdGlc-xとした。
[0042] 実施例 2： PtdGlcの性状およびィ匕学構造
得られた PtdGlcおよび PtdGlc-xをメタノリシス、へキサン分配後メタノール層を乾燥 TMSィ匕して GCにより単糖を分析したところ、両者ともグルコースのみを含んでいた。ま たへキサン層を同様に GC分析したところ、両者とも脂肪酸として C10:0, C20,0のみで 構成されていた（図 3)。
[0043] 両者を 600 MHzの1 H- NMR分析したところ、 PtdGlc画分ではグルコースのリングプロ トン、グリセロールのプロトンが明瞭に認められまたグルコースの 1位と 31Pの相関が確 認された（図 5)。これに対し、 PtdGlc-xではグルコースの 6位のプロトンが低磁場にシ フトしていて、 6位に何らかの置換基をもっていると予測された (図 4)。
[0044] また、両者の精密質量分析を行ったところ、 PtdGlc力 93.6 (C H 0 P)の分子ィォ
47 90 13
ンピークが得られ、また MS-MSによるフラグメントイオンとして脂肪酸 C18:0由来の 283 .2642, C20:0由来の 311.2955などが得られて GC分析 · NMR分析とまったく矛盾のな い結果だった。また PtdGlc-xは PtdGlcよりァセチル基に相当する 42質量単位大きい 、 935.6 (C H 0 P)の分子イオンピークが得られ、 MS-MSで得られるフラグメントィォ
49 92 14
ンは PtdGlcと同一だった (図 6)。すなわち、 PtdGlc- Xは PtdGlcのグルコースの 6位がァ セチノレイヒされたものだった。
[0045] 両物質の TLCのパターンを図 7に示す。どちらも糖及びリンの発色 (not shown)が見 られる力 リンの発色は Ptdlns、 PCに較べて弱ぐ 6-O-Ac-PtdGlcにおいて特に弱い
[0046] 実施例 3：放射状グリアマーカーとしての PtdGlc, 6-0- Ac- PtdGlc
(1)ラフト様マイクロドメインを認識する単クローン抗体 DIM 21の作製 2 X 108の HL60細胞を 200 μ g rGL-7で刺激して 24時間後、細胞を 1% Triton X-10 0を含む Tris緩衝液中でリシスさせ、ショ糖密度勾配遠心法でラフト様マイクロドメイン を浮上させて単離し、これを免疫原として単クローン抗体 DIM21を作製した。
[0047] 即ち、得られた DIM画分（1本 2 x 108 cell, 6本分)は Tris-緩衝生理食塩水で希釈し てショ糖密度を下げてから 50,000 rpm, 1時間超遠心して沈澱させ、 400 1の同緩衝 液に再懸濁して 100 1ずつ分注して凍結保存した。 RIBIアジュバント系を用い、 3匹 の BALB/Cマウス腹腔内に 1回に 100 1の DIMストックを用い、 2.5週おきに 3回に分 けて注入した。その 1ヶ月後、アジュバントフリーで最終免疫し、 3日後に脾臓を摘出し て脾臓細胞を採取、ミエローマ細胞株 X63-Ag8.653と融合させてノ、イブリドーマを作 製した。このハイプリドーマは HAT (ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン)加増殖培 地に 10%ハイプリドーマクローユングファクター（Igen, Gaithersburg, MD)を添カ卩して 3 7°C, 10% CO気流下で維持した。ハイプリドーマの培養上清は DIM画分を抗原とする
2
ELISAで活性をチェックしてスクリーニングし、陽性培養は限界希釈法にてサブクロー ユングした。得られた抗 DIM陽性クローンを HL60由来粗 PtdGlc画分を抗原とする TL C-ィムノスティユングで二次スクリーニングし、最終的に PtdGlcを認識する抗体産生 株 DIM21を得た。
[0048] 単クローン抗体 DIM21は HL60由来粗 PtdGlc画分と TLC上で反応する。このィムノリ アクティブスポットを PVDF膜に転写し、抽出、メタノーリシス、トリメチルシリルイ匕して G C/MS分析すると単糖としてグルコースを検出した。また TLC上でリンを検出するモリ ブデンブルー試薬と反応し、「グルコースを含むリン脂質」と反応していることが示され た。しかし、 DIM画分のタンパクを抗原とするウェスタン 'ブロッテイングでは反応性が 認められない。 DIM21は PtdGlcのみならず、 TLC上ではホスファチジルイノシトール（ Ptdlns)、ホスファチジルグリセロール (PtdGly)とも反応するが、同一抗原濃度（Pで定 量)では PtdGlcと最もよく反応する。（検出限界濃度は PtdGlcは 100 pmole内外である のに対し、 Ptdlns及び PtdGlyは 500pmole〜lnmole)また表面プラズモン共鳴でも同様 の結果が得られている。実際には組織抽出液では Ptdlns, PtdGlyの濃度の方が高い ので、 PIPLCを十分に働かせるなどの注意が必要だ力 DIM21による組織染色に関 しては PIは、合成遺伝子の解析から生後から増加するのに対し、本抗原は逆に減少 すること、 PIは組織あまねく存在するのに対し、この糖脂質は細胞特異性が高いこと を考えれば、 PIの可能性は否定できる。従って、脳切片で DIM21に反応しているもの は PtdGlcである。
[0049] (2)放射状グリアへの PtdGlc, 6-0- Ac- PtdGlcの局在
上記（1)で作製した単クローン抗体 DIM 21を用いて、胎生 12.5日力 生後 21日目 までのマウスの脳切片を染色すると既知の放射状グリアマーカー BLBPおよび GLAST による染色と重なる (図 8)。すなわち、 PtdGlcはラジアルグリアの細胞表面マーカー分 子の候補となることが示された。
[0050] 実施例 3b : PtdGlc陽性細胞の性質
(1)マウス胎児の終脳からの PtdGlc陽性細胞の単離
実施例 3の知見力も脳における PtdGlc陽性細胞がラジアルグリアである強い可能性 が示唆された。近年ラジアルグリアは神経幹細胞ある 、は神経前駆細胞として機能し ていることが明らかにされている（Nature 414, 112-117, 2001; Nature Reviews Neuro science 2, 287-293, 2001)。そこで、 PtdGlc陽性細胞の性質を明らかにすべくさらに 以下の検討を進めた。
[0051] 胎生 14. 5日目のマウス胎児から終脳を取り出し、 5、 6回ピペッティングを行うこと で脳組織を 900 μ 1の Hank's balanced salt solution (HBSS)中に分散させた。得られ た細胞分散液を集め、 1300rpmで 3分間、室温で遠心分離して細胞を沈降させた。 ここで得られた細胞のペレットを HBSSで一度洗浄し、 40 μ mのナイロンセルストレイ ナー（nylon cell strainer) (BD Falcon™ REF 352340)を通した。細胞分散液の体積を 15mlとなるように調製し、この細胞を、約 10 g/mlの Alexa 488標識 DIM21抗体により 氷上 2時間染色した。 次いで 0. 2%BSAを含む HBSS (BSA-HBSS)で一度洗浄した 後、 BSA-HBSS中に細胞を再度分散させて濾過をした後、 Epics Elite ESP (Beckma n-Colter)セルソータを用いて、 DIM21陽性の細胞を BSA-HBSS中に単離した。
[0052] (2)二ユーロスフエアの形成と、ニューロスフェア形成細胞の分ィ匕
DIM21陽性の細胞は直ちに EGF (20ng/ml)と (FGF)10ng/mlとを添カ卩した D- MEM/F 12混合培地に移して数日間培養し、その結果、ニューロスフェア (神経塊）を形成さ せることが出来た。 [0053] 次 、で、ニューロスフェアを形成する細胞を EGFと FGFとを含まな 、新し 、分化培 地 (Stem Cell Technologies Inc.Vancouver, BCより購入)に移植し、数日間カバースリ ップ上で分化させた。
[0054] これら細胞の分化を検出するために、グリア細胞酸性タンパク質 (glial cell acidic pr otein : GFAP)をァストロサイトのマーカーに、タイプ III j8チューブリン- 1 (Tuj-1)をニュ 一ロンのマーカーに、 galactocerebroside (Ga :)をオリゴデンドロサイトのマーカーとし て細胞の染色を行い、陽性細胞の有無を確認した。結果、図 1 1に示すように、 GFAP 陽性細胞 (ァストロサイト）、 Tujl陽性細胞 (ニューロン）、 G C陽性細胞 (オリゴデンド 口サイト）の出現が見られ、 PtdGlc陽性細胞は分ィ匕多能性をもつ神経幹細胞であるこ とが示された。
[0055] この結果から、 PtdGlcが神経幹細胞にとって不可欠な機能を有しているとともに、 Pt dGlcが神経幹細胞又は神経前駆細胞の有望なマーカーとして使用可能なことが示 唆された。
[0056] 実施例 4 :軸索成長円錐縮退誘導活性
本発明の式（1)で表される PtdGlcをハチ毒由来ホスホリパーゼ A2で消化し、この消 化産物をィアト口ビーズカラムで精製して Lyso- PtdGlc(LPG)を得た。即ち、アクアシル カラムを用いて得られた PtdGlc画分は窒素気流下で乾燥し、 lmg/mlになるように 20m MTris-HCl緩衝液 (pH 7.6)に溶かして分注、凍結保存したハチ毒由来ホスホリパー ゼ A2 ( 25 1)及び 0.5% Triton X- 100 (25 μ 1)をカ卩えてよく撹拌し、 37°C, 30分間反 応させた。窒素気流下で乾燥後、少量のクロ口ホルム/メタノール (2: 1 , v/v)に溶かし 、 TLCにて LPG生成を確認した。これをィアト口ビーズカラムで精製した。
[0057] この LPGは低濃度でマウス後根神経節-ユーロンの成長円錐を縮退させる活性が あった（図 9)。すなわち、胎生 12.5日のマウス胎児から脊髄後根神経節を分離し、 10 0 μ g/mlポリ- L-リジン及び 20 μ g/mlラミニンをコートしたガラスボトムディッシュ中で オーバーナイト培養して軸索を伸長させる。翌日、培地を無血清 DMEMに換えて、 3 時間飢餓培養後、 LPG 0, 10, 100 /z Mになるように添加し、 30分後に成長円錐を観 察カウントしたところ、ポジティブコントロールのリゾホスファチジン酸と同等もしくはそ れ以上の軸索成長円錐縮退誘導活性を示した。 [0058] 近年リゾホスファチジン酸（LPA)，スフインゴシン- 1-リン酸（S1P)は様々な細胞に多 彩な応答を引き起こす生理活性脂質として注目され (図 10)、 edg-ファミリーの G-タン ノ^共役型受容体 (GPCR)を介したシグナル伝達を活性ィ匕することが解明されてきて V、る。 (し ontos, J. J. A, Ishn, I and Jerold Cnun (2000). Lysophosphatidic Acid Rece ptors. Mol Pharmacol 58: 1188- 1196.；及び Sorensen, S. D" Nicole, O" Peavy, nR. D., Montoya, L. M., Lee C. J., Murphy T. J., Traynelis, S. F. and Hepler J. R (2003 ) Common signaling pathways link activation of murine PAR- 1, LPA, and SIP recept ors to proliferation of astrocytes. Mol Pharmacol 64:1199—1209, 2003)。私達もコラ プスアツセィの系にお 、てポジティブコントロールとして LPAをお!/ヽて 、るが、 LPGは 少なくとも LPAと同等の活性を示す。
[0059] 実施例 5 インビトロでの成長円錐ターニングアツセィ（in vitro growth cone turning a ssay)
(1) PtdGlcあるいはその代謝産物であるリゾ体 (以下 LPG)が、軸索の成長円錐の 伸長に与える影響を調べるために、 Lohof et al., 1992, J. Neurosci 12: 1253-1261、 Zheng et al., 1994, Nature 368, 140- 144に記載の方法に基づき、インビトロでの成長 円錐ターニングアツセィを行った。
[0060] トリ後根神経節 (Dorsal root ganglia。以下 DRG)を胚生 10日目の胚から取り出し、 D RG感覚-ユーロンを個々の細胞にばらした後、 NGFと N2とを添カ卩した L15培地中 で、 37°Cで培養した。そして伸長している軸索先端の成長円錐に対し、顕微鏡下で 伸長方向に対して 45度、 100 の位置にピペット先端をおいて PtdGlc又は LPGを濃 度勾配添加し，軸索の応答を観察した。 PtdGlc,、 LPGとも反発応答が観察されたが、 PtdGlcは 10 Mで反発応答を惹起したのに対し、 LPGではその 1/10以下の濃度で 反発応答が引き起こされ、 LPGは強い神経軸索ガイダンス活性をもつことが明かとな つた（図 12)。なお、図 12には LPGでの結果のみを示している。
[0061] 以上の結果から、本発明の糖脂質は、神経軸索の伸長を制御する新しい生理活性 脂質分子であることが示された。
産業上の利用可能性
[0062] 本発明のホスファチジルダルコシド及びそのァセチルイ匕糖脂質は、ラット胎生期の 脳から単離された新規な生理活性糖脂質である。本発明のホスファチジルダルコシド 及びそのァセチルイ匕糖脂質は、放射状グリアのマーカー分子として有用であり、これ らを検出することにより放射状グリアを検出することができる。また、本発明のホスファ チジルダルコシド、そのァセチルイ匕糖脂質、及びそれらをホスホリパーゼで消化する ことにより得られる消化産物は神経軸索の移動を制御することができることから、神経 軸索移動の制御剤などの医薬として有用である。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、胎生 21日のラット胎仔脳より単離したホスファチジルダルコシドおよびそ のグルコースの 6位がァセチル基により修飾された 6-0-ァセチル-ホスファチジルグ ルコシドの化学構造を示す。胎生 21日のラット胎仔脳より単クローン抗体 DIM21に認 識される脂質画分を抽出精製し、構成糖'脂肪酸のガスクロマトグラフ分析、一次元 プロトン-,二次元プロトン-プロトン相関-,二次元プロトン-31 P相関- NMR ^ベクトル分 析、エレクトロスプレーイオン化精密質量分析および MS- MSによるプロダクトィオンス ベクトル分析の結果を総合して完全構造を決定した。
[図 2]図 2は、ホスファチジルダルコシドの Q-セファロース (A)及びセンシユーパックァ クァシルカラム (B)からの DIM 21抗原の溶出パターンを示す。胎生 21日のラット胎仔 脳は摘出後直ちに液体窒素に投入して瞬間凍結し、凍結乾燥した。これをクロロホ ルム（C) :メタノール (M)混液 (2: 1)及び C: M:水 (W) (5: 8: 3)にて抽出後、溶媒を留 去して PIPLC処理 (500 mU/g乾燥組織重量，一昼夜反応）し、 Folch分配して有機層 を C: M (4:1)で平衡化したフエ-ルポ口ネートァガロース (PBA)カラムに注入、 PBAに 吸着する、糖を含む脂質を集めた。溶媒留去後 C: M: W (30: 60: 8)で平衡ィ匕した Q- セファロースカラム (1 ( 8 cm)に注入、非吸着画分を同じ溶媒でよく洗い流した後、水 に 0.1 M酢酸ナトリウムを含む C: M: W (30: 60: 8)で DIM 21陽性画分を溶出し、 TLC 及び TLC-ィムノスティユングでモニターした。この画分で最も量の多!、ものは PIPLC で切れ残ったホスファチジルイノシトール (Ptdlns)である力 これに加えてオルシノー ル陽性、 DIM 21反応陽性の 2種類の抗原脂質が得られた。この画分を集め、 C: M 9: 1で平衡化したアクアシルカラム（センシユーパック）に供した。 C: M 9: 1で 10分間非 吸着画分を洗い流し、その後 9: 1力 7: 3, 90分間のグラジェントで溶出した。溶出 画分は、同様に TLC, TLC-ィムノステイニングでモニターした。このクロマトグラフィー により、 TLC上で単一スポットを示す精製標品を得ることができた（図 7)。
[図 3]図 3は、構成糖及び脂肪酸のガスクロマトグラフ分析を示す。センシユーから溶 出された各成分を代表すると思われる、 No. 29, No. 37及び No. 51をそれぞれ 20 1 テフロンライナー付き栓をもつスピッツ管に取り、溶媒留去後 5%塩ィヒ水素メタノールを 加え密栓して 80°C,オーバーナイトメタノーリシスした。室温に冷却後へキサンで分配 し、へキサン層は脂肪酸分析に供した。またメタノール層（メチルダリコシドを含む）は 溶媒留去後デシケーター中で真空ポンプで吸引し、よく乾燥させた。直前に 1%トリメ チルクロロシラン (TMCS)試薬（Pierce) 20 1を加えて室温 30分反応させこの反応液 1 μ 1を SHIMADZU GC- 2014型ガスクロマトグラフ装置に装着した CBP-1キヤビラリ 一力ラム (SHIMADZU GLC)に注入し， 100°C-250°C, rate 5°C/minの昇温で分析し た。 No. 29, No.37は単糖としてグルコースのみであり、脂肪酸組成においてもまった く同一であった。 No. 37周辺の画分 (No. 36— 39)を PG,これよりやや Rfの高い No. 29 周辺の画分 (No. 28〜31)を!^ とした。 No. 51からはイノシトールが得られ， No. 51を 含む画分はホスファチジルイノシトールと同定した。
[図 4]図 4は、 Fr. No. 29及び No. 37の一次元プロトン NMR ^ベクトルを示す。得られ た PG, PGxを含む画分は溶媒留去後、重メタノール 100 1に溶解し、重メタノールで 共洗いした 3mm径 NMR管（SHIGEMI, Tokyo)に 4cmの深さになるように注入した。こ れを磁気共鳴吸収測定装置（日本電子、 JNM-ECA600)にて一次元プロトン NMR^ ベクトルを測定した。両者とも糖としてグルコースのみを検出した力 No.29の PGxに おいてはグルコースのリングプロトンのうち、 6位のプロトンは一方は高磁場に、一方 は低磁場にシフトして 、て、 6位が何らかの置換基で修飾されて 、ると示唆された。
[図 5]図 5は、 Fr. No. 29及び No.37のプロトン- P相関を示す。両サンプルでダルコ一 スの 1位及びグリセロールの 3位のプロトンと Pとの相関が認められた。
[図 6]図 6は、 PG, PGxの精密質量分析を示す。 PG, PGxを含む画分は溶媒留去後 C ： M(2: 1, v/v)に溶解してフーリエ変換型質量分析装置（FT ICR MS、 Bruker Dalto nics)を用いて質量分析及びタンデム MS-MS分析を行った。 PGxの分子イオンピーク は PGよりも 42質量単位大きい。フラグメントイオンはまったく同一だった。以上の結果 力 グルコースの 6位の修飾はァセチル化であると同定した。 PGX ESI FT-ICR MS( negative ion) Cacd m/z for C49H92014P— :935.62302 (delta:— 0.66ppm)、 PGX2:ESI FT-ICR MS(negative ion) Cacd m/z for C47H90O13P— :893.61246 (delta:— 0.74ppm) 、 PGXlからの生成イオン: C3H605P— (calcd: 152.99584); C18H3502" (calcd: 283.26 425); C20H39O2" (calcd: 311.29555); C21H40O6P" (calcd: 419.25680); C23H4406 P— (calcd: 447.28810)、 PGX2からの生成イオン: C3H605P— (calcd: 152.99584); C18H 3502" (calcd: 283.26425); C20H39O2" (calcd: 311.29555); C21H40O6P" (calcd: 41 9.25680); C23H4406P" (calcd: 447.28810)
[図 7]図 7は、 PtdGlc, 6-O-Ac-PtdGlcの酸性、中性及びアルカリ性展開溶媒を用 いた TLC展開像を示す。 PtdGlc及び 6-O-Ac-PtdGlcは 1ナノモル相当量 (Pで算出） をスフインゴ糖脂質として LacCer, CSE;リン脂質として PI及び PCとともに HPTLCにァ プライ、中性溶媒として C: M: W (60: 35: 8, v/v/v)、アルカリ溶媒として水に 2.5N NH OHを含む C: M: W (60: 35: 8, v/v/v)、酸性溶媒として C: Aceton: M: HOAc: W (5:
4
2: 2: 1: 0.5)でそれぞれ展開し、オルシノール硫酸試薬をスプレーして 105°Cに加熱 発色させた。レーン l (LacCer)、レーン 2 (CSE)、レーン 3 (6-0-Ac-PtdGlc(PGXl))、 レーン 4 (PtdGlc(PGX2))、レーン 5 (Ptdlns)、レーン 6 (PC)、展開溶媒系（I) C: M: 2. 5N NH OH (60: 35: 8)、 (II) C: M: W (60: 35: 8)、 (III)C: A: M: HOAc: W (5: 2: 1: 1:
4
0.5)
[図 8]図 8は、 PtdGlcがラジアルグリアの細胞表面マーカー分子であることを示す結果 である。胎生 14.5日のマウス胎仔脳を 4%パラホルムアルデヒドを含む PBSに 3日浸漬 固定し、マイクロスライサーで 4 0 μ mに薄切した。これを mAb DIM 21 (10 μ g/ml)とラ ジアルグリアマーカーである BLBPまたは GLASTの抗体 (guinea pig anti- BLBP IgG 1 μ g/ml, guinea pig anti- GLAST IgG 0.5 μ g/ml北海道大学'渡辺雅彦教授より恵与 )で二重染色し 1昼夜浮遊反応させた。 PBSで洗浄後 (2 X 5min., 1 x 15min.)、蛍光二 次抗体 (Alexa 488 anti-mouse IgM, Alexa 568 anti-guinea pig IgG ど らも 2 μ g/ml,
Molecular Probe.Inc. OR, USA )で 1時間浮遊反応させた。 PBSで洗浄後 (2x 5min., lx 15min.)、スライドガラス上にマウントし、封入剤 (IMMU- MOUNT, Thermo Shandon,
USA)とカバーガラスで封入した。これを共焦点レーザー顕微鏡 (Olympus FV1000, T okyo, Japan)を用いて観察した。スケールバーは 20 μ m
[図 9]図 9は、 Lyso-PtdGlcはマウス DRG-ユーロンの成長円錐を縮退させることを示 す結果である。胎生 12.5日のマウス胎仔より脊髄を取り出し、後根神経節を分離して ラミニン（20 μ g/ml)で 37°C, 3時間コートしたガラスボトムディッシュ中で 10%FCS及び 1 00ng/ml NGF加 DMEM培地でオーバーナイト培養して軸索を伸長させた。翌日これ を NGF及び血清を含まない飢餓培地に置換して 3時間培養、終濃度 100及び 10 M となるようにリピドを添カ卩し、 37°C, 30分反応させ、 20%ショ糖を含む 3.7%ホルマリン in P BSで固定して DRGを一周して成長円錐をカウントし、縮退率を算出した。
[図 10]図 10は、 生理活性脂質の構造を示す。（A)リゾホスファチジン酸 （B)スフイン ゴシン 1-リン酸 (C)リゾホスファチジルダルコシド および可能な生理活性脂質 (D)リ ゾホスファチジル (-6-0-ァセチル)-ダルコシド
[図 11]図 11は、 PtdGlc陽性細胞が-ユーロスフェアを形成し、さらに分化する様子を 示す図面である。
圆 12]図 12は軸索の成長円錐力 SLPGに対して反発応答する様子を示す図面である

Claims

請求の範囲
[1] 下記の式（1)から (4)の何れかで表される糖脂質。
[化 1]
Figure imgf000024_0001
[化 3]
Figure imgf000024_0002
[化 4]
Figure imgf000024_0003
[2] 下記の式（1)から (4)の何れかで表される糖脂質を有効成分として含む、医薬。
[化 5]
Figure imgf000024_0004
[化 6]
Figure imgf000024_0005
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0002
神経軸索移動の制御剤である、請求項 2に記載の医薬。
下記の式（1)又は (2)で表される糖脂質を検出することを含む、放射状グリアを検出 する方法。
[化 9]
Figure imgf000025_0003
[化 10]
Figure imgf000025_0004
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