DE69613801T3

DE69613801T3 - Verfahren zur industriellen Herstellung von Phosphatidylserine

Info

Publication number: DE69613801T3
Application number: DE69613801.8T
Authority: DE
Inventors: Lorenzo De Ferra; Pietro Massardo; Oreste Piccolo; Stefano Servi
Original assignee: Chemi SpA
Current assignee: Chemi SpA
Priority date: 1995-12-08
Filing date: 1996-12-03
Publication date: 2014-12-18
Anticipated expiration: 2016-12-04
Also published as: EP0776976A2; EP0922707B1; DE69616834T3; US5700668A; EP0776976B1; KR970043060A; DE69616834D1; IT1316435B1; ITMI961686A1; ES2105999T1; KR100446399B1; ATE203057T1; DE69613801T2; ES2105999T5; DE776976T1; EP0922707B2; JPH09173092A; EP0922707A1; EP0776976B2; DE69613801D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserinen der Formel (I), im folgenden als PS bezeichnet, durch Umsetzung von racemischem oder enantiomerenreinem Serin, bevorzugt (L)-Serin, mit natürlichen Phosphatiden wie Sojabohnen- oder Eilecithin oder mit synthetischen Phosphatiden der Formel (II), in Gegenwart einer Phospholipase D, im folgenden als PLD bezeichnet, mit transphosphatidylierender Aktivität, in einem diphasischen, wässrigen/organischen System.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben die allgemeinen Formeln (I) und (II):
wobei R¹ und R², die gleich oder verschieden sind, ausgewählt werden aus einem C₁₀-C₃₀ gesättigten, mono- oder polyungesättigten Acyl; X = OH oder OM, wobei M ein Alkali-, Erdalkalimetall, Ammonium oder Alkylammonium ist;
R₃ = CH₂CH₂NH₂ oder CH₂CH₂N⁺(CH₃)₃.
Die Bedeutung der Verbindungen (I) ist verschiedenartig, insbesondere bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Therapie von involutiven zerebralen Syndromen verschiedenen Ursprungs, wie vaskulären Pathologien auf atherosklerotischer Basis oder nicht, und/oder senilem Verfall; zur Herstellung von Liposomenformulierungen und in neuerer Zeit für diätetische Zusammensetzungen, umfassend natürliche Lecithine, insbesondere Sojalecithin, die mit Phosphatidyl-L-Serin angereichert sind, im folgenden als PS(L) bezeichnet, welche polyungesättigte Fettsäuren als Acylreste enthalten.
Die steigende Nachfrage nach industriellen Mengen an PS(L) zu vernünftigen Kosten veranlasste den Anmelder durch Durchführung einer gründlichen Untersuchung zur Erfüllung eines solchen Bedarfs.
Die Herstellung von Phosphatiden (I) mit Hilfe von PLD als enzymatischem Katalysator bei der Transphosphatidylierungsreaktion ist bereits bekannt. Die bekannten Verfahren betreffen jedoch die Labormaßstabsherstellung (einige Gramm) und leiden an einer Reihe von Nachteilen, die im Folgenden spezifiziert sind, und die ihre industrielle Maßstabsvergrößerung verhindern.
Es ist auch bekannt, dass die industrielle Reproduzierbarkeit von Laborverfahren für enzymatische Reaktionen, insbesondere bei Verwendung roher Enzyme, nicht leicht bewältigt werden kann.
Es ist darüber hinaus wichtig zu erwähnen, dass PLD-Enzyme auch dazu fähig sind, die wässrige Hydrolyse von Phosphatiden unter Bildung von Phosphatidinsäure zu katalysieren, im Folgenden als PA bezeichnet, im Wettbewerb mit der Transphosphatidylierungsreaktion, wobei die Kinetiken beider Reaktionen in starkem Maße durch die Reaktionsbedingungen und durch den Ursprung dieses Enzyms beeinflusst werden.
Beispielsweise offenbart Comfurius P. el dl. Biochim. Biophys. Acta 488, 36 (1977) als erster die Herstellung einer etwa 1/1-Mischung von PS(L) und PA durch Reaktion von Eilecithin oder synthetischen Phosphatidylcholinen mit L-Serin in Gegenwart von teilweise gereinigtem PLD-Enzym (aus Kohl) unter Druck bei 45°C und pH 5,6.
PS(L) wird dann durch Chromatographie aus Cellulose unter Verwendung einer Chloroform/Methanol-Mischung als Eluens gereinigt. Es ist offensichtlich, dass ein solches Verfahren nicht für die industrielle Produktion geeignet ist, sowohl aufgrund der Verwendung von Ethylether als auch wegen der niedrigen Selektivität. Über interessantere Ergebnisse wurde von Yamane T. et al. Biochim. Biophys. Acta 1003, 277 (1989) berichtet, wobei PLD-Enzyme verschiedenen Ursprungs (aus Kohl und aus Streptomyces-Stämmen) mit verschiedenen Transphosphatidylierungs-Aktivitäten in der PC-Umwandlung mit (D)- und (L)-Serin verglichen wurden; eine Untersuchung der verschiedenen Reaktionsparameter wie pH, Lösungsmittel, Temperatur, Reagenz- und Enzymkonzentration (auch nach Immobilisierung untersucht) wurde ebenfalls durchgeführt.
Der betrachtete pH reichte von 5,5 bis 7,0, wobei das effektivste diphasische Lösungsmittelsystem für das freie Enzym Ethylether-Wasser oder Ethylacetat-Wasser war, während Lösungsmittel wie Benzol, Toluol und Chloroform weniger wirksam sind; darüber hinaus ist Ethylacetat für das immobilisierte Enzym nicht geeignet. Die Temperatur reicht von 20°C bis 40°C, und die Tests wurden bevorzugt bei 30°C durchgeführt, obwohl die Reaktionsgeschwindigkeit mit der Temperatur ansteigt; die Tests wurden bei einer 3,4 M-Serinkonzentration durchgeführt, welche dessen Löslichkeit bei pH 5,6 bei 30°C entsprechen, während die PC-Konzentration sehr niedrig gehalten wird (< 53,4 mMol, üblicherweise 17,8 mMol) und die Enzymkonzentration 0,2 bis 0,8 U/ml beträgt (eine Einheit wird als Enzymmenge definiert, die in einer Minute bei 30° ± 0,5°C 1 μMol reines PC zu PA hydrolysiert).
Unter Verwendung eines hoch reinen Phosphatidylcholins, im Folgenden als PC bezeichnet, würde eine fast vollständige Umwandlung von PS unter optimalen Reaktionsbedingungen erzielt. Im Unterschied zu PLD aus Kohl katalysieren bakterielle PLDs die Transphosphatidylierung mit (D)- und (L)-Serin in gleicher Weise.
Ungeachtet der Vorteile gegenüber der zuvor verwendeten Methode kann dieses Verfahren immer noch nicht als industriell anwendbar angesehen werden, da die Studie darauf zielte, die optimalen Bedingungen unter Verwendung von gereinigten Enzymen und hochreinem PC zu finden, während nichts über die Verwendung von günstigen und weniger reinen Lecithinen und die Verwendung von nicht gereinigten Enzymen berichtet wird.
JP-A-63 036,791 offenbart die Verwendung von Aktivkohle und anderen Trägern in großen Mengen als Adsorber für Serin und PLD, wobei dieses Material in einem Lösungsmittel mit niedrigem Wassergehalt (bevorzugt < 0,2%) suspendiert wird, worin das Phospholipid sich löst, so dass die kompetitive Bildung von PA vermindert wird. Alternativ wird dieser Träger auf eine Säule gegeben, und das organische Lösungsmittel wird durch die Säule eluiert. Dieses Verfahren lässt sich industriell nur schwierig anwenden, da das Enzym und das Substrat auf demselben Träger abgefangen werden sollten und ein niedriger Wassergehalt erforderlich ist.
JP-B-63 036,792 offenbart die Verwendung von Kohl-PLD in einem diphasischen Wasser/Diisopropylether-System als Lösungsmittel, wobei unter Micellen-Bedingungen gearbeitet wird. Ein sehr niedriger Umsatz wird ausgehend von partiell gereinigtem Sojalecithin mit einem PC-Gehalt von etwa 68% erzielt, wobei der PS(L)-Gehalt am Ende der Reaktion 24% beträgt.
Über bessere Ergebnisse wurde in JP-B-02 079,996 berichtet, wo ein Streptomyces-PLD in Ethylacetat verwendet wird; sogar bei Verwendung eines synthetischen, reinen Phosphatidylcholins als Ausgangsmaterial ist die Ausbeute des entsprechenden PS(L) etwa 68%, ähnlich wie die in JP-B-63 123,389 angegebene, bei der ein Ei-PC in Ethylether mit Hilfe eines Nocardiopsis- oder Actinomadura-PLD in PS(D) umgewandelt wurde.
Schließlich offenbaren Okahata Y. et al. J. Chem. Soc. Perkin trans. 1, 919 (1995) die Verwendung von Streptomyces-PLD, beschichtet mit Lipiden, die separat hergestellt wurden, die zur Ausübung der katalytischen Aktivität in einem organischen Lösungsmittel bei pH 5,5 fähig sind. Dieses Enzym sollte viel aktiver sein als das rohe Enzym, mit dem die Reaktion häufig nicht vollständig ist. Trotz der Angabe im Artikel, dass die maximale Reaktionsgeschwindigkeit des rohen Enzyms bei saurem pH-Wert von etwa 4 erzielt wird, ist die Reaktionsgeschwindigkeit dennoch < 2% der des Lipid beschichteten Enzyms.
Unter Verwendung eines diphasischen Wasser/Benzol-Systems als Lösungsmittel und von Ei-PC bei 49°C in 24 Stunden würde mit dem Lipid beschichteten Enzym ein PS(L) in etwa 75% Ausbeute erhalten.
Aus den Lehren des oben diskutierten Stands der Technik würden Fachleute schließen, dass:

– die Verwendung von rohen Lecithinen nicht günstig oder sogar unmöglich ist;
– die Verwendung von gereinigtem oder mindestens nicht rohem und daher teurem Enzym notwendig ist;
– industriell akzeptabel, nicht toxische, umweltkompatible Lösungsmittel schwierig verwendbar sind;
– ein deutlicher Serinüberschuss notwendig ist, was daher die Notwendigkeit zur Isolierung oder Recyclierung von Serin beinhaltet. Darüber hinaus sind die in den obigen Methoden offenbarten chromatographischen Verfahren weitere Gründe gegen die industrielle Anwendbarkeit dieser Methoden.

Überraschenderweise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, welches die Überwindung der Nachteile und Vorurteile des Stands der Technik ermöglicht, unter Verwendung von Fermentationsflüssigkeiten von Mikroorganismus-Stamm-Produzenten von extrazellulärer PLD, wahlweise dialysiert durch Membranen mit geeignetem Cut-Off, in einem diphasischen Wasser/organischen Lösungsmittel-System, worin entweder das organische Lösungsmittel Toluol ist oder der pH-Wert der Reaktion im Bereich von 4 bis 4,5 liegt.
Die Erfindung stellt daher ein Verfahren für die Herstellung von Verbindungen (I) bereit, umfassend die Reaktion von Phosphathiden (II) mit racemischem oder enantiomerenreinem Serin, bevorzugt mit L-Serin, in Gegenwart von roher Phospholiphase D aus zentrifugierten Fermentationsflüssigkeiten von Mikroorganismus-Stämmen, die extrazelluläre PLD mit hoher Transphosphatidylierungsaktivität produzieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann effizient mit geeigneten bekannten Stämmen durchgeführt werden.
Das bevorzugte organische Lösungsmittel, Toluol, bietet eine Anzahl von Vorteil wie niedrige Kosten, niedrige Toxizität, Umweltkompatibilität, hohe Löslichkeit von Phosphatid (II) und insbesondere rohen Lecithinen und PS, niedrige Löslichkeit von Serin, was die Entfernung und Isolierung dieser Aminosäure, die in großem Überschuss anwesend ist, aus dem produzierten PS ermöglicht; Kompatibilität mit der enzymatischen Aktivität von PLD und Ermöglichen einer ausreichend schnellen und hochselektiven (PS zu PA-Verhältnis) Transphosphatidylierungsreaktion.
Toluol ermöglicht darüber hinaus durch wiederholte Solubilisierungen und Konzentrationen die vollständige Entfernung der primären Alkohole, insbesondere Ethanol, die bis zu 0,5% in kommerziellem Lecithin vorhanden sind, von dem verwendeten Lecithin. Diese Alkohole sind extrem reaktiv als Serinkompetitoren in der Transphosphatidylierungsreaktion und könnten ungewünschte Phosphatide liefern, wie Phosphatidylethanol, bis zu 8% mit einem dementsprechenden Absinken der PS-Qualität und -ausbeule.
Die Reaktion wird bevorzugt bei 25° ± 5°C bei pH-Werten im Bereich von 4 bis 4,5 durchgeführt, während die pH-Werte der Methoden des Stands der Technik über 5 lag. Darüber hinaus haben wir im Gegensatz zu zuvor Ergebnissen eine verminderte Selektivität beobachtet, wenn die Reaktionstemperatur ≥ 40°C war. Die weiteren Reaktionsbedingungen wie Rühren und Zugabeverfahren, genauso wie die Gegenwart von Additiven wie Alkali- oder Erdalkalimetallionen, sind üblich und können leicht durch die Fachleute bestimmt werden.
Überraschenderweise kann das erfindungsgemäße Verfahren sowohl auf hochreine Lecithine wie Epikuron 200^® (95% Soja-PC, erhältlich von Lucas Meyer) als auch auf preisgünstige Lecithine niedriger Reinheit wie Epikuron^® 135 (Lucas Meyer) angewendet werden, das aus einem Gemisch von PC (35%) und PE (8%) und Triglyceriden (50%) besteht; dasselbe trifft für Ei-PC wie Ovothin 160^® (60% Ei-PC, Lucos Meyer) oder synthetische Phosphatide der Formel (II) zu.
Es ist dank seiner bevorzugten Lösung in der Heptanphase möglich, in 90%iger Ausbeute die Reinheit eines aus Epikuron 200^® erhaltenen PS(L) von 98% auf 95% zu sleigern,; auf gleiche Weise wurde die Reinheit eines aus Epikuron 135^® erhaltenen PS(L) von 58% auf etwa 80% erhöht. Schließlich kann eine weitere Reinigung von PS durch Kristallisation aus Heptan/Aceton in Form des Calciumsalzes und anschließende Umwandlung in jedes andere Salz entsprechend üblichen Techniken erzielt werden.
Serin kann nach verschiedenen Methoden isoliert werden. Eine erste Methode umfasst die partielle Konzentration unter reduziertem Druck der wässrigen Lösung aus der Transphosphatidylierungsreaktion nach Abtrennung der Toluolphase und nach Behandlung mit Aktivkohle, und die Kristallisation von Serin aus dieser Lösung. Alternativ ist es möglich, de wässrige Phase aus der beendeten Reaktion in eine nachfolgende Charge zurückzuführen, wobei die Isolierung des enthaltenen Serins vermieden wird. Dies wird durch Behandlung der wässrigen Phase mit Aktivkohle, Entfernen von anorganischen und Cholin-Salzen durch Elektrodialyse bei pH 5,7, was der isoelektrische Serin-pH ist, in einer Tangentialfluß-Elektrodialyseapparatur, wobei der pH-Wert während der Elektrolyse konstant gehalten wird, bewirkt; die resultierende wässrige Lösung kann als solche oder nach wahlweiser Konzentration der wässrigen Lösung unter Vakuum oder durch umgekehrte Osmose verwendet werden.
Ein ähnliches Verfahren kann auch durchgeführt werden unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen anstelle der Elektrodialyse zur Entfernung von anorgonischen und Cholin-Salzen und anschließendes Konzentrieren der wässrigen Lösung mit den oben genannten Verfahren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann bequem für die Herstellung von Phosphatidyl-(L)-Serinen angewendet werden, wobei R₁ und R₂ Acylketten von Palmitin-, Stearin-, Öl-, Linolensäuren sind, in gleichen Verhältnissen wie denjenigen von Sojalecithin, oder wobei R₁ und R₂ Acylketten von Palmitin-, Stearin-, Palmitolein-, Öl-, Linolen-, Arochidonsäure sind, in gleichen Verhältnissen wie denjenigen von Eilecithin.
Die im Folgenden angegebenen Verfahren verdeutlichen die Erfindung weiter durch Beispiele.
Beispiel 1
Herstellung des PLD-Katalysators. Allgemeines Verfahren.
Die verschiedenen verwendeten Stämme von Streptomyces wurden) bei pH 7 durch Zugabe von 1M HCl unter Rühren während 24 Stunden in 1 l-Kolben gezüchtet, enthaltend 200 ml eines Mediums, bestehend aus Glucose (10 g/l), Hefeextrakt (20 g/l), Pepton (5 g/l), K₂HPO₄ (2 g/l), MgSO₄-Heptahydrat (0,5 g/l.
Die Kulturen wurden zum Animpfen von 10 l Fermentern verwendet, enthaltend 5 l desselben Nährmediums, und ein Antischaummittel, falls notwendig, und die Fermentation wurde während 24 Stunden bei 30°C unter einem Luftstrom unter Rühren bei 500 Upm fortgesetzt, wobei ein konstanter pH-Wert von 7 durch automatische Zugabe von 0,1 M NaOH oder 0,1 M HCl aufrecht erhalten wurde. Gegen Ende wurde die Kulturflüssigkeit zentrifugiert und bei 4°C gelagert.
Die industrielle Fermentation wurde mit gleichen Verfahren in einem 2000 l-Reaktor durchgeführt, wobei nach 23 Stunden eine Endaktivität der Kulturflüssigkeit von 2–3 Ku/I PLD erzielt wurde, bestimmt nach dem in der Literatur beschriebenen Test [Biotechn. Techn., 7, 795 (1993)]. Die resultierende Fermenationskulturflüssigkeit wurde zentrifugiert und als solche oder nach Konzentration auf etwa 1/10 des Ausgangsvolumens durch Ultrafiltration durch Millipore-Membranen mit einem Cut-Off von 10000 Dalton bei einem pH, der durch Verwendung von 0,1 M Natriumacetat auf einen Wert von 5,6 gepuffert wurde, verwendet.
Beispiel 2
Herstellung von PS(L) ausgehend von Sojalecithin Epikuron 200
20 g Epikuron 200^® (Lucas Meyer) und 100 ml Toluol werden unter Stickstoff in einen 1000 ml-Reaktor gegeben, und die Lösung wird unter Vakuum durch Abdestillieren von etwa 80 ml des Lösungsmittels konzentriert. Frisches Toluol wird zugegeben, und die Lösung wird erneut unter reduziertem Druckkonzentriert. Das Verfahren wird wiederholt, bis ein Gehalt an Ethanol oder anderen C₁-C₄-Alkoholen, die üblicherweise in kommerziellem Lecithin vorhanden sind, unter 20 ppm erreicht wird. Der Rückstand wird in frischem Toluol bis auf ein Volumen von 400 ml aufgenommen und mit 94,5 g (L)-Serin versetzt. Die resultierende Suspension wird mit der wässrigen Lösung (300 ml) versetzt, die PLD aus ATCC 55717 enthielt, hergestellt nach dem Verfahren aus Beispiel 1 mit einer enzymatischen Aktivität von 2 U/ml, und bei 10°C mit 3,34 g Calciumchlorid, 4,08 g Natriumacetattrihydrat und etwa 3 g Eisessigsäure versetzt, so dass ein pH um 4,5 erzielt wurde. Das resultierende diphasische System wird auf eine Temperatur von 25° ± 2°C erhitzt und während etwa 6 Stunden heftig gerührt. Die Mischung wird dann über Decalite filtriert, welches weiter mit 2 × 100 ml Toluol gewaschen wird; die organische Phase wird von der wässrigen Phase, die den Serinüberschuss enthält, abgetrennt und unter reduziertem Druck konzentriert, wobei ein Rückstand (22,3 g) erhalten wurde, der in 525 ml n-Heptan und 171 ml Methanol aufgenommen wurde. Die untere Methanolphase wird verworfen, während die obere weiter mit 220 ml Methanol extrahiert wird. Nach der Abtrennung wird die obere Phase unter Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert, unter Rühren bei –5°C mit 400 ml Aceton versetzt, filtriert und unter Vakuum getrocknet und ergibt 15 g PS(L)-Calciumsalz mit einem 97% HPLC (PA-Gehalt < 3%).
Die Serin enthaltende wässrige Phase wird mit 16 g Aktivkohle behandelt und auf Decalite filtriert; anschließend wird sie unter Vakuum (30 mmHg) konzentriert, wobei etwa 70% des Lösungsmittels abdestilliert werden; dann gekühlt, filtriert und bei 50°C getrocknet, wobei etwa 52 g reines (L)-Serin erhalten werden. Die den Überschuss Serin (etwa 43 g) enthaltenden Mutterlaugen werden für die anschließende Isolierung zu der wässrigen Phase gegeben, die aus einer weiteren PS-Synthese stammt.
Beispiel 3
Herstellung von PS(L), ausgehend von Epikuron 135
400 kg Epikuron 135^® (Lucas Meyer), 3000 l Toluol, 100 l Wasser werden unter Stickstoff in einen 5000 l-Reaktor aus rostfreiem Stahl gegeben, und die Mischung wird unter Vakuum konzentriert, wobei bei 45°C etwa 1000 l Lösungsmittel abdestilliert werden. Ein weiterer 6000 l-Reaktor aus rostfreiem Stahl wird mit 1355 l Fermentationsflüssigkeil von ATCC 55717 beschickt, enthaltend etwa 3 KU/I PLD, 22,7 kg Calciumchlorid, 27,6 kg Natriumacetattrihydrat, und bei 10°C mit 22 l 80%iger Essigsäure, 625 kg L-Serin (End-pH 4,2). Die beiden Lösungen werden kombiniert und die resultierende Mischung wird auf 25°C erwärmt und dort unter starker Rühren während 8 Stunden gehalten. Die HPLC-Analyse zeigt einen PS(L)-Gehalt von etwa 75% der gesamten Phospholipide. Die Mischung wird dann mit einer Suspension von 36 kg Decalite in 500 l Toluol versetzt und filtriert, wobei das Filter mit 400 l Toluol/Wasser (3/1, V/V) gewaschen wird. Die wässrige Phase wird dann abgetrennt und zur Isolierung von (L)-Serin in Analogie zu der Beschreibung im nachfolgenden Beispiel 6 behandelt, während die organische Phase nach weiterer Filtration auf Decalite unter Vakuum auf einen etwa 440 kg-Rückstand konzentriert wird, der in 5000 l Aceton aufgenommen wird und während etwa 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird. Nach Kühlen der Mischung auf 0°C wird das Produkt filtriert und ergibt etwa 323 kg PS(L) feuchtes Calciumsalz (50%).
Das Produkt wird weiter durch Behandlung mit 2000 l Aceton gereinigt und getrocknet und ergibt etwa 273 kg PS(L) Calciumsalz (58%). Eine 20 g-Probe wurde durch Extraktion mit Heptan/Methanol in Analogie zur Beschreibung in Beispiel 2 gereinigt und ergab 1 1,6 g PS(L) Calciumsalz (80%).
Beispiel 4
Herstellung von PS(L) ausgehend von Eilecithin
13 g Ovothin 160^® (60% PC; Lucas Meyer), 158 ml Toluol in 38 g (L)-Serin werden unter Stickstoff in einen 500 ml-Reaktor gegeben. Die resultierende Suspension wird mit der wässrigen Lösung (300 ml) versetzt, enthaltend PLD aus ATCC 55717, hergestellt noch dem Verfahren von Beispiel 1 mit einer enzymatischen Aktivität von 2 U/ml, zugegeben bei 10°C mit 1,4 g Calciumchlorid, 1,7 g Natriumacetattrihydrat und Eisessig, der zur Einstellung eines pH von etwa 4,1 notwendig ist. Das resultierende diphasische System wird auf eine Temperatur von 25° ± 2°C erhitzt und während 6 Stunden stark gerührt. Die Mischung wird dann auf Decalite filtriert, das weiter mit 2 × 100 ml Toluol gewaschen wird: die organische Phase wird von der wässrigen Phase abgetrennt, welche den Serinüberschuss enthält, und unter reduziertem Druckkonzentriert, wobei ein Rückstand erhalten wird, der in 320 ml n-Heptan und 100 ml Methanol aufgenommen wird. Die untere Methanolphase wird verworfen, während die obere Phase mit 35 ml Heptan verdünnt und weiter mit 95 ml Methanol extrahiert wird. Die höhere Phase wird abgetrennt, unter Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert und unter Rühren bei –5°C mit 250 ml Aceton versetzt, wobei nach Filtration und Trocknen unter Vakuum 7,3 PS(L)-Calciumsalz mit 84% HPLC erhalten werden.
Beispiel 5
Herstellung von DLPS(L), ausgehend von DLPC.
Unter Wiederholung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens, jedoch unter Verwendung von L-α-Dilinoleoylphosphatidylcholin, als DLPC bezeichnet, anstelle von 20 g Epikuron 200 werden 15,1 g L-α-Dilinoleoylphosphatidyl-L-Serin, als DLPS(L) bezeichnet, als Calciumsalz (96% HPLC-Reinheit) erhalten.
Beispiel 6
Isolierung und Recyclieren von L-Serin
Eine wässrige Lösung (10 l), erhalten am Ende einer Transposphatidylierungsreaktion noch den Verfahren von Beispiel 3, wurde nach Abtrennen der Toluollösung und Filtration auf Decalite mit 0,3 kg Aktivkohle behandelt, und der pH wurde durch Zugabe einer 30%igen wässrigen NaOH-Lösung auf 5,7 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde während 4 Stunden in einer Tangentialflusselektrodialyseapparatur geholfen, wobei der pH der Zufuhrkammer bei 5,7 ± 0,5 gehalten wurde.
Die Leitfähigkeit der Zufuhrkammer während dieser Zeit nahm vom Ausgangswert 12700 μSiemens/cm auf einen Endwert von 480 μSiemens/cm ab. Die wässrige L-Serin-Lösung (97% Aminosäureisolierung), in geeigneter Weise durch umgekehrte Osmose konzentriert, wurde erneut anstelle von frischem, festem L-Serin in einer anschließenden Transphosphatidylierungsreaktion mit gleichen Ergebnissen verwendet.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I)
worin: R¹ und R², die gleich oder verschieden sind, aus einer gesättigten, einfach oder mehrfach ungesättigten C₁₀-C₃₀-Acylgruppe ausgewählt werden; X = OH oder OM, worin M für ein Alkali- oder Erdalkalimetall, für Ammonium oder Alkylammonium steht; wobei das Verfahren die Umsetzung von Phosphatiden der allgemeinen Formel (II) umfasst
worin R¹, R² und X die oben angegeben Bedeutungen haben und R³ für CH₂-CH₂NH₂ oder CH₂-CH₃N⁺(CH₃)₃ steht, mit racemischem oder enantiomerem reinem Serin, in einem zweiphasigen Wasser/organischen Lösungsmittel-System in Gegenwart von roher Phospholipase D aus den zentrifugierten Fermentationsbrühen von Mikroorganismen-Stämmen, die extrazelluläre PLD bilden, worin die Phosphatide der allgemeinen Formel (II) Mischungen von Phosphatidylcholin und/oder -ethanolamin natürlichen Ursprungs, ausgewählt aus Soja- oder Ei-Lecithinen, mit einem Phospholipid-Gehalt im Bereich von 20 bis 95% sind und worin der Reaktions-pH-Wert im Bereich von 4 bis 4,5 liegt,
Verfahren nach Anspruch 1, worin das organische Lösungsmittel Toluol ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reaktionstemperatur 25 ± 5°C beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die rohe Phospholipase D von dem Streptomyces-Stamm ATCC 55717 gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Phosphatidyl-(L)-serin, worin R¹ und R² Acyl-Ketten der Palmitin-, Stearin-, Öl-, Linol- oder Linolensäure in ähnlichen Mengenanteilen wie das Soja-Lecithin sind,
Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Phosphatidyl-(L)-serin, worin R¹ und R² Acyl-Ketten der Palmitin-, Stearin-, Palmitolein-, Öl-, Linol- oder Arachidonsäure in ähnlichen Mengenanteilen wie das Ei-Lecithin sind.
Verfahren zur Gewinnung (Abtrennung) von L-Serin als kristalliner Feststoff aus wässrigen Lösungen einer Transphosphatidylierungs-Reaktion, die nach Anspruch 1 durchgeführt wird, wobei in diesem Verfahren nach der Abtrennung der organischen Phase die genannte wässrige Phase unter Vakuum partiell eingeengt wird, um kristallines L-Serin auszufällen.
Verfahren zur Gewinnung (Abtrennung) von L-Serin in Form einer wässrigen Lösung, die frei von anorganischen und Cholin-Salzen ist, aus wässrigen Lösungen einer Transphosphatidylierungs-Reaktion, die nach Anspruch 1 durchgeführt wird, wobei in diesem Verfahren nach dem Filtrieren und Abtrennen der organischen Phase die genannte wässrige Phase bei einem pH-Wert von 5,7 ± 0,5 einer Elektrodialyse unterworfen oder alternativ mit Ionenaustauscher-Harzen behandelt wird.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I)
worin: R¹ und R², die gleich oder verschieden sind, aus einer gesättigten, einfach oder mehrfach ungesättigten C₁₀-C₃₀-Acylgruppe ausgewählt werden; X = OH oder OM, worin M für ein Alkali- oder Erdalkalimetall, für Ammonium oder Alkylammonium steht; wobei das Verfahren die Umsetzung von Phosphatiden der allgemeinen Formel (II) umfasst
worin R¹, R² und X die oben angegeben Bedeutungen haben und R³ für CH₂-CH₂NH₂ oder CH₂-CH₃N⁺(CH₃)₃ steht, mit racemischem oder enantiomerem reinem Serin, in einem zweiphasigen Wasser/organischen Lösungsmittel-System in Gegenwart von roher Phospholipase D aus den zentrifugierten Fermentationsbrühen von Mikroorganismen-Stämmen, de extrazelluläre PLD bilden, worin das organische Lösungsmittel Toluol ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die Phosphatide der allgemeinen Formel (II) Mischungen von Phosphatidylcholin und/oder -ethanolamin natürlichen Ursprungs, ausgewählt aus Soja- oder Ei-Lecithinen, mit einem Phospholipid-Gehalt im Bereich von 20 bis 95% sind.
Verfahren nach Anspruch 9, worin der Reaktions-pH-Wert im Bereich von 4 bis 4,5 liegt.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die Reaktionstemperatur 25 ± 5°C beträgt.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die rohe Phospholipase D von dem Streptomyces-Stamm ATCC 5571 7 gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung von Phosphatidyl-(L)-serin, worin R¹ und R² Acyl-Ketten der Palmitin-, Stearin-, Öl-, Linol- oder Linolensäure in ähnlichen Mengenanteilen wie das Soja-Lecithin sind.
Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung von Phosphatidyl-(L)-serin, worin R¹ und R² Acyl-Ketten der Palmitin-, Stearin-, Palmitolein-, Öl-, Linol- oder Arachidonsäure in ähnlichen Mengenanteilen wie das Ei-Lecithin sind.
Verfahren zur Gewinnung (Abtrennung) von L-Serin als kristalliner Feststoff aus wässrigen Lösungen einer Transphosphatidylierungs-Reaktion, die nach Anspruch 9 durchgeführt wird, wobei in diesem Verfahren nach der Abtrennung der organischen Phase die genannte wässrige Phase unter Vakuum partiell eingeengt wird, um kristallines L-Serin auszufällen.
Verfahren zur Gewinnung (Abtrennung) von L-Serin in Form einer wässrigen Lösung, die frei von anorganischen und Cholin-Salzen ist, aus wässrigen Lösungen einer Transphosphatidylierungs-Reaktion, die nach Anspruch 9 durchgeführt wird, wobei in diesem Verfahren nach dem Filtrieren und Abtrennen der organischen Phase die genannte wässrige Phase bei einem pH-Wert von 5,7 ± 0,5 einer Elektrodialyse unterworfen oder alternativ mit Ionenaustauscher-Harzen behandelt wird.