JP3289058B2 - 酵素を用いたエステル製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リパーゼ酵素を触媒と
して、脂肪酸と一級テルペンアルコールからエステルを
収率良く製造する方法および立体選択的にエステルを製
造する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、有機溶媒中での生化学反応が注目
され、その利用例が増加している。有機溶媒の使用目的
は、脂溶性化合物を溶解して水溶液中では得られない均
一な反応系を実現するためであるが、一方で有機溶媒と
の接触によるストレスのために酵素が変性し、その特異
性が失われる場合が多々ある。このようなトラブルを防
止するため有機溶媒のように脂溶性化合物を速やかに溶
解できるが、その接触により酵素の高次構造が破壊され
ることが無いような媒体の利用がはかられているが、こ
れまで十分満足しうる結果は得られていない。また、リ
パーゼを用いたエステル等の化合物のより効率的な製造
方法の開発も求められている。一方、脂溶性ラセミ化合
物の光学分割を目的としたリパーゼによる立体選択的な
エステル合成反応は、有機合成化学の立場から重要であ
る。５０種のリパーゼとエストラーゼの有機溶媒中での
活性について検討したところ、多くの酵素が一級テルペ
ンアルコールのシトロネロールをエステル化できたが、
これらの酵素は一級アルコールに対し、立体選択制を示
さないことが報告されている（園元謙二、触媒、３２、
３０９−３１０、１９９０年）。そのためリパーゼを用
いた一級テルペンアルコールエステル化反応において立
体選択的にエステルを製造する方法についても開発が要
望されてきている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、一級テルペ
ンアルコールと脂肪酸のエステル化反応において、エス
テルを収率良く製造する方法及び酵素の特異的作用を利
用して光学純度の高いエステルを製造する方法を提供す
ることを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、超臨界二
酸化炭素雰囲気下で、脂肪酸と一級テルペンアルコール
とのエステル化反応を、リパーゼ酵素を固定化した粉末
を充填した反応器内で連続的に行い、超臨界二酸化炭素
の圧力、温度を調節することにより効率よくエステルが
得られること、および特定の条件下で光学純度の高いエ
ステルを製造し得ることを見出し、本発明をなすに至っ
た。

【０００５】 すなわち、本発明は、リパーゼの存在
下、脂肪酸と一級テルペンアルコールとを反応させエス
テルを製造するに当り、臨界温度以上及び臨界圧力以上
の二酸化炭素の雰囲気中で行うことを特徴とする脂肪酸
と一級テルペンアルコールとのエステルの効率的な製造
方法を提供するものである。更に臨界点付近の圧力及び
温度の二酸化炭素の雰囲気下で反応させることを特徴と
する脂肪酸と一級テルペンアルコールから立体選択的に
エステルを製造する方法を提供するものである。

【０００６】一般に、気体と、固体あるいは液体を接触
させた場合、常温、常圧下において気相に移行する固体
あるいは液体の量は、極めて僅かである。しかし、その
気体が臨界温度以上及び臨界圧力以上の状態では、気相
に移行する固体あるいは液体の量は飛躍的に増大するの
で、超臨界二酸化炭素は温和な条件下で例えば高分子量
の有機化合物を溶解できる。すなわち、超臨界二酸化炭
素を反応媒体として使用すれば、反応生成物を効果的に
系内に拡散させたり、副生物を速やかに系外に除去でき
る利点を有する。これにより、平衡的にも有利な有機化
学反応を構築でき、反応を効率的に進行できる可能性が
ある。近年、有機溶媒中での生化学反応が注目され、そ
の利用例が増加している。有機溶媒の使用目的は、脂溶
性化合物を溶解して水溶液中では得られない均一な反応
系を実現するためであるが、一方で有機溶媒との接触に
よるストレスのために酵素が変性し、その特異性が失わ
れる場合が多々ある。その点、超臨界二酸化炭素の臨界
温度は３１℃と室温付近にあり、脂溶性化合物を遠やか
に溶解できるので、酵素反応の反応媒体として使用する
ことにより、反応速度の向上や新たな反応の開発が期待
できる。本発明によれば、上述の超臨界二酸化炭素の性
質に着目し、当該流体の温度、圧力を調節することによ
り、脂肪酸と一級テルペンアルコールとのエステル化反
応を、リパーゼの存在下で行うことにより、エステルを
効率良く製造することができる。更に臨界点付近の圧力
および温度の二酸化炭素の雰囲気下で反応させることに
より、リパーゼの存在下、脂肪酸と一級テルペンアルコ
ールから光学純度の高いエステルを立体選択的に製造す
ることができる。

【０００７】最近、超臨界二酸化炭素はその臨界点付近
で温度、圧力によってその溶媒特性が著しく変化するこ
とが報告されてきている。とりわけ臨界点付近では溶質
分子近傍領域で二酸化炭素分子の凝集作用が起こり、ク
ラスターを形成することが知られている。即ち、臨界点
付近では溶質−二酸化炭素分子間の相互作用力が著しく
増大し、その作用は温度、圧力に強く依存する。そこで
本発明において、この臨界点付近での二酸化炭素分子の
強い凝集力を酵素反応プロセスに応用することも検討し
た。酵素は基質に比べて柔軟な構造を有しているので、
上述した臨界点付近での二酸化炭素のクラスター形成や
立体圧迫性は酵素の高次構造に対して強い影響を及ぼ
し、その特異性を変化させる可能性がある。

【０００８】本発明者らは、これらのことに着目し、超
臨界二酸化炭素雰囲気下で、脂肪酸と一級テルペンアル
コールとの反応を、リパーゼを固定化した粉末を充填し
た反応器内で行い、その反応速度及びエステル生成物の
光学純度の温度、圧力依存性について検討した。その結
果、当該反応は、二酸化炭素の臨界点以上の圧力及び温
度条件で反応速度が著しく増大することが分かった。更
に二酸化炭素の臨界点付近の条件下ではキラル原子すな
わち不斉原子をもつ一級テルペンアルコールのラセミ体
を用いると、酵素の基質特異性により、特定の光学活性
のもののみが反応し、いわゆるラセミ分割が行われる結
果、光学純度の高い（Ｓ）−（−）−エステルを製造で
きることを見い出した。

【０００９】圧力が臨界圧力以上では圧力の増加にとも
なって、反応速度が急激に増加し、１０Ｍｐａ以上の圧
力ではその改善の程度は減少する傾向が認められる。水
飽和シクロヘキサン溶液中において３５．２℃で当該反
応を行った場合と比べると、超臨界二酸化炭素中の反応
では、例えば温度３５．２℃および圧力８．４１Ｍｐａ
の時、反応速度は３．０倍および温度３５．２℃および
圧力１９．３０Ｍｐａの時５．１倍となり、反応効率が
飛躍的によくなることが判明した。この様に、当該反応
は臨界圧力以上および臨界温度以上では好適に効率よく
行うことができる。経済性等を考慮すれば、二酸化炭素
の臨界温度とそれより１０℃高い温度との間の温度範囲
および臨界圧力より０．１〜１５Ｍｐａ高い圧力範囲で
当該反応をより好適に効率よく行うことができる。二酸
化炭素の臨界温度とそれより１０℃高い温度との間の温
度範囲および臨界圧力より０．１〜１２Ｍｐａ高い圧力
範囲で当該反応を最も好適に効率よく行うことができ
る。

【００１０】臨界点付近の圧力および温度の二酸化炭素
の雰囲気中でリパーゼの存在下、脂肪酸と一級テルペン
アルコールを反応させることにより、光学純度の高いエ
ステルが好適に立体選択的に得られる。臨界点付近の圧
力７．５〜９ＭＰａおよび温度３１〜３６℃の二酸化炭
素の雰囲気下で光学純度の高いエステルがより好適に立
体選択的に得られる。臨界点付近の圧力８．４１ＭＰａ
および温度３１．２℃の二酸化炭素の雰囲気下で光学純
度の高いエステルが最も好適に立体選択的に得られる。

【００１１】脂肪酸はカルボキシル基を１個もつ鎖式化
合物であり、鎖式カルボン酸の総称である。本発明では
炭素数（ｎ）が２〜４０である、以下に示す脂肪酸を好
適に用いることができる。脂肪酸としては飽和脂肪酸列
（Ｃ_ｎＨ_２ｎＯ_２）、オレイ酸列（Ｃ_ｎＨ
_２ｎ−２Ｏ_２）、リノール酸列（Ｃ_ｎＨ
_２ｎ−４Ｏ_２）、リノレン酸列（Ｃ_ｎＨ
_２ｎ−６Ｏ_２）、および高度不飽和酸列（Ｃ_ｎＨ
_２ｎ−８Ｏ_２，Ｃ_ｎＨ_{２ｎ−１０}Ｏ_２，Ｃ_ｎＨ
_{２ｎ−１２}Ｏ_２）はいずれも用いることができる。例え
ばカプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、
ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジ
ン酸、ベフェン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン
酸、ソーマリン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エル
シン酸、鯨油酸、リノール酸、リノレン酸、エレオステ
アリン酸、モロクチ酸、パリナリン酸、イワシ酸、ヒラ
ガシンラ酸、ニシン酸、リシノレイン酸、の単独あるい
はこれらのいくつかが混合した脂肪酸をより好適に本発
明の反応に用いることができる。更にオレイン酸は本発
明の反応に最も好適に用いられ得る。

【００１２】天然物から得られる有機化合物のうち、炭
素数が５の倍数５ｎ（ｎ≧２の整数）である物質をテル
ペンと総称している。テルペンアルコールはテルペンに
１個の水酸基が置換した化合物であり、そのうち水酸基
が付加した炭素原子に１個の炭素原子が結合しているも
のを一級テルペンアルコールと呼んでいる。本発明では
一級テルペンアルコールとして一級モノテルペンアルコ
ール、一級セスキテルペンアルコール、一級ジテルペン
アルコール、一級トリテルペンアルコール、一級テトラ
テルペンアルコール、およびｎが10個以上の一級ポリテ
ルペンアルコールはいずれも好適に使用することが可能
である。より好適には一級モノテルペンアルコール、一
級セスキテルペンアルコールおよび一級ジテルペンアル
コールを使用することができる。一級モノテルペンアル
コールのうち、シトロネロールを一級テルペンアルコー
ルとして本発明の反応に用いることは最も好適に反応が
進行する。

【００１３】リパーゼは脂肪酸のグリセリンエステルで
ある脂肪加水分解に関与する酵素であり、エステラーゼ
の一種である。動植物、微生物に広く分布し、特に動物
の膵液中に多量に存在する。基質特性の異なるものがい
ろいろあり、さらに生物の種類によって作用最適ｐＨ、
最適温度、基質特性などが異なることが知られている。
本発明ではリパーゼを触媒として使用しており、植物リ
パーゼ、動物リパーゼ、微生物リパーゼおよび酵母リパ
ーゼは好適に本発明のエステル合成反応に用いることが
できる。酵母リパーゼあるいは微生物リパーゼを反応に
用いることにより、より好適に反応を行うことができ
る。リパーゼとしてカンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｎｃｅａ）リパーゼＭＹを
用いることにより、本発明の光学分割反応は最も好適に
進行させることができる。

【００１４】

【作用】 本発明方法によって得られるエステル生成物
の収率は、二酸化炭素の臨界温度および臨界圧力を越え
ると４倍以上に増大し、水飽和シクロヘキサン溶液中で
同温度で当該反応を行った場合に比べると、６倍以上に
向上する。また臨界点付近で生成物の立体選択性も著し
く向上し、ほぼ１００％近い光学純度を有する（Ｓ）−
（−）−エステル化合物を得ることができる。

【００１５】

【実施例】以下に、実施例を示すが、本発明は、これら
の実施例に限定されるものではない。

【００１６】実施例 基質として、オレイン酸と（±）−シトロネロールを用
い、超臨界二酸化炭素雰囲気下でのリパーゼによるエス
テル化反応を連続的に行った。リパーゼはリン酸緩衝液
に溶解し、グルタルアルデヒドによって前処理したグラ
スビーズ上に固定化した後、反応器（長さ：１３０ｍ
ｍ、内径４．６ｍｍ）に充填した。二酸化炭素の流量
は、０．１７ＮＬ／ｍｉｎ（１ＮＬは温度２０℃，圧力
１０１．３ｋＰａでのガス容積が１Ｌであることを意味
する。）で、高圧ポンプによって送液し、圧力は圧力調
整弁によって行った。オレイン酸と（±）−シトロネロ
ールの供給速度は、それぞれ２．４４μｍｏｌ／ｍｉｎ
および３．１５μｍｏｌ／ｍｉｎとして両基質を各高圧
ポンプによって送液し、混合器中で撹はんした後、反応
器に送った。エステル化反応は圧力７．５８−１９．３
０ＭＰａ、温度３１．２−４１．２℃で行った。さら
に、超臨界二酸化炭素中の反応と比較するため、水飽和
シクロヘキサン中３５．２℃で同様な反応を行った。
反応生成物のｏ１ｅｉｃ ａｃｉｄ ３．７−ｄｉｍｅ
ｔｈｙ１−６−ｏｃｔｅｎｙ１ ｅｓｔｅｒ（以下、エ
ステル生成物と記す）はガスクロマトグラフィーによっ
て分析した。エステル生成物の光学純度は、カラムクロ
マトグラフィーによって反応混合物から単離後、ポーラ
リメーターによって決定した。

【００１７】表１に３５．２℃でのエステル化反応の反
応速度の圧力依存性を示す。超臨界二酸化炭素雰囲気下
でのエステル化反応は、水飽和シクロヘキサン溶液中で
の反応に比べて、反応速度が大きく、反応が効率時に進
行することがわかる。超臨界二酸化炭素雰囲気下ではそ
の圧力が増加するにつれて反応速度が増大し、その傾向
は臨界圧力付近で顕著であった。１９．３ＭＰａの反応
速度は、７．５８ＭＰａの場合に比べて４倍以上に向上
した。

【００１８】

【表１】

【００１９】 表２にエステル生成物の光学純度の温
度、圧力依存性を示した。臨界点付近で反応させた実験
７で得られた試料だけが（Ｓ）−（−）−エステル生成
物の光学純度が非常に高く、臨界点付近で立体選択的に
反応が進行するのがわかる。すなわち、圧力８．４１Ｍ
Ｐａ，温度３１．２℃ではその光学純度が９８．９％と
ほぼ立体選択的に（Ｓ）−（−）−エステル生成物が得
られた。また、圧力７．５８ＭＰａ，温度３５．２℃で
はその光学純度が２３．４％であり、立体選択的に
（Ｓ）−（−）−エステル生成反応が進行するのが認め
られた。同様の反応を水飽和シクロヘキサン溶液中で行
った（実験６）が、ラセミ分割は全く認められなかっ
た。また、超臨界二酸化炭素雰囲気下においても、臨界
点より離れた圧力、温度領域（実験３，４，５および
８）では、その光学純度は著しく低下し、立体選択的反
応は臨界点付近で起こりやすいことを示している。

【００２０】

【表２】

【００２１】

【発明の効果】本発明によって、脂肪酸と一級テルペン
アルコールとのエステルを、室温付近で効率良く製造す
ることができる。更に、超臨界二酸化炭素の臨界点付近
の圧力および温度で反応させることによって、光学純度
の良いエステルを立体選択的に製造できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 合議体 審判長 田中 久直 審判官 徳廣 正道 審判官 大久保 元浩 (56)参考文献 特開 昭62−115293（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−30592（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−21098（ＪＰ，Ａ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リパーゼの存在下、脂肪酸と一級テルペン
   アルコールとを反応させエステルを製造するに当たり、
   臨界温度以上および臨界圧力以上の二酸化炭素の雰囲気
   中で行うことを特徴とする脂肪酸と一級テルペンアルコ
   ールとのエステルの製造方法。
2. 【請求項２】二酸化炭素の臨界温度とそれより１０℃高
   い温度との間の温度範囲および二酸化炭素の臨界圧力よ
   り０．１〜１５ＭＰａ高い範囲内の圧力下で行うことを
   特徴とする請求項１記載のエステルの製造方法。
3. 【請求項３】リパーゼの存在下、脂肪酸と一級テルペン
   アルコールとを反応させエステルを製造するに当たり、
   臨界点付近の圧力および温度の二酸化炭素の雰囲気中で
   行うことを特徴とする脂肪酸と一級テルペンアルコール
   とのエステルの立体選択的製造方法。
4. 【請求項４】臨界点付近の圧力７．５〜９MPaおよび温
   度３１〜３６℃の二酸化炭素の雰囲気中で行うことを特
   徴とする請求項３記載のエステルの立体選択的製造方
   法。
5. 【請求項５】臨界点付近の圧力８．４１MPaおよび温度
   ３１．２℃の二酸化炭素の雰囲気中で行うことを特徴と
   する請求項３および４記載のエステルの立体選択的製造
   方法。
6. 【請求項６】リパーゼがカンジダ・シリンドラッセ（Ｃ
   ａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）リパーゼＭＹ
   である請求項１、２、３、４および５記載のエステルの
   製造方法。