CN111363733A

CN111363733A - 一种耐热磷脂酶d突变体及其制备和合成功能磷脂的方法

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Publication number: CN111363733A
Application number: CN202010161601.6A
Authority: CN
Inventors: 刘逸寒; 路福平; 马杰莹
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-03-10
Also published as: CN111363733B

Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种热稳定性能提升的磷脂酶D突变体及其制备与应用。通过分子生物学技术手段获得郝氏链霉菌(Streptomyces halstedii)野生型的磷脂酶D基因，利用易错PCR技术对野生型磷脂酶D基因进行随机突变，得到磷脂酶D突变体S163F，及其编码基因pldm，重新构建重组质粒，并实现了其在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得热稳定性进一步提高的磷脂酶D。

Description

一种耐热磷脂酶D突变体及其制备和合成功能磷脂的方法

技术领域：

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种热稳定性能提升的磷脂酶D突变体及其制备与应用。

背景技术：

磷脂酶D(Phospholipase D,PLD,EC 3.1.4.4)，是一种能作用于磷酰氧键的酶，不仅能水解磷脂头部末端的磷酯键生成磷脂酸和羟基化合物，还可以催化一些含羟基的化合物结合到磷脂的酰基上，形成新的磷脂，这一特性称为PLD的转磷酯化反应，也称碱基交换反应。磷脂广泛分布于动植物界，是一种天然的生物表面活性剂，也是人类及动植物组织细胞膜的重要组成成分，具有良好的乳化性和抗氧化性；同时作为细胞膜的重要组成部分还具有调节血脂，降低胆固醇；强化脑部功能，增强记忆力；延缓衰老等重要的生理功能。因此，可以利用PLD对磷脂进行改性，制备单一或稀有磷脂，如磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。这些酶改性磷脂在营养价值，各种性能等方面大为改进和提高，被广泛地应用于食品、保健品、医药、饲料、化妆品等领域。

目前，PLD已在植物、动物及微生物中相继发现。与动植物来源的PLD相比，微生物来源的PLD易于分离、提取及生产，具有较强的底物耐受性，较宽广的底物专一性和较高的转酯活性，因而备受关注。目前已报道的产PLD的微生物主要有链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、大肠杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏杆菌属(Salmonella)等。其中，链霉菌属来源的PLD表现出较强的转酯能力以及更为广泛的底物选择谱，因此，对其研究最为广泛。

目前，常见的磷脂制备工艺主要有有机溶剂萃取法和超临界CO₂萃取法。有机溶剂萃取法生产纯度低、存在有机溶剂残留等安全隐患；超临界CO₂萃取法存在生产成本高，工业化难度大等问题。与之相比，利用PLD生物催化制备自然界稀少、难以分离提纯的单一磷脂及磷脂衍生物，具有绿色环保、反应条件温和，成本低廉，规模化生产简单等优点。PLD的应用严格受限于其活性、专一性、最适温度和pH值、温度和酸碱稳定性、溶剂耐受性等酶学性质。其中热稳定性是酶的一个重要性质，具有以下优点：活力稳定；能降低微生物污染的概率；对化学变性剂具有较好的抵抗力；加快动力学反应；在较高温度下，增加底物溶解度和利用率；降低工业成本等。因此，酶的热稳定性研究具有重要意义，有助于扩展酶在食品、医药、饲料等领域的应用。然而，目前大多数PLD维持其正常活性的条件温和，而实际应用中高热、高酸、高盐等环境不可避免，从而导致酶的热稳定性差、效率低和特异性差等，这不仅限制了其应用范围，还增加了工业应用成本，为实际应用带来困难。因此，筛选到热稳定性能好的PLD及其编码基因，具有重要研究意义。为了解决这些实际应用问题，研究者通过蛋白质工程技术来改善天然酶的功能及特征，以满足工业上的应用，例如定向进化、理性设计、化学修饰等。

定向进化是改善蛋白质功能和活性的重要手段之一，尤其在提高蛋白质热稳定性方面。它属于蛋白质的非理性设计，不需要获得蛋白的高级结构以及催化位点等结构，只需对蛋白氨基酸序列做随机突变。它可以在实验室里模拟自然选择的进化机制，通过分子生物学手段在体外快速建立含大量目的蛋白编码基因的突变体文库，并通过高通量的定向筛选方法，快速得到符合人类应用价值的蛋白突变体。定向进化的核心步骤主要包括构建具有多样性的突变体文库和高通量的筛选方法。常用的包括：易错PCR、饱和突变、DNA改组、交错延伸PCR等。定点突变，即理性设计，在蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等基础上，有的放矢对其进行改造，且只能对天然酶蛋白质中的少数氨基酸进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，对酶功能的改造有限。因此，对于结构与功能未知的酶，定向进化可在一定程度上弥补理性设计的不足。

芽孢杆菌表达系统作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛地应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。它与常用的大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可将目的基因表达的产物分泌到胞外，从而降低进一步收集、分离、纯化基因表达产物的成本和工作量。

芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等均可作为表达宿主菌。在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究也十分清楚，具有密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、不产生致病毒素、对培养基无特殊要求等优点。随着分子生物学技术的发展和芽孢杆菌研究的深入，使用芽孢杆菌表达系统已经克隆和表达了大量基因，有些已进行大规模工业生产，多种酶和临床需要的化学药品或者工业产品都通过芽孢杆菌来表达生产。

发明内容：

基于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种热稳定性能提升的新型PLD及其制备与应用。

实现本发明目的的技术路线概述如下：

通过基本的分子生物学技术手段获得郝氏链霉菌(Streptomyces halstedii)野生型PLD基因，通过酶切、连接等构建重组载体之后，经测序获得野生型pld序列(如SEQ IDNO.2所示)，利用易错PCR技术对野生型PLD基因进行随机突变，利用枯草芽孢杆菌表达系统筛选得到PLD突变体S163F，及其编码基因pldm，重新构建重组载体，并实现了其在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得热稳定性能提高的PLD突变体。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.PLD突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示PLD突变体中突变的氨基酸。如Ser163Phe，表示位置163的氨基酸由野生型PLD的Ser替换成Phe，位置的编号对应于SEQ IDNo.1中野生型PLD的氨基酸序列编号。

在本发明中，小写斜体pld表示野生型PLD的编码基因，小写斜体pldm表示突变体S163F的编码基因，信息如下表。

PLD	氨基酸突变位点	基因突变位点	氨基酸SEQ ID No.	核苷酸SEQ ID No.
					野生型	—	—	1	2
S163F	Ser163Phe	T<u>C</u>C→T<u>T</u>C	3	4

所述的PLD突变体及其编码基因的表达载体为pBSA43，宿主细胞可以为枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218或地衣芽孢杆菌TCCC11965。

本发明的实验方案具体如下：

1、所述热稳定性能提升的PLD突变体编码基因的获得，包括如下步骤：

(1)以郝氏链霉菌野生型PLD编码基因pld(SEQ ID No.2)为模板进行易错PCR随机突变野生型PLD编码基因；

(2)将随机突变后的PLD编码基因，通过酶切、连接等构建重组质粒后转入枯草芽孢杆菌WB600中，筛选获得热稳定性能提升的PLD突变体，经测序获得PLD突变体编码基因pldm，将含有热稳定性能提高的PLD突变体编码基因的质粒pET22b-pldm保存。

2、一株含热稳定性能提高的PLD编码基因的枯草芽孢杆菌重组菌株及以其制备热稳定PLD的过程，包括如下步骤：

(1)将PLD突变体编码基因pldm与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43通过连接得到新的重组质粒pBSA43-pldm；

(2)将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中，经卡那霉素(Kan)抗性筛选，酶切验证得到重组菌株，之后将重组菌株进行培养发酵，得到热稳定性能提高的PLD。

3、一株含有热稳定性能提高的PLD编码基因的解淀粉芽孢杆菌菌株及以其制备热稳定性能提高的PLD的过程，包括如下步骤：

(1)将重组质粒pBSA43-pldm转入解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218，得到的重组菌株经过Kan抗性筛选和PLD的酶活测定，得到热稳定性能提高的PLD的高产菌株；

(2)之后进行发酵，制备热稳定性能提高的PLD。

4、一株含有热稳定性能提高的PLD编码基因的地衣芽孢杆菌菌株及以其制备热稳定性能提高的PLD的过程，包括如下步骤：

(1)将重组质粒pBSA43-pldm转入宿主菌株地衣芽孢杆菌TCCC11965中，经过Kan抗性筛选得到PLD重组菌株。

(2)将重组菌株发酵后制备热稳定性提高的PLD。

所述PLD突变体S163F的酶学特性如下：

(1)比活：PLD突变体S163F的比活为12.8U/mg。

(2)最适反应温度：50℃。

(3)温度稳定性：在pH 6.0条件下，分别于30和40℃水浴保温120min后，突变体PLD的残余酶活分别为98％左右和92％左右，相比之下野生型的残余酶活分别为90％左右和60％左右；在50℃时水浴保温60min后，突变体PLD仍有27％左右的残余酶活，与之相比野生型PLD保温40min已完全失活。

(4)最适pH及pH稳定性：野生型和突变体PLD最适pH均为6.0，于4℃下，在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中保温120h后，二者残余活力均保持在85％以上。

本发明还提供上述PLD突变体S163F及其编码基因的应用，特别是在合成功能磷脂中的应用。

有益效果：

1、本发明利用易错PCR技术对野生型PLD进行随机突变，得到热稳定性提高的突变体S163F，在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中，分别于30、40℃时保温120min后，发现突变体PLD与野生型PLD相比随着保温时间的增加稳定性有所提高。温度为30℃时，保温120min后，突变体PLD残余酶活比野生型酶活提高8％左右；温度为40℃时，保温120min后，突变体PLD残余酶活比野生型酶活提高32％左右；温度为50℃时，保温40min后，野生型PLD已失活，而突变体PLD保温60min后仍有27％左右的残余酶活。

2、本发明分别使用了枯草芽孢杆菌表达系统、解淀粉芽孢杆菌表达系统、地衣芽孢杆菌系统，实现热稳定性能提高的PLD突变体不同方式的高效表达。

说明书附图：

图1为本发明野生型PLD基因的PCR扩增电泳图

其中：M为DNA Marker，1为PLD基因；

图2为本发明重组质粒pBSA43-pldm酶切验证图

其中：M为DNA Marker，1为枯草芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-pldm经BamH I和HindIII双酶切电泳图，2为解淀粉芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-pldmBamH I和Hind III双酶切电泳图，3为地衣芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-pldm经BamH I和Hind III双酶切电泳图；

图3为本发明突变体S163F纯化样品的SDS-PAGE图

其中：M为DNA Marker，1为S163F纯化样品；

图4为本发明野生型PLD与突变体PLD最适温度曲线

其中：WT为本发明野生型PLD，S163F为本发明突变体PLD；

图5为本发明野生型PLD与突变体PLD最适pH曲线

其中：WT为本发明野生型PLD，S163F为本发明突变体PLD；

图6为热稳定性曲线

其中：

A为30℃下分别保温20、40、60、80、100、120min的热稳定性曲线；

B为40℃下分别保温20、40、60、80、100、120min的热稳定性曲线；

C为50℃下分别保温10、20、30、40、50、60min的热稳定性曲线；

WT为本发明野生型PLD，S163F为本发明突变体PLD；

图7为pH 6.0时的稳定性曲线

其中：WT为本发明野生型PLD，S163F为本发明突变体PLD。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明所使用的地衣芽胞杆菌为TCCC11965，公开于：Development andapplication of a CRISPR/Cas9 system for Bacillus licheniformis genome editing[J].International Journal of Biological Macromolecules,2019,122:329-337，目前保存于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心，公众可从该中心获取菌种。

本发明实施例所用培养基如下：

LB培养基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0。

10×SP盐溶液(g/L)：K₂HPO₄ 91.7，KH₂PO₄ 30，(NH4)₂SO₄ 10，柠檬酸钠5，MgSO₄·7H₂O 10。

SP I培养基：1×SP 97.6mL，5％酪蛋白水解物400μL，10％酵母汁1mL，50％葡萄糖1mL。(5％酪蛋白水解物：0.5g酸水解酪蛋白溶于10mL ddH₂O；10％酵母汁：1g酵母提取物溶于10mL ddH₂O；50％葡萄糖：5g葡萄糖溶于10mL ddH₂O)

SP II培养基：SP I培养基99mL，100mM CaCl₂ 500μL，500mM MgCl₂ 500μL。

LBS培养基(g/L)：山梨醇91.085，NaCl 10，酵母抽提物5，胰蛋白胨10。

种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；

发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L。

上述培养基的固态培养基均添加2％琼脂。

实施例1：野生型PLD基因的获得

1.野生型PLD基因来自实验室保存的郝氏链霉菌(Streptomyces halstedii)TCCC21102菌株，提取基因组。

(1)菌株活化：用接种环从甘油管中蘸取郝氏链霉菌孢子液，接种于GYM平板，三区划线，28℃恒温培养4-5d；

(2)转接：用无菌水将茄子瓶内孢子洗下，12000r/min离心1min，反复清洗，最后转接于50mL的2XYT液体培养基中，置于摇床中，28℃，200r/min，培养24h；

(3)收集菌体：取适量培养菌液分装于1.5mL EP管，12000r/min离心2min，弃上清；

(4)加入100μL ddH₂O重悬菌体，并加入50μL的50mg/mL溶菌酶，37℃水浴10min；

(5)加入100μL BTL Buffer和20μL蛋白酶K，旋涡振荡；

(6)55℃水浴40-50min，每隔20-30min，振荡混匀；

(7)加入5μL RNA酶，颠倒混匀数次，室温放置5min；

(8)12000rpm离心2min，去掉未消化部分，将上清部分转移至新的1.5mL EP管；

(9)加入220μL BDL Buffer，振荡混匀，65℃水浴10min；

(10)加入220μL无水乙醇，吹吸混匀；

(11)转移至吸附柱，静置1min，12000rpm离心1min，弃滤液；

(12)加入500μL HBC Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(13)加入700μL DNA Wash Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(14)加入500μL DNA Wash Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(15)12000rpm，空离2min，55℃金属浴10min，晾干；

(16)加入40μL ddH₂O洗脱基因组。

2.扩增野生型PLD基因

设计野生型PLD基因的扩增引物，序列如下：

上游P1(SEQ ID No.5)：

CGGGATCCGCGGAAGCGCCCACA(划线部分为BamH I酶切位点)

下游P2(SEQ ID No.6)：

CCCAAGCTTGCCCTGGCAGAGGCC(划线部分为Hind III酶切位点)

PCR扩增的反应体系为50μL，其组成为：

PrimeSTAR Max	25μL
		上游引物P1(20μmol/L)	2μL
下游引物P2(20μmol/L)	2μL
		基因组	2μL
ddH<sub>2</sub>O	19μL
		总体积	50Μl

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

扩增程序的设置为：

a.预变性:98℃30s；

b.变性：98℃10s；

c.退火：56℃45s；

d.延伸：72℃10s；

e.b-d反应30个循环；

f.延伸:72℃10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到郝氏链霉菌野生型PLD基因的条带，约1500bp(见图1)，再由DNA切胶回收试剂盒回收PCR产物，通过酶切、连接构建重组质粒pET22b-pld，送测序公司进行测序，获得野生型pld基因序列(SEQ ID NO.2所示)。

实施例2：PLD突变体S163F的获得

1.易错PCR：以野生型PLD基因为模板进行易错PCR，其反应体系如下：

ddH<sub>2</sub>O	21Μl
		重组质粒pET22b-pld(5ng/μL)	1μL
上游引物P1(10μmol/L)	2μL
		下游引物P2(10μmol/L)	2Μl
Taq DNA聚合酶	0.5Μl
		10×Taq buffer	5μL
dATP(10mmol/L)	1Μl
		dGTP(10mmol/L)	1Μl
dTTP(10mmol/L)	5μL
		dCTP(10mmol/L)	5μL
MgCl<sub>2</sub>(25mmol/L)	10Μl
		MnCl<sub>2</sub>(10mmol/L)	1.25Μl

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

体系完成后，进行易错PCR反应，程序设置如下：

a.预变性:95℃5min；

b.变性：95℃30s；

c.退火：56℃45s；

d.延伸：72℃90s；

e.b-d反应35个循环；

f.延伸:72℃10min。

PCR反应结束后，将PCR产物与载体质粒进行BamH I和Hind III双酶切，经过纯化回收，易错PCR产物与同样经过双酶切的载体质粒pBSA43进行连接，通过转化枯草芽孢杆菌WB600，涂布于含Kan(100μg/mL)的LB固体培养基，37℃培养箱静置培养12h，得到转化子。

3.筛选方法：采用酶联比色法进行活性检测。PLD可以将大豆卵磷脂(PC)水解为胆碱和磷脂酸，胆碱在胆碱氧化酶的作用下生成甜菜碱和过氧化氢(H₂O₂)，H₂O₂通过过氧化氢酶的作用与4-氨基安替比啉和苯酚生成醌亚胺显色物质，该物质在500nm下具有吸光值。因此通过检测胆碱的含量，可以定量计算出PLD在一定时间内的水解效率，从而得到其酶活力大小。由于发酵上清存在目的蛋白，可以直接用发酵上清进行筛选。

4.突变体文库的筛选：在96孔板中每个孔中加入200μL含Kan(100μg/mL)的LB液体培养基，随后，用灭过菌的牙签挑取每一个转化子的单克隆至96孔板中，挑取过程中尽可能使得每次都刚好沾到少量的菌。将96孔板转移至摇床培养，160rpm，37℃培养48h。然后采用低温离心机(4℃)，4000rpm离心10min，取50μL发酵上清加入到200μL反应液的96孔板1中，40℃反应10min，然后加入20μL反应终止液，煮沸5min，待其冷却至室温后，加入130μL显色液，在37℃的酶标仪内准确反应30min后，检测OD₅₀₀。检测出具有活性的突变体后，这些突变体对应的剩余发酵上清取50μL放入板2各孔中，然后放置在50℃保温30min，随后冰上放置2min后，按同样方法在40℃下检测酶活力。

注：反应液：卵磷脂乳液(卵磷脂乳液：0.1g大豆卵磷脂，2mL乙醚，3mL 7.5％Triton X-100，20mL ddH₂O)：100mM Tris-HCl(pH 8.0)：100mM CaCl₂＝23:2:1(v/v/v)。

反应终止液：Tris 121.14mg/mL，EDTANa₂ 186mg/mL，用HCl调pH至8.0.

显色液：胆碱氧化酶0.5U/mL，过氧化氢酶1U/mL，4-氨基安替比啉0.5mg/mL，Triton X-100 5mg/mL，苯酚0.25mg/mL，10mM Tris-HCl(pH 8.0)1mL/mL。

5.选取热稳定性提高的突变体。根据板1与板2的情况，计算每个突变体的残余酶活，选取相较于野生型热稳定性能提升的突变体，对选取的突变体进行酶活与热稳定性能的重复实验后，获得在50℃保温30min后仍有残余酶活的突变体，将该突变体接入平板，并送出菌样进行测序。

经过上述步骤的易错PCR，选取出热稳定性能提高的突变体，测序后得到其中含有一个氨基酸突变，即S163F(TCC→TTC)，从而获得PLD突变体S163F(SEQ ID NO.3)，及其编码基因pldm(SEQ ID NO.4)。

实施例3：枯草芽孢杆菌热稳定性能提高的PLD重组菌的构建

1.构建热稳定性能提升的PLD表达质粒pBSA43-pldm

将PLD突变体基因pldm与枯草芽孢杆菌表达载体pBSA43都经BamHI和HindIII双酶切，随后进行连接，构建得到重组质粒pBSA43-pldm，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证并测序，确定构建成功，即获得重组表达质粒pBSA43-pldm。

2.表达质粒pBSA43-pldm转化枯草芽孢杆菌WB600

(1)枯草芽孢杆菌WB600菌种活化，在无抗LB平板上三区划线，培养12h；

(2)挑取单菌落，接种于含有5mL LB培养基的试管中，37℃，220rpm培养12h；

(3)按2％的接种量，取100μL种子液接种于含有5mL SPI培养基的试管中，37℃，220rpm，培养3-4h至OD₆₀₀＝1.2；

(4)快速取200μL接种于2mL SPII培养基，37℃，100rpm，培养1.5h；

(5)加入20μL的10mM EGTA，37℃，100rpm，培养10min；

(6)加入1-2μL重组质粒，37℃，100rpm，培养30min后，转速调至220rpm，继续培养1-2h；

(7)将菌液转移至已灭菌的1.5mL EP管中，5000rpm离心5min，弃上清，留50μL培养液重悬菌体，菌液涂布于含Kan的平板；

(8)挑转化子，提质粒、酶切验证(如图2中1泳道所示)，得到枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-pldm。

实施例4：构建解淀粉芽孢杆菌热稳定性能提升的PLD表达重组菌株

1.构建解淀粉芽孢杆菌热稳定性能提升的PLD高表达重组菌株

(1)制备解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218感受态

①菌种活化，在无抗LB固体培养基上三区划线，37℃培养24h；

②挑单菌落接种于LBS培养基，37℃，220rpm，培养12h；

③以2％的接种量，将种子液接种于100mL LBS培养基中，37℃，220rpm，培养2-3h至OD₆₀₀＝0.4-0.6；

④用低温离心机(4℃),5000rpm，离心10min，弃上清；

⑤菌体用30mL洗涤缓冲液(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油)重悬，用低温离心机(4℃),5000rpm，离心10min，弃上清；

⑥重复步骤⑤，共洗涤3次；

⑦用10mL缓冲液重悬菌体(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油，14％PEG6000)；

⑧分装感受态，每管100μL，-80℃保存备用。

(2)电转解淀粉芽孢杆菌

①75％酒精清洗电转杯；

②将10ng重组质粒pBSA43-pldm和100μL感受态混匀后转移至电转杯中，冰浴2min；

③2100-2500V，电击4-6ms后，立即加入1mL复苏液(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃，220rpm复苏3h，涂布于含Kan抗性的平板；

④挑转化子，提质粒，酶切验证(如图2中2泳道所示)，得到解淀粉芽孢杆菌重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-pldm。

实施例5：构建地衣芽孢杆菌热稳定性能提升的PLD重组菌株

向预冷的1mm电转杯中加入60μL TCCC11965感受态细胞和1μL(50ng/μL)pBSA43-pldm，混匀并冰浴5min，设置参数(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)，电击一次，随后立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.5mol/L甘露醇)，混匀后吸取至1.5mLEP管中，37℃摇床震荡培养3h，离心后留取200μL复苏物涂布在具有Kan抗性的LB平板上，37℃培养24h，挑取转化子，提质粒、酶切验证(酶切验证如图2中3泳道所示)，得到地衣芽孢杆菌重组菌株TCCC11965/pBSA43-pldm。

实施例6：热稳定性能提升的PLD在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达及制备

1.将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-pldm接种于含卡纳霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；

2.按1％接种量转接于50mL的LB培养基中，37℃，220r/min培养48h，离心收集发酵上清，即得到热稳定性能提升的S163F粗酶液；

3.随后收集发酵液，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后，透析除盐，再将透析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/LTris-HCl(pH7.0)缓冲液溶解，上样至纤维素离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0～1mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡，上样至sephadex g25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化后的酶液，取纯化后酶液进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示，获得大小为53kDa的单一条带。纯化后酶液，经冷冻干燥制得高活力S163F酶粉。

实施例7：热稳定性能提升的PLD在解淀粉芽孢杆菌中的表达及制备

1.平板三区划线活化重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-pldm；

2.挑取单菌落接种于50mL含Kan的抗性种子培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h；

3.以2％的接种量转接于含有卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、220r/min发酵培养48h。

4.12000rpm，离心10min，收集发酵上清，即得到PLD突变体的粗酶液；

5.收集发酵上清，采用实施例6的方法，使用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，获得洗脱后的酶液，并经过真空冷冻干燥制得高活力S163F酶粉。

实施例8：地衣芽孢杆菌热稳定性能提高的PLD的制备

1.平板三区划线活化重组菌株TCCC11965/pBSA43-pldm；

2.挑取单菌落接种于50mL含Kan的抗性种子培养基中，37℃，220r/min振荡培养12h；

3.以2％的接种量转接于含有卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃，220r/min发酵培养48h。

5.然后收集发酵上清，采用实施例6的方法，使用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，获得洗脱后的酶液，并经过真空冷冻干燥制得高活力S163F酶粉。

实施例9：PLD酶活力和热稳定性能测定

1.PLD酶活测定原理

PLD可以将大豆卵磷脂(PC)水解为胆碱和磷脂酸，胆碱在胆碱氧化酶的作用下生成甜菜碱和过氧化氢(H₂O₂)，H₂O₂通过过氧化氢酶的作用与4-氨基安替比啉和苯酚生成醌亚胺显色物质，该物质在500nm下具有吸光值。因此通过检测胆碱的含量，可以定量计算出PLD在一定时间内的水解效率，从而得到其酶活力大小。

2.PLD酶活的定义

在一定温度和pH条件下，PLD每分钟水解PC产生1μmol的胆碱，即1个酶活力单位(U)。

酶活公式：

活力(U/mL)＝[170×△OD×(V2+V3)×V1×n]/(V2×t×1000)

注：△OD代表从反应开始到结束，吸光度的变化量；

V1：总反应体积，本研究中为2.5mL；

V2：反应产物体系，本研究中为0.3mL；

V3：显色液体积，本研究中为0.5mL；

n：稀释倍数；

t：代表从反应开始到结束所用时间，本研究中为10min；

3.PLD酶活测定方法与步骤

将反应体系：1.3mL反应液于40℃保温5min，加入1.0mL酶液40℃(野生型)和50℃(突变体)反应10min，再加入200μL反应终止液并煮沸5min来终止反应，以上为总反应体积V1；取300μL反应产物(V2)，加入500μL显色液(V3)37℃反应30min；采用酶标仪在500nm检测OD值。样品均含有3组平行实验。

反应终止液：Tris 121.14mg/mL，EDTANa₂ 186mg/mL，用HCl调pH至8.0

4.酶活测定结果如下表(以实施例6、7和8制备的S163F粗酶液以及同样方法制备的野生型PLD粗酶液为实验对象)：

注：野生型PLD粗酶液的制备中，首先采用实施例3、4、5同样的方法构建野生酶重组菌株，之后采用实施例6、7、8同样的发酵方法制备野生酶粗酶液。

5.最适温度

将野生型(WT)与突变体(S163F)的酶液(实施例6-8任意实施例制备的)分别于30、40、50、60和70℃进行酶活测定，以最高活力作为100％，计算其在各个温度下的相对活力，结果如图4所示，野生型最适温度为40℃，突变型最适温度为50℃.

6.最适pH

将野生型(WT)与突变体(S163F)的酶液(实施例6-8任意实施例制备的)置于pH4.0、pH 5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸盐缓冲液中于40℃(野生型)和50℃(突变体)下分别进行酶活测定，以最高活力作为100％，计算其在各个pH下的相对活力，结果如图5所示，野生型与突变体最适pH均为6.0。

7.热稳定性能的检测

通过记录野生型(WT)与突变体(S163F)在不同温度下，保温一定时间的残余酶活变化，以体现PLD的热稳定性能的变化。

将野生型(WT)与突变体(S163F)的酶液(实施例6-8任意实施例制备的)分别保存于0.05M的pH 6.0的磷酸盐缓冲液中，在30，40℃的条件下，分别保温20、40、60、80、100、120min，50℃下分别保温10、20、30、40、50、60min，每个时间点测一次残余酶活力。测定方法按步骤3进行。以未经过处理时的酶活为100％，计算处理后的残余酶活力，结果如图6所示。

本实验记录发现，在30℃时，保温120min，野生型的残余酶活为90％左右，S163F突变体的残余酶活为98％左右；在40℃时，保温120min，野生型的残余酶活为60％左右，S163F突变体的残余酶活为92％左右；在50℃，野生型保温40min，完全失活，而S163F突变体保温60min后残余酶活仍有27％左右。

通过以上对比发现，S163F突变体的最适温度以及热稳定性相较于野生型PLD均有提高。

8.pH稳定性检测

以相同酶活力的野生型与突变体的酶粉(实施例6-8任意实施例制备的)分别溶解于6.0的磷酸盐缓冲液中，于4℃分别保温120h，每隔12h测一次残余酶活，以未保温的酶活为100％，计算处理后的残余酶活力，结果如图7所示。

本实验记录发现，突变体的pH稳定性和野生型酶活无明显差异，且在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中保温120h后，二者残余酶活均保持在85％以上。

实施例10：制备功能磷脂

1.制备PA

底物为0.1g大豆卵磷脂(PC含量90％)，溶于10mL pH 7.0的磷酸缓冲液中，加入PLD突变体，其中PLD突变体为本发明实施例6-8任一制备(催化时酶粉添加量为50U)。反应温度40℃，在磁力搅拌器搅拌作用下反应3h，随后通过一定体积的25％HCl/无水乙醇(V/V＝1.2/100)在42℃提取70min，于pH＝5时分离杂质，再于pH＝8时沉淀PA，即获得磷脂酸，然后采用HPLC进行液相检测，根据标曲计算出PA含量，进而计算测得PA的产率为100％，PA产率(摩尔％)＝PA量/初始PC量×100％。

2.制备PS

取0.05g大豆卵磷脂(PC含量90％)与0.125g L-丝氨酸溶于10mL pH 5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液中，加入PLD突变体，其中PLD突变体为本发明实施例6-8任一制备(催化时酶粉添加量为100U)。反应温度40℃，在磁力搅拌器搅拌作用下反应6h，随后通过15mL氯仿/甲醇(2：1)萃取获得PS，然后采用HPLC进行液相检测，根据标曲计算出PA含量，进而计算测得PA的产率为58％，PS产率(摩尔％)＝PS产量/初始PC量×100％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种耐热磷脂酶D突变体及其制备和合成功能磷脂的方法

<130> 1

<141> 2020-03-10

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 504

<212> PRT

<213> 郝氏链霉菌(Streptomyceshalstedii)

<400> 1

Ala Glu Ala Pro Thr Pro His Leu Asp Ser Val Glu Gln Thr Leu Arg

1 5 10 15

Gln Val Ser Pro Gly Leu Glu Gly Ser Val Trp Glu Arg Thr Ala Gly

20 25 30

Asn Arg Leu Gly Ser Ser Thr Pro Gly Gly Ala Asp Trp Leu Leu Gln

35 40 45

Thr Pro Gly Cys Trp Gly Asp Ala Ala Cys Thr Asp Arg Pro Gly Ser

50 55 60

Arg Arg Leu Leu Asp Lys Met Arg Gln Asp Ile Ala Gly Ala Arg Gln

65 70 75 80

Thr Val Asp Ile Ser Thr Leu Ala Pro Phe Pro Asn Gly Gly Tyr Gln

85 90 95

Asp Ala Ile Val Ala Gly Leu Lys Glu Ser Ala Gln Lys Gly Asn Arg

100 105 110

Leu Lys Val Arg Ile Met Val Gly Ala Ala Pro Ile Tyr His Ser Thr

115 120 125

Val Ile Pro Ser Ser Tyr Arg Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu Gly Pro

130 135 140

Ala Ala Ala Ala Asn Ile Thr Leu Asn Val Ala Ser Met Thr Thr Ser

145 150 155 160

Lys Thr Ser Phe Ser Trp Asn His Ser Lys Leu Ile Val Val Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Val Ile Thr Gly Gly Ile Asn Ser Trp Lys Asp Asp Tyr Leu

180 185 190

Asp Thr Thr His Pro Val Ser Asp Val Asp Leu Ala Leu Ser Gly Pro

195 200 205

Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Tyr Leu Asp Ser Leu Trp Asp Trp Thr

210 215 220

Cys Arg Asn Lys Gly Asn Trp Ser Ser Val Trp Phe Ala Ala Ser Ser

225 230 235 240

Gly Ala Asp Cys Met Pro Ala Leu Pro Arg Pro Ala Thr Pro Glu Gly

245 250 255

Gly Gly Asp Val Pro Ala Leu Ala Val Gly Gly Leu Gly Val Gly Ile

260 265 270

Arg Gln Asn Asp Pro Thr Ser Ser Phe Arg Pro Val Leu Pro Thr Ala

275 280 285

Gly Asp Thr Lys Cys Gly Ile Gly Val Ser Asp Lys Thr Asn Ala Asp

290 295 300

Arg Asp Tyr Asp Thr Val Asn Pro Glu Glu Ser Ala Leu Arg Ala Leu

305 310 315 320

Val Ser Ser Ala Thr Ser His Ile Glu Ile Ser Gln Gln Asp Val His

325 330 335

Ala Thr Cys Pro Pro Leu Pro Arg Tyr Glu Val Arg Leu Tyr Asp Ala

340 345 350

Leu Ala Ala Lys Leu Val Ser Gly Val Lys Val Arg Ile Val Val Ser

355 360 365

Asp Pro Ala Asn Arg Gly Thr Ile Gly Ser Gly Gly Tyr Ser Gln Ile

370 375 380

Lys Ser Leu Ser Glu Val Ser Asp Ala Leu Arg Gly Arg Val Thr Ala

385 390 395 400

Leu Thr Gly Asp Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ala Leu Cys Glu Asn Leu

405 410 415

Gln Leu Ala Thr Phe Arg Ala Ser Asp Lys Pro Thr Trp Ala Asp Gly

420 425 430

Lys Pro Tyr Ala Gln His His Lys Leu Val Ser Val Asp Gly Ser Ala

435 440 445

Phe Tyr Ile Gly Ser Lys Asn Leu Tyr Pro Ser Trp Leu Gln Asp Phe

450 455 460

Gly Tyr Val Val Glu Ser Pro Ala Ala Ala Ala Gln Leu Arg Thr Asp

465 470 475 480

Leu Leu Asp Pro Gln Trp Arg Tyr Ser Gln Ala Thr Ala Thr Tyr Asp

485 490 495

Tyr Ala Arg Gly Leu Cys Gln Gly

500

<210> 2

<211> 1512

<212> DNA

<213> 郝氏链霉菌(Streptomyceshalstedii)

<400> 2

gcggaagcgc ccacaccgca cctggactcg gtcgagcaga ccctgcgtca ggtctcgccg 60

ggcctggagg gctcggtctg ggagcgcacc gccggcaacc ggctcggctc ctccaccccg 120

ggcggcgccg actggctgct ccagaccccc ggctgctggg gcgatgccgc ctgcaccgac 180

cggcccggat cgcgccgcct cctggacaag atgcgccagg acatcgcagg cgcccgccag 240

acggtggaca tatcgacgct ggctcccttc cccaacggcg gataccagga cgcgatcgtc 300

gcgggcctga aggagtccgc ccagaagggc aaccggctga aggtccgcat catggtgggc 360

gccgcgccca tctaccactc cacggtgatc ccctcgtcct accgcgacga gctgctcgcg 420

aagctcgggc cggccgccgc ggccaacatc accctcaacg tggcctcgat gaccacctcg 480

aagacctcct tctcctggaa ccactccaag ctgatcgtgg tggacggcgg ttcggtgatc 540

accggcggca tcaacagctg gaaggacgac tacctcgaca ccacccaccc ggtcagcgac 600

gtcgacctcg cgctgtccgg ccccgccgcc ggctccgcgg gccgctacct ggactccctg 660

tgggactgga cctgccgcaa caagggcaac tggagctcgg tctggttcgc cgcctcctcc 720

ggcgccgact gcatgcccgc cctgccccgg ccggccaccc cggagggcgg cggtgacgta 780

cccgcgctcg ccgtcggcgg cctcggcgtc ggcatccgcc agaacgaccc cacctcgtcc 840

ttccgccccg tcctgcccac ggccggcgac accaagtgcg ggatcggggt gtccgacaag 900

accaacgccg accgggacta cgacaccgtc aacccggagg agagcgccct gcgcgccctc 960

gtctccagcg cgacctcgca catcgagatc tcccagcagg acgtgcacgc cacctgcccg 1020

ccgctgcccc gttacgaggt acgcctctac gacgccctcg ccgcgaagct cgtctccggc 1080

gtgaaggtcc gcatcgtggt gagcgacccg gcgaaccgcg gcacgatcgg cagcggcggc 1140

tactcgcaga tcaagtcgct ctccgaggtg agcgacgccc tgcgcggccg ggtgacggcc 1200

ctgaccggtg acggcggccg ggcgcggacg gctctgtgcg agaacctcca gctggccacg 1260

ttccgtgcct ccgacaagcc gacctgggcc gacggcaagc cctacgccca gcaccacaag 1320

ctggtctcgg tggacggttc ggccttctac atcggttcca agaacctgta cccgtcgtgg 1380

ctgcaggact tcggctacgt cgtcgagagc ccggccgcgg ccgcgcagct caggaccgac 1440

ctgctggacc cgcagtggcg ctactcccag gccaccgcga cgtacgacta cgcccgcggc 1500

ctctgccagg gc 1512

<210> 3

<211> 504

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Ala Glu Ala Pro Thr Pro His Leu Asp Ser Val Glu Gln Thr Leu Arg

1 5 10 15

Gln Val Ser Pro Gly Leu Glu Gly Ser Val Trp Glu Arg Thr Ala Gly

20 25 30

Asn Arg Leu Gly Ser Ser Thr Pro Gly Gly Ala Asp Trp Leu Leu Gln

35 40 45

Thr Pro Gly Cys Trp Gly Asp Ala Ala Cys Thr Asp Arg Pro Gly Ser

50 55 60

Arg Arg Leu Leu Asp Lys Met Arg Gln Asp Ile Ala Gly Ala Arg Gln

65 70 75 80

Thr Val Asp Ile Ser Thr Leu Ala Pro Phe Pro Asn Gly Gly Tyr Gln

85 90 95

Asp Ala Ile Val Ala Gly Leu Lys Glu Ser Ala Gln Lys Gly Asn Arg

100 105 110

Leu Lys Val Arg Ile Met Val Gly Ala Ala Pro Ile Tyr His Ser Thr

115 120 125

Val Ile Pro Ser Ser Tyr Arg Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu Gly Pro

130 135 140

Ala Ala Ala Ala Asn Ile Thr Leu Asn Val Ala Ser Met Thr Thr Ser

145 150 155 160

Lys Thr Phe Phe Ser Trp Asn His Ser Lys Leu Ile Val Val Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Val Ile Thr Gly Gly Ile Asn Ser Trp Lys Asp Asp Tyr Leu

180 185 190

Asp Thr Thr His Pro Val Ser Asp Val Asp Leu Ala Leu Ser Gly Pro

195 200 205

Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Tyr Leu Asp Ser Leu Trp Asp Trp Thr

210 215 220

Cys Arg Asn Lys Gly Asn Trp Ser Ser Val Trp Phe Ala Ala Ser Ser

225 230 235 240

Gly Ala Asp Cys Met Pro Ala Leu Pro Arg Pro Ala Thr Pro Glu Gly

245 250 255

Gly Gly Asp Val Pro Ala Leu Ala Val Gly Gly Leu Gly Val Gly Ile

260 265 270

Arg Gln Asn Asp Pro Thr Ser Ser Phe Arg Pro Val Leu Pro Thr Ala

275 280 285

Gly Asp Thr Lys Cys Gly Ile Gly Val Ser Asp Lys Thr Asn Ala Asp

290 295 300

Arg Asp Tyr Asp Thr Val Asn Pro Glu Glu Ser Ala Leu Arg Ala Leu

305 310 315 320

Val Ser Ser Ala Thr Ser His Ile Glu Ile Ser Gln Gln Asp Val His

325 330 335

Ala Thr Cys Pro Pro Leu Pro Arg Tyr Glu Val Arg Leu Tyr Asp Ala

340 345 350

Leu Ala Ala Lys Leu Val Ser Gly Val Lys Val Arg Ile Val Val Ser

355 360 365

Asp Pro Ala Asn Arg Gly Thr Ile Gly Ser Gly Gly Tyr Ser Gln Ile

370 375 380

Lys Ser Leu Ser Glu Val Ser Asp Ala Leu Arg Gly Arg Val Thr Ala

385 390 395 400

Leu Thr Gly Asp Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ala Leu Cys Glu Asn Leu

405 410 415

Gln Leu Ala Thr Phe Arg Ala Ser Asp Lys Pro Thr Trp Ala Asp Gly

420 425 430

Lys Pro Tyr Ala Gln His His Lys Leu Val Ser Val Asp Gly Ser Ala

435 440 445

Phe Tyr Ile Gly Ser Lys Asn Leu Tyr Pro Ser Trp Leu Gln Asp Phe

450 455 460

Gly Tyr Val Val Glu Ser Pro Ala Ala Ala Ala Gln Leu Arg Thr Asp

465 470 475 480

Leu Leu Asp Pro Gln Trp Arg Tyr Ser Gln Ala Thr Ala Thr Tyr Asp

485 490 495

Tyr Ala Arg Gly Leu Cys Gln Gly

500

<210> 4

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gcggaagcgc ccacaccgca cctggactcg gtcgagcaga ccctgcgtca ggtctcgccg 60

ggcctggagg gctcggtctg ggagcgcacc gccggcaacc ggctcggctc ctccaccccg 120

ggcggcgccg actggctgct ccagaccccc ggctgctggg gcgatgccgc ctgcaccgac 180

cggcccggat cgcgccgcct cctggacaag atgcgccagg acatcgcagg cgcccgccag 240

acggtggaca tatcgacgct ggctcccttc cccaacggcg gataccagga cgcgatcgtc 300

gcgggcctga aggagtccgc ccagaagggc aaccggctga aggtccgcat catggtgggc 360

gccgcgccca tctaccactc cacggtgatc ccctcgtcct accgcgacga gctgctcgcg 420

aagctcgggc cggccgccgc ggccaacatc accctcaacg tggcctcgat gaccacctcg 480

aagaccttct tctcctggaa ccactccaag ctgatcgtgg tggacggcgg ttcggtgatc 540

accggcggca tcaacagctg gaaggacgac tacctcgaca ccacccaccc ggtcagcgac 600

gtcgacctcg cgctgtccgg ccccgccgcc ggctccgcgg gccgctacct ggactccctg 660

tgggactgga cctgccgcaa caagggcaac tggagctcgg tctggttcgc cgcctcctcc 720

ggcgccgact gcatgcccgc cctgccccgg ccggccaccc cggagggcgg cggtgacgta 780

cccgcgctcg ccgtcggcgg cctcggcgtc ggcatccgcc agaacgaccc cacctcgtcc 840

ttccgccccg tcctgcccac ggccggcgac accaagtgcg ggatcggggt gtccgacaag 900

accaacgccg accgggacta cgacaccgtc aacccggagg agagcgccct gcgcgccctc 960

gtctccagcg cgacctcgca catcgagatc tcccagcagg acgtgcacgc cacctgcccg 1020

ccgctgcccc gttacgaggt acgcctctac gacgccctcg ccgcgaagct cgtctccggc 1080

gtgaaggtcc gcatcgtggt gagcgacccg gcgaaccgcg gcacgatcgg cagcggcggc 1140

tactcgcaga tcaagtcgct ctccgaggtg agcgacgccc tgcgcggccg ggtgacggcc 1200

ctgaccggtg acggcggccg ggcgcggacg gctctgtgcg agaacctcca gctggccacg 1260

ttccgtgcct ccgacaagcc gacctgggcc gacggcaagc cctacgccca gcaccacaag 1320

ctggtctcgg tggacggttc ggccttctac atcggttcca agaacctgta cccgtcgtgg 1380

ctgcaggact tcggctacgt cgtcgagagc ccggccgcgg ccgcgcagct caggaccgac 1440

ctgctggacc cgcagtggcg ctactcccag gccaccgcga cgtacgacta cgcccgcggc 1500

ctctgccagg gc 1512

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cgggatccgc ggaagcgccc aca 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

cccaagcttg ccctggcaga ggcc 24

Claims

1.一种磷脂酶D突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述磷脂酶D突变体的编码基因。

3.权利要求2所述磷脂酶D突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID No.4所示。

4.一种包含权利要求2所述基因的重组载体或重组菌株。

5.如权利要求4述的重组载体或重组菌株，其特征在于，表达载体为pBSA43，宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218或地衣芽孢杆菌TCCC11965。

6.权利要求4所述重组载体或重组菌株的应用。

7.权利要求1所述磷脂酶D在生产功能磷脂中的应用。