JPS63245684A - ホスフアチジン酸誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 大豆レシチン、卵黄レシチン等のリン脂質は、その界面
活性や生理作用を活かして、食品、化粧品、塗料、潤滑
油、磁性材料、飼料、医薬品、農薬等の製造に広く利用
されているが、リン脂質と水酸基含有化合物にホスファ
チジル基転移作用を有する酵素を作用させて得られる新
たなホスファチジン酸誘導体も、原料のリン脂質以上に
有利な性質を示す有用物質であることが多い。本発明は
、リン脂質を原料にして上記ホスファチジル基転移反応
によりホスファチジン酸誘導体を製造する方法の改良に
関するものである。

従来の技術 ホスファチジン酸の誘導体であるリン脂質に水の存在下
でホスホリパーゼＤを作用させると、加水分解を起こし
てホス７７チジン酸を生じるが、その際、ホスファチジ
ル基の受容体となり得るアルコール性水酸基含有化合物
お上り２価の金属イオンを共存させると、下記のような
ホスファチジル基転移反応を起こして新たなホスファチ
ジン酸誘導体を生じることが知られている。

ＣＨ２０Ｒ，Ｃ１１２０Ｒ。

（リン脂質） （式中、Ｒ，、Ｒ２はアシル基、アルキル基等、Ｘｌは
糖またはアルコール性水酸基含有塩基の水酸基部分の水
素原子１個を除いた後に残る有機基、Ｘ２は直鎖脂肪族
多価アルコール、糖などの水酸基含有化合物からその水
酸基部分の水素原子１個を除いた後に残る有機基を表わ
す。）２価金属イオンは、ホスホリパーゼＤにホスファ
チジル基転移反応活性を発現させるのに不可欠のものと
考えられており（但し、ホスファチジルグリセロールと
いう同一リン脂質分子種間でのホス７７チジル基転移反
応においては例外的に２価金属イオンの添加を必要とし
なかったという報告−Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｗ
　　５１　＊　７４７ｔ　１９７３−がある）、したが
って、従来、一般品な異種分子間ホスファチジル基転移
反応によりホスファチジン酸誘導体を製造する場合は必
ず２価゛−”　、 金ｌイオン（普通はＣａイオン）によってホスホリパー
ゼＤの活性化を行なっていた（特開昭５８−６３３８８
号、同５８−６７１８３号、同５９−１８７７９２号、
同６２−３６１９５号等）。

ホスホリパーゼＤの活性（ｂにＣａイオンを用いた場合
、反応系にはこのイオンと反応性ある物質を加えること
ができないし、また、水酸基含有化合物であってもＣａ
イオンと化合して反応性を失うようなものはホスファチ
ジル基受容体として使うことができない。たとえば、転
移反応の至適ｐＨが６〜７付近にある酵素を用いる場合
、最も使い易く且つ安価なリン酸緩衝液はＣａイオンと
反応して沈殿を生じるため使うことができず、より高価
な緩衝液を使用せざるを得ない。また、目的物の一部に
Ｃａ塩型のものができるから、Ｎａ塩型なと池の塩型の
ものを製造する場合はキレート剤を用いたりして目的と
する塩に変換するなどの掻作が必要である。

発明が　　しようとする４題点 本発明の目的は、リン脂質とホスホリパーゼＤを用いる
従来のホスファチジン酸誘導体の製法が上述のように２
価金属イオンの使用にともなう種々の制約あるものであ
ったことに鑑み、２価金属イオンを用いないホスホリパ
ーゼＤ活性化法による製法を提供して、ホスファチジン
酸誘導体の製造を従来よりも容易にすることにある。

刑１戸詠」詭１（［ζ包Ｏチ戊 上記目的を達成することに成功した本発明の製法は、ホ
スホリパーゼＤの活性化に２価金属イオンを用いず、か
わりにホスホリパーゼＤ活性化作用を有する有機溶媒を
用いることを特徴とするものである。

有機溶媒たとえばジエチルエーテルは、従来の製法にお
いてもしばしば反応系構成成分として用いられている。

しかしなが呟従来の製法においては、有機溶媒は水に難
溶性のリン脂質を溶かして酵素およびホスファチジル基
受容体の水溶液と接触させるための単なる溶媒として使
われており、酵素の活性化には必ずＣａイオン等の２価
金属イオンが別に使われている。

２価金属イオンを用いず有機溶媒による酵素活性化を行
うこの発明は、本発明者らによる次のような新規な知見
に基づくものである。

（ａ）　　ある種の有機溶媒（たとえば酢酸エチル、４
−ヘプタノン等）は、反応系にある比率以上に加えられ
た場合、２価金属イオンが存在しなくてもホスホリパー
ゼＤを活性化する。

（ｂ）　　ある種の有機溶ｔ＆（たとえば低級脂肪族−
級アルコール、ジメチルホルム７ミド、ジメチルスルホ
キシド等）は、ホスホリパーゼＤをほとんど活性化せず
、むしろ失活させる。

（ｃ）　　ホスホリパーゼＤを活性化する溶媒の中にも
、ある濃度以上ではホスホリパーゼＤを失活させるもの
が多い（たとえば四塩化炭素、ｎ−ヘキサン、ベンゼン
、２−ブタノール、ノオキサン等）。

（ｄ）　　ホスホリパーゼＤに対して事実上不活性な有
機溶媒、すなわちホスホリパーゼＤを活性化せず、また
失活もさせない有機溶媒もある。

したがって、本発明においては、ホスホリパーゼＤにホ
スファチジル基転移反応活性を発現させる作用を有する
有機溶媒を、上記活性化作用のほうが酵素失活作用より
も強く現われるような条件で用いて、ホスホリパーゼＤ
を活性化する。

適量使用した場合にホスホリパーゼＤを活性化するとと
もにリン脂質を溶解もしくは分散させる能力の点でもす
ぐれ、したがって本発明の製法において使用する有機溶
媒として好ましい有機溶媒を示すと、次のようなものが
ある。

エステル類：炭素数２〜１０の脂肪族カルボン酸および
同じ炭素数範囲の脂肪族アルコールから得られる炭素数
４〜１２のエステル類が特に好ましい。たとえば酢酸エ
チル、酢酸ブチル、酢酸７ミル、酢酸デシル、プロピオ
ン酸エチル、プロピオン酸プロピル、酪酸エチル、酪酸
ブ、チル、イソ酪酸イソブチル、イソ吉草酸エチルなど
である。なかでも酢酸エチルは、２価金属塩を用いる従
来の製法ではとうてい不可能であったような高率（約９
０％以上）でホスファチジル基転移反応を生起させ、ホ
スファチジン酸の副成が少ないだけでなく、取扱いが容
易で価格も紙庫であるから、本発明の製法で用いるホス
ホリパーゼＤ活性化剤として最ら好ましい。ギ酸メチル
やギ酸エチルは酵素失活作用がやや強く、使い難い。

炭素数１１以上の高級脂肪族カルボン酸やアルコールか
ら得られるエステル、あるいはヒドロキシカルボン酸類
（たとえば゛乳酸、７マル酸、クエン酸等）のエステル
は、ホスホリパーゼＤ活性化作用が弱い。

ケトンＭ：炭素数５〜９の脂肪族ケトン、たとえば３−
ペンタノン、メチルイソブチルケトン、４−ヘプタノン
、ジイソブチルケトンが、特に好ましい。プロパノンや
ブタノンなど、炭素数が５未満のものは、酵素失活作用
が強い。

ハロゲン化炭化水素二ジクロルメタン、トリクロルメタ
ン、ジクロルエタン等が好ましい。

前述のように、これら好ましい溶媒といえども使用量に
よっては酵素を失活させることがあり、また失活作用が
強く現れる濃度もそれぞれ異なるか呟好適使用量は溶媒
によって異なるが、多くの場合、好適使用量は水１容量
部に対して有機溶媒０．０５〜５０容量部の範囲にある
。個々の有機溶媒についての最適使用量は、実験により
容易に確認することができる。

本発明の製法において、原料のリン脂質としてはグリセ
ロリン脂質であればいかなるリン脂質も使用することが
でき、たとえば大豆レシチン、卵黄レシチンなど天然の
もののほか、ホス７アチジルコリン、ホス７７チジルエ
タノールアミンなどの合成品を用いることができる。

いま一つの反応原料である“ホス７７チジル基受容体”
となり得る化合物は、水酸基を有する化合物、すなわち
メタノール、エタノール、プロパツール、２−プロパ７
−ル、フタノール、２−ブタノール、イソアミルアルコ
ール、ヘキサノール、ヘプタメール、オクタツール、デ
カノール、グリセリン、エチレングリコール等のアルコ
ール類；グルコース、キシロース、アラビノース、フル
クトース、β−Ｄ−グルコース、マンノース、スクロー
ス、ラクトース、セロビオース、メリビオース等の糖類
；グルコサミン、ガラクトサミン、アセチルガラクトサ
ミン等の７ミノ糖；ソルビトール、マンニトール等の糖
アルコール；アミグダリン、サリシン等の配糖体；フェ
ノール、ニトロフェノール、ジニトロフェノール等のフ
ェノール類；その他（たとえばアデノシン）の中から任
意に選ばれる。

なお、本発明の目的は反応方法の改良にあり、特定のホ
ス７７チジン酸誘導体を提供することにあるのではない
から、いかなるリン脂質とホス７７チジル基受容体とを
組合せて反応させるかは全く自由である（本発明の方法
においてのみホスファチジル基転移反応を生じ得ないリ
ン脂質は見いだされていない）。

ホスホリパーゼＤとしては、キャベツ、ニンシ゛ン、ピ
ーナツなどの植物体から抽出されたものと、微生物由来
のものとがあり、本発明においてはそのいずれを用いて
もよいが、微生物、特に放線菌由来のホスホリパーゼＤ
は、熱安定性にすぐれるとともに活性が強いので好まし
い。本発明の製法において、ホスホリパーゼＤは反応系
に溶解させて用いるほか、固定化酵素の形で用いてもよ
い。

リン脂質、ホスファチジル基受容体となる化合物、ホス
ホリパーゼＤおよびその活性化剤となる有は溶媒を混合
してホスファチジル基転移反応を生起させる場合、混合
類は特に限定されないが、代表的な方法は次のとおりで
ある。

Ａ、リン脂質を水中に分散、懸濁させ、そこにホスファ
チジル基受容体となる化合物、ホスホリパーゼＤ溶液お
よび酵素活性化剤とする有機溶媒を加えて撹拌、混合す
る。

Ｂ、酵素活性化剤とする有機溶媒にリン脂質を溶解し、
ホス７７チジル基受容体となる化合物およびホスホリパ
ーゼＤの水溶液と混合する。

Ｃ０酵素活性化剤とする有機溶媒にリン脂質およびホス
７７チジル基受容体となる化合物を溶解し、ホスホリパ
ーゼＤの水溶液と混合する。

反応系には、必要に応じて池に任意の補助的成分、たと
えばｐＨ調整のための緩衝剤、リン脂質またはその溶液
を分散させるための界面活性剤等を、酵素作用の妨げと
ならない範囲で加えることができる。但し２価金属イオ
ンは、有機溶媒によるホスホリパーゼＤ活性化の妨げと
なるわけではないが、本発明では使用しない。

ホスホリパーゼＤを固定化酵素の形で用いる場合は、反
応系を撹拌不要の安定な均一相にしておくことが望まし
い。その場合は、反応系構成成分が特定の比率で配合さ
れたと島に形成される透明な均一相を固定化酵素と接触
させるとよい。

上記透明な均一相は、酵素活性化用の有機溶媒にリン脂
質を比較的高濃度に溶解し、そこにホス７７チジル基受
容体となる化合物の水溶液を一定の限度内で加えて攪拌
したときリン脂質の界面活性が関与して形成される。こ
の均一相は、酵素活性化剤としての有機溶媒以外の親水
性有機溶媒を少量加えると形成され易くなることがある
。たとえば、卵黄レシチン２０重量％、グリセリン５重
量％、酢酸エチル６０重量％、２−プロパツール５重量
％、水１０重１％の組成の混合物は、容易に、透明な均
一相を形成する。

用いた酵素の至適温度付近で充分時間反応させたのち、
反応液から７七トンやエタノールを用いた溶媒分別法、
シリカゲルやアルミナあるいは逆相担体等を用いたカラ
ムクロマトグラフィー、薄層りａマドグラフィー等の方
法により、目的とするホス７７チジン酸誘導体を分取す
ることができる。

ヌ１廻 以下、実施例を示して本発明を説明する。

実施例　１　　　　　・ 一黄レシチンから調製されたホス７７チジルコリン５Ｉ
ｌ１ｇ（シグマ社）に、ホスファチジル基受容体として
グリセリン１００ｕｌ、ｐＨ６，０のリン酸緩衝液４０
０．１、放線菌由来のホスホリパーゼＤ　１ユニツトを
加え、混合する。

上記のよ□うにして得られる混合物に、０〜１００１ｍ
の酢酸エチルを加え、５０℃に保って振とうしなが呟ホ
ス７７チジル基転移反応によるホス７アチジルグリセロ
ールの生Ｉ＆量を経時的に定量した。その結果は表１の
とおりであって、２価金属イオンを加えなくても、酢酸
エチル添加量３０１Ｊ１以上の場合にホス７アチシルグ
リセロールが生成した。

表１　ホス７７チジルグリセロール生成速度ａＲ−ｘ−
＋ｔｖｍｍ　　　ｕｌ　　　戒　　（ＩＩｇ／ｕｎｉｔ
・ｍ１ｎ）実施例　２ ホス７７チジルフリン含有量が約９０％である大豆レシ
チン２．５ｇ、濃度３０％（ｗ／ｖ）のホスファチジル
基受容体水溶液１００ｍ１．放線菌由来のホスホリパー
ゼＤ溶液２ｍｌ、酢酸エチル３７５ｍ１を混合し、攪拌
しながら５０℃で６０分間反応させる。

受容体を種々変更して上記製法を実施した結果を表２に
示す、なお、表中の「％」は、反応液中の未反応リン脂
質を含む合本スフ７チジン酸誘導体基準の重量％である
。

表２ 一愛」Ｌ遵−リμｊｌ掬 キシロース　　　　　７２．２ 〃ラクトース　　　　８１．３ アミグダリン　　　　　８．６ ソルビトール　　　　７４．２ セリン　　　　　　　４６．５ グリセリン　　　　　８３．８ 実施例　３ ホス７アチジルコリン含有量約９０％の大豆レシチン２
．５ｇ１ホスフアチジル基受容体としてのグリセリン３
０論１、ｐＨ５，５の緩衝液４０ｍ１、放線菌由来のホ
スホリパーゼＤ溶液２輪１およびその活性化剤としての
有機溶媒を混合し、５０℃で２０分間反応させる。

上記製法において、有機溶媒の種類および添加量を種々
変更し、ホスファチジル基転移反応生成物であるホス７
７チジルグリセロールの収率を調べた。その結果、下記
Ａ群の化合物を用いた場合は、実験した範囲内（有機溶
媒添加量１０〜４００ｍ１）のいずれかの添加水準にお
いて２０％をこえる収率が達成され、またＢ群の化合物
の場合も１０〜２０％の収率が達成された。

Ａ：イソプロビルエーテル、　２−ペンタノン、　３−
ペンタノン、　メチルイソブチルケトン、　４−ヘプタ
ノン、　ジイソブチルケトン、　ギ酸メチル、ギ酸エチ
ル、酢酸エチル。

酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル
。

酢酸イソブチル、酢酸５ｅｅ−ブチル、酢酸ｎ−７ミル
、酢酸イソアミル、酢酸ｎ−デシル、プロピオン酸エチ
ル、酪酸エチル、イソ酪酸エチル、吉草酸エチル、　イ
ソ吉草酸エチル、プロピオンＷ１ｎ−プロピル、酪酸ｎ
−ブチル、　２−デカノール、ベンゼン、　トルエン、
　キシレン、　ジクロルエタン、　フェニルメルカプタ
ン Ｂ：エチルエーテル、ブチルエーテル、テトラヒドロ７
ラン、　ジオキサン、　７セチルアセトン、　オクタン
酸エチル、　７マル酸ジエチル、マレイン酸ジエチル、
　コハク酸ジエチル、酒石酸トリエチル、　イソ吉草酸
イソアミル。

２−プロパツール、　２−ブタノール、ヘプタツール、
　２−へブタノール、　オクタツール、ペンタン、ヘキ
サン、ヘプタノ、　イソオクタン、　シクロヘキサン、
ジクロルメタン。

トリクロルメタン、テトラクロルメタン１皿Ω効呆 ホスホリパーゼＤのホスファチジル基転移反応活性を２
価金属イオンによらずに有機溶媒で発現させる本発明の
製法は、反応系に２価金属イオンが入り込まないことに
よりリン酸塩緩衝液の使用も自由になり、ホスホリパー
ゼＤや反応条件の選択の幅が広くなって容易に最適条件
での反応を行わせることができるようになるほか、反応
液からの目的物の分離・精製も容易である。また、２価
金属イオンが転移反応を直接妨害するために従来は使用
不可能であったようなリン脂質やアルコ−性水酸基含有
化合物も反応原料にすることができるから、本発明によ
り新規なホスファチジン酸誘導体を提供する途が開けた
ことになる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ホスファチジル基受容体の存在下、リン脂質にホ
   スホリパーゼＤを作用させてホスファチジル基転移反応
   を生起させることによりホスファチジン酸誘導体を製造
   するに当り、ホスホリパーゼＤにホスファチジル基転移
   反応活性を発現させるための２価金属イオンを用いず、
   有機溶媒によりホスホリパーゼＤの活性化を行うことを
   特徴とするホスファチジン酸誘導体の製造法。
2. （２）ホスホリパーゼＤの活性化を炭素数４〜１２のエ
   ステル類、炭素数５〜９のケトン類、またはハロゲン化
   炭化水素により行う特許請求の範囲第１項記載の製造法
   。
3. （３）エステル類として酢酸エチルを用いる特許請求の
   範囲第２項記載の製造法。