CN101875929A - 利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶d的菌株 - Google Patents
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Abstract
利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶D的菌株，属于微生物诱变技术领域。其特征是：以色褐链霉菌作为出发菌株，将其单孢子菌悬液依次进行“紫外线和氯化锂复合诱变→大气压冷等离子体和氯化锂复合诱变”，最后得到一株高产磷脂酶D的色褐链霉菌，用于发酵制备磷脂酶D。本发明的效果和益处是诱变筛选得到一株高产磷脂酶D的色褐链霉菌菌株，为磷脂酶D工业化生产提供了有较高应用价值的高产菌株，同时也为磷脂酶D的发酵培养及应用奠定了良好的基础，并且为微生物诱变育种提供了一种良好可行的方法。本发明采用的诱变和筛选方法具有操作简单、效率高等特点，对具有工业应用价值的菌株筛选具有实用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物诱变技术领域，涉及到利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶D的菌株。
背景技术
天然磷脂是良好的天然表面活性剂，但由于结构和组成的原因，其应用范围受到很大限制。为了改善磷脂的性能，人们通过磷脂改性技术研制和开发新型磷脂产品。具有特殊生理功效的改性磷脂商业价值高、市场前景广阔，这也使得磷脂的改性成为目前国内外研究的热点，人们尝试用各种方法对磷脂进行改性研究。
由于磷脂结构的相似性，使得一般的物理化学改性方法难以制备高纯度的单一磷脂，如目前利用溶剂分提得到的磷脂产品纯度低，溶剂消耗量大，且生产成本高，产品溶剂残留也大。新兴的生物技术改性磷脂方法即磷脂的酶法改性与传统改性方法相比有着一些独特的优势，如生物酶法改性具有更好的反应特异性、温和的反应条件以及更少的环境污染等。利用磷脂酶改性可获取高纯特定脂肪酸结构的磷脂产品(结构磷脂)，这些特殊结构的磷脂在自然界中含量极少，难以用化学方法合成，但容易用酶法改性获得。酶法改性生成的磷脂可保持其天然构型，一般可省去分离步骤。但目前磷脂及其衍生物的酶法改性和合成技术大多还处在实验室阶段，磷脂酶活性低、成本高是磷脂改性规模化的主要瓶颈。
磷脂酶D(PLD，EC 3.1.4.4)是作用于磷脂分子中磷酰氧键(P-O)的一类酶，可催化发生两种反应：其一，水解磷脂生成磷脂酸和羟基化合物；其二，当有另一种含羟基的化合物存在时，可催化其结合到磷脂的碱基上，形成新的磷脂，此为PLD的转磷酯化反应或碱基交换反应。在磷脂的酶法改性和稀有磷脂生产领域，PLD有着重要的作用。PLD是在生物膜、脂质体、药物的研究中对磷脂进行结构修饰的关键性工具酶，它可催化制备自然界稀少、难以分离提纯的单体磷脂及磷脂衍生物，如：磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)等，在食品及医药行业的应用中起着重要的作用，因此，PLD来源和制备方法研究是目前一个很活跃的领域。
PLD主要来源于动植物和微生物，尽管来源比较广泛，但是由于含量低，分离提纯工艺复杂，且活力也不高，导致PLD价格昂贵，限制了PLD的广泛应用。PLD的活性、稳定性和选择性是影响磷脂酶工业应用的重要因素，但由于PLD生产技术的不成熟，使PLD的稳定性和反应选择性不能得到保证，目前获得高产PLD的菌株是解决这些问题的关键。天津科技大学的李斌等利用表达载体pET-22b(+)，实现了色褐链霉菌PLD基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达，并利用镍亲和柱对表达产物进行纯化，但重组PLD酶活力较低，目前还无法实现规模化生产。
获得相对高产菌株的方法主要是通过诱变来实现的，常用的方法主要有紫外诱变、化学诱变等。紫外诱变是一种使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变方法，大约有80％的高产抗生素产生菌都曾经用过紫外诱变方法。西北大学的郭浩对其筛选出的链霉菌进行紫外诱变，所得诱变菌产PLD酶活为0.055U/mL，酶活较低。低温等离子体诱变作为一种新型诱变方法，被用于微生物诱变。低温等离子体的电离率较低，电子温度远高于离子温度，离子温度甚至可与室温相当，且低温等离子体中存在着大量的种类繁多的活性粒子，比通常的化学反应所产生的活性粒子种类更多、活性更强，因此，近20多年来该技术在灭菌和生物诱变方面的应用已引起人们的广泛关注。大连理工大学对等离子体诱变做了大量研究，侯英敏、李爽、董晓宇等分别对大气压冷等离子体介质阻挡放电法对产1，3-丙二醇的克雷伯氏菌进行诱变研究，筛选出不同目的的诱变菌株，取得了良好的效果。因此本实验在利用紫外和氯化锂复合诱变的基础上也利用大气压冷等离子体介质阻挡放电法对产PLD的色褐链霉菌进行诱变育种。低温等离子体在密闭的放电室中产生，断电后消失，无任何残留物，其发生装置简单，易于操作，因而具有安全、无污染等特点。
发明内容
本发明的目的是利用物理、化学诱变产生一株稳定高产PLD的菌株，解决现有技术PLD酶活较低、价格昂贵的问题，为PLD进一步规模化生产及应用奠定基础。
本发明的技术方案是利用物理、化学诱变产生一株稳定高产PLD的菌株，其特征是：以色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)CCGMC 4.331为出发菌株，将其单孢子菌悬液依次进行“紫外线和氯化锂复合诱变→大气压冷等离子体和氯化锂复合诱变”，最后得到一株高产PLD的色褐链霉菌，用于发酵制备PLD。
步骤1
将出发菌株CCGMC 4.331进行紫外线和氯化锂复合诱变，包括以下步骤：
(1)制备菌悬液
将色褐链霉菌CCGMC 4.331接种到马铃薯葡萄糖(PDA)斜面培养基上，25～35℃恒温培养5～10天，待孢子成熟后，加入3～10mL 0.9％无菌生理盐水，用接种环将孢子轻轻刮下，倒入盛有玻璃珠的试管中，充分振荡，使孢子充分打散，成为单孢子悬液，用无菌生理盐水稀释调整菌个数达到107～109个/mL左右。
(2)诱变过程
在黑暗条件下进行紫外诱变(紫外灯功率15W)，在照射之前，开启紫外灯预热20～30min，取4～7mL制备好的菌悬液于直径为9cm的无菌培养皿内，放入一无菌磁力搅拌器，然后置磁力搅拌器上、紫外灯下30cm处，开启培养皿盖在搅拌下进行照射，使处理均匀，操作时将紫外诱变器用黑布包住，避免白炽光。诱变处理时间为15～120s。诱变结束后用报纸包严，为防止诱变后光复活，将诱变后的菌悬液避光放置0.5～3h，然后用10倍稀释法把经过照射的菌悬液用无菌生理盐水稀释，将对照组稀释涂于PDA平板培养基上，同时将诱变组稀释涂于含0.3％～0.4％氯化锂PDA平板培养基上，然后将平板诱变菌放置于25～35℃恒温培养箱避光培养，培养时间7～10天。
(3)突变株的筛选
挑取24株突变菌和2株对照菌的单菌落，将其分别接入种子培养基中，25～35℃培养24h后，分别再接入发酵培养基，对其进行摇瓶初筛；然后再选取5株PLD酶活相对较高的突变株，对其进行摇瓶复筛，复筛每组做三个平行，过程同摇瓶初筛，其筛选依据为PLD酶活大小。
步骤2
将经过紫外线和氯化锂复合诱变的高产PLD的菌株再进行大气压冷等离子体和氯化锂复合诱变，包括以下步骤：
(1)制备菌悬液
将经过紫外和氯化锂复合诱变的菌株接种至PAD斜面培养基上，25～35℃恒温培养5～10天，待孢子成熟后，加入3～10mL 0.9％无菌生理盐水，用接种环将孢子轻轻刮下，倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡，使孢子充分打散，再经纱布过滤即可得到悬浮液，用无菌生理盐水稀释调整至菌个数达到107～109个/mL左右。
(2)诱变过程
采用介质阻挡放电(DBD)实验装置，等离子体产生于两个不同直径的圆形放电电极之间，上电极直径为45mm，与高压电相连，下电极60mm与地线相连。取0.4～0.7mL制备好的单孢子菌悬液于直径60mm的石英玻璃平板上，然后将其放到下电极上，调整上电极到菌液液面的距离约为3～4mm。打开等离子体电源，诱变处理时间为10～90s。放电峰值电压12～15kV；频率6.0～8.0kHz。将处理后菌液稀释涂平板，培养基中添加0.3％～0.5％的氯化锂作为助诱变剂，对照菌直接稀释涂于PDA平板培养基中，每样做三个平行，25～35℃避光培养3～10天后统计菌落总数，取平均值计算诱变致死率。选择诱变时间，对菌种进行诱变处理。
(3)突变株的筛选
挑取24株突变菌和2株对照菌的单菌落，将其分别接入种子培养基中，25～35℃培养24h后，分别再接入发酵培养基，对其进行摇瓶初筛；然后再选取4株PLD酶活相对较高的突变株，对其进行摇瓶复筛，复筛每组做三个平行，过程同摇瓶初筛，其筛选依据为PLD酶活大小。
上述所用的马铃薯葡萄糖(PDA)斜面培养基为：去皮马铃薯200g，切成小块，加水1L，煮沸30min，然后用纱布过滤，再按比例加入20g葡萄糖及1.5％～2.0％琼脂，再定容至1L，pH自然；诱变用PDA斜面培养基为上述PDA培养基基础上加入0.3％～0.5％的氯化锂；培养条件为：将所需要培养的菌种接到PDA斜面培养基中，28℃恒温培养7～10天。
本发明的效果和益处是诱变筛选得到一株高产PLD的色褐链霉菌菌株，为PLD工业化生产提供了有较高应用价值的高产菌株，同时也为PLD的发酵培养及应用奠定了良好的基础，并且为微生物诱变育种提供了一种良好可行的方法。本发明采用的诱变和筛选方法具有操作简单、效率高等特点，对具有工业应用价值的菌株筛选具有实用价值。
具体实施方式
本发明所用发酵种子培养基组成为：葡萄糖10.0g/L，酵母浸粉20.0g/L，蛋白胨5.0g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH7.0；培养条件为：28℃恒温振荡培养24h。
所用发酵培养基组成为：蛋白胨20.0g/L，可溶性淀粉25.0g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，CaCO3 1.0g/L，Tween 80 20.0g/L；培养条件为：发酵周期为7d，发酵温度为28℃，发酵液初始pH值为6.0，接种量为3％，发酵培养基装液量为10mL/100mL三角瓶，摇床转速为200rpm。
所用PLD酶活测定方法为：取卵磷脂0.5g，加乙醚1mL制成500mg/mL的溶液，加水10mL，冰浴下振荡至形成乳液。取100μL置试管中，加入0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)100μL、0.1mol/L氯化钙溶液50μL、7.5％Triton X-100150μL和酶液100μL，立即置37℃水浴中反应10min。加入含50mmol EDTA的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)200μL，置沸水浴中5min，终止反应，冷却至室温。加入1.0mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)2mL(其中含有2U胆碱氧化酶，2U过氧化酶，4-氨基安替比林2mg，苯酚1mg和Triton X-100 20mg)，置37℃水浴中20min。反应后的混合液于500nm处测定吸光度。以水代替酶液，同法操作，作为空白对照。以氯化胆碱标准物代替酶液作标准曲线，并将其转化为胆碱浓度，可以根据标准曲线查出所测粗酶液水解产生的胆碱的含量，从而确定PLD的酶活。PLD的酶活力定义为：以卵磷脂为底物，在pH＝6.0，37℃条件下，每分钟产生1μmol胆碱所需的酶量定义为一个酶活力单位，记为U/mL。
酶活计算公式为：
酶活(U/mL)＝[(A500nm-0.0051)/0.0979(μmol/mL)×0.1(mL)]/[(10(min)×0.1(mL)]
下面结合实施例，对本发明进一步说明。
以色褐链霉菌为出发菌株，将其单孢子菌悬液依次进行“紫外线和氯化锂复合诱变→大气压冷等离子体和氯化锂复合诱变”，最后得到一株可高产PLD的色褐链霉菌，可用于液体发酵制备PLD。包括以下两个部分，下面分别予以说明。
1、利用紫外和氯化锂复合诱变产生一株稳定的高产PLD的菌株，包括以下步骤：
(1).制备单孢子菌悬液
将色褐链霉菌CCGMC 4.331接种在马铃薯葡萄糖(PDA)斜面培养基上，28℃恒温培养7天，待孢子成熟后，加入5mL 0.9％无菌生理盐水，用接种环将孢子轻轻刮下，倒入盛有玻璃珠的试管中，充分振荡，使孢子充分打散，成为单孢子菌悬液，用无菌生理盐水稀释调整菌个数达到108个/mL左右。
(2).诱变过程
在黑暗条件下进行紫外诱变(紫外灯功率15W)，在正式照射之前，开启紫外灯预热20～30min，取5mL制备好的菌悬液于直径为9cm的无菌培养皿内，放入一无菌磁力搅拌器，然后置磁力搅拌器上、15W紫外灯下30cm处，开启培养皿盖正式在搅拌下照射30s，使处理均匀，操作时紫外诱变器用黑布包住，避免白炽光。诱变结束后用报纸包严，为防止诱变后光复活，将诱变后的菌悬液避光放置1h，然后用10倍稀释法把经过照射的菌悬液用无菌生理盐水稀释，将对照组稀释涂于PDA平板培养基上，同时将诱变组稀释涂于含0.4％氯化锂PDA平板培养基上，然后将平板诱变菌放置于28℃恒温培养箱避光培养，培养时间7天。
(3).突变株的筛选
挑取24株突变菌和2株对照菌的单菌落，将其分别接入种子培养基中，28℃培养24h后，分别再接入发酵培养基，对其进行摇瓶初筛，筛选依据为PLD酶活大小，筛选得到5株产PLD酶活相对较高的突变株。
然后再选取这5株突变株，对其进行摇瓶复筛，复筛每组做三个平行，过程同摇瓶初筛，筛选依据为PLD酶活大小，筛选得到一株产PLD酶活较高的突变株。
经过紫外和氯化锂复合诱变产生一株稳定的PLD的菌株，将其命名为PU-4，其产PLD酶活达到0.636U/mL，比出发菌株(0.562U/mL)酶活提高了13.17％，且通过传代实验，验证了此菌的遗传稳定性。
2、利用大气压冷等离子体与氯化锂对PU-4进行复合诱变，从而得到一株稳定的高产PLD的菌株，包括以下步骤：
(1).制备单孢子菌悬液
将经过紫外和氯化锂复合诱变的一株菌接种至PAD斜面培养基上，28℃恒温培养7天，待孢子成熟后，加入5mL 0.9％无菌生理盐水，用接种环将孢子轻轻刮下，倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡，使孢子充分打散，再经纱布过滤即可得到单孢子菌悬液，用无菌生理盐水稀释调整至菌个数达到108个/mL左右。
(2).诱变过程
本实验采用介质阻挡放电(DBD)实验装置，等离子体产生于两个不同直径的圆形放电电极之间，上电极直径为45mm，与高压电相连，下电极60mm与地线相连。取0.5mL制备好的单孢子菌悬液于直径60mm的石英玻璃平板上，然后将其放到下电极上，调整上电极到菌液液面的距离约为3mm。打开等离子体电源，诱变处理时间为10～90s。该实验最佳物理放电参数为：放电峰值电压13kV；频率7.0kHz。将处理后菌液稀释涂平板，培养基中添加0.4％的氯化锂作为助诱变剂，对照菌直接稀释涂于PDA平板培养基中，每样做三个平行，28℃避光培养3天后统计菌落总数，取平均值计算诱变致死率。选择诱变时间，对菌种进行诱变处理。
(3).突变株的筛选
挑取24株突变菌和2株对照菌的单菌落，将其分别接入种子培养基中，28℃培养24h后，分别再接入发酵培养基，对其进行摇瓶初筛，筛选依据为PLD酶活大小。筛选得到四株产PLD酶活相对较高的突变株。
然后再选取4株PLD酶活相对较高的突变株，对其进行摇瓶复筛，复筛每组做三个平行，过程同摇瓶初筛，其筛选依据为PLD酶活大小。筛选得到一株产PLD酶活相对较高的突变株。
利用大气压冷等离子体和氯化锂对PU-4进行复合诱变，得到一株稳定的高产PLD的菌株，将其命名为PUP-8，其产PLD酶活达到0.878U/mL，比出发菌株PU-4的酶活(0.636U/mL)提高了38.05％，比出发菌株的酶活(0.562U/mL)提高了56.23％，且通过传代实验，验证了此菌的遗传稳定性。
Claims (3)
1.利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶D的菌株，其特征在于：以色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)CCGMC 4.331为出发菌株，将其单孢子菌悬液依次进行“紫外线和氯化锂复合诱变→大气压冷等离子体和氯化锂复合诱变”，最后得到一株高产磷脂酶D的色褐链霉菌，用于发酵制备磷脂酶D。
2.根据权利要求1所述的利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶D的菌株，其特征在于：
步骤1
将出发菌株CCGMC 4.331进行紫外线和氯化锂复合诱变，包括以下步骤：
(1)制备单孢子菌悬液
将色褐链霉菌CCGMC 4.331接种到马铃薯葡萄糖斜面培养基上，25～35℃恒温培养5～10天，待孢子成熟后，加入3～10mL 0.9％无菌生理盐水，用接种环将孢子轻轻刮下，倒入盛有玻璃珠的试管中，充分振荡，使孢子充分打散，成为单孢子菌悬液，用无菌生理盐水稀释调整菌个数达到107～109个/mL左右；
(2)诱变过程
在黑暗条件下进行紫外诱变，紫外灯功率15W，在照射之前，开启紫外灯预热20～30min，取4～7mL制备好的菌悬液于直径为9cm的无菌培养皿内，放入一无菌磁力搅拌器，然后置磁力搅拌器上、紫外灯下30cm处，开启培养皿盖在搅拌下进行照射，使处理均匀，操作时紫外诱变器用黑布包住，避免白炽光，诱变处理时间为15～120s，诱变结束后用报纸包严，为防止诱变后光复活，将诱变后的菌悬液避光放置0.5～3h，然后用10倍稀释法把经过照射的菌悬液用无菌生理盐水稀释，将对照组稀释涂于马铃薯葡萄糖平板培养基上，同时将诱变组稀释涂于含0.3％～0.5％氯化锂马铃薯葡萄糖平板培养基上，然后将平板诱变菌置于25～35℃恒温培养箱避光培养，培养时间7～10天；
(3)突变株的筛选
挑取24株突变菌和2株对照菌的单菌落，将其分别接入种子培养基中，25～35℃培养24h后，分别再接入发酵培养基，对其进行摇瓶初筛；然后再选取5株磷脂酶D酶活相对较高的突变株，对其进行摇瓶复筛，复筛每组做三个平行，过程同摇瓶初筛，其筛选依据为磷脂酶D酶活大小；
步骤2
将经过紫外线和氯化锂复合诱变的高产磷脂酶D的菌株再进行大气压冷等离子体和氯化锂复合诱变，包括以下步骤：
(1)制备单孢子菌悬液
将经过紫外线和氯化锂复合诱变产生的一株稳定高产磷脂酶D的突变菌株接至PAD斜面培养基上，25～35℃恒温培养5～10天，待孢子成熟后，加入3～10mL 0.9％无菌生理盐水，用接种环将孢子轻轻刮下，倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡，使孢子充分打散，再经纱布过滤即可得到单孢子菌悬液，用无菌生理盐水稀释调整至菌个数达到107～109个/mL左右；
(2)诱变过程
采用介质阻挡放电实验装置，等离子体产生于两个不同直径的圆形放电电极之间，取0.4～0.7mL制备好的单孢子菌悬液于直径60mm的石英玻璃平板上，然后将其放到下电极上，调整上电极到菌液液面的距离约为3～4mm，打开等离子体电源，诱变处理时间为10～90s，将处理后菌液稀释涂平板，培养基中添加0.3％～0.5％的氯化锂作为助诱变剂，对照菌直接稀释涂于马铃薯葡萄糖平板培养基中，每样做三个平行，25～35℃避光培养3～10天后统计菌落总数，取平均值计算诱变致死率，选择诱变时间，对菌种进行诱变处理；
(3)突变株的筛选
挑取24株突变菌和2株对照菌的单菌落，将其分别接入种子培养基中，25～35℃培养24h后，分别再接入发酵培养基，对其进行摇瓶初筛；然后再选取4株磷脂酶D酶活相对较高的突变株，对其进行摇瓶复筛，复筛每组做三个平行，过程同摇瓶初筛，其筛选依据为磷脂酶D酶活大小。
3.根据权利要求1或2所述的利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶D的菌株，其特征在于：所用的马铃薯葡萄糖斜面培养基为：去皮马铃薯200g，切成小块，加水1L，煮沸30min，然后用纱布过滤，再按比例加入20g葡萄糖及1.5％～2.0％琼脂，再定容至1L，pH自然；诱变用马铃薯葡萄糖斜面培养基为上述马铃薯葡萄糖培养基基础上加入0.3％～0.5％的氯化锂；25～35℃恒温培养7～10天。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20101103 |