CN104004797A - sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸的制备方法 - Google Patents

sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸(2-DHA-PS)的方法。通过重叠PCR技术实现定向进化，获得高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D；利用高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备2-DHA-PS，首先磷脂酰胆碱和丝氨酸在高活力磷脂酶D的催化下生成磷脂酰丝氨酸，然后磷脂酰丝氨酸再与二十二碳六烯酸在高活力磷脂酶A2的催化下生成2-DHA-PS。该方法合成的产品中2-DHA-PS的相对含量较高，有效克服了现有合成方法的不足。

Description

sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸的制备方法
技术领域
本发明属于生物催化领域，具体涉及高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸(2-DHA-PS)的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是一种多不饱和脂肪酸，DHA碳链结构含有六个双键，具有高度的不饱和性。DHA在人体自身难以合成，需由食物提供，是人体必需脂肪酸之一。DHA与人体的生理功能密切相关，可维持大脑、视网膜等的正常功能和生长发育，具有抑制血小板凝聚、抗血栓、调血脂、提高免疫力、健脑益智等功效，对抑制炎症和部分癌症、糖尿病的发生也有较好的功效。
磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)是一种天然的磷脂，PS的结构决定了其具有双亲性的独特性质，带有负电荷的一端具有亲水性(或水溶性)，由脂肪酸组成的另一端具有亲脂性(或脂溶性)。PS能够提高脑细胞活力，对预防老年痴呆症、治疗脑萎缩、改善老年人的大脑功能有很好的疗效，此外对减少压力激素的分泌、促进脑疲劳的恢复、平衡情绪、缓解抑郁症也有一定的疗效。PS还可以改善青少年学生的记忆力、增加学习时的集中力、有效提高学习成绩、治疗儿童多动症。
单纯地服用DHA会造成胃肠的负担，而且DHA不容易通过血脑屏障。研究表明，PS可以作为DHA的一种载体，当DHA结合到磷脂酰丝氨酸甘油骨架2位时，DHA的稳定性更高，而且更易通过血脑屏障。DHA和PS在体外以2-DHA-PS的形式被吸收后，在大脑中最终转化为DHA-PS而进行神经保护作用，2-DHA-PS可以兼具DHA和PS的生物学功能。
目前2-DHA-PS的生产方法主要是以富含不饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物，在磷脂酶D的催化下合成富含不饱和脂肪酸的PS，但这种方法存在选择性不高、易引入其他杂质、无法获取高纯度2-DHA-PS等问题。
磷脂酶D(EC3.1.4.4)，属于催化磷酸二脂酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，分布在从细菌到高等动植物的众多生物类群中，其主要生理功能是参与细胞脂质代谢，信号转导及生物膜形成等。磷脂酶D的研究已开展了近五十年，但距工业生产的需要，特别是与其他酶生产和应用相比，存在很大的差距，究其原因，主要原因是，1.酶源狭窄且在生物体内含量极微，提纯相当困难；2.该酶在生物体内的功能及作用机理尚未完全搞清，其应用范围不广。
磷脂酶A2(EC3.1.1.4)，属于催化磷脂甘油骨架2位(sn-2位)磷酸二脂酯键水解的一类酶的总称，但是某些来源的磷脂酶A2具有催化磷脂甘油骨架2位磷酸二脂酯键碱基交换的功能，其广泛存在于哺乳动物的细胞和体液以及蛇毒、蜂毒、微生物中，是一种重要的代谢和调节酶类。磷脂酶A2有很高的应用价值，但目前对其应用技术的研究还比较少，主要原因是，1.酶源狭窄，目前磷脂酶A2主要从动物胰脏、蛇毒、蜂毒中提取，也有从动物内脏或微生物中提取磷脂酶A2，但是工艺复杂，不利于磷脂酶A2的大量生产和利用；2.该酶的作用机理尚未完全搞清，目前对其催化磷脂甘油骨架2位磷酸二脂酯键水解的研究较多，而对催化磷脂甘油骨架2位磷酸二脂酯键碱基交换的研究甚少。
枯草芽孢杆属于革兰氏阳性菌。枯草芽孢杆菌表达系统有以下优点：1、能够高效地分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽孢杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并具有生长迅速，对营养无特殊要求的优点；4密码子偏爱性不明显；5发酵简单，枯草芽孢杆菌是好氧菌，无需厌氧发酵设备，对培养基无特殊要求，发酵结束后，简单地分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的纯化回收阶段；6具有抗逆性，可生产多种耐热性酶制剂。
毕赤酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速。毕赤酵母表达系统用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。毕赤酵母表达系统具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达系统表达的蛋白质更加稳定，毕赤酵母表达系统具有两种表达形式，包括毕赤酵母游离表达系统和毕赤酵母细胞表面展示系统。毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因比较理想的工具。
在本发明中，高活力磷脂酶A2基因和高活力磷脂酶D基因均在枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统(包括毕赤酵母游离表达系统和毕赤酵母细胞表面展示系统)中表达，得到产高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D的重组菌株。重组菌株经发酵后可制备高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D，两种酶可用于催化制备2-DHA-PS。
中国专利《高活力磷脂酶D及细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备》，授权公告号CN 102286440B，公布了一种高活力磷脂酶D及细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备方法，公布了该高活力磷脂酶D基因序列及其构建表达方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备2-DHA-PS的方法。
实现本发明目的的技术路线概述如下：
通过重叠PCR技术实现定向进化，分别对野生型磷脂酶A2的编码基因进行定点突变和野生型磷脂酶D的编码基因进行定点突变(专利CN102286440B)，构建重组载体并在枯草芽孢杆菌WB600或毕赤酵母GS115中成功表达，获得高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D；利用高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸(2-DHA-PS)，先是丝氨酸和磷脂酰胆碱在高活力磷脂酶D的催化下生成磷脂酰丝氨酸(PS)，其再与DHA在高活力磷脂酶A2的催化下生成2-DHA-PS，经分离纯化得到2-DHA-PS产品。
在本发明中采用如下定义：
1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2、磷脂酶A2突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示磷脂酶A2突变体中突变的氨基酸。如Glu37Ala，表示位置37的氨基酸由亲本磷脂酶A2的Glu替换成Ala，位置的编号对应于SEQID NO：9中磷脂酶A2的氨基酸序列编号。
在本发明中，plA2表示磷脂酶A2的原始序列(如SEQ ID NO：9所示)，plA2m表示磷脂酶A2的突变序列(如SEQ ID NO：10所示)。
用于表达所述的磷脂酶A2突变体的克隆载体为pUC-T，表达载体为pBSA43或pPIC9K，展示载体为pPIC9K-Flo；用于所述的表达载体pBSA43转化的微生物宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600，用于所述的表达载体pPIC9K或展示载体pPIC9K-Flo转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母GS115。
3、酶活力定义
磷脂酶A2的酶活力定义：37℃时1min内催化生成1.0nmol游离巯基所需的酶量定义为1个酶活力单位U。
磷脂酶D的酶活力定义：37℃时1min内催化水解L-α-卵磷脂释放1.0μmol的胆碱所需要的酶量定义为1个酶活单位U。
本发明的技术方案概述如下：
高活力磷脂酶A2基因和高活力磷脂酶D基因均在枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统(包括毕赤酵母游离表达系统和毕赤酵母细胞表面展示系统)中表达，得到产高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D的重组菌株。
高活力磷脂酶A2可以由枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌株、毕赤酵母高活力磷脂酶A2游离表达重组菌株或毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2重组菌株制备。
高活力磷脂酶D可以由枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶D重组菌株、毕赤酵母高活力磷脂酶D游离表达重组菌株或毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶D重组菌株制备。
所述2-DHA-PS的制备方法包括如下步骤：
(1)将所述高活力磷脂酶D加入pH3.0-6.0的含有丝氨酸、CaCl2的醋酸-醋酸钠缓冲液中，与含有磷脂酰胆碱的乙醚等体积混合均匀，在30-50℃下反应6-16小时；其中，反应之前高活力磷脂酶D浓度为10-40mg/mL、丝氨酸的浓度为1.0-3.0M、CaCl2的浓度为2.0mM。
(2)反应结束后静置分层，提取含磷酯酰丝氨酸的有机相。
(3)在步骤(2)得到的含磷酯酰丝氨酸的有机相中加入二十二碳六烯酸，然后与pH4.0-9.0的含有高活力磷脂酶A2、CaCl2的磷酸盐缓冲液等体积混合均匀，在30-50℃下反应6-16小时；其中，反应之前磷脂酶A2浓度为10-40mg/mL、CaCl2的浓度为2.0mM。
(4)反应结束后静置分层，提取有机相并加入4-6倍体积的丙酮将生成的2-DHA-PS沉淀下来，然后离心分离，收集沉淀并用丙酮洗涤2-4次，即可得到2-DHA-PS产品。
为提高反应的转化率，上述步骤(1)中，优选的，反应开始前磷脂酰胆碱的浓度为0.05-0.3M；更优选的，磷脂酰胆碱浓度为0.1M。
上述步骤(1)中，优选的，反应开始前高活力磷脂酶D的浓度为30mg/mL。
上述步骤(3)中，优选的，反应开始前二十二碳六烯酸的浓度为0.1-0.4M；更优选的，二十二碳六烯酸浓度为0.3M。
上述步骤(3)中，优选的，反应开始前高活力磷脂酶D的浓度为30mg/mL。
所述高活力磷脂酶A2含有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其是氨基酸序列如SEQID NO：9所示的野生型磷脂酶A2通过定点突变得到的突变体。
所述野生型磷脂酶A2来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，将其氨基酸序列中Glu37、Asp78的氨基酸位点分别替换为Ala、His，得到高活力磷脂酶A2突变体。
所述高活力磷脂酶D来源于专利CN 102286440B。
相同条件下，磷脂酰胆碱经毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D和枯草芽孢杆菌表达高活力磷脂酶A2催化制备2-DHA-PS的转化率为27.5％，比磷脂酰胆碱经毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D和枯草芽孢杆菌表达野生型磷脂酶A2催化制备2-DHA-PS的转化率高14.1％。磷脂酰胆碱经毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D和毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶A2催化制备2-DHA-PS的转化率为32.0％，比磷脂酰胆碱经毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D和毕赤酵母游离表达野生型磷脂酶A2催化制备2-DHA-PS的转化率高16.0％。磷脂酰胆碱经毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D和毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂催化制备2-DHA-PS的转化率为23.7％，比磷脂酰胆碱经毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D和毕赤酵母细胞表面展示野生型磷脂酶A2全细胞催化剂催化制备2-DHA-PS的转化率高12.9％。
一种枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌株的构建及高活力磷脂酶A2的制备过程包括以下步骤：
1、将野生型磷脂酶A2基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA2，通过重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因，得到高活力磷脂酶A2突变体编码基因；
2、将高活力磷脂酶A2突变体编码基因与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43连接，构建获得携带有高活力磷脂酶A2突变体编码基因的重组载体；
3、将重组载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中，构建获得重组菌株；
4、将重组细胞进行发酵制备高活力磷脂酶A2；
5、制备高活力磷脂酶A2酶粉。
一种毕赤酵母高活力磷脂酶A2游离表达重组菌株的构建及高活力磷脂酶A2的制备过程包括以下步骤：
1、将野生型磷脂酶A2基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA2，通过重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因，得到高活力磷脂酶A2突变体编码基因；
2、将高活力磷脂酶A2突变体编码基因与表达载体pPIC9K相连，得到携带高活力磷脂酶A2突变体编码基因的重组表达载体；
3、将重组载体转化入毕赤酵母GS115中，得到重组细胞；
4、将得到的重组细胞经遗传霉素筛选，结合磷脂酶A2的酶活测定，得到高活力磷脂酶A2的高产菌株；
5、将高产菌株进行发酵制备高活力磷脂酶A2；
6、制备高活力磷脂酶A2酶粉。
一种毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2重组菌株的构建及高活力磷脂酶A2全细胞催化剂的制备过程包括以下步骤：
1、将野生型磷脂酶A2编码基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA2，通过重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因，得到高活力磷脂酶A2突变体编码基因；
2、将高活力磷脂酶A2突变体编码基因序列与毕赤酵母展示载体pPIC9K-Flo相连，得到携带高活力磷脂酶A2突变体编码基因的重组载体pPIC9K-Flo-plA2m；
3、将重组载体转化入宿主菌株毕赤酵母GS115中，得到毕赤酵母细胞表面展示磷脂酶A2重组菌株。
4、将重组菌株发酵后制备酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂。
有益效果：
1、本发明使用重叠PCR技术，对野生型磷脂酶A2进行定点突变，获得的高活力磷脂酶A2的比酶活比野生型提高13.7％，提高了磷脂酶A2的应用性能。
2、本发明提供了一种高效催化制备2-DHA-PS的方法，2-DHA-PS经过磷脂酶A2和磷脂酶D两步催化反应制备而得，克服了现有合成方法产量低、选择性不高、无法获取高纯度2-DHA-PS的问题，通过本发明的方法可制备高纯度的2-DHA-PS，在医药、食品及保健品领域具有很大的应用潜力。
附图说明
图1为本发明磷脂酶A2成熟肽基因的PCR扩增电泳图(其中M为DNA Marker，1、2为磷脂酶A2成熟肽基因)；
图2为本发明定点突变流程；
图3为本发明催化制备2-DHA-PS的工艺流程。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明所述高活力磷脂酶D基因的获得方法，如无特别说明，均使用专利CN 102286440B所述的方法。高活力磷脂酶D基因pldm的核苷酸序列如专利CN102286440B中序列8所示。
实施例1：野生型磷脂酶A2成熟肽基因的获得
1、野生型磷脂酶A2成熟肽基因来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)ATCC23899，提取其基因组DNA。
其中天蓝色链霉菌基因组DNA的提取步骤如下：
(1)从培养菌体的平板上挑取一环菌接种于40mL适当培养基中，26℃，150r/min培养2-3d。
(2)取1mL培养液于1.5mL EP管中，12000r/min离心10min，倒尽上清，用200μL溶液I重悬。
(3)加50μL的50mg/mL溶菌酶在4℃下消化1h。
(4)加入1/2体积的2％SDS溶液反应10min，至菌悬液呈现粘稠状。
(5)加入等体积的饱和苯酚：氯仿＝1：1，混合均匀，离心10min，将上清转移到另一干净EP管中，弃去下层有机相及蛋白沉淀。
(6)反复抽提两次，再用等体积氯仿抽提一次，去除痕量苯酚。
(7)加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，12000r/min离心10min，弃去上清，用70％乙醇(500或600μL)洗涤2次。
(8)将EP管倒置于滤纸上，晾干后用TE缓冲液溶解，-20℃保存备用。
2、根据已报道磷脂酶A2成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的磷脂酶A2成熟肽基因的扩增引物如下：
上游P1(SEQ ID NO：1)：5’-GCCCCCGCGGACAAGCCCCAGGT-3’
下游P2(SEQ ID NO：2)：5’-TCAGCCGAAGATCTTGACGGC-3’
扩增模板为天蓝色链霉菌基因组DNA，其扩增的反应体系为：
2×buffer 25μL
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL
上游引物P1(20μmol/L) 5μL
下游引物P2(20μmol/L) 5μL
DNA模版 2μL
LA TaqDNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 10.5μL
总体积 50μL
扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸30s反应30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到369bp的条带(图1)，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到本发明的野生型磷脂酶A2成熟肽基因plA2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
实施例2：高活力磷脂酶A2基因的获得。
1、野生型磷脂酶A2基因连接入载体pUC-T。
将纯化后的目的基因plA2与载体pUC-T连接，形成重组质粒pUC-T-plA2，将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中。
2、定点突变
基于重叠PCR技术(见图2)进行定点突变，构建高活力磷脂酶A2，设计引物如下：
上游P1(SEQ ID NO：1)：5’-GCCCCCGCGGACAAGCCCCAGGT-3’
下游P2(SEQ ID NO：2)：5’-TCAGCCGAAGATCTTGACGGC-3’
重叠引物P3(SEQ ID NO：3)：5’-GGCCGCCTACGCGTTCGACTGGT-3’
重叠引物P4(SEQ ID NO：4)：5’-ACCAGTCGAACGCGTAGGCGGCC-3’
重叠引物P5(SEQ ID NO：5)：5’-GGGCAGCTTCCACGCCAACAAGA-3’
重叠引物P6(SEQ ID NO：6)：5’-TCTTGTTGGCGTGGAAGCTGCCC-3’
重叠引物P3与P4包含了对37位氨基酸残基的突变。而重叠引物P5与P6则包含了对78位氨基酸残基的突变。
以重组质粒pUC-T-plA2为模板进行PCR扩增，按照如下顺序，将各组分在PCR管内混合。
PCR1，反应体系如下：
2×buffer 25μL
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL
上游引物P1(20μmol/L) 5μL
重叠引物P4(20μmol/L) 5μL
DNA模板 2μL
LA TaqDNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 10.5μL
总体积 50μL
PCR2，反应体系如下：
2×buffer 25μL
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL
重叠引物P3(20μmol/L) 5μL
下游引物P2(20μmol/L) 5μL
DNA模板 2μL
LA TaqDNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 10.5μL
总体积 50μL
PCR1、2扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，30个循环；72℃10min。然后进行第二步的PCR，按照如下顺序，将各组分在PCR管内混合。
PCR3，反应体系如下：
2×buffer 25μL
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL
PCR1产物 1μL
PCR2产物 1μL
LA TaqDNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 20.5μL
总体积 50μL
PCR3扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，10个循环；72℃10min。
PCR4，反应体系如下：
2×buffer 25μL
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL
上游引物P1(20μmol/L) 5μL
下游引物P2(20μmol/L) 5μL
PCR3产物 2μL
LA TaqDNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 10.5μL
总体积 50μL
PCR4扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，30个循环；72℃10min。
测序(北京华大生物工程公司)结果表明，此时扩增得到Glu37→Ala(氨基酸SEQ ID NO：37位Glu突变为Ala)的磷脂酶A2基因片段，以此基因片段为DNA模版进行下一轮PCR。
PCR5，反应体系如下：
2×buffer 25μL
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL
上游引物P1(20μmol/L) 5μL
重叠引物P6(20μmol/L) 5μL
DNA模板 2μL
LA TaqDNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 10.5μL
总体积 50μL
PCR6，反应体系如下：
2×buffer 25μL
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL
重叠引物P5(20μmol/L) 5μL
下游引物P2(20μmol/L) 5μL
DNA模板 2μL
LA TaqDNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 10.5μL
总体积 50μL
PCR5、6扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，30个循环；72℃10min。然后进行第二步的PCR，按照如下顺序，将各组分在PCR管内混合；
PCR7，反应体系如下：
2×buffer 25μL
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL
PCR5产物 1μL
PCR6产物 1μL
LA TaqDNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 20.5μL
总体积 50μL
PCR7扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，10个循环；72℃10min。
PCR8，反应体系如下：
2×buffer 25μL
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL
上游引物P1(20μmol/L) 5μL
下游引物P2(20μmol/L) 5μL
PCR7产物 2μL
LA TaqDNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 10.5μL
总体积 50μL
PCR8扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，30个循环；72℃10min。
测序(北京华大生物工程公司)结果表明，此时扩增得到Glu37→Ala、Asp78→His的高活力磷脂酶A2基因plA2m，如SEQ ID NO：8所示。
实施例3：枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D重组菌的构建
1、表达载体pBSA43的构建
pBSA43是以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽孢杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中的果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Ampr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记。同时又带有Kmr，可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。
2、高活力磷脂酶D和高活力磷脂酶A2表达载体pBSA43-pldm和pBSA43-plA2m的构建
将经重叠PCR构建获得的高活力磷脂酶A2基因和高活力磷脂酶D基因经双酶切后分别与同样双酶切的枯草芽孢杆菌表达载体pBSA43连接，构建重组质粒pBSA43-pldm和pBSA43-plA2m。将pBSA43-pldm和pBSA43-plA2m转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证并测序，确定构建获得重组质粒pBSA43-pldm和pBSA43-plA2m。
3、重组质粒pBSA43-pldm和pBSA43-plA2m转化枯草芽孢杆菌WB600
在60μL感受态细胞中加入1μL(50ng/μL)重组质粒混匀并转移到冰冷的电转化杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布在LB平板上，37℃培养24-36h，挑取阳性转化子，获得枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-pldm和枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-plA2m。
实施例4：毕赤酵母高活力磷脂酶D和高活力磷脂酶A2游离表达重组菌的构建
1、高活力磷脂酶D表达载体pPIC9K-pldm和高活力磷脂酶A2表达载体pPIC9K-plA2m的构建
将重叠PCR纯化产物双酶切后分别与同样双酶切的毕赤酵母表达载体pPIC9K用连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经Amp抗性筛选，菌落37℃摇培过夜后抽提质粒，重组质粒进行酶切验证。将验证正确的重组表达质粒分别命名为pPIC9K-pldm和pPIC9K-plA2m。将经过酶切后得到的阳性克隆送至北京华大基因科技股份有限公司测序，以保证目的片段序列的正确性。
2、高活力磷脂酶D重组菌株和高活力磷脂酶A2重组菌株的构建及高活力磷脂酶D重组菌株和高活力磷脂酶A2重组菌株的筛选
(1)线性化质粒DNA的制备
在转化毕赤酵母之前，要先将构建好的重组表达质粒pPIC9K-pldm和pPIC9K-plA2m线性化，以提高质粒在毕赤酵母染色体上的整合效率。每次转化需要线性化质粒DNA5-20μg，用于转化的质粒DNA的纯度应至少满足限制性酶切的需要，质粒越纯，转化效率越高。分别用SacI和SalI限制性内切酶进行线性化酶切。
(2)线性化质粒pPIC9K-pldm和pPIC9K-plA2m电转化毕赤酵母、阳性转化子的鉴定及高产菌株的筛选
①将80μL感受态细胞和5-20μg经线性化的DNA加入到1.5mL预冷的离心管中，混匀，将反应液转移到预先冰浴的转化杯中；
②冰浴装有转化液的转化杯5min，根据电转装置推荐的参数，进行毕赤酵母电转化：
③脉冲后，立即向转化杯中加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇溶液，把转化液转移到一个新的1.5mL离心管中；
④30℃静置培养l～2h，吸取毕赤酵母GS115电转液200μL涂布在MD培养基上；
⑤30℃培养直至转化子出现；
⑥挑取转化子单菌落溶解在10μL去离子水中，取2μL菌液，加入Lyticase破壁酶，30℃反应l0min，反应液立即放入-80℃冰箱中冷冻l0min，使酵母细胞壁裂解，释放的基因组作为模板进行PCR。以转入空质粒pPIC9K的毕赤酵母GS115/pPIC9K作为对照，确定阳性转化子。
⑦在确定阳性转化子的基础上，先用含不同浓度遗传霉素的抗性平板筛选高遗传霉素抗性的转化子，然后分别测定这些高遗传霉素抗性的转化子的磷脂酶A2的酶活，以得到磷脂酶D的高产菌株GS115/pPIC9K-pldm和磷脂酶A2的高产菌株GS115/pPIC9K-plA2m。
实施例5：毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶D和磷脂酶A2重组菌的构建
1、重组质粒pPIC9K-Flo-pldm和pPIC9K-Flo-plA2m的构建
将重叠PCR纯化产物与载体pPIC9K-Flo经双酶切后，将高活力磷脂酶D基因和高活力磷脂酶A2基因连接至载体pPIC9K-Flo中，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含有Amp的LB固体培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用EcoRI和MluI双酶切鉴定并测序，命名为pPIC9K-Flo-pldm和pPIC9K-Flo-plA2m。
2、毕赤酵母重组菌的构建
将测序正确的重组质粒经SalI线性化后，用电转化法转化毕赤酵母GS115，MD平板筛选重组子，获得毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶D重组菌GS115/pPIC9K-Flo-pldm和高活力磷脂酶A2重组菌GS115/pPIC9K-Flo-plA2m。
实施例6：高活力磷脂酶D和高活力磷脂酶A2在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达及制备
将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-pldm和WB600/pBSA43-plA2m接种于LB液体培养基(含卡纳霉素，30μg/mL)中，37℃，200r/min培养过夜，按1％接种量转接于50mL新鲜培养基中，200r/min培养48h，可制备获得高活力磷脂酶D粗酶液和高活力磷脂酶A2粗酶液，然后采用分级盐析法沉淀高活力磷脂酶D和高活力磷脂酶A2，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得高活力磷脂酶D纯酶酶粉和高活力磷脂酶A2纯酶酶粉。
实施例7：高活力磷脂酶D和高活力磷脂酶A2在毕赤酵母游离表达重组菌中的表达及制备
将培养于YPD固体平板上的毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D和高活力磷脂酶A2重组菌接种至YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养24h。以1％的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30℃培养24h，然后6000r/min离心5min得到菌体，转入BMMY培养基中。30℃、250r/min，每隔24h补甲醇，使其终浓度保持在0.5％V/V，培养120h后可得到磷脂酶D的粗酶液和磷脂酶A2的粗酶液，然后采用分级盐析法沉淀高活力磷脂酶D和高活力磷脂酶A2，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得高活力磷脂酶D纯酶酶粉和高活力磷脂酶A2纯酶酶粉。
实施例8：毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶D和高活力磷脂酶A2全细胞催化剂的制备
将培养于YPD固体平板上的毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶D和高活力磷脂酶A2重组菌接种至YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养24h，以1％的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30℃培养24h，然后6000r/min离心5min得到菌体，转入BMMY培养基中，30℃、250r/min培养120h，每隔24h补甲醇，使其终浓度保持在0.5％V/V，然后离心收集取菌体，用双蒸水洗1-2次，加入保护剂，通过真空冷冻干燥制得毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶D和高活力磷脂酶A2全细胞催化剂。
实施例9：野生型磷脂酶A2重组菌的构建、表达及野生型磷脂酶A2的制备
将野生型磷脂酶A2基因分别在枯草芽孢杆菌和毕赤酵母GS115中表达，其中枯草芽孢杆菌野生型磷脂酶A2重组菌株WB600/pBSA43-plA2的构建方法基本如实施例2；毕赤酵母野生型磷脂酶A2游离表达重组菌株GS115/pPIC9K-plA2的构建方法基本如实施例3；毕赤酵母细胞表面展示野生型磷脂酶A2重组菌GS115/pPIC9K-Flo-plA2的构建方法基本如实施例4。分别将获得的三株重组菌株表达，并按实施例5、实施例6和实施例7所示的方法制备野生型磷脂酶A2纯酶酶粉和毕赤酵母细胞表面展示野生型磷脂酶A2全细胞催化剂。
实施例10：磷脂酶A2活力测定
1、磷脂酶A2酶活测定原理
微孔比色法是国外最新发展的一种磷脂酶A2测定法。其原理是基于1976年Aarsman等建立的巯基显色法,即合成一种磷脂类似物2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱(2-hexadecanoylthio-l-ethyl-phosphorylcholine，HEPC)作底物，该底物中sn-2位以硫酯键替代，仍可受磷脂酶A2水解，并释放出游离巯基，与5.5’-二硫代硝基苯甲酸(DTNB)或其它显色剂显色,在410nm波长附近有最大吸收，测定吸收值，换算出巯基的量就可以求出酶活力。反应在96孔板中进行，用酶标仪测定吸收值。酶活力定义为：37℃下每分钟产生1nmol游离巯基的酶量为1个酶活力单位。
2、磷脂酶A2酶活测定方法
(1)基础液：0.2mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲液90ml，加入0.2mol/L CaCl2，5mmol/LDTNB，5mmol/L去氧胆酸钠各20ml，充分混匀。
(2)工作液：5mmol/L HEPC1ml加基础液15ml，混匀。
(3)对照液：蒸馏水1ml，加基础液15ml，混匀。
磷脂酶A2的测定步骤
混匀，37℃温育1h，测410nm波长A值，空白调零
(4)酶活力计算
磷脂酶A2活力(U/ml)＝12.25×(A测定孔-A对照孔)
3、磷脂酶A2酶活测定
测定原始磷脂酶A2和突变后磷脂酶A2的比酶活，突变后磷脂酶A2的比酶活比突变前提高了13.7％。
比酶活定义：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。
将得到的重组菌株以及天蓝色链霉菌发酵后测定酶活，其中枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌发酵后发酵液中磷脂酶A2的酶活可达到53.5U/ml，毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶A2重组菌发酵后发酵液中的酶活可达106.4U/ml，毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂的酶活可达260U/(g·干细胞)。枯草芽孢杆菌野生型磷脂酶A2重组菌发酵后发酵液中磷脂酶A2的酶活为46.2U/ml，毕赤酵母游离表达野生型磷脂酶A2重组菌发酵后发酵液中的酶活可达94.4U/ml，毕赤酵母细胞表面展示野生型磷脂酶A2全细胞催化剂的酶活可达223U/(g·干细胞)。而天蓝色链霉菌磷脂酶A2的酶活仅为7.4U/ml。
实施例11：磷脂酶D活力测定
采用酶联比色法进行活性检测：磷脂酶D催化水解L-α-卵磷脂生成胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化酶的作用下与4-氨基氨替比林和苯酚生成醌亚胺显色物质，在A＝500nm下具有吸光值。反应体系：将220mg的L-α-卵磷脂溶于含有3mL50mM的SDS溶液、6mL1M NaOAc缓冲液(pH＝8.0)、39mL的去离子水、0.272mL17.9％的乙醇溶液(终浓为1％)的混合体系作为底物溶解液。将39mg4-氨基氨替比林、80mg苯酚及8mg过氧化物酶溶于5.5mL的100mM Tris HCl(pH＝8.0)缓冲液中作为胆碱显色剂。取2.4mL底物溶液、0.3mL的500mM CaCl2溶液、0.2mL的去离子水混合并置于37℃水浴。然后加入0.1mL的酶液，混合均匀，于37℃反应10min，沸水浴终止反应，待冷却至室温加入0.05mL2M Tris HCl(pH＝9.0)缓冲液，混合并离心后，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液2mL与0.1mL胆碱显色剂、0.1mL胆碱氧化酶溶液室温反应2.5h。在反应混合物中加入2.0mL去离子水，离心得到澄清透亮的粉红色溶液，最后于A500nm检测吸光值。酶活定义：pH＝8.0、T＝37℃时，磷脂酶D1min内催化水解L-α-卵磷脂释放1.0μmol的胆碱所需要的酶量。
将得到的高活力磷脂酶D重组菌株发酵后测定酶活，其中枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶D重组菌发酵后发酵液中的酶活可达到22.8U/ml，毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D重组菌发酵后发酵液中的酶活可达42.1U/ml，毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶D全细胞催化剂的酶活可达120U/(g·干细胞)。
实施例12：本发明采用的分析条件
样品中2-DHA-PS相对含量的分析方法为液质联用技术(HPLC/ESI/MSn)，具体过程是取适量的样品，溶解于氯仿:甲醇＝1:1(v/v)溶液中，并在样品溶液中加入1μM的磷酯酰丝氨酸(PS(14:0/14:0))内标物。
利用HPLC/ESI/MSn法检测的色谱条件为：
固定相：Si60色谱柱(125mm×4mm,5μm)
柱温：25℃
样品溶液进样量：5μl
采用柱后分流技术：色谱柱内流速为1mL/min，分流后流入质谱离子源的流速为0.2mL/min
流动相体系：流动相A：氯仿：甲醇：氢氧化铵＝89：10.5：0.5(v/v/v)；流动相B：氯仿：甲醇：氢氧化铵：水＝55：39.5：0.5：5(v/v/v/v)。
洗脱梯度程序:0～45min，95％A～50％A，5％B～50％B；45～60min，50％A～95％A，50％B～5％B。
利用HPLC/ESI/MSn法检测的质谱条件为：
离子化方式：ESI(负离子方式)
扫描范围在m/z550～1000
喷雾电压为4.5KV
离子传输管的温度为350℃
2-DHA-PS相对含量的表征方法为：
2-DHA-PS转化率(％)＝2-DHA-PS/PC*100％
实施例13：野生型磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备2-DHA-PS
以磷脂酰胆碱和二十二碳六烯酸作为原料，以本实验室制备的野生型磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备2-DHA-PS。
首先以磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物，以高活力磷脂酶D为催化剂制备磷酯酰丝氨酸。其中磷脂酰胆碱的浓度为0.1M，丝氨酸的浓度为2.0M，高活力磷脂酶D30mg/mL，反应温度40℃，反应pH4.5，反应时间10h，制备磷酯酰丝氨酸。其中枯草芽孢杆菌表达高活力磷脂酶D催化制备磷酯酰丝氨酸的转化率为50.4％、毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D催化制备磷酯酰丝氨酸的转化率为78.6％、毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶D催化制备磷酯酰丝氨酸的转化率为60.3％。
由于毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D催化制备磷酯酰丝氨酸的转化率最高，故以毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D催化制备的磷酯酰丝氨酸和二十二碳六烯酸为底物，以野生型磷脂酶A2为催化剂制备2-DHA-PS。磷脂酰丝氨酸的浓度为0.015M、二十二碳六烯酸的浓度为0.3M、野生型磷脂酶A230mg/mL、反应温度为37℃、反应pH7.0、反应时间为14h时，由磷酯酰丝氨酸经野生型磷脂酶A2催化得到2-DHA-PS的转化率分别为17.1％(枯草芽孢杆菌表达野生型磷脂酶A2)、20.3％(毕赤酵母游离表达野生型磷脂酶A2)和13.8％(毕赤酵母细胞表面展示野生型磷脂酶A2全细胞催化剂)。由磷脂酰胆碱经两步反应得到2-DHA-PS的转化率分别为13.4％(枯草芽孢杆菌表达野生型磷脂酶A2和毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D)、16.0％(毕赤酵母游离表达野生型磷脂酶A2和毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D)和10.8％(毕赤酵母细胞表面展示野生型磷脂酶A2全细胞催化剂和毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D)。
实施例14：高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备2-DHA-PS
以磷脂酰胆碱和二十二碳六烯酸作为原料，以本实验室制备的高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备2-DHA-PS。
首先以磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物，以高活力磷脂酶D为催化剂制备磷酯酰丝氨酸。其中磷脂酰胆碱的浓度为0.1M，丝氨酸的浓度为2.0M，高活力磷脂酶D30mg/mL，反应温度40℃，反应pH4.5，反应时间10h，制备磷酯酰丝氨酸。其中枯草芽孢杆菌表达的高活力磷脂酶D催化制备磷酯酰丝氨酸的转化率为50.4％、毕赤酵母游离表达的高活力磷脂酶D催化制备磷酯酰丝氨酸的转化率为78.6％、毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶D催化制备磷酯酰丝氨酸的转化率为60.3％。
由于毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D催化制备磷酯酰丝氨酸的转化率最高，故以毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D催化制备的磷酯酰丝氨酸和二十二碳六烯酸为底物，以高活力磷脂酶A2为催化剂制备2-DHA-PS。磷脂酰丝氨酸的浓度为0.015M、二十二碳六烯酸的浓度为0.3M、高活力磷脂酶A230mg/mL、反应温度为37℃、反应pH7.0、反应时间为14h时，由磷酯酰丝氨酸经高活力磷脂酶A2催化得到2-DHA-PS的转化率分别为35.0％(枯草芽孢杆菌表达高活力磷脂酶A2)、40.7％(毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶A2)和30.1％(毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂)。由磷脂酰胆碱经两步反应得到2-DHA-PS的转化率分别为27.5％(枯草芽孢杆菌表达高活力磷脂酶A2和毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D)、32.0％(毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶A2和毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D)和23.7％(毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂和毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶D)，分别比野生型磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备2-DHA-PS的转化率高14.1％、16.0％和12.9％。
实施例15：
以蛋黄卵磷脂(PC含量80％)和海藻油DHA(DHA的含量为50％)为原料制备2-DHA-PS。蛋黄卵磷脂可以在市场中购买获得。海藻油DHA是本实验室将购买的海藻油经脂肪酶水解而得。
首先，将40mg/mL的新型高活力磷脂酶D加入含有丝氨酸2.0M、CaCl22.0mM的10mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)中，与含有蛋黄卵磷脂2g的乙醚溶液等体积混合均匀，在40℃下反应10小时后离心收集有机相，在有机相中加入2g海藻油DHA并补加乙醚至10mL，然后与含10mg/mL新型高活力磷脂酶A2的磷酸盐缓冲液(pH7.0)等体积混合均匀，在35℃下反应10小时，反应结束后静止分层，提取有机相并加入5倍体积的丙酮将产物沉淀下来，然后离心分离，收集沉淀并用丙酮洗涤2次，即可得到2-DHA-PS产品。取样并用HPLC/ESI/MSn法检测样品中2-DHA-PS的相对含量，结果表明，所得产品中2-DHA-PS的转化率可达到28.6％。

Claims (10)

1.一种2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，所述方法包括：丝氨酸与磷脂酰胆碱在高活力磷脂酶D的催化下生成磷脂酰丝氨酸，磷脂酰丝氨酸与DHA在高活力磷脂酶A2的催化下生成2-DHA-PS；所述高活力磷脂酶A2含有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，是氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的野生型磷脂酶A2通过定点突变得到的突变体；所述高活力磷脂酶D来源于专利CN102286440B。
2.如权利要求1所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将所述高活力磷脂酶D加入pH3.0-6.0的含有丝氨酸、CaCl2的醋酸-醋酸钠缓冲液中，与含有磷脂酰胆碱的乙醚等体积混合均匀，在30-50℃下反应6-16小时；其中，反应之前高活力磷脂酶D浓度为1.0-4.0U/mL、丝氨酸的浓度为1.0-3.0M、CaCl2的浓度为2.0mM；
(2)反应结束后静置分层，提取含磷酯酰丝氨酸的有机相；
(3)在步骤(2)得到的含磷酯酰丝氨酸的有机相中加入二十二碳六烯酸，然后与pH4.0-9.0的含有高活力磷脂酶A2、CaCl2的磷酸盐缓冲液等体积混合均匀，在30-50℃下反应6-16小时；其中，反应之前磷脂酶A2浓度为10-40U/mL、CaCl2的浓度为2.0mM；
(4)反应结束后静置分层，提取有机相并加入4-6倍体积的丙酮将生成的2-DHA-PS沉淀下来，然后离心分离，收集沉淀并用丙酮洗涤2-4次，即可得到2-DHA-PS产品。
3.如权利要求2所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述磷脂酰胆碱的浓度为0.05-0.3M。
4.如权利要求2所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述二十二碳六烯酸的浓度为0.1-0.4M。
5.如权利要求1-4任一一项所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的野生型磷脂酶A2代替所述高活力磷脂酶A2。
6.如权利要求1-4任一一项所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，所述高活力磷脂酶A2由枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌株、毕赤酵母高活力磷脂酶A2游离表达重组菌株或毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2重组菌株制备。
7.如权利要求6所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，由枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌株制备所述高活力磷脂酶A2包括以下步骤：
(1)将野生型磷脂酶A2基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA2，通过重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因，得到如SEQ ID NO：8所示高活力磷脂酶A2突变体编码基因；
(2)将高活力磷脂酶A2突变体编码基因与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43连接，构建获得携带有高活力磷脂酶A2突变体编码基因的重组载体；
(3)将重组载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中，构建获得重组菌株；
(4)将重组细胞进行发酵制备并提取高活力磷脂酶A2；
(5)提取高活力磷脂酶A2。
8.如权利要求6所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，由毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2重组菌株制备所述高活力磷脂酶A2包括以下步骤：
(1)将野生型磷脂酶A2编码基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA2，通过重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因，得到如SEQ ID NO：8所示高活力磷脂酶A2突变体编码基因；
(2)将高活力磷脂酶A2突变体编码基因序列与毕赤酵母展示载体pPIC9K-Flo相连，得到携带高活力磷脂酶A2突变体编码基因的重组载体pPIC9K-Flo-plA2m；
(3)将重组载体转化入宿主菌株毕赤酵母GS115中，得到毕赤酵母细胞表面展示磷脂酶A2重组菌株。
(4)将重组菌株发酵后制备酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂。
9.如权利要求6所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，由所述毕赤酵母高活力磷脂酶A2游离表达重组菌株制备所述高活力磷脂酶A2包括以下步骤：
(1)将野生型磷脂酶A2基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA2，通过重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因，得到高活力磷脂酶A2突变体编码基因；
(2)将高活力磷脂酶A2突变体编码基因与表达载体pPIC9K相连，得到携带高活力磷脂酶A2突变体编码基因的重组表达载体；
(3)将重组载体转化入毕赤酵母GS115中，得到重组细胞；
(4)将得到的重组细胞经遗传霉素筛选，结合磷脂酶A2的酶活测定，得到高活力磷脂酶A2的高产菌株；
(5)将高产菌株进行发酵制备高活力磷脂酶A2；
(6)提取高活力磷脂酶A2。
10.根据权利要求1-4任一一项所述方法制备的2-DHA-PS。
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