ES2165115T5

ES2165115T5 - Un procedimiento para la purificacion de fosfatidinilserina.

Info

Publication number: ES2165115T5
Application number: ES98111111T
Authority: ES
Inventors: Lorenzo De Ferra; Pietro Massardo; Oreste Piccolo; Stefano Servi
Original assignee: Chemi SpA
Current assignee: Chemi SpA
Priority date: 1995-12-08
Filing date: 1996-12-03
Publication date: 2010-03-25
Anticipated expiration: 2016-12-03
Also published as: DE69613801T3; KR100446399B1; DE69616834T3; EP0776976A2; EP0922707B1; EP0776976B2; ES2105999T1; DE69616834D1; EP0776976B1; KR970043060A; ITMI961686A1; EP0922707A1; IT1316435B1; ES2105999T3; DE69616834T2; DE776976T1; DE69613801T2; ES2105999T5; CA2192257A1; EP0922707B2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCESO PARA LA PURIFICACION DE FOSFATIDILSERINAS (PS) POR EXTRACCION SELECTIVA DE MEZCLAS DE FOSFOLIPIDOS QUE CONTIENE UN PS EN SISTEMAS DIFASICOS DE DISOLVENTES ORGANICOS Y, EVENTUALMENTE, POR CRISTALIZACION ADICIONAL.

Description

Un procedimiento para la purificación de fosfatidilserina.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de fosfatidilserinas de fórmula (I), denominadas en lo que sigue PS, dependiendo de los diferentes coeficientes de partición en disolventes orgánicos difásicos.

Los compuestos que pueden ser objeto de los procedimientos de la invención tienen la fórmula general (I) y están preparados partiendo preferentemente de los compuestos (II), de acuerdo con el procedimiento del documento EP 0 776 976:

1

en las que

R^{1} y R^{2}, que son iguales o diferentes, se seleccionan de un grupo acilo C_{10}-C_{30} saturado, mono o poliinsaturado;

X = OH u OM, en las que M es un metal alcalino o alcalinotérreo, amonio o alquilamonio; R^{3} = CH_{2}CH_{2}NH_{2} o CH_{2}CH_{2}N^{+}(CH_{3})_{3}.

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La importancia de los compuestos (I) es diversa, particularmente en la preparación de composiciones farmacéuticas para la terapia de síndromes degenerativos cerebrales de diferente origen, tales como patologías vasculares de base aterosclerótica o no y/o decadencia senil; para la preparación de formulaciones liposomales y más recientemente para composiciones dietéticas que comprenden lecitinas naturales, particularmente lecitina de soja enriquecida con fosfatidil-L-serina, denominada en lo que sigue PS(L), que contiene ácidos grasos poliinsaturados como residuos acilo.

La creciente demanda de cantidades industriales de PS(L) a un coste razonable impulsó al solicitante a llevar a cabo una completa investigación para satisfacer dicha necesidad.

Comfurius P. et al., en Biochim. Biophys. Acta 488, 36 (1977) revelan en primer lugar la producción de una mezcla de aproximadamente 1/1 de PS(L) y ácido fosfatídico (PA), haciendo reaccionar a presión a 45ºC y a pH 5,6, en un sistema de éter etílico/agua bifásico, lecitina de huevo o fosfatidilcolinas sintéticas con L-serina en presencia de enzima PLD parcialmente purificada (de repollo).

Se purifica después la PS(L) mediante cromatografía sobre celulosa utilizando una mezcla cloroformo/metanol como eluyente. Es evidente que este procedimiento no es adecuado para una producción industrial debido tanto al uso de éter etílico como a la baja selectividad; además el procedimiento cromatográfico descrito en este procedimiento de purificación es adicionalmente un elemento contra la aplicabilidad industrial de dichos procedimientos por el uso de cloroformo en la mezcla eluyente, la baja productividad y el alto coste.

La invención proporciona un procedimiento para la purificación de la PS, dependiendo de los diferentes coeficientes de partición en sistemas de disolventes orgánicos difásicos de fosfatidas tales como PS, PA fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) y las correspondientes lisofosfatidas en la forma de las sales correspondientes, particularmente las correspondientes sales de calcio en el sistema difásico heptano/metanol.

Es posible aumentar, con un rendimiento del 90%, la pureza de una PS(L) obtenida de Epikuron 200® del 88% al 95% gracias a su reparto preferencial en la fase heptano; de forma similar, se aumentó la pureza de una PS(L) obtenida de Epikuron 135® del 58% a aproximadamente el 80%. Finalmente, puede obtenerse una purificación adicional de la PS mediante cristalización a partir de heptano/acetona en forma de la sal de calcio y la posterior conversión en cualquier otra sal, según técnicas convencionales.

Puede aplicarse convenientemente el procedimiento de la invención para la preparación de fosfatidil-(L)-serinas en las que R_{1} y R_{2} son cadenas acilo de ácidos palmítico, esteárico, oleico, linoleico en proporciones similares a aquella de la lecitina de soja o en las que R_{1} y R_{2} son cadenas acilo de ácidos palmítico, esteárico, palmitoleico, oleico, linoleico, araquidónico en proporciones similares a aquella de la lecitina de huevo o en las que R_{1} y R_{2} son las mismas cadenas acilo en proporciones similares a las del material de partida (II). El procedimiento comunicado a continuación ilustra adicionalmente la invención.

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Ejemplo 1

Preparación de PS(L) partiendo de Epikuron 200 de lecitina de soja

Se colocan 20 g de Epikuron 200® (Lucas Meyer) y 100 ml de tolueno en un reactor de 1.000 ml, bajo nitrógeno, y se concentra la solución a vacío destilando aproximadamente 80 ml del disolvente. Se añade tolueno recién preparado y se concentra la solución de nuevo a presión reducida. Se repite el procedimiento hasta alcanzar un contenido en etanol u otros alcoholes C_{1}-C_{4}, que están habitualmente presentes en la lecitina comercial, por debajo de 20 ppm. Se suspende el residuo en tolueno recién preparado hasta un volumen de 400 ml y se añaden 94,5 g de (L)-serina. Se añade a la suspensión resultante una solución acuosa (300 ml) que contiene PLD de ATCC 55717, preparada según los procedimientos de (Ejemplo 1) y teniendo una actividad enzimática de 2 U/ml, se añaden a 10ºC 3,34 g de cloruro de calcio, 4,08 g de acetato de sodio trihidratado y aproximadamente 3 g de ácido acético glacial obteniendo un pH de aproximadamente 4,5. Se calienta el sistema bifásico resultante hasta una temperatura de 25 \pm 2ºC y se mantiene bajo fuerte agitación durante aproximadamente 6 horas. Se filtra después la muestra sobre decalita, que se lava adicionalmente con 2x100 ml de tolueno; se separa la fase orgánica de la fase acuosa que contiene el exceso de serina, y se concentra a presión reducida dando un residuo (22,3 g) que se suspende en 525 ml de n-heptano y 171 ml de metanol. Se desecha la fase inferior de metanol mientras que se extrae adicionalmente la superior con 220 ml de metanol. Después de la separación, se concentra la fase superior a vacío hasta un volumen pequeño, se añaden, bajo agitación a -5ºC, 400 ml de acetona, se filtra y se seca a vacío dando 15 g de sal de calcio de PS(L) con un HPLC al 97% (contenido en PA <3%).

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Ejemplo 2

Preparación de PS(L) a partir de lecitina de soja Epikuron 135

Se colocan 400 kg de Epikuron 135® (Lucas Meyer), 3.000 l de tolueno y 100 l de agua en un reactor de acero inoxidable de 5.000 l, bajo nitrógeno, y se concentra la mezcla a vacío destilando a 45ºC aproximadamente 1.000 l de disolventes. Se carga otro reactor de acero inoxidable de 6.000 l con 1.355 l de caldo de fermentación de ATCC 55717, que contiene aproximadamente 3 KU/l de PLD, 22,7 kg de cloruro de calcio, 27,6 kg de acetato de sodio trihidratado y a 10ºC 22 l de ácido acético al 80% y 625 kg de L-serina (pH final 4,2). Se combinan las dos soluciones y se calienta la mezcla resultante y se mantiene a 25ºC con fuerte agitación durante 8 horas. El análisis de HPLC muestra un contenido en PS(L) de aproximadamente el 75% de los fosfolípidos totales. Se añade después a la mezcla una suspensión de 36 kg de decalita en 500 l de tolueno y se filtra, lavando el filtro con 400 l de tolueno/agua (3/1, v/v). Se separa entonces la fase acuosa y se trata para recuperar la (L)-serina de forma análoga a la descrita en el ejemplo 6 posterior, mientras que la fase orgánica, después de filtración adicional sobre decalita, se concentra a vacío hasta un residuo de aproximadamente 440 kg, que se suspende en 5.000 l de acetona y se agita durante aproximadamente 6 horas a temperatura ambiente. Después de enfriar la mezcla hasta 0ºC, se filtra el producto dando aproximadamente 323 kg de la sal de calcio húmeda de PS(L) (50%).

Se purifica adicionalmente el producto mediante tratamiento con 2.000 l de acetona y se seca, dando aproximadamente 273 kg de sal de calcio de PS(L) (58%).

Se purificó una muestra de 20 g mediante extracción con heptano/metanol, de forma análoga a la que se describe en el ejemplo 1, dando 11,6 g de sal de calcio de PS(L) (80%).

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Ejemplo 3

Preparación de PS(L) partiendo de lecitina de huevo

Se colocan 13 g de Ovothin 160® (PC al 60%, Lucas Meyer), 158 ml de tolueno y 38 g de (L)-serina en un reactor de 500 ml bajo nitrógeno. Se añade a la suspensión resultante una solución acuosa (300 ml) que contiene PLD de ATCC 55717, y que tiene una actividad enzimática de 2 U/ml, se añaden a 10ºC 1,4 g de cloruro de calcio, 1,7 g de acetato de sodio trihidratado y el ácido acético glacial necesario para obtener un pH de aproximadamente 4,1. Se calienta el sistema bifásico resultante hasta una temperatura de 25º \pm 2ºC y se mantiene bajo fuerte agitación durante aproximadamente 6 horas. Se filtra después la mezcla sobre decalita que se lava adicionalmente con 2x100 ml de tolueno; se separa la fase orgánica de la fase acuosa, que contiene el exceso de serina, y se concentra a presión reducida dando un residuo que se suspende en 320 ml de n-heptano y 100 ml de metanol. Se desecha la fase inferior de metanol mientras que se diluye la superior con 35 ml de heptano y se extrae adicionalmente con 95 ml de metanol. Se separa la fase superior, se concentra a vacío hasta un volumen pequeño y se añaden bajo agitación a -5ºC 250 ml de acetona dando, tras filtración y secado a vacío, 7,3 g de sal de calcio de PS(L) con una HPLC al 84%.

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Ejemplo 4

Preparación de DLPS(L) a partir de DLPC

Repitiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 1, pero utilizando 20 g de L-\alpha-dilinoleoilfosfatidilcolina, representada como DLPC, en lugar de 20 g de Epikuron 200®, se obtienen 15,1 g de L-\alpha-dilinoleoilfosfatidil-L-serina, representada como DLPS(L), como la sal de calcio (pureza de HPLC al 96%).

Claims

1. Un procedimiento para la purificación de los compuestos de fórmula (I) en forma de las sales correspondientes

2

en la que:

X = OH u OM, en el que M es un metal alcalino, metal alcalinotérreo, amonio o alquilamonio; mediante extracción selectiva de las mezclas fosfolipídicas que contienen fosfatidilserina en sistemas difásicos de disolventes orgánicos, caracterizado porque dicho sistema difásico es un sistema heptano/metanol.

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2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fosfatidilserina se purifica a partir de los otros fosfolípidos mediante la extracción selectiva de la sal de calcio correspondiente a partir de una mezcla de heptano/metanol.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los fosfolípidos se seleccionan del grupo constituido por fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico y los correspondientes lisofosfolípidos.

4. Un procedimiento para la purificación adicional de la fosfatidilserina obtenida de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la fosfatidilserina se somete a una cristalización a partir de heptano/acetona, en forma de la sal de calcio, y a conversión posterior en cualquier otra sal.