WO2006015773A2 - Verfahren zur herstellung und/oder modifikation von phospholipiden unter verwendung der phospholiphase d aus streptomyces flavopersicum - Google Patents

Verfahren zur herstellung und/oder modifikation von phospholipiden unter verwendung der phospholiphase d aus streptomyces flavopersicum Download PDF

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WO2006015773A2
WO2006015773A2 PCT/EP2005/008374 EP2005008374W WO2006015773A2 WO 2006015773 A2 WO2006015773 A2 WO 2006015773A2 EP 2005008374 W EP2005008374 W EP 2005008374W WO 2006015773 A2 WO2006015773 A2 WO 2006015773A2
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reaction
phosphatidyl
phospholipase
streptomyces
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Alexander Skolaut
Tatjana Allin
Geoffrey Hills
Katrin Häser
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Bioghurt Biogarde Gmbh & Co. Kg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen

Definitions

  • the present invention is a process for the enzymatic production and / or modification of phospholipids by head group exchange with the aid of phospholipase D (PLD).
  • PLD phospholipase D
  • Japanese Patent Document Publication No. 02079990 also discloses a process for producing phosphatidylserine using a phospholipase D derived from Streptomyces to react phosphatidylcholine and serine.
  • Japanese Patent Publication No. 2001-279612 discloses a process for producing phosphatides, wherein the starting phosphatides are reacted with an alcohol component in a single-phase aqueous system with a phospholipase D having a transphosphatidylating activity and Streptoverticillium hachijoense (ATCC 19769) is produced.
  • the subject of the international patent application WO 02/12485 is a promoter from the DNA of Streptoverticillium cinnamoneum, with which it should be possible to produce special protein compounds, such as, for example, phospholipase D.
  • phospholipid-vitamin conjugates can be produced enzymatically by using a phospholipase D derived from Streptomyces strains and especially Streptoverticillium flavopersicum.
  • a phospholipase D derived from Streptomyces strains and especially Streptoverticillium flavopersicum.
  • it is assumed in particular of dimyristoylphosphatidylcholine and pyridoxine or pyrodylcarbinol.
  • Streptomyces strains are generally used for fermentation processes or to obtain specific enzymes.
  • EP 141 613 A1 et al. a method of producing optically active 3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine involving Streptomyces aureoverticillatus, Streptomyces bicolor, Streptomyces blastmyceticus, Streptomyces chartreusis, Streptomyces flavopersicus, Streptomyces flavotricini, Streptomyces hachijoensis, Streptomyces halstedii, Streptomyces tendae, Streptomyces toyocaensis , Streptoverticillium griseocarneum or Streptoverticillium hiroshimense.
  • Japanese Patent Document JP 83107175 discloses a process for producing cholesterol oxidase, which enzyme can be derived from Streptomyces aspergillus, Streptomyces capuensis, Streptomyces flavopersicus or Streptomyces griseolavendus.
  • JP 05336984 A2 and JP 05336984 A2 also describe the use of a culture broth of Streptoverticillium cinnamoneum, wherein phosphatidylcholine is converted to phosphatidylethanolamine and phosphatidic acid in a two-phase system.
  • the transferase activity should be improved by adding phospholipids into the culture medium of, for example, Streptoverticillium be, the microorganisms are then used in the two-phase system.
  • the isolation or purification of a PLD from Streptoverticillium cinnamoneum describes SU 1125246 and SU 986923 and Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya (1982), 18 (1), 41 to 47.
  • PLDs 1 Hydrolysis and transphosphatidylation of different PLDs 1 such as phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine and phosphatidylserine, wherein the actual Transphosphatidyl mecanics is activated by the addition of metal ions.
  • the object of the present invention is therefore to provide a process for the enzymatic preparation and / or modification of
  • PLD phospholipase D
  • a PLD should be used, which can be used not only in highly purified form, but their activity is sufficient to be used in the form of a low-fermentation or fermentation broth.
  • a phospholipase D which consists of Streptoverticillium flavopersicum, Streptoverticillium netropsis and / or Streptomyces netropsis.
  • the phospholipases D used in the process according to the invention are enzymes with pronounced activity. It has therefore also been found in the present context advantageous that in addition to the use of the PLD in a purified form, a crude or at least partially purified PLD-containing fermentation broth can be used. As also already mentioned, the PLDs encompassed by this invention also develop their activity and activity specificity in immobilized form, covalent and / or adsorbent binding modes being preferred for the enzymes, which is also included in the present invention.
  • the phospholipids suitable for the present process are not limited to certain varieties, it has been found to be advisable to use lecithins and particularly preferably soya, rapeseed oil or egg yolk lecithins as starting materials, it also being possible for corresponding mixtures to be used , Also, the amount of starting material used is completely uncritical, so that preferred amounts between 1, 0 and 20.0% by weight, based on the reaction mixture, in the method according to the invention can be used, wherein dispersions of phospholipids are to be regarded as particularly preferred. Especially recommended are quantities that are between 3.0 and
  • the present invention recommends pH values of the reaction mixture that are between 4.0 and 9.0, with values between 5.0 and 7.5 being preferred and pH values between 5.5 and 6 5 are to be regarded as particularly preferred.
  • the reaction temperature should be between 5 and 60 ° C, taking into account the particular starting material used and the degree of purity of the PLD temperature ranges between 20 and 50 ° C are preferred and temperatures between 25 and 45 ° C are considered to be particularly suitable.
  • the claimed process can also be carried out in the absence of cofactors, it may be advisable in specific cases to add metal ions to the reaction mixture to increase the enzyme activity.
  • the invention provides that the reaction mixture then contains divalent metal ions, such as Ca 2+ , Mg 2+ and / or Zn 2+ , preferably in concentrations between 0.5 and 100 mM.
  • the PLD variants used in the claimed process have a pronounced effect and substrate specificity, which is why they can also be used in crude, ie uncleaned, form. This means that, depending on the degree of purification of the reaction conditions and the particular used in terms of their amounts However, the present invention recommends PLD amounts, the enzyme activity of 0.1 to 1,000 units / g, preferably 0.1 to 100 units / g and more preferably 0.1 to 10 units / g , used starting material correspond.
  • the present invention preferably provides phosphatidic acid, phosphatidylserine, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol and / or phosphatidylglycerol as preferred reaction products.
  • the present invention also claims a process variant in which the total reaction time is between 0.5 and 20 hours, wherein preferably the reaction should be completed within 1 to 8 hours, more preferably between 3 and 6 hours.
  • the reaction solution of the process according to the invention after the end of the reaction is considered to be approximately free of phosphatidic acid.
  • the present invention also includes an additional variant in which the reaction solution at the end of the reaction contains a maximum of 1.0% by weight, based on the total reaction mixture of phosphatidic acid.
  • a further variant according to the invention provides that the reaction solution contains a maximum of 15 wt .-% of phosphatidic acid after completion of the reaction, but this amount is now based on the phospholipid content.
  • the resulting phospholipid or the phospholipid mixture produced can additionally be purified by an alcoholic extraction, for which in particular an alcohol having 1 to 3 carbon atoms or any mixtures thereof are used. Ethanol has proven particularly suitable for this purpose.
  • the phospholipids produced by this new and extremely economical process are not limited to specific fields of application.
  • the phospholipids obtainable in this way are suitable both for technical and physiological applications, with the improvement in the final performance in particular is in the foreground, for the purpose of the phospholipids according to the invention can be used in the form of dietary supplements, functional foods or in the context of clinical special nutrition.
  • the pH is kept constant using an autotitrator (Metrohm, Titrino 716 S, 0.1 N sodium hydroxide solution).
  • an autotitrator Microhm, Titrino 716 S, 0.1 N sodium hydroxide solution.
  • 500 ⁇ l of a preparation of the PLD from Streptoverticillium flavopersicum (950 U / ml) 5 were added to the reaction mixture. After a reaction time of four hours, the reaction was stopped by a pH shift (pH: 3.0).
  • the phospholipid distribution in the crude reaction product was as follows:
  • PA 10% by weight (0.25% by weight based on the reaction solution)
  • PC 6% by weight
  • PE 6% by weight
  • PS 26% by weight
  • PI 13% by weight 5
  • the phospholipid distribution in the crude reaction product was as follows:
  • PA 6 wt .-% (0.25 wt .-% based on the reaction solution)
  • PC 6 wt .-%
  • PE 1 wt .-%
  • PS 62 wt .-%
  • PI 0 wt .-%

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung und/oder Modifikation von Phospholipiden beansprucht, bei dem der Kopfgruppenaustausch mit Hilfe von Phospholipase D (PLD) durchgeführt wird, die aus Streptoverticillium flavopersicum, Streptoverticillium netropsis und/oder Streptomyces netropsis stammt. Das Enzym kann bei diesem Verfahren sowohl in aufgereinigter Form, als auch als rohe oder teilaufgereinigte PLD­ haltige Fermentationsbrühe auch in immobilisierter Form eingesetzt werden. Als Ausgangsmaterial kommen Lecithine in Frage, die in Gegenwart zweiwertiger Metallionen bei pH-Werten zwischen 4,0 und 9,0 sowie Reaktionstemperaturen zwischen 5 bis 60 °C insbesondere zu Phosphatidyl­säure, Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol und/oder Phosphatidylglycerin umgesetzt werden. Das Verfahren zeichnet sich insbesondere durch seine Wirkungsspezifität und die ausgeprägte Aktivität der eingesetzten PLD aus, wobei die erhaltenen Reaktionslösungen beinahe frei von Phosphatidylsäure sind.

Description

Verfahren zur enzymatischen Herstellung und/oder Modifikation von
Phospholipiden
Beschreibung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung und/oder Modifikation von Phospholipiden durch Kopfgruppenaustausch mit Hilfe von Phospholipase D (PLD).
Verfahren zur Herstellung von Phospholipiden unter Verwendung von Enzymen und insbesondere Phospholipase D sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt, wobei das Hauptaugenmerk auf nachgeschalteten Aufreinigungs- und Abtrennungsschritten zur Gewinnung hochreiner Phospholipide liegt. Beispielhaft verwiesen sei in diesem Zusammenhang auf das Patentdokument EP 1048738 B1 , welches ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserinen beschreibt, bei dem Phosphatide mit Serin in Gegenwart einer Phospholipase D umgesetzt werden. Das Reaktionsmedium stellt eine wässrige Dispersion dar und die Reaktion verläuft in Gegenwart mindestens eines oberflächenaktiven Mittels. Bezüglich der eingesetzten PLD ist angegeben, dass diese durch den Stamm Streptomyces ATCC 55717 produziert wurde.
Aus dem japanischen Patentdokument, veröffentlicht unter der Nr. 02079990, ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin bekannt, bei dem zur Umsetzung von Phosphatidylcholin und Serin eine Phospholipase D eingesetzt wird, die aus Streptomyces stammt.
Das japanische Patentdokument Nr. 2001-279612 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatiden, wobei die Ausgangsphosphatide mit einer Alkohol-Komponente in einem einphasigen wässrigen System mit einer Phospholipase D umgesetzt werden, die eine Transphosphatidylierungsaktivität besitzt und durch Streptoverticillium hachijoense (ATCC 19769) produziert wird.
Gegenstand der internationalen Patentanmeldung WO 02/12485 ist ein Promoter aus der DNA von Streptoverticillium cinnamoneum, mit dem es möglich sein soll, spezielle Eiweiß-Verbindungen, wie bspw. Phospholipase D, herzustellen.
Gemäß dem Dokument CA 2,005,990 können Phospholipid-Vitamin- Konjugate enzymatisch hergestellt werden, indem eine Phospholipase D eingesetzt wird, die aus Streptomyces-Stämmen und insbesondere Streptoverticillium flavopersicum stammt. Hierbei wird insbesondere von Dimyristoylphosphatidylcholin und Pyridoxin oder Pyrodylcarbinol ausgegangen.
Streptomyces-Stämme werden generell für Fermentationsprozesse oder zur Gewinnung spezifischer Enzyme verwendet. So beschreibt bspw. EP 141 613 A1 u.a. ein Verfahren zur Herstellung des optisch aktiven 3-(3,4- Dihydroxyphenyl)-Serins unter Beteiligung von Streptomyces aureoverticillatus, Streptomyces bicolor, Streptomyces blastmyceticus, Streptomyces chartreusis, Streptomyces flavopersicus, Streptomyces flavotricini, Streptomyces hachijoensis, Streptomyces halstedii, Streptomyces tendae, Streptomyces toyocaensis, Streptoverticillium griseocarneum oder Streptoverticillium hiroshimense. Aus dem japanischen Patentdokument JP 83107175 ist ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase bekannt, wobei das Enzym aus Streptomyces aspergilloides, Streptomyces capuensis, Streptomyces flavopersicus oder Streptomyces griseolavendus stammen kann.
Die Herstellung von Phospholipiden mit Hilfe einer PLD aus Streptoverticillium cinneamoneum in Gegenwart von EDTA beschreibt JP 06269287 A2.
Aus Biotechnology and Bioengineering 1994, 44 (10), 1193 bis 1198 ist die Herstellung von Phosphatidylethanolamin aus Phosphatidylcholin unter Verwendung einer Kulturbrühe eines Actinomyceten bekannt, wobei die ursprünglich geringe Selektivität durch Zugabe von EDTA in einem Zweiphasensystem deutlich gesteigert werden soll. Als typische Actinomyceten sind Streptomyces mediocidicus, Streptoverticillium cinnamoneum und Streptoverticillium hachijoense aufgeführt.
Auch die beiden japanischen Patentdokumente JP 05336984 A2 und JP 05336984 A2 beschreiben die Verwendung einer Kulturbrühe von Streptoverticillium cinnamoneum, wobei Phosphatidylcholin zu Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylsäure in einem Zweiphasensystem umgesetzt wird.
Die Herstellung von Phospholipase D mit Hilfe von bestimmten Streptomyces-Vertretern ist ebenfalls im Stand der Technik umfangreich vorbeschrieben. So ist der Publikation General of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2003), 23(2-5), 107 bis 115 die Konstruktion eines Überexprimierungssystems zur extrazellulären Produktion zu entnehmen, wobei die Umsetzung von Phosphatidylcholin zu Phosphatidylethanolamin im Vordergrund steht und zur Herstellung des Enzyms Streptoverticillium cinnamoneum eingesetzt wird. Die Herstellung von PLD mit Hilfe immobilisierter Zellen von Streptoverticillium cinnamoneum beschreibt Biotechnology Letters (1996), 18(8), 951 bis 956. Gemäß JP 05056776 A2 soll die Verbesserung der Transferase-Aktivität durch Zugabe von Phospholipiden in das Kulturmedium von bspw. Streptoverticillium möglich sein, wobei die Mikroorganismen anschließend im Zweiphasensystem eingesetzt werden. Die Isolation bzw. Aufreinigung einer PLD aus Streptoverticillium cinnamoneum beschreiben SU 1125246 und SU 986923 sowie Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya (1982), 18(1), 41 bis 47.
Aus Biochimica et Biophysica Acta (2001), 1530(1), 23 bis 31 ist eine membrangebundene PLD aus Streptoverticillium cinnamoneum bekannt, die ausschließlich hydrolytische Aktivität besitzt und Phosphatidylethanolamin sowie Phosphatidylserin als Substrate bevorzugt. Diese PLD ist nicht zu einer Transferase-Reaktion fähig.
Die Reinigung, Sequenzierung und Charakterisierung einer sekretorischen PLD aus Streptoverticillium cinnamoneum beschreibt das Journal of
Biochemistry (Tokyo) (1999), 125(2), 263 bis 269. Diese PLD katalysiert die
Hydrolyse und die Transphosphatidylierung unterschiedlicher PLDs1 wie bspw. Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin, wobei die eigentliche Transphosphatidylierungsaktion durch die Zugabe von Metallionen aktiviert wird.
Im Hinblick auf die Herstellung von Phospholipiden in enzymatischen Systemen ist neben der Auswahl des geeigneten Reaktionssystems immer auch der Einsatz von Phospholipase D ausschlaggebend. Zwar sind aus dem Stand der Technik Phospholipasen D unterschiedlicher Herkunft bekannt, jedoch besteht nach wie vor der Bedarf nach neuen PLDs, insbesondere mit ausgeprägter Wirkungsspezifität.
Für die vorliegende Erfindung hat sich deshalb die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung und/oder Modifikation von
Phospholipiden bereitzustellen, bei dem der Kopfgruppenaustausch mit Hilfe von Phospholipase D (PLD) durchgeführt wird. Die in diesem Verfahren eingesetzte PLD sollte eine ausgeprägte Wirkungsspezifität aufweisen, so dass nach Beendigung der Umsetzung das Reaktionsmedium arm an unreagierten Gehalten von eingesetzten Phospholipiden ist und gleichzeitig nur geringe Gehalte an unerwünschten Nebenprodukten aufweist.
Außerdem sollte eine PLD eingesetzt werden, die nicht nur in stark aufgereinigter Form eingesetzt werden kann, sondern deren Aktivität ausreicht, um auch in Form einer wenig aufgereicherten Fermentations- oder Reaktionsbrühe eingesetzt zu werden.
Gelöst wurde diese Aufgabe mit einem entsprechenden Verfahren, bei dem eine Phospholipase D verwendet wird, die aus Streptoverticillium flavopersicum, Streptoverticillium netropsis und/oder Streptomyces netropsis stammt.
Überraschend wurde beim Einsatz dieses neuen Verfahrens festgestellt, dass nicht nur die Aufgabenstellung vollständig erfüllt wurde, indem die eingesetzten PLDs eine ausgeprägte Wirkungsspezifikät aufweisen und zudem auch in nicht-aufgereinigter Form zu zufriedenstellenden Umsätzen führen. Zusätzlich wurde nämlich auch gefunden, dass die Kopfgruppenaustauschreaktion, also die eigentliche Transphosphatidylierung nicht auf bestimmte Phospholipid-Vertreter beschränkt ist und dass die PLD auch in immobilisierter Form eingesetzt werden kann, was deren Verluste minimiert und zudem die Reaktion steuerbar macht. Diese Vorteile waren in Vorkenntnis der bislang bekannten Phospholipase D-Varianten nicht vorhersehbar.
Wie bereits als überraschender Effekt angesprochen, handelt es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Phospholipasen D um Enzyme mit einer ausgeprägten Aktivität. Es hat sich deshalb im vorliegenden Zusammenhang auch als vorteilhaft gezeigt, dass neben dem Einsatz der PLD in aufgereinigter Form auch eine rohe oder zumindest teilaufgereinigte PLD-haltige Fermentationsbrühe eingesetzt werden kann. Wie ebenfalls bereits erwähnt, entwickeln die von dieser Erfindung mitumfassten PLDs ihre Aktivität und Wirkungsspezifität auch in immobilisierter Form, wobei bevorzugt kovalente und/oder adsorbtive Bindungsarten für die Enzyme in Betracht kommen, was von der vorliegenden Erfindung ebenfalls mitumfasst wird.
Die für das vorliegende Verfahren geeigneten Phospholipide sind zwar nicht auf bestimmte Varietäten beschränkt, jedoch hat es sich als empfehlenswert herausgestellt, wenn als Ausgangsmaterialien Lecithine und besonders bevorzugt Soja-, Rapsöl- oder Eigelb-Lecithine eingesetzt werden, wobei selbstverständlich auch entsprechende Mischungen Anwendung finden können. Auch die jeweils eingesetzte Menge des Ausgangsmaterials ist völlig unkritisch, so dass bevorzugte Mengen zwischen 1 ,0 und 20,0 Gew.- %, bezogen auf das Reaktionsgemisch, im Verfahren gemäß Erfindung eingesetzt werden können, wobei Dispersionen von Phospholipiden als besonders bevorzugt anzusehen sind. Besonders empfehlenswert sind Mengen, die zwischen 3,0 und
12,0 Gew.-% bzw. zwischen 5,0 und 9,0 Gew.-% liegen, wiederum bezogen auf das Gesamtreaktionsgemisch.
Bezüglich der weiteren Reaktionsbedingungen ist festzustellen, dass diese ebenfalls vollkommen unkritisch sind. Im Sinne optimaler Ausbeuten und Umsatzraten empfiehlt die vorliegende Erfindung allerdings pH-Werte des Reaktionsgemisches, die zwischen 4,0 und 9,0 liegen, wobei Werte zwischen 5,0 und 7,5 als bevorzugt und pH-Werte zwischen 5,5 und 6,5 als besonders bevorzugt anzusehen sind. Die Reaktionstemperatur sollte sich zwischen 5 und 60 °C bewegen, wobei unter Beachtung des jeweils eingesetzten Ausgangsmaterials und des Reinheitsgrades der PLD Temperaturbereiche zwischen 20 und 50 °C bevorzugt werden und Temperaturen zwischen 25 und 45 °C als besonders geeignet zu betrachten sind.
Zwar kann das beanspruchte Verfahren auch in Abwesenheit von Cofaktoren durchgeführt werden, doch kann es in speziellen Fällen durchaus empfehlenswert sein, dem Reaktionsgemisch zur Steigerung der Enzym- Aktivität Metallionen zuzusetzen. Hierfür sieht die Erfindung vor, dass das Reaktionsgemisch dann zweiwertige Metallionen, wie Ca2+, Mg2+ und/oder Zn2+ enthält, vorzugsweise in Konzentrationen zwischen 0,5 und 100 mM.
Es wurde bereits mehrfach darauf hingewiesen, dass die im beanspruchten Verfahren eingesetzten PLD-Varianten eine ausgeprägte Wirkungs- und Substratspezifität besitzen, weshalb sie auch in roher, also unaufgereinigter, Form eingesetzt werden können. Dies bedeutet im Hinblick auf deren Einsatzmengen, dass diese zwar in Abhängigkeit vom Aufreinigungsgrad von den Reaktionsbedingungen und dem jeweils verwendeten Ausgangsmaterial deutlich variieren können, jedoch empfiehlt die vorliegende Erfindung PLD-Mengen, die einer Enzym-Aktivität von 0,1 bis 1 000 Units/g, bevorzugt 0,1 bis 100 Units/g und stärker bevorzugt 0,1 bis 10 Units/g, eingesetzten Ausgangsmaterial entsprechen.
Hinsichtlich der durch Kopfgruppenaustausch erhältlichen Produkte sieht die vorliegende Erfindung vorzugsweise Phosphatidylsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol und/oder Phosphatidylglycerin als bevorzugte Reaktionsprodukte vor.
Schließlich wird mit der vorliegenden Erfindung auch eine Verfahrensvariante beansprucht, bei der die Gesamtreaktionsdauer zwischen 0,5 und 20 Stunden liegt, wobei vorzugsweise die Reaktion innerhalb von 1 bis 8 Stunden, besonders bevorzugt zwischen 3 und 6 Stunden abgeschlossen sein sollte. Überraschenderweise wurde (wie bereits angesprochen) festgestellt, dass die Reaktionslösung des erfindungsgemäßen Verfahrens nach Reaktionsende als annähernd frei von Phosphatidylsäure anzusehen ist. Aus diesem Grund schließt die vorliegende Erfindung auch eine zusätzliche Variante ein, bei der die Reaktionslösung nach Reaktionsende maximal 1,0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtreaktionsgemisch an Phosphatidylsäure, enthält. Eine weitere erfindungsgemäße Variante sieht vor, dass die Reaktionslösung nach Beendigung der Reaktion maximal 15 Gew.-% an Phosphatidylsäure enthält, wobei diese Mengenangabe sich aber nun auf den Phospholipid-Anteil bezieht.
Abschließend kann das erhaltene Phospholipid bzw. das hergestellte Phospholipid-Gemisch im Rahmen der vorliegenden Erfindung zusätzlich durch eine alkoholische Extraktion aufgereinigt werden, wofür insbesondere ein Alkohol mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder beliebige Mischungen davon eingesetzt werden. Als besonders geeignet hat sich hierfür Ethanol erwiesen. Die mit diesem neuen und äußerst wirtschaftlichen Verfahren hergestellten Phospholipide sind natürlich nicht auf spezielle Anwendungsgebiete beschränkt. Aufgrund der Möglichkeit, sowohl die Substrate als auch die Produkte gezielt auszuwählen und die Zielverbindungen in großer Reinheit auf äußert wirtschaftliche Weise herzustellen, kommen die so erhältlichen Phospholipide sowohl für technische als auch für physiologische Anwendungen in Frage, wobei im letzten Fall insbesondere die Verbesserung der Gehimleistung im Vordergrund steht, zu deren Zweck die gemäß Erfindung hergestellten Phospholipide in Form von Nahrungsergänzungsmitteln, Funktionsnahrungsmitteln oder auch im Rahmen der klinischen Sonderernähung eingesetzt werden können.
Die nachfolgenden Beispiele verdeutlichen die Vorteile des beanspruchten Verfahrens:
Beispiele:
Beispiel 1 :
5 In einem Reaktionsgefäß wurden 30 g eines entölten Standardlecithins (EPIKURON® 100 P, Degussa Food Ingredients GmbH, 20 - 24 Gew.-% Phosphatidylchoiin, PC; 18 - 24 Gew.-% Phosphatidylethanolamin, PE; 12 -15 Gew.-% Phosphatidylinostol, PI; 4 - 7 Gew.-% Phosphatidsäure, PA) in einem Liter vollentsalztem Wasser bei 45 0C unter Rühren dispergiert. o Anschließend wurden 14 g CaCI2 (wasserfrei) und 300 g L-Serin zugegeben und der pH-Wert auf 6,0 eingestellt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit Hilfe eines Autotitrators (Firma Metrohm, Titrino 716 S, 0,1 N Natronlauge) konstant gehalten. Zum Start der Umsetzung wurden 500 μl einer Präparation der PLD aus Streptoverticillium flavopersicum (950 U/ml) 5 zur Reaktionsmischung gegeben. Nach einer Reaktionsdauer von vier Stunden wurde die Reaktion durch einen pH-Shift (pH: 3,0) beendet.
Die Phospholipidverteilung im Reaktionsrohprodukt war wie folgt:
o PA: 10 Gew.-% (0,25 Gew.-% bezogen auf die Reaktionslösung) PC: 6 Gew.-% PE: 6 Gew.-% PS: 26 Gew.-% PI: 13 Gew.-% 5
Beispiel 2:
In einem Reaktionsgefäß wurden 30 g eines angereicherten Lecithins (62 Gew.-% PC, 9 Gew.-% PE, 2 Gew.-% PA) in einem Liter vollentsalztem o Wasser bei 45 0C unter Rühren dispergiert. Anschließend wurden 1 ,4 g CaCI2 (wasserfrei) und 200 g L-Serin zugegeben und der pH-Wert auf 5,6 eingestellt. Während der Reaktion wurde der pH-Wert mit Hilfe eines Autotitrators (Firma Metrohm, Titrino 716 S, 0,1 N Natronlauge) konstant gehalten. Zum Start der Umsetzung wurden 350 Units einer Präparation der PLD aus Streptoverticillium netropsis zur Reaktionsmischung gegeben. Nach einer Reaktionsdauer von vier Stunden wurde die Reaktion durch einen pH-Shift (pH: 3,0) beendet.
Die Phospholipidverteilung im Reaktionsrohprodukt war wie folgt:
PA: 6 Gew.-% (0,25 Gew.-% bezogen auf die Reaktionslösung) PC: 6 Gew.-% PE: 1 Gew.-% PS: 62 Gew.-% PI: 0 Gew.-%

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung und/oder Modifikation von Phospholipiden durch Kopfgruppenaustausch mit Hilfe von 5 Phospholipase D (PLD), dadurch gekennzeichnet, dass eine
Phospholipase D aus Streptoverticillium flavopersicum, Streptoverticillium netropsis und/oder Streptomyces netropsis verwendet wird.
o 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine rohe oder teilaufgereinigte PLD-haltige Fermentationsbrühe oder eine aufgereinigte PLD eingesetzt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch 5 gekennzeichnet, dass die PLD in immobilisierter Form, bevorzugt in kovalenter und/oder adsorbtiver Bindungsart verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial Lecithin und besonders bevorzugt Soja-, o Rapsöl- und/oder Eigelblecithin eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsmaterial in Mengen von 1 ,0 bis 20,0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtreaktionsgemisch und bevorzugt als 5 Dispersion, eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 4,0 und 9,0, bevorzugt zwischen 5,0 und 7,5 und besonders bevorzug zwischen 5,5 und 6,5, liegt
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur 5 bis 60 0C beträgt, bevorzugt 20 bis 50 ° C und besonders bevorzugt 25 bis 45 0C.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgemisch zweiwertige Metallionen wie Ca2+, Mg2+ und/oder Zn2+ enthält, vorzugsweise in Konzentrationen zwischen 0,5 und 100 mM.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die PLD-Komponente in Mengen eingesetzt wird, die einer Enzym- Aktivität von 0,1 bis 1 000 Units/g eingesetztem Ausgangsmaterial, entspricht.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylsäure und/oder Phosphatidylglycerin erhalten werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtreaktionsdauer 0,5 bis 20 Stunden, bevorzugt 1 bis 8 Stunden und besonders bevorzugt 3 bis 6 Stunden beträgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionslösung nach Reaktionsende maximal 1,0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtreaktionsgemisch, an Phosphatidylsäure enthält.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionslösung nach Reaktionsende maximal 15 Gew.-%, bezogen auf den Phospholipid-Anteil, an Phosphatidylsäure enthält.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Phospholipid(-Gemisch) durch eine alkoholische Extraktion aufgereinigt wird.
PCT/EP2005/008374 2004-08-07 2005-08-02 Verfahren zur herstellung und/oder modifikation von phospholipiden unter verwendung der phospholiphase d aus streptomyces flavopersicum WO2006015773A2 (de)

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