ITMI961686A1 - Procedimento per la produzione industriale di fosfatidilserina - Google Patents
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Description
"PROCEDIMENTO PER LA PRODUZIONE INDUSTRIALE DI FOSFATIDIL-SBRINA"
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la preparazione di fosfatidilserine di formula (I) , d'ora in avanti indicate genericamente con la sigla PS, mediante reazione di serina racema o enantiomericamente pura, preferibilmente di (L) -serina, con fosfatidi naturali, quali ad esempio lecitina da soia o lecitina da uovo, ovvero fosfatidi di origine sintetica, di formula generale (II), in presenza di Lina fosfolipasi D, d'ora in avanti indicate genericamente con la sigla PLD, dotata di attività transfosf atidilante , in un sistema bifasico acquoso/organico.
Nelle formule generali (I) e (II), R1 e R2, uguali o diversi tra loro, rappresentano un acile eventualmente mono o poliinsaturo;
X = OH ovvero OM, dove M = metallo alcalino, alcalinoterroso, ammonio o alchilammino (incluso il sale interno);
L'importanza dei composti di formula generale (I) è molteplice, in particolare nella produzione di composizioni farmaceutiche adatte per la terapia di sindromi cerebrali involutive di natura diversa quali ad esempio patologie vascolari su base aterosclerotica e non e/o decadimento senile, nella preparazione di particolari formulazioni liposomiali e più recentemente nella commercializzazione di composizioni dietetiche a base di lecitine naturali, in particolare lecitina di soia, arricchita in fosfatidil-(L)-serina, d'ora in avanti indicata con la sigla PS(L), contenente acidi grassi poliinsaturi quali residui acilici.
La richiesta da parte del mercato di quantità industriali crescenti e a costo contenuto di PS(L), ha spinto la richiedente ad effettuare un'intensa attività sperimentale al fine di individuare le condizioni per la preparazione di un siffatto prodotto che rispondessero ai requisiti di fattibilità su scala industriale.
In letteratura risultava infatti descritta in diverse pubblicazioni e brevetti la produzione di fosfatidi di formula generale (I) mediante l'impiego di PLD, quale catalizzatore enzimatico nella reazione di transfosfatidilazione. Tuttavia tali procedure, che si riferiscono a produzioni in scala laboratorio (qualche grammo}, presentano una serie di inconvenienti, che saranno di seguito elencati, che ne rendono problematico lo scale-up industriale.
In reazioni enzimatiche, inoltre, in particolare quando si usano enzimi non purificati, il tecnico del ramo sa che spesso la riproducibilità su scala industriale di procedure di laboratorio non è di facile attuazione.
E' importante tra l'altro ricordare che enzimi PLD sono in grado di catalizzare anche la reazione di idrolisi con acqua di fosfatidi ad acido fosfatidico, d'ora in avanti indicato con la sigla PA, in competizione con la reazione di transfosfatidilazione; la cinetica delle due reazioni è fortemente influenzata dalle condizioni di reazione e dall'origine del suddetto enzima.
Ad esempio Comfurius P. et al., Biochim. Biophys. Acta 488, 36 (1977) per primo descrive la produzione di una miscela circa 1/1 di PS(L) e di PA, per reazione sotto pressione a 45'C ed a pH 5,6, in un sistema bifasico etere etilico/acqua, di lecitina da uovo ovvero fosfatidilcoline di origine sintetica con L-serina in presenza di enzima PLD (da cavolo) parzialmente purificato.
La PS(L) viene successivamente purificata mediante cromatografia su cellulosa utilizzando come eluente una miscela di cloroformio/metanolo. E' ben chiaro che una simile procedura, sia per l'uso dell'etere etilico sia per la scarsa selettività, è inadatta per ima produzione industriale.
Risultati decisamente più interessanti sono stati riportati da Yamane T. et coll., Biochim. Biophys. Acta 1003, 277 (1989) dove sono confrontati enzimi PLD di origine diversa (da cavolo e da ceppi di Streptorayces) dotati di attività transfosfatidilante diversa nella conversione della PC con (D)- ed (L)-serina e viene effettuato uno studio di differenti parametri di reazione tra cui: pH, solvente, temperatura, concentrazione dei reagenti e dell'enzima (che viene anche studiato dopo immobilizzazione).
Il pH studiato varia tra 5,5-7,0; il sistema bifasico di solventi considerato più efficiente per l'enzima libero risulta costituito da etere etilico o da etilacetato con l'acqua mentre meno efficienti risultano solventi quali benzene, toluene e cloroformio; inoltre l'etilacetato è inadatto per l'enzima immobilizzato; la temperatura è compresa tra 20*C e 40*C e preferenzialmente le prove sono state condotte a 30*C, anche se la velocità di reazione cresce all'aumentare della temperatura; le prove sono state condotte ad una concentrazione 3,4 M in serina che rappresenta la solubilità di quest'ultima al pH 5,6 a 30’C, mentre la concentrazione di PC viene tenuta molto bassa (<53,4 irti, di solito 17,8 mM) e la concentrazione dell'enzima è 0,2-0,8 U/ral (un'unità è definita come la quantità di enzima che idrolizza in un minuto 1 pmol di PC pura a PA a 30* ± 0,5*C).
Utilizzando una fosfatidilcolina, d'ora in avanti indicata con la sigla PC, ad alta purezza, si otterrebbe una pressocchè totale conversione in PS nelle condizioni ottimali di reazione. A differenza di PLD da cavolo, PLD da batteri catalizzano in maniera analoga la transfosfatidilazione con (D)- e (L)-serina.
Nonostante gli indubbi progressi rispetto al metodo precedentemente impiegato non si può ancora parlare di metodo adatto all'industrializzazione anche perchè lo studio è stato effettuato al fine di trovare le condizioni ottimali utilizzando enzimi purificati e PC ad alta purezza, mentre nulla viene detto sull'uso di lecitine a basso costo e limitata purezza e sull'impiego di enzimi non purificati.
Ad esempio in JP-A-63 036,791 si utilizza carbone attivo, o altri supporti, in notevole quantità come assorbente per la serina e per la PLD, e sospendendo tale materiale in un solvente organico a basso contenuto d'acqua (preferenzialmente <0,2%, per diminuire la competitiva formazione di PA) dove è sciolto il fosfolipide; alternativamente tale supporto è caricato su colonna ed il solvente organico viene quindi eluito su colonna. Il tecnico del ramo può facilmente rendersi conto delle difficoltà a realizzare industrialmente un procedimento siffatto, in particolare per quanto riguarda l'intrappolamento sul medesimo supporto dell'enzima e del reattivo e per quanto concerne il basso tenore d'acqua.
Nella demanda di brevetto JP-A-63 036,792 si usa un sistema bifasico acqua/diisopropiletere come solvente con la PLD da cavolo operando sotto condizioni micellari. Lavorando su una lecitina di soia parzialmente purificata, con un contenuto di PC pari al 68%, si ottiene una conversione molto bassa ed il contenuto di PS(L) al termine della reazione risulta essere pari al 24%.
Risultati migliori sono riportati in JP-A-02 079,990 dove si usa PLD da Streptomyces in etil acetato; tuttavia anche usando come materia prima una fosfatidilcolina pura di origine sintetica la resa nella corrispondente PS(L) risulterebbe circa 68%, analogamente a quanto già esemplificato nella domanda di brevetto giapponese Kokai Tokkyo Koho JP 63 123,389 dove una PC da uovo in etere etilico era stata convertita in fosfatidil-D-serina, PS(D), per azione di PLD da Nocardiopsis o da Actinomadura.
Infine, Okahata Y. et al., J. Chem. Soc. Perkin trans. 1, 919 (1995) descrivono il vantaggio di usare PLD da Streptomyces ricoperta di lipidi, preparata a parte, in grado di svolgere l'attività catalitica in solvente organico a pH 5,5. Tale enzima risulterebbe molto più attivo dell'enzima grezzo per il quale spesso la reazione non va a completezza. Nonostante che nell'articolo si sottolinei il fatto che a pH più acidi intorno a 4 si abbia la massima velocità di reazione dell'enzima grezzo, questa in ogni caso risulta <2% della velocità di reazione dell'enzima ricoperto da lipidi. Utilizzando un sistema bifasico acqua/benzene come solvente, PC da uovo a 40 “C in 24 ore con l'enzima rivestito da lipidi si otterrebbe una PS(L) con una resa di circa 75%.
Da questi dati di letteratura il tecnico del ramo sarebbe spinto a dedurre la non convenienza d'uso o addirittura l'impossibilità d'uso di lecitine non purificate, la necessità di disporre di un enzima purificato o comunque non grezzo, di conseguenza costoso, la difficoltà di utilizzo di solventi industrialmente accettabili, poco tossici ed ecologicamente compatibili; inoltre la necessità di utilizzare un notevole eccesso di serina ne impone il riciclo e/o il recupero per una sintesi industrialmente accettabile ma la letteratura sopra citata fornisce solo indicazioni limitate. Infine nel caso in cui la selettività non risultasse ottimale la letteratura indicherebbe solo purificazioni cromatografiche per ottenere una PS ad alta purezza chimica.
Sorprendentemente, la presente invenzione fornisce un processo che permette di superare gli svantaggi e pregiudizi della tecnica nota, impiegando brodi di fermentazione di ceppi di microorganismi produttori di PLD extracellulare, eventualmente dializzati attraverso membrane con cut-off opportuno, in un sistema solvente bi fasico acqua/solvente organico, preferibilmente acqua/toluene.
L'invenzione fornisce pertanto un processo per la preparazione di composti (I) che comprende la reazione di fosfatidi (II) con serina racema o enantiomericamente pura, preferibilmente con L-serina, in presenza di fosfolipasi D grezza da brodi di fermentazione centrifugati di ceppi di microorganismi produttori di PLD extracellulare aventi alta attività di transfosfatidilazione.
L'invenzione, in un ulteriore aspetto, fornisce anche un nuovo ceppo di Streptorayces che produce una PLD extracellulare avente elevata attività di transfosfatidilazione.
Il ceppo è stato depositato presso ATCC il 13.10.1995, al numero di accesso 55717.
Il processo dell'invenzione può essere anche efficacemente effettuato con opportuni ceppi noti.
Il solvente organico preferito, toluene, fornisce un numero di vantaggi quali basso costo, bassa tossicità, compatibilità ambientale, elevata solubilità del fosfatide (II) e in particolare delle lecitine grezze e di PS, bassa solubilità della serina, con conseguente facilità di rimozione e recupero di questo amminoacido, presente in grande eccesso, dalla PS prodotta; compatibilità con l'attività enzimatica di PLD e capacità di fornire una reazione di transfosfatidilazione veloce e altamente selettiva (rapporto PS/PA).
Il toluene permette inoltre, dopo ripetute solubilizzazioni e concentrazioni, la completa rimozione dalla lecitina impiegata degli alcoli primari, in particolare etanolo, che sono presenti fino allo 0,5% nella lecitina commerciale. Questi alcoli sono estremamente reattivi come competitori della serina nella reazione di transfosfatidilazione e potrebbero fornire fosfatidi non desiderati, quale fosfatidiletanolo, fino all'8% con una conseguente diminuzione nella qualità e resa di PS.
La reazione è preferibilmente effettuata a 25* 5"C a valori di pH variabili da 4 a 4,5, a differenza dei metodi noti in cui il era superiore a 5. Inoltre, in contrasto con i risultati riportati in precedenza, abbiamo osservato una selettività diminuita quando la temperatura di reazione era > a 40*C. Le altre condizioni di reazione, quali le procedure di agitazione e di aggiunta, cosi come la presenza di additivi «piali ioni di metalli alcalini o alcalino-terrosi, sono convenzionali e possono essere facilmente determinati dagli esperti nella tecnica.
Sorprendentemente, il processo dell’invenzione può essere vantaggiosamente applicato sia a lecitine ad elevata purezza quali Epilcuron 200^®) (PC di soia al 95%, disponibile da Lucas Meyer) sia a lecitine a basso costo e purezza quali Epikuron(R)l35 (Lucas Meyer), costituite da una miscela di PC (35%) e PE (8%) e trigliceridi (50%); lo stesso vale per PC da uovo, quale 0vothin^ )l60 (60% PC da uovo, Lucas Meyer) o fosfatidi sintetici di formula (II).
Infine, l'invenzione fornisce anche un metodo per la purificazione della PS ottenuta, basandosi sui diversi coefficienti di partizione in sistemi solventi organici bifasici di fosfatidi quali PS, PA, PC, PE e i corrispondenti lisofosfatidi sotto forma dei sali corrispondenti, in particolare i corrispondenti sali di calcio nel sistema difasico eptano/metanolo .
E' possibile aumentare, con una resa del 90%, la purezza di PS(L) ottenuta da Epikuron 200 dall'88% al 95% grazie alla sua ripartizione preferenziale nella fase eptanica; analogamente, la purezza di un PS(L) ottenuta da Epikuron 135 fu aumentata dal 58% a circa 1*80%. Infine, un'ulteriore purificazione di PS può essere ottenuta per cristallizzazione da eptano/acetone sotto forma del sale di calcio e successiva conversione in un altro sale qualunque, secondo tecniche convenzionali.
La serina può essere recuperata secondo metodi diversi. Un primo metodo comprende la concentrazione parziale sotto pressione ridotta della soluzione acquosa dalla reazione di transfosfatidilazione, dopo separazione della fase toluenica e dopo trattamento con carbone attivo, e la cristallizzazione di serina da detta soluzione. Alternativamente, è possibile riciclare la fase acquosa dalla reazione completata in una successiva lavorazione, evitando l'isolamento della serina contenuta. Ciò è effettuato trattando la fase acquosa con carbone attivo, rimuovendo sali inorganici e di colina per elettrodialisi a pH 5,7, che è il pH isoelettrico della serina, in un dispositivo di elettrodialisi a flusso tangenziale, mantenendo il valore di costante durante l'elettrodialisi; la soluzione acquosa risultante può essere impegnata come tale o dopo eventuale concentrazione della soluzione acquosa sotto vuoto o per osmosi inversa.
Può anche essere effettuato un processo simile impiegando, invece di elettrodialisi, resine a scambio ionico per rimuovere sali inorganici e di colina e concentrare quindi la soluzione acquosa con le procedure sopra menzionate.
11 processo dell'invenzione può essere convenientemente inpiegato per la preparazione di fosfatidil-(L)-serine dove R1 e R2 sono catene aciliche degli acidi paimitico, stearico, oleico, linoleico in proporzioni simili a quelle della lecitina di soia o in cui R1 e R2 sono catene aciliche degli acidi palmitico, stearico, palmitoleico, oleico, linoleico, arachidonico in proporzioni simili a quelle della lecitina di uovo.
Le procedure riportate in seguito esemplificano ulteriormente l'invenzione.
Esempio 1
Preparazione del catalizzatore PLD. Procedura generale
I diversi ceppi di Streptomyces utilizzati sono stati fatti crescere sotto agitazione per 24 ore in beute da 1 1 contenenti 200 mi di un mezzo costituito da glucosio (10 g/1), estratto di lievito (20 g/1), peptone (5 g/1), eptaidrato (0,5 g/1) ad un pH 7 per aggiunta di HC1 1M. Le culture sono state utilizzate per inoculare fermentatori da 10 1 contenenti 5 1 del medesimo mezzo nutritivo, contenente se necessario un antischiuma, e la fermentazione è stata mantenuta per 24 ore a 30*C, sotto flusso di aria con un'agitazione di 500 rpm, mantenendo costante il valore di pH ad un valore di 7 per aggiunta automatica di 0,1 M o di HCl 0,1 M. Al termine il brodo è stato centrifugato e conservato a 4‘C.
La fermentazione industriale è stata condotta con modalità analoghe in un reattore da 2.000 1, arrivando dopo 23 ore ad un'attività finale del brodo di 2-3 Ku/1 di PLD, determinata mediante il test descritto in letteratura [Biotechn. Techn., 7, 795 (1993)]. Il brodo di fermentazione così prodotto, dopo centrifugazione, è stato utilizzato tal quale o dopo concentrazione a circa 1/10 del volume iniziale, ad un pH tamponato ad un valore di 5,6 con impiego di sodio acetato 0,1 M, mediante ultrafiltrazione attraverso membrane Millipore aventi un cut-off di 10.000 daltons.
Preparazione di PS(L) a partire da lecitina di soia Epikuron 200
In un reattore da 1.000 mi di caricano, sotto azoto, 20 g di Epikuron 200 (Lucas Meyer) e 100 mi di toluene e la soluzione viene concentrata sotto vuoto distillando circa 80 mi di solvente. Toluene fresco viene reintegrato e la soluzione nuovamente concentrata a pressione ridotta. L'operazione si ripete fino a verifica di un contenuto di etanolo ovvero di altri alcoli usualmente presenti nella lecitina commerciale, minore di 20 ppm. Il residuo viene ripreso con toluene fresco fino ad un volume di 400 mi e addizionato di 94,5 g di (L)-serina. Alla sospensione così ottenuta si aggiunge la soluzione acquosa (300 mi) contenente PLD da ATCC 55717, preparata secondo le modalità dell'esempio 1 e avente un'attività enzimatica di 2 U/ral, addizionata a 10’C di 33,4 g di calcio cloruro, 4,08 g di sodio acetato triidrato e circa 3 g di acido acetico glaciale per ottenere un pH di circa 4,5. Il sistema bifasico così ottenuto viene riscaldato ad una temperatura di 25* ± 2'C e mantenuto sotto vigorosa agitazione per circa 6 ore. La miscela viene quindi filtrata su un pannello di decalite che viene ulteriormente lavato con 2x100 mi di toluene; la fase organica viene separata dalla fase acquosa, contenente l'eccesso di serina, e concentrata a pressione ridotta per dare un residuo (22,3 g) che viene ripreso con 525 mi di n-eptano e 171 mi di metanolo. La fase inferiore metanolica viene scartata mentre quella superiore ulteriormente estratta con 220 mi di metanolo. La fase superiore dopo separazione viene concentrata sotto vuoto a piccolo volume e addizionata sotto agitazione a -5*C di 400 mi di acetone a dare dopo filtrazione ed essiccamento sotto vuoto 15 g di PS(L) sale di calcio a titolo HPLC 97% (contenuto di PA <3%).
La fase acquosa contenente la serina viene trattata con 16 g di carbone decolorante e filtrata su decalite. Successivamente viene concentrata sotto vuoto (30 mmHg) distillando via circa il 70% del solvente; quindi raffreddata per dare dopo filtrazione ed essiccamento a 50*C circa 52 g di (L)-serina pura. Le acque madri contenenti il resto della serina (circa 43 g) vengono addizionate alla fase acquosa derivanti da una ulteriore sintesi di PS per un successivo recupero. Esempio 3
Preparazione di PS(L) a partire da lecitina di soia Boikuron 135
In un reattore inox da 5.000 1 vengono caricati sotto azoto 400 kg di Epikuron 135 (Lucas Meyer), 3.000 1 di toluene, 100 1 di acqua e la miscela viene concentrata sotto vuoto distillando a 45’C circa 1.000 1 di solventi. In un altro reattore inox da 6.0001 vengono caricati 1.355 1 di brodo di fermentazione da ATCC 55717, contenenti circa 3 KU/1 PLD, 22,7 kg di calcio cloruro, 27,6 kg di sodio acetato triidrato, e a 10*C 22 1 di acido acetico 80% 625 kg di L-serina (pH) finale (4,2). Le due soluzioni vengono riunite e la miscela risultante, sotto vigorosa agitazione, viene scaldata e mantenuta a 25*C per 8 ore. Da analisi HPLC il contenuto di PS(L) è circa 75% del totale dei fosfolipidi. La miscela viene quindi addizionata di una sospensione di 36 kg di decalite in 500 1 di toluene e filtrata lavando il filtro con 400 1 di toluene/acqua (3/1, V/V). La fase acquosa viene quindi separata e trattata per il recupero della (L)-serina in maniera analoga a quanto descritto nel successivo Esempio 7, mentre la fase organica dopo ulteriore filtrazione su decalite viene concentrata sotto vuoto fino ad un residuo di circa 440 kg, che viene ripreso con 5.000 1 di acetone e lasciato in agitazione per circa 6 ore a temperatura ambiente. Dopo aver raffreddato la miscela a 0*C il prodotto viene filtrato per dare circa 323 kg iznidi di PS(L) sale di calcio (titolo 50%).
Il prodotto viene ulteriormente purificato per trattamento con 2.000 1 di acetone per dare dopo essiccamento circa 273 kg di PS(L) sale di calcio (titolo 58%).
Un campione di 20 g è stato purificato mediante estrazione da eptano/metanolo, analogamente a quanto descritto nell'Esenpio 2 per dare 11,6 g di PS(L) sale di calcio (titolo 80%).
Esempio 4
Preparazione di PS(L) a partire da lecitina da uovo
In un reattore da 500 mi si caricano, sotto azoto,’ 13 g di Ovothin 160 (60% PC; Lucas Meyer), 158 mi di toluene e 38 g di (L)-serina. Alla sospensione cosi ottenuta si aggiunge la soluzione acquosa (300 mi) contenente PLD da ATCC 55717, preparata secondo la modalità dell'Esempio 1 e avente un'attività enzimatica di 2 U/ml, addizionata a 10*C di 1,4 g di calcio cloruro, 1,7 g di sodio acetato triidrato e acido acetico glaciale necessario per ottenere un pH circa 4,1. Il sistema bifasico così ottenuto viene riscaldato ad una temperatura di 25* ± 2*C e mantenuto sotto vigorosa agitazione per circa 6 ore. La miscela viene quindi filtrata su un pannello di decalite che viene ulteriormente lavato con 2x100 mi di toluene; la fase organica viene separata dalla fase acquosa, contenente l'eccesso di serina, e concentrata a pressione ridotta per dare un residuo che viene ripreso con 320 mi di n-eptano e 100 mi di metanolo. La fase inferiore metanolica viene scartata mentre quella superiore, diluita con 35 mi di eptano, viene ulteriormente estratta con 95 mi di metanolo. La fase superiore dopo separazione viene concentrata sotto vuoto a piccolo volume e addizionata sotto agitazione a -5“C di 250 mi di acetone a dare dopo filtrazione ed essiccamento sotto vuoto 7,3 g di PS(L) sale di calcio a titolo HPLC 84%.
Esempio 5
Preparazione di DLPS(L) a partire da DLPC
Operando in modo analogo a quanto descritto nell'Esempio 2, ma utilizzando come materiale prima 20 g di L-a-dilinoneilfosfatidiloolina, indicata con la sigla DLPC, al posto dei 20 g di Epikuron 200 si sono ottenuti 15,1 g di L-a-dilinoneilfosfatidil-L-serina, indicata con la sigla DLPS(L), sotto forma di sale di calcio (purezza HPLC 96%).
Esempio 6
Recupero e riciclo della L-serina
Una soluzione acquosa (10 1), ottenuta al termine di ima reazione di transfosfatidilazione, condotta secondo le modalità dell'Esempio 3, dopo separazione della soluzione toluenica e filtrazione su decalite, è stata trattata con 0,3 kg di carbone decolorante e portata ad un valore di di 5,7 per aggiunta di una soluzione acquosa di NaOH 30%. la soluzione così ottenuta è stata mantenuta per 4 ore in un'apparecchiatura di elettrodialisi a flusso tangenziale, mantenendo il pH del comparto di alimentazione al valore di pH = 5,7 ± 0,5.
La conducibilità del comparto di alimentazione durante tale periodo è passata dal valore iniziale di 12.700 μ Siemens/cm al valore finale di 480 μ Siemens/cm. La soluzione acquosa di L-serina (recupero dell'amminoacido pari al 97%), opportunamente concentrata mediante osmosi inversa, è stata riutilizzata al posto di L-serina fresca solida in una successiva reazione di transfosfatidilazione con analoghi risultati.
Claims (14)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la preparazione di conposti di formula (I) (I) nella quale uguali o diversi tra loro rappresentano un acile eventualmente mono o poliinsaturo; X = OH ovvero OM, dove M = metallo alcalino, alcalinoterroso, ammonio o alchilammonio (incluso il sale interno); caratterizzato dell fatto che fosfatidi di formula generale (II); (II) nelle quali e X hanno i significati sopra definiti edvengono fatti reagire con serina racema o enantiomericamente pura, e preferenzialmente con {L)-serina, in un sistema bifasico acqua/solvente organico in presenza di una fosfolipasi D da brodi di fermentazione centrifugati di ceppi di microorganismi, produttori di PLD extracellulare ad elevata capacità di transfosfatidilazione.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui il solvente è toluene .
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che i fosfatidi di formula generale (II) sono miscele di fosfatidilcolina e/o etanolammina di origine naturale, scelte fra lecitine di soia o da uovo, a titolo in fosfolipidi compreso tra 20% e 95%.
- 4. Procedimento come definito nella rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che il pH di reazione è conpreso tra 4 e 4,5.
- 5. Procedimento come definito nella rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che la temperatura di reazione è 25* ± 5*C.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la fosfolipasi D grezza è prodotta dal ceppo di Streptomyces ATCC 55717.
- 7. Procedimento secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di fosfatidii-(L)-serina, caratterizzato dal fatto che e sono i residui acilici derivanti da acido palmitioo, stearico, oleico, linoleico e linolenico, presenti nelle proporzioni analoghe a quelle riscontrate nella lecitina di soia.
- 8. Procedimento secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di fosfatidii-(L)-serina in cui R^ e R^ sono catene aciliche degli acidi paimitico, stearico, palmitoleico, oleico, linoleico, arachidonioo in preparazioni simili a quelle di lecitine di uovo.
- 9. Procedimento di purificazione di fosfatidilserine sotto forma di sali alcalini, alcalinoterrosi, ammonio o alchilamnonio mediante estrazione selettiva di miscele di fosfolipidi contenenti PS in sistemi bifasici di solventi organici.
- 10. Procedimento secondo la rivendicazione 9 caratterizzato dal fatto che la fosfatidilserina è purificata parzialmente o totalmente da altri fosfolipidi, in particolare PC, PE, PA e dai corrispondenti lisofosfolipidi, mediante estrazione selettiva del corrispondente sale di calcio da una miscela di eptano/metanolo.
- 11. Procedimento per l'ulteriore purificazione di fosfatidilserina ottenuta secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che la fosfatidilserina viene cristallizzata da eptano/acetone, sotto forma di sale di calcio, e convertita successivamente, secondo tecnica nota, in qualsivoglia altro sale.
- 12. Procedimento di recupero di L-serina, cane solido cristallino da soluzioni acquose di una reazione di transfosfatidilazione condotta secondo le modalità della rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che dopo separazione della fase organica detta fase acquosa è parzialmente concentrata sotto vuoto per permettere la precipitazione della L-serina cristallina.
- 13. Procedimento di recupero di L-serina, sotto forma di una soluzione acquosa priva di sali inorganici e di sali di colina, a partire da soluzioni acquose ottenute al termine di una reazione di transfosfatidilazione condotta secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, dopo filtrazione, separazione della fase organica, tale fase acquosa è sottoposta ad elettrodialisi ad un valore di pH = 5,7 ± 0,5 o alternativamente trattate con resine a scambio ionico.
- 14. Il ceppo di Streptomyces depositato alla American Type Culture Collection ATCC al numero 55717 il 13.10.1995.
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