JPH05336984A - リン脂質の塩基交換反応方法 - Google Patents
リン脂質の塩基交換反応方法Info
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- JPH05336984A JPH05336984A JP17197692A JP17197692A JPH05336984A JP H05336984 A JPH05336984 A JP H05336984A JP 17197692 A JP17197692 A JP 17197692A JP 17197692 A JP17197692 A JP 17197692A JP H05336984 A JPH05336984 A JP H05336984A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 微生物の生産するホスホリパーゼＤのホスフ
ァチジル基転移作用を利用して塩基構造が変換されたリ
ン脂質を製造するにあたり、反応系のpHをホスホリパー
ゼＤの加水分解反応の至適pHから偏倚させ、ホスホリパ
ーゼＤを失活させることなく加水分解反応を抑制できる
pHに保持し、ホスホリパーゼＤの選択率（加水分解反応
速度に対する転移反応速度の比）を高めて反応を行なう
ことを特徴とするリン脂質の塩基交換反応方法。 【効果】 微生物種に依存することなく選択率を高める
ことができ、所望のリン脂質を高収率で得ることができ
る。
ァチジル基転移作用を利用して塩基構造が変換されたリ
ン脂質を製造するにあたり、反応系のpHをホスホリパー
ゼＤの加水分解反応の至適pHから偏倚させ、ホスホリパ
ーゼＤを失活させることなく加水分解反応を抑制できる
pHに保持し、ホスホリパーゼＤの選択率（加水分解反応
速度に対する転移反応速度の比）を高めて反応を行なう
ことを特徴とするリン脂質の塩基交換反応方法。 【効果】 微生物種に依存することなく選択率を高める
ことができ、所望のリン脂質を高収率で得ることができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はリン脂質の生産方法に関
し、更に詳しくは、塩基構造の変換されたリン脂質を効
率的に生産するためのホスファチジル基転移反応方法に
関する。リン脂質は、その界面活性や生理作用を生かし
て、単に乳化剤に用い得るのみならずリポソームの基材
として薬剤運搬体、人工血液、人工細胞等への応用が近
年注目されており、また、それ自体生理活性・薬理作用
を持つものとして、医学・薬学・工学的分野の様々の用
途が考えられている。このような多様な要求に対応する
ために、各々の用途に応じた構造を有するリン脂質を効
率的に製造する方法を開発することは、産業上非常に意
義あることである。
し、更に詳しくは、塩基構造の変換されたリン脂質を効
率的に生産するためのホスファチジル基転移反応方法に
関する。リン脂質は、その界面活性や生理作用を生かし
て、単に乳化剤に用い得るのみならずリポソームの基材
として薬剤運搬体、人工血液、人工細胞等への応用が近
年注目されており、また、それ自体生理活性・薬理作用
を持つものとして、医学・薬学・工学的分野の様々の用
途が考えられている。このような多様な要求に対応する
ために、各々の用途に応じた構造を有するリン脂質を効
率的に製造する方法を開発することは、産業上非常に意
義あることである。
【０００２】
【従来の技術】従来、このようなリン脂質を製造する方
法としては、キャベツ由来、膵臓由来、或いは微生物由
来の種々の精製ホスホリパーゼＤを直接或いは固定化等
を行って反応させる方法が提案されている（特開昭６３
−４２６９１、同６３−４４８９３、特開平１−１５３
０９０、同２−３５０９３、同２−４９５９３）。
法としては、キャベツ由来、膵臓由来、或いは微生物由
来の種々の精製ホスホリパーゼＤを直接或いは固定化等
を行って反応させる方法が提案されている（特開昭６３
−４２６９１、同６３−４４８９３、特開平１−１５３
０９０、同２−３５０９３、同２−４９５９３）。
【０００３】このようなホスホリパーゼＤによるホスフ
ァチジル基転移反応を利用してリン脂質の塩基部分を交
換しようとする場合、一般に水相と有機溶媒相とからな
る２相系で反応が行なわれる。即ち、主として水溶性酵
素、受容体、pH緩衝液、無機塩等を含む水相と、主とし
て親油性である原料リン脂質を含む有機溶媒相とを攪
拌、混合する反応系である。
ァチジル基転移反応を利用してリン脂質の塩基部分を交
換しようとする場合、一般に水相と有機溶媒相とからな
る２相系で反応が行なわれる。即ち、主として水溶性酵
素、受容体、pH緩衝液、無機塩等を含む水相と、主とし
て親油性である原料リン脂質を含む有機溶媒相とを攪
拌、混合する反応系である。
【０００４】本来リン脂質分解酵素のひとつであるホス
ホリパーゼＤは、リン脂質のホスファチジル基と塩基と
の間のエステル結合を加水分解して、ホスファチジン酸
及び塩基を遊離させる酵素であるが、グリセロール、エ
タノールなどのアルコール性水酸基を有する化合物の共
存下で、リン脂質の塩基交換反応を接触することが知ら
れている。しかしながら、一般的にはホスホリパーゼＤ
の特性のひとつ、即ち塩基交換反応速度と加水分解反応
速度の比（選択率）はその酵素の由来の微生物種に大き
く依存していると考えられている（ Biochimica et Bio
physica Acta.,960, 334, 1988 ）。従って、工業的に
は目的とする反応に応じた特性を有するホスホリパーゼ
Ｄを生産する微生物の選択が重要な課題となっていた。
ホリパーゼＤは、リン脂質のホスファチジル基と塩基と
の間のエステル結合を加水分解して、ホスファチジン酸
及び塩基を遊離させる酵素であるが、グリセロール、エ
タノールなどのアルコール性水酸基を有する化合物の共
存下で、リン脂質の塩基交換反応を接触することが知ら
れている。しかしながら、一般的にはホスホリパーゼＤ
の特性のひとつ、即ち塩基交換反応速度と加水分解反応
速度の比（選択率）はその酵素の由来の微生物種に大き
く依存していると考えられている（ Biochimica et Bio
physica Acta.,960, 334, 1988 ）。従って、工業的に
は目的とする反応に応じた特性を有するホスホリパーゼ
Ｄを生産する微生物の選択が重要な課題となっていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本考案はかかる実情に
鑑み、微生物種に依存することなく上記選択率を高める
ことのできるリン脂質の塩基交換反応方法を提供するも
のである。
鑑み、微生物種に依存することなく上記選択率を高める
ことのできるリン脂質の塩基交換反応方法を提供するも
のである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の課
題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、反応系のpHを
制御することにより、微生物によって生産されるホスホ
リパーゼＤの選択率を制御することが可能となり、これ
まで主として加水分解反応が優先的に進行すると考えら
れていた微生物由来のホスホリパーゼＤを用いた場合で
も、微生物種に依存することなくホスファチジル基転移
反応を安定に且つ効率的に行なうことができることを見
いだした。即ち、本発明は、微生物の生産するホスホリ
パーゼＤのホスファチジル基転移作用を利用して塩基構
造が変換されたリン脂質を製造するにあたり、反応系の
pHをホスホリパーゼＤの加水分解反応の至適pHから偏倚
させ、ホスホリパーゼＤを失活させることなく加水分解
反応を抑制できるpHに保持し、ホスホリパーゼＤの選択
率（加水分解反応速度に対する転移反応速度の比）を高
めて反応を行なうことを特徴とするリン脂質の塩基交換
反応方法を内容とするものである。
題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、反応系のpHを
制御することにより、微生物によって生産されるホスホ
リパーゼＤの選択率を制御することが可能となり、これ
まで主として加水分解反応が優先的に進行すると考えら
れていた微生物由来のホスホリパーゼＤを用いた場合で
も、微生物種に依存することなくホスファチジル基転移
反応を安定に且つ効率的に行なうことができることを見
いだした。即ち、本発明は、微生物の生産するホスホリ
パーゼＤのホスファチジル基転移作用を利用して塩基構
造が変換されたリン脂質を製造するにあたり、反応系の
pHをホスホリパーゼＤの加水分解反応の至適pHから偏倚
させ、ホスホリパーゼＤを失活させることなく加水分解
反応を抑制できるpHに保持し、ホスホリパーゼＤの選択
率（加水分解反応速度に対する転移反応速度の比）を高
めて反応を行なうことを特徴とするリン脂質の塩基交換
反応方法を内容とするものである。
【０００７】即ち、例えば加水分解反応の至適pHがpH８
付近に存在するホスホリパーゼＤをホスファチジル基転
移反応に利用する際に、反応系のpHを加水分解反応を抑
制する様な条件、即ちpHが３〜５の低pH域又はpH１０〜
１２の高pH域において反応を行なうことにより、転移活
性に比べ加水分解活性が低く抑えられるためホスホリパ
ーゼＤの選択率を高めることが可能となる。特に低pH域
においてはホスホリパーゼＤの転移活性自体も高められ
るため、この効果がより顕著となる。本発明者らの検討
結果によれば、本発明の方法により加水分解生成物は殆
ど認められず、ホスホリパーゼＤの選択率をほぼ１００
％にまで高めることが可能である。
付近に存在するホスホリパーゼＤをホスファチジル基転
移反応に利用する際に、反応系のpHを加水分解反応を抑
制する様な条件、即ちpHが３〜５の低pH域又はpH１０〜
１２の高pH域において反応を行なうことにより、転移活
性に比べ加水分解活性が低く抑えられるためホスホリパ
ーゼＤの選択率を高めることが可能となる。特に低pH域
においてはホスホリパーゼＤの転移活性自体も高められ
るため、この効果がより顕著となる。本発明者らの検討
結果によれば、本発明の方法により加水分解生成物は殆
ど認められず、ホスホリパーゼＤの選択率をほぼ１００
％にまで高めることが可能である。
【０００８】本発明に用いられる微生物としては、ホス
ホリパーゼＤを生産するものであればいかなる微生物も
利用することができるが、代表的なものとして、リゾプ
ス(Rhizopus)属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、ム
コール(Mucor) 属、シュードモナス(Psedomonas)属、キ
ャンディダ(Candida) 属、ペリシリウム(Penicillium)
属、クロモバクテリウム(Chromobacterium) 属、ストレ
プトマイセス（Streptomyces）属、ストレプトバーチシ
リウム（Streptoverticillium ）属、ミクロモノスポラ
（Micromonospora) 属、ノカルディア（Nocardia) 属、
ノカルディオプシス（Nocardiopsis) 属、アクチノマヂ
ューラ（Actinomadura) 属、等に属する微生物を挙げる
ことができる。より具体的には、リゾプス・ジャパニカ
ス（Rhizopus japonicus, IFO 4785)、リゾプス・デレ
マー(Rhizopus delemar, IFO 4697)、アスペルギルス・
ニガー(Aspergillus niger, IFO 4066) 、シュードモナ
ス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens, IFO
3081) 、ムコール・ミーハイ(Mucor miehei, ATCC 1645
7)、キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa, ATCC 1057
1)、ペニシリウム・サイクロピウム(Penicillium cyclo
pium, IFO 5847) 、クロモバクテリウム・ビスコサム(C
hromobacterium viscosum, ATCC 6918) 、ストレプトマ
イセス・メディオシディカス（Streptomyces mediocidi
cus, IFO 13202）、ストレプトマイセス・プルニカラー
(Streptomyces prunicolor, IFO 13075)、ストレプトマ
イセス・アンチバイオティカス(Streptomyces antibiot
icus, IFO 13271)、ストレプトバーチシリウム・ハチジ
ョーエンセ（Streptoverticillium hachijoense, IFO 1
2782）、ストレプトバーチシリウム・シンナモネウム(S
treptoverticillium cinnamoneum, IFO 12852)、ミクロ
モノスポラ・チャルセア（Micromonospora chalcea,ATC
C 12452) 、ノカルディア・メディテラーネイ（Nocardi
a mediterranei, IFO13142) 、ノカルディオプシス・ダ
ソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei, IFO 13908)
、アクチノマジューラ・リバノチカ（Actinomadura li
banotica, IFO14095) 等が挙げられる。これらは単独又
は２種以上組み合わせて用いられ、これらの他にも公知
の微生物が適用される。
ホリパーゼＤを生産するものであればいかなる微生物も
利用することができるが、代表的なものとして、リゾプ
ス(Rhizopus)属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、ム
コール(Mucor) 属、シュードモナス(Psedomonas)属、キ
ャンディダ(Candida) 属、ペリシリウム(Penicillium)
属、クロモバクテリウム(Chromobacterium) 属、ストレ
プトマイセス（Streptomyces）属、ストレプトバーチシ
リウム（Streptoverticillium ）属、ミクロモノスポラ
（Micromonospora) 属、ノカルディア（Nocardia) 属、
ノカルディオプシス（Nocardiopsis) 属、アクチノマヂ
ューラ（Actinomadura) 属、等に属する微生物を挙げる
ことができる。より具体的には、リゾプス・ジャパニカ
ス（Rhizopus japonicus, IFO 4785)、リゾプス・デレ
マー(Rhizopus delemar, IFO 4697)、アスペルギルス・
ニガー(Aspergillus niger, IFO 4066) 、シュードモナ
ス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens, IFO
3081) 、ムコール・ミーハイ(Mucor miehei, ATCC 1645
7)、キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa, ATCC 1057
1)、ペニシリウム・サイクロピウム(Penicillium cyclo
pium, IFO 5847) 、クロモバクテリウム・ビスコサム(C
hromobacterium viscosum, ATCC 6918) 、ストレプトマ
イセス・メディオシディカス（Streptomyces mediocidi
cus, IFO 13202）、ストレプトマイセス・プルニカラー
(Streptomyces prunicolor, IFO 13075)、ストレプトマ
イセス・アンチバイオティカス(Streptomyces antibiot
icus, IFO 13271)、ストレプトバーチシリウム・ハチジ
ョーエンセ（Streptoverticillium hachijoense, IFO 1
2782）、ストレプトバーチシリウム・シンナモネウム(S
treptoverticillium cinnamoneum, IFO 12852)、ミクロ
モノスポラ・チャルセア（Micromonospora chalcea,ATC
C 12452) 、ノカルディア・メディテラーネイ（Nocardi
a mediterranei, IFO13142) 、ノカルディオプシス・ダ
ソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei, IFO 13908)
、アクチノマジューラ・リバノチカ（Actinomadura li
banotica, IFO14095) 等が挙げられる。これらは単独又
は２種以上組み合わせて用いられ、これらの他にも公知
の微生物が適用される。
【０００９】上記該微生物を培養して、ホスホリパーゼ
を生産させるために用いられる培地成分としては、微生
物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭
素源としては同化可能な炭素化合物、例えばブドウ糖、
ショ糖、乳糖、麦芽糖、澱粉、デキストリン、糖蜜等の
糖類、グリセリン、炭化水素類、有機酸、脂肪酸、油
脂、アルコール類等が単独又は２種以上の組み合わせで
使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であ
ればよく、無機窒素源、有機窒素源いづれでも利用可能
であり、例えばコーンスチープリカー、大豆粉、小麦グ
ルテン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキ
ス、カゼイン加水分解物、尿素、カザミノ酸、硝酸態窒
素、アンモニウム態窒素等が単独又は２種以上の組み合
わせで使用される。その他、リン酸塩、マグネシウム、
カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛、食塩等の
塩類が必要に応じて単独又は２種以上の組み合わせで使
用される。
を生産させるために用いられる培地成分としては、微生
物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭
素源としては同化可能な炭素化合物、例えばブドウ糖、
ショ糖、乳糖、麦芽糖、澱粉、デキストリン、糖蜜等の
糖類、グリセリン、炭化水素類、有機酸、脂肪酸、油
脂、アルコール類等が単独又は２種以上の組み合わせで
使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であ
ればよく、無機窒素源、有機窒素源いづれでも利用可能
であり、例えばコーンスチープリカー、大豆粉、小麦グ
ルテン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキ
ス、カゼイン加水分解物、尿素、カザミノ酸、硝酸態窒
素、アンモニウム態窒素等が単独又は２種以上の組み合
わせで使用される。その他、リン酸塩、マグネシウム、
カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛、食塩等の
塩類が必要に応じて単独又は２種以上の組み合わせで使
用される。
【００１０】また、上記該微生物の培養方法としては一
般に微生物の培養に用いられる方法が利用される。即
ち、回分培養、流加培養、連続培養等が用いられ、培養
温度は、菌体が生育しリン脂質分解酵素を生産可能な範
囲内で適宜採用し得るが、通常１５〜４０℃が好まし
い。回分培養においては、培養時間は菌体内リン脂質分
解酵素活性が最大となる時点で培養を終了すればよく、
通常は１〜７日程度である。
般に微生物の培養に用いられる方法が利用される。即
ち、回分培養、流加培養、連続培養等が用いられ、培養
温度は、菌体が生育しリン脂質分解酵素を生産可能な範
囲内で適宜採用し得るが、通常１５〜４０℃が好まし
い。回分培養においては、培養時間は菌体内リン脂質分
解酵素活性が最大となる時点で培養を終了すればよく、
通常は１〜７日程度である。
【００１１】微生物の生産するホスホリパーゼＤとして
は、菌体外に分泌された酵素を利用する場合は、微生物
の培養液をそのまま反応に用いてもよいし、静置分離、
濾過、或いは遠心分離などの方法を用いて菌体を分離し
た後に利用してもよい。また、精製した酵素を用いても
よいが、好ましくは微生物の培養液から菌体を除去した
後培養液を濃縮し、反応に利用するほうが効率よくホス
ファチジル基転移反応を行なうことができ、工業的には
好都合である。また、菌体内に蓄積された酵素を利用す
る場合は、該酵素を微生物菌体から分離あるいは抽出
し、そのままもしくは固定化して使用してもよく、ある
いは微生物菌体をそのまま使用してもなんら問題はな
い。
は、菌体外に分泌された酵素を利用する場合は、微生物
の培養液をそのまま反応に用いてもよいし、静置分離、
濾過、或いは遠心分離などの方法を用いて菌体を分離し
た後に利用してもよい。また、精製した酵素を用いても
よいが、好ましくは微生物の培養液から菌体を除去した
後培養液を濃縮し、反応に利用するほうが効率よくホス
ファチジル基転移反応を行なうことができ、工業的には
好都合である。また、菌体内に蓄積された酵素を利用す
る場合は、該酵素を微生物菌体から分離あるいは抽出
し、そのままもしくは固定化して使用してもよく、ある
いは微生物菌体をそのまま使用してもなんら問題はな
い。
【００１２】酵素の使用量としてはリン脂質１ｇあたり
０．０１〜１０００ユニットが好ましく、より好ましく
は０．１〜１０ユニットの範囲である。ここでいう酵素
活性単位の１ユニットとは、１分間に１μmol のホスフ
ァチジルコリンを加水分解する酵素量を表す。
０．０１〜１０００ユニットが好ましく、より好ましく
は０．１〜１０ユニットの範囲である。ここでいう酵素
活性単位の１ユニットとは、１分間に１μmol のホスフ
ァチジルコリンを加水分解する酵素量を表す。
【００１３】本発明において用いられるホスファチジル
基転移反応の原料リン脂質としては、ホスホリパーゼＤ
の基質となり得るものであれば、天然資源から抽出した
もの、又は抽出後精製したもの、或いは合成したものの
如何を問わず使用できる。また、市販のもの、或いは公
知の方法で調整したものを使用してもよい。例えば、大
豆レシチン、脱脂大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、リ
ゾレシチン、ホスファチジン酸等、又はそれらの混合物
等が挙げられる。本発明の効果を最大に発揮するために
は、原料リン脂質として精製したもの、ないしは組成の
単純なものを用いた方が純粋な反応生成物が得られる面
で都合が良い。また、原料リン脂質の価格及び人手の容
易さ、更には酵素に対する反応性の面から、特にホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホ
スファチジルセリンが工業的に効果が高く好ましい。
基転移反応の原料リン脂質としては、ホスホリパーゼＤ
の基質となり得るものであれば、天然資源から抽出した
もの、又は抽出後精製したもの、或いは合成したものの
如何を問わず使用できる。また、市販のもの、或いは公
知の方法で調整したものを使用してもよい。例えば、大
豆レシチン、脱脂大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、リ
ゾレシチン、ホスファチジン酸等、又はそれらの混合物
等が挙げられる。本発明の効果を最大に発揮するために
は、原料リン脂質として精製したもの、ないしは組成の
単純なものを用いた方が純粋な反応生成物が得られる面
で都合が良い。また、原料リン脂質の価格及び人手の容
易さ、更には酵素に対する反応性の面から、特にホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホ
スファチジルセリンが工業的に効果が高く好ましい。
【００１４】これらのリン脂質の構成脂肪酸としては同
一又は異種であって、炭素数８〜２４の飽和又は不飽和
脂肪酸であり、例えばカプロン酸、カプリン酸、ラウリ
ン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベ
ヘン酸、アラキジン酸、パルミトオレイン酸、オレイン
酸、リノール酸、α−及びγ−リノレイン酸、エルシン
酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキ
サエン酸、テトラコサテトラエン酸等が挙げられる。
一又は異種であって、炭素数８〜２４の飽和又は不飽和
脂肪酸であり、例えばカプロン酸、カプリン酸、ラウリ
ン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベ
ヘン酸、アラキジン酸、パルミトオレイン酸、オレイン
酸、リノール酸、α−及びγ−リノレイン酸、エルシン
酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキ
サエン酸、テトラコサテトラエン酸等が挙げられる。
【００１５】本発明における受容体としては、コリン、
エタノールアミン、セリン、Ｎーメチルエタノールアミ
ン、Ｎ，Ｎージメチルエタノールアミン等の含窒素アル
コール類やグリセロール、グルコース、フラクトース等
のポリオール、単糖類等、カルニチン、アスコルビン酸
等の水酸基を有するビタミン類等を挙げることができ
る。これらは単独又は２種以上組み合わせて用いられ
る。
エタノールアミン、セリン、Ｎーメチルエタノールアミ
ン、Ｎ，Ｎージメチルエタノールアミン等の含窒素アル
コール類やグリセロール、グルコース、フラクトース等
のポリオール、単糖類等、カルニチン、アスコルビン酸
等の水酸基を有するビタミン類等を挙げることができ
る。これらは単独又は２種以上組み合わせて用いられ
る。
【００１６】本発明において所定のpHを保つために種々
の酸、アルカリ、バッファーが用いられるが、例えばpH
３〜５の範囲では、２０mM〜１Ｍのギ酸−ギ酸ナトリウ
ムバッファー、グリシン−塩酸バッファー、酢酸−酢酸
ナトリウムバッファー、クエン酸−クエン酸ナトリウム
バッファー、或いは１mM〜１Ｍのギ酸、酢酸、コハク
酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、塩
酸、硫酸、硝酸、リン酸等が、pH１０〜１２の範囲で
は、２０mM〜１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー、グリ
シン−水酸化ナトリウムバッファー、炭酸水素ナトリウ
ム−炭酸ナトリウムバッファー、アンモニア−塩化アン
モニウムバッファーや、１mM〜１Ｍの水酸化カリウム、
水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、アンモニア等
が用いられ得る。これらは単独又は２種以上組み合わせ
て用いられる。
の酸、アルカリ、バッファーが用いられるが、例えばpH
３〜５の範囲では、２０mM〜１Ｍのギ酸−ギ酸ナトリウ
ムバッファー、グリシン−塩酸バッファー、酢酸−酢酸
ナトリウムバッファー、クエン酸−クエン酸ナトリウム
バッファー、或いは１mM〜１Ｍのギ酸、酢酸、コハク
酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、塩
酸、硫酸、硝酸、リン酸等が、pH１０〜１２の範囲で
は、２０mM〜１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー、グリ
シン−水酸化ナトリウムバッファー、炭酸水素ナトリウ
ム−炭酸ナトリウムバッファー、アンモニア−塩化アン
モニウムバッファーや、１mM〜１Ｍの水酸化カリウム、
水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、アンモニア等
が用いられ得る。これらは単独又は２種以上組み合わせ
て用いられる。
【００１７】反応は、原料リン脂質を溶解又は懸濁する
有機溶媒の存在下で行うことが好ましく、微生物酵素を
失活させることの少ない溶媒系であればいずれも使用で
きる。例えば石油エーテル、ジエチルエーテル、メチル
エチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、クロロホル
ム、ジクロロメタン、四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ
−オクタン、イソオクタン、酢酸エチル、ジオキサン、
ベンゼン等の溶媒、又はこれらの混合溶媒系等が挙げら
れる。ただし、前述の如くアルコール類は目的反応の基
質となるため、基質として添加する以外に用いることは
あまり好ましくない。反応温度は、用いる微生物の生産
するホスホリパーゼＤの至適温度付近が好ましく、通常
２０〜６０℃の範囲である。ただし、用いる溶媒が低沸
点のものである場合等は、この限りではない。反応時間
については、回分法の場合は概ね０．５〜４０時間、半
回分法や連続法においても、この反応条件に見合った反
応時間を設定することにより、目的とする反応を行わせ
ることができる。また反応様式としては、容器に入れた
有機溶媒相と水相とを、懸濁し接触反応させればよく、
回転撹拌や超音波による撹拌方式、カラム中において水
相と有機溶媒相とを向流に流して接触させる方式、カラ
ム中に酵素を含む水相を保持しておいて、油滴状に導入
した有機溶媒相を自然浮上させながら反応を行なう方
式、などのあらゆる形式の反応様式が適用可能である。
有機溶媒の存在下で行うことが好ましく、微生物酵素を
失活させることの少ない溶媒系であればいずれも使用で
きる。例えば石油エーテル、ジエチルエーテル、メチル
エチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、クロロホル
ム、ジクロロメタン、四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ
−オクタン、イソオクタン、酢酸エチル、ジオキサン、
ベンゼン等の溶媒、又はこれらの混合溶媒系等が挙げら
れる。ただし、前述の如くアルコール類は目的反応の基
質となるため、基質として添加する以外に用いることは
あまり好ましくない。反応温度は、用いる微生物の生産
するホスホリパーゼＤの至適温度付近が好ましく、通常
２０〜６０℃の範囲である。ただし、用いる溶媒が低沸
点のものである場合等は、この限りではない。反応時間
については、回分法の場合は概ね０．５〜４０時間、半
回分法や連続法においても、この反応条件に見合った反
応時間を設定することにより、目的とする反応を行わせ
ることができる。また反応様式としては、容器に入れた
有機溶媒相と水相とを、懸濁し接触反応させればよく、
回転撹拌や超音波による撹拌方式、カラム中において水
相と有機溶媒相とを向流に流して接触させる方式、カラ
ム中に酵素を含む水相を保持しておいて、油滴状に導入
した有機溶媒相を自然浮上させながら反応を行なう方
式、などのあらゆる形式の反応様式が適用可能である。
【００１８】
【発明の効果】叙上のごとく、ホスファチジル基転移反
応を行なう際に反応系のpHをホスホリパーゼＤの加水分
解反応の至適pHより偏倚させ、ホスホリパーゼＤを失活
させることなく加水分解反応を抑制できるpHを保つこと
により、ホスファチジル基転移反応の選択率を微生物種
に依存することなく著しく高めることが可能となる。こ
の様に反応条件を操作することによりホスファチジル基
転移反応の選択率を抑制することに成功したのは本発明
が最初である。更に本発明によれば、例えば近年、ドラ
ッグデリバリーシステムにおけるリポソームの基材とし
て工業的生産が望まれている高純度のリン脂質を生産す
るにあたり、ホスファチジル基転移反応を利用して効率
的且つ経済的に所望のリン脂質を高収率で得ることがで
きる。
応を行なう際に反応系のpHをホスホリパーゼＤの加水分
解反応の至適pHより偏倚させ、ホスホリパーゼＤを失活
させることなく加水分解反応を抑制できるpHを保つこと
により、ホスファチジル基転移反応の選択率を微生物種
に依存することなく著しく高めることが可能となる。こ
の様に反応条件を操作することによりホスファチジル基
転移反応の選択率を抑制することに成功したのは本発明
が最初である。更に本発明によれば、例えば近年、ドラ
ッグデリバリーシステムにおけるリポソームの基材とし
て工業的生産が望まれている高純度のリン脂質を生産す
るにあたり、ホスファチジル基転移反応を利用して効率
的且つ経済的に所望のリン脂質を高収率で得ることがで
きる。
【００１９】
【実施例】次に実施例を用いて本発明を詳細に説明する
が、本発明はもとよりかかる実施例のみに限定されるも
のではない。以下の記載において、「％」は特に断らな
い限り「重量％」を意味する。尚、リン脂質の分析は高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて行なった。
固定相には、シリカゲルにアミノプロピル基を化学結合
させたカラムを、また移動相溶媒としてはアセトニトリ
ル：メタノール：１０mMリン酸二水素アンモニウム＝６
１２：２８９：１００の混合溶媒系を用い、２０５nmに
おける吸収を測定することにより定量を行なった。ホス
ホリパーゼＤの加水分解活性は、ホスファチジルコリン
がホスホリパーゼＤにより加水分解される際に遊離して
くるコリンの量を酵素法を用いることにより測定を行な
った。酵素活性の定義として、３７℃、pH８．０におけ
る反応で、１分間あたり１μmol のコリンを遊離する酵
素量を１ユニット（Unit）と定義した。
が、本発明はもとよりかかる実施例のみに限定されるも
のではない。以下の記載において、「％」は特に断らな
い限り「重量％」を意味する。尚、リン脂質の分析は高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて行なった。
固定相には、シリカゲルにアミノプロピル基を化学結合
させたカラムを、また移動相溶媒としてはアセトニトリ
ル：メタノール：１０mMリン酸二水素アンモニウム＝６
１２：２８９：１００の混合溶媒系を用い、２０５nmに
おける吸収を測定することにより定量を行なった。ホス
ホリパーゼＤの加水分解活性は、ホスファチジルコリン
がホスホリパーゼＤにより加水分解される際に遊離して
くるコリンの量を酵素法を用いることにより測定を行な
った。酵素活性の定義として、３７℃、pH８．０におけ
る反応で、１分間あたり１μmol のコリンを遊離する酵
素量を１ユニット（Unit）と定義した。
【００２０】比較例１ ストレプトバーチシリウム・シナモネウム IFO 12852
を、グルコース１％、肉エキス０．７５％、ポリペプト
ン０．７５％、NaCl０．３％、MgSO4 ０．１％を含む培
地（pH７．２）で、温度３０℃、６日間振盪培養した。
得られた培養液は３０００rpm で１０分間遠心分離を行
なうことにより菌体を除去した後酵素溶液として塩基交
換反応に供した。こうして得られた培養液中のホスホリ
パーゼＤの加水分解反応の至適pHは８．０であり、３７
℃、pH８．０におけるホスホリパーゼＤ加水分解活性は
培養液１リットルあたり１０００ユニットであった。密
栓したサンプル瓶に、ホスファチジルコリン（旭化成
製）０．７ｇ、ジエチルエーテル３００ml、４Ｍモノエ
タノールアミン（pH８．０）４０ml、０．１Ｍクエン酸
−クエン酸ナトリウムバッファー（pH８．０）１５５m
l、上記の如く調製した培養上清５．０mlを加え、３０
℃にて５時間反応させた。反応液組成の経時変化を図１
に示した。分析の結果、５時間反応後の反応液組成は、
ホスファチジルコリン０％、ホスファチジルエタノール
アミン１１％、ホスファチジン酸８９％、選択率は１１
％であった。
を、グルコース１％、肉エキス０．７５％、ポリペプト
ン０．７５％、NaCl０．３％、MgSO4 ０．１％を含む培
地（pH７．２）で、温度３０℃、６日間振盪培養した。
得られた培養液は３０００rpm で１０分間遠心分離を行
なうことにより菌体を除去した後酵素溶液として塩基交
換反応に供した。こうして得られた培養液中のホスホリ
パーゼＤの加水分解反応の至適pHは８．０であり、３７
℃、pH８．０におけるホスホリパーゼＤ加水分解活性は
培養液１リットルあたり１０００ユニットであった。密
栓したサンプル瓶に、ホスファチジルコリン（旭化成
製）０．７ｇ、ジエチルエーテル３００ml、４Ｍモノエ
タノールアミン（pH８．０）４０ml、０．１Ｍクエン酸
−クエン酸ナトリウムバッファー（pH８．０）１５５m
l、上記の如く調製した培養上清５．０mlを加え、３０
℃にて５時間反応させた。反応液組成の経時変化を図１
に示した。分析の結果、５時間反応後の反応液組成は、
ホスファチジルコリン０％、ホスファチジルエタノール
アミン１１％、ホスファチジン酸８９％、選択率は１１
％であった。
【００２１】実施例１ モノエタノールアミンならびにクエン酸−クエン酸ナト
リウムバッファーのpHを５．０とした以外は比較例１と
全く同様に行なった。反応液組成の経時変化を図２に示
した。分析の結果、５時間反応後の反応液組成は、ホス
ファチジルコリン０％、ホスファチジルエタノールアミ
ン１００％、ホスファチジン酸０％、選択率は１００％
であった。
リウムバッファーのpHを５．０とした以外は比較例１と
全く同様に行なった。反応液組成の経時変化を図２に示
した。分析の結果、５時間反応後の反応液組成は、ホス
ファチジルコリン０％、ホスファチジルエタノールアミ
ン１００％、ホスファチジン酸０％、選択率は１００％
であった。
【００２２】実施例２ モノエタノールアミンのpHを１１．０として、バッファ
ーとしてリン酸ナトリウムバッファー（pH１１．０）を
用いた以外は実施例１と全く同様に行なった。反応液組
成の経時変化を図３に示した。分析の結果、５時間反応
後の反応液組成は、ホスファチジルコリン７４％、ホス
ファチジルエタノールアミン２５％、ホスファチジン酸
１％、選択率は９６％であった。
ーとしてリン酸ナトリウムバッファー（pH１１．０）を
用いた以外は実施例１と全く同様に行なった。反応液組
成の経時変化を図３に示した。分析の結果、５時間反応
後の反応液組成は、ホスファチジルコリン７４％、ホス
ファチジルエタノールアミン２５％、ホスファチジン酸
１％、選択率は９６％であった。
【００２３】実施例３ 実施例１で使用した微生物の代わりに、ストレプトマイ
セス・メディオシディカス IFO 13202、ミクロモノスポ
ラ・チャルセア ATCC 12452 、ノカルディア・メディテ
ラーネイ IFO 13142、ノカルディオプシス・ダソンビレ
イ IFO 13908、アクチノマジューラ・リバノチカ IFO 1
4095、リゾプス・デレマー IFO 4697 、アスペルギルス
・ニガー IFO 4066 、シュードモナス・フルオレッセン
ス IFO 3081 、ムコール・ミーハイ ATCC 16457 、キャ
ンディダ・ルゴサ ATCC 10571 、ペニシリウム・サイク
ロピウム IFO 5847 、クロモバクテリウム・ビスコサム
ATCC 6918を使用し、pH５．０、８．０、１１．０の各
pHにおいて塩基交換反応を実施した。pH５．０の時は実
施例１と、pH８．０の時は比較例１と、pH１１．０の時
は実施例２とそれぞれ一致する様に反応条件を調製して
反応を実施した。どの微生物もpH７．０〜８．０の範囲
に加水分解反応の至適pHを持っていた。ＰＣからＰＥへ
の塩基交換反応を行なった場合の５時間後の反応液組成
の分析結果ならびに選択率を表１及び表２に示した。表
１及び表２より、微生物種によらず反応液のpHをホスホ
リパーゼＤの加水分解反応の至適pHより偏倚させ加水分
解反応を抑制することにより、ホスホリパーゼＤの選択
率が著しく高められていることがわかる。
セス・メディオシディカス IFO 13202、ミクロモノスポ
ラ・チャルセア ATCC 12452 、ノカルディア・メディテ
ラーネイ IFO 13142、ノカルディオプシス・ダソンビレ
イ IFO 13908、アクチノマジューラ・リバノチカ IFO 1
4095、リゾプス・デレマー IFO 4697 、アスペルギルス
・ニガー IFO 4066 、シュードモナス・フルオレッセン
ス IFO 3081 、ムコール・ミーハイ ATCC 16457 、キャ
ンディダ・ルゴサ ATCC 10571 、ペニシリウム・サイク
ロピウム IFO 5847 、クロモバクテリウム・ビスコサム
ATCC 6918を使用し、pH５．０、８．０、１１．０の各
pHにおいて塩基交換反応を実施した。pH５．０の時は実
施例１と、pH８．０の時は比較例１と、pH１１．０の時
は実施例２とそれぞれ一致する様に反応条件を調製して
反応を実施した。どの微生物もpH７．０〜８．０の範囲
に加水分解反応の至適pHを持っていた。ＰＣからＰＥへ
の塩基交換反応を行なった場合の５時間後の反応液組成
の分析結果ならびに選択率を表１及び表２に示した。表
１及び表２より、微生物種によらず反応液のpHをホスホ
リパーゼＤの加水分解反応の至適pHより偏倚させ加水分
解反応を抑制することにより、ホスホリパーゼＤの選択
率が著しく高められていることがわかる。
【００２４】
【表１】 ＰＣ：ホスファチジルコリン ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン ＰＡ：ホスファチジン酸
【００２５】
【表２】 ＰＣ：ホスファチジルコリン ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン ＰＡ：ホスファチジン酸
【００２６】実施例４ 塩基交換反応の際の受容体として、エタノールアミンの
代わりにセリンを１６．８ｇ加え、微生物としてストレ
プトバーチシリウム・シナモネウムを用いた以外は実施
例２と全く同様に行なった。結果を表３に示す。
代わりにセリンを１６．８ｇ加え、微生物としてストレ
プトバーチシリウム・シナモネウムを用いた以外は実施
例２と全く同様に行なった。結果を表３に示す。
【００２７】実施例５ 塩基交換反応の際の受容体として、セリンの代わりにグ
リセロールを１４．７ｇ加えた以外は実施例４と全く同
様に行なった。結果を表３に示す。
リセロールを１４．７ｇ加えた以外は実施例４と全く同
様に行なった。結果を表３に示す。
【００２８】実施例６ 塩基交換反応の際の受容体として、セリンの代わりにア
スコルビン酸を２８．２ｇ加えた以外は実施例４と全く
同様に行なった。結果を表３に示す。
スコルビン酸を２８．２ｇ加えた以外は実施例４と全く
同様に行なった。結果を表３に示す。
【００２９】実施例７ 塩基交換反応の際の受容体として、セリンの代わりにカ
ルニチンを２５．９ｇ加えた以外は実施例４と全く同様
に行なった。結果を表３に示す。
ルニチンを２５．９ｇ加えた以外は実施例４と全く同様
に行なった。結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】 ＰＣ：ホスファチジルコリン ＰＡ：ホスファチジン酸 ＰＸ：ホスファチジルセリン（実施例３） ホスファチジルグリセロール（実施例４） ホスファチジルイノシトール（実施例５） ホスファチジルアスコルビン酸（実施例６） ホスファチジルカルニチン（実施例７）
【００３１】実施例８ ストレプトバーチシリウム・シナムネウム IFO 12852
を、グルコース１０％、肉エキス０．７５％、ポリペプ
トン０．７５％、NaCl ０．３％、MgSO4 ０．１％を含
む培地（pH７．２）で、温度３０℃、６日間振盪培養し
た。得られた菌体を２回水洗し、次いでアセトンに浸漬
した後濾過し、次いで常温にて真空乾燥した。得られた
乾燥菌体を５０mg培養上清を加える代わりに添加した以
外は実施例３と全く同様に行なった。５時間反応後の反
応液組成の分析結果ならびに選択率を表４に示した。ホ
スファチジル基転移反応を行なう際に反応系のpHをＰＬ
−Ｄの加水分解反応の至適pHより偏倚させることによ
り、ＰＬ−Ｄの選択率を変えることができ、ホスファチ
ジル基転移反応を微生物種に依存することなく抑制する
ことが可能となる。
を、グルコース１０％、肉エキス０．７５％、ポリペプ
トン０．７５％、NaCl ０．３％、MgSO4 ０．１％を含
む培地（pH７．２）で、温度３０℃、６日間振盪培養し
た。得られた菌体を２回水洗し、次いでアセトンに浸漬
した後濾過し、次いで常温にて真空乾燥した。得られた
乾燥菌体を５０mg培養上清を加える代わりに添加した以
外は実施例３と全く同様に行なった。５時間反応後の反
応液組成の分析結果ならびに選択率を表４に示した。ホ
スファチジル基転移反応を行なう際に反応系のpHをＰＬ
−Ｄの加水分解反応の至適pHより偏倚させることによ
り、ＰＬ−Ｄの選択率を変えることができ、ホスファチ
ジル基転移反応を微生物種に依存することなく抑制する
ことが可能となる。
【００３２】
【表４】
【図１】比較例１における反応液組成の経時変化を示す
グラフである。
グラフである。
【図２】実施例１における反応液組成の経時変化を示す
グラフである。
グラフである。
【図３】実施例２における反応液組成の経時変化を示す
グラフである。
グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:785） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:29） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:03）
Claims (2)
- 【請求項１】 微生物の生産するホスホリパーゼＤのホ
スファチジル基転移作用を利用して塩基構造が変換され
たリン脂質を製造するにあたり、反応系のpHをホスホリ
パーゼＤの加水分解反応の至適pHから偏倚させ、ホスホ
リパーゼＤを失活させることなく加水分解反応を抑制で
きるpHに保持し、ホスホリパーゼＤの選択率（加水分解
反応速度に対する転移反応速度の比）を高めて反応を行
なうことを特徴とするリン脂質の塩基交換反応方法。 - 【請求項２】 微生物がリゾプス属、アスペルギルス
属、シュードモナス属、ムコール属、キャンディダ属、
ペリシリウム属、クロモバクテリウム属、ストレプトマ
イセス属、ストレプトバーチシリウム属、ミクロモノス
ポラ属、ノカルディア属、ノカルディオプシス属及びア
クチノマヂューラ属から選択される少なくとも１種であ
る請求項１記載の反応方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17197692A JPH05336984A (ja) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | リン脂質の塩基交換反応方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17197692A JPH05336984A (ja) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | リン脂質の塩基交換反応方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05336984A true JPH05336984A (ja) | 1993-12-21 |
Family
ID=15933236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17197692A Withdrawn JPH05336984A (ja) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | リン脂質の塩基交換反応方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05336984A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006015773A2 (de) * | 2004-08-07 | 2006-02-16 | Bioghurt Biogarde Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur herstellung und/oder modifikation von phospholipiden unter verwendung der phospholiphase d aus streptomyces flavopersicum |
| US7067292B2 (en) | 2001-08-28 | 2006-06-27 | Bioghurt Biogarde Gmbh & Co. Kg | Method for the production of phospholipids |
-
1992
- 1992-06-04 JP JP17197692A patent/JPH05336984A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7067292B2 (en) | 2001-08-28 | 2006-06-27 | Bioghurt Biogarde Gmbh & Co. Kg | Method for the production of phospholipids |
| WO2006015773A2 (de) * | 2004-08-07 | 2006-02-16 | Bioghurt Biogarde Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur herstellung und/oder modifikation von phospholipiden unter verwendung der phospholiphase d aus streptomyces flavopersicum |
| WO2006015773A3 (de) * | 2004-08-07 | 2006-07-13 | Bioghurt Biogarde Gmbh & Co Kg | Verfahren zur herstellung und/oder modifikation von phospholipiden unter verwendung der phospholiphase d aus streptomyces flavopersicum |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19990831 |