KR20090006803A - 포스포리파아제 ｄ의 활성을 억제하는 펩티드 및 그동정방법 - Google Patents

포스포리파아제 ｄ의 활성을 억제하는 펩티드 및 그동정방법 Download PDF

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Abstract

포스포리파아제 D(phospholipase D)의 활성을 억제하는 펩티드 및 그 동정방법을 제공한다. 본 발명은 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 및 그 동정방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 포스포리파아제 D를 특이적으로 억제하여 포스포리파아제 D가 관여하는 다양한 세포 신호 전달을 효과적으로 조절할 수 있으며, 더 나아가 암세포의 항암제 내성 획득을 억제함으로써 기존 항암제들의 항암 작용을 획기적으로 개선할 수 있는 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 서열 및 그 동정방법을 제공할 수 있다.
포스포리파아제 D, Phospholipase D, PLD, hAP180

Description

포스포리파아제 Ｄ의 활성을 억제하는 펩티드 및 그 동정방법 {Peptide inhibiting the activities of phospholipase D and method for identification of the peptide sequence}
본 발명은 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 및 그 동정방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 포스포리파아제 D를 특이적으로 억제하여 포스포리파아제 D가 관여하는 다양한 세포 신호 전달을 효과적으로 조절할 수 있으며, 더 나아가 암세포의 항암제 내성 획득을 억제함으로써 기존 항암제들의 항암 작용을 획기적으로 개선할 수 있는 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 및 그 동정방법에 관한 것이다.
포스포리파아제(phsopholipase)는 인지질을 가수분해하는 작용을 수행하며, 기질 특이성에 따라서 포스포리파아제 A1, A2, B, C 및 D로 분류된다. 포스포리파아제 A1 및 A2는 주로 동물세포 및 미생물 등에 널리 분포하는데 대부분 세포막에 결합되어 있고, 포스포리파아제 B는 A1 및 A2와 함께 작용하여 인지질에 존재하는 두 곳의 지방산 에스테르 결합에 대한 가수분해에 관여하며, 포스포리파아제 C는 세균 의 외분비효소 중의 하나이며 동물세포에서는 포스파티딜이노시톨에 특이성을 가지는 포스포리파아제 C가 포스파티딜이노시톨의 대사회로에 관여하는 것으로 알려져 있다.
포스포리파아제 D(phospholipase D: PLD, 이하 'PLD'라 한다.)는 포유동물에 있어서 호르몬, 신경전달물질 및 성장인자 등과 같은 다양한 물질을 통한 세포 신호 전달에 관여하며, 인지질의 일종인 포스파티딜콜린(phosphatidyl choline: PC)을 포스파티드산(phosphatidic acid: PA) 및 콜린으로 가수분해시키는 작용을 수행하는 것으로 알려져 있다. PLD에 의해서 가수분해된 PA는 세포내 지질 2차 전달자로서 기능하여, 세포내 소포 과립의 이동(vesicular trafficking), 세포골격 재배열(cytoskeletal rearrangement) 및 세포분열 등과 같은 다양한 과정에 관여할 수도 있고, 디아실글리세롤(diacyl glycerol:DAG), 리소포스파티드산 (lysophosphatidic acid: LPA) 또는 아라키돈산(arachidonic acid) 등과 같은 또 다른 신호전달 물질로 변환될 수도 있다.
한편, 효과적인 항암제로 기능하기 위해서는, 개발된 약물이 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서 암세포만 공격할 수 있는 충분한 암세포 특이성을 가져야 할 뿐만 아니라, 암세포들이 개발된 항암제에 대해서 내성을 획득하게 되는 문제점을 해결할 필요성이 있다. 암세포의 항암제에 대한 내성 획득을 설명하기 위한 기작으로는, ⅰ) 암세포 자신이 세포 내의 항암제를 탐지하여 이를 세포 외로 방출하는 에너지 의존성 수송체들을 보유하거나, ⅱ) 암세포들이 항암제-유도 세포괴사에 대한 비민감성을 지니거나, 또는 ⅲ) 암세포들이 약물-약독화 메카니즘을 발동시킨 다고 보고된 바 있다.
특히, 항암제에 대한 내성을 획득한 암세포는 PLD의 활성이 매우 높은 것으로 보고된 바 있는데, PLD에 의해서 형성된 PA는 엔도사이토시스(endocytosis) 도중에 클래스린-코팅된 소낭들(clathrin-coated vesicles)의 조립에 필수적 요소이다. 따라서, 암세포의 항암제에 대한 내성 획득을 억제함으로써 기존에 개발된 항암제들의 항암 효과를 극대화시키기 위해서 PLD의 활성을 억제하는 물질에 대한 개발이 매우 효과적인 접근 방법이 될 수 있을 것이다.
기존에 PLD에 대해서 억제 활성을 갖는 것으로 알려진 단백질들로는 앰피피신(amphiphysin), 시냅토자닌(synaptojanin) 및 AP180 등이 있다. 앰피피신은 앰피피신 Ⅰ 및 Ⅱ로 분류되고, 클래스린 코팅과 결합하는 헤테로다이머를 형성하여 외생적으로 발현된 PLD1 및 PLD2를 억제할 뿐만 아니라, 내생적 PLD의 활성도 억제하는 것으로 알려져 있으며, 앰피피신 Ⅰ에 의한 PLD의 억제 작용에는 N-말단이 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 시냅토자닌은 래트의 뇌로부터 정제된 150 kDa의 단백질로서 PI(4,5)P2의 4- 및 5-포스페이트를 가수분해시키며, 시냅토자닌의 중심 영역은 이노시톨 폴리포스페이트 5-포스파타아제(IP 5-Pases) 패밀리와 매우 유사한 것으로 알려져 있다.
한편, 세포 내 소기관들 사이에서 단백질 및 지질 수송을 매개하는 클래스린-코팅된 소낭들의 형성에 관여하는 클래스린 조립 단백질은 테트라머 AP 패밀리 및 모노머 AP 패밀리로 분류될 수 있다. 또한 테트라머 AP 패밀리는 다시 골지막으로부터의 버딩(budding)되는 클래스린-코팅된 소낭들에 존재하는 AP-1 및 세포막으로 부터 버딩되는 클래스린-코팅된 소낭들에 존재하는 AP-2로 분류되고, 모노머 AP 패밀리는 AP180 및 CALM 등으로 분류된다. AP180은 프리시냅틱 세포막(presynaptic plasma membrane)으로부터 버딩되는 클래스린-코팅된 소낭들에 존재하며, 본 발명자들은 기존에 AP180의 Pro-290부터 Lys-320까지의 펩티드 서열이 PLD와 결합하여 PLD의 활성을 억제한다는 사실을 보고한 바 있다(The Journal of Biological Chemistry, vol. 272, No.25, Issue of June 20, pp. 15986-15992, 1997).
그러나 PLD를 억제하여 암세포의 항암제 내성을 극복하기 위한 신약후보 물질을 개발하기 위해서는 상기 펩티드 서열 중 구체적으로 어떠한 모티브가 PLD의 활성 억제에 결정적인 역할을 하는지를 규명해야 할 필요가 있다.
본 발명자들은 클래스린 조립 단백질인 AP180의 펩티드 서열 중 구체적으로 어떠한 서열이 PLD의 활성 억제에 직접적으로 작용하는지를 규명하고자 하였으며, 이에 따라 본 발명이 이루고자 하는 첫 번째 기술적 과제는 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 서열을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 이루고자 하는 두 번째 과제는 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 서열의 동정방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫 번째 기술적 과제를 달성하기 위해서, 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 가지며, 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드를 제공한 다.
또한, 본 발명은 상기 두 번째 기술적 과제를 달성하기 위해서,
클래스린 조립 단백질인 hAP180의 펩티드 서열 중 Pro-290부터 Lys-320까지의 펩티드 서열을, 카르복실 말단 쪽이 절단된 Pro-290을 개시점으로 하고 Gly-291부터 Lys-320까지의 임의의 지점까지를 종료점으로 하는 서로 다른 길이의 복수 개 부분 펩티드 서열들로 분획하고, 아미노 말단부터 보존된 도메인 부위를 서로 다른 길이의 복수 개 부분 펩티드 서열들로 분획하는 단계;
상기 부분 펩티드 서열들을 코딩하는 핵산 서열들에 프라이머를 접합시켜서 중합효소 연쇄 반응에 의하여 증폭시키는 단계;
상기 증폭된 각각의 핵산 서열들을 벡터에 삽입한 다음 포스포리파아제 D 발현 세포에 도입하여 포스포리파아제 D의 활성도를 측정함으로써 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 부분 펩티드 서열들을 선별하는 단계; 및
상기 선별 단계에 의해서 선별되지 않은 부분 펩티드 서열들 중 가장 긴 길이를 갖는 부분 펩티드 서열의 종료점 직후 아미노산을 개시점으로 하고, 상기 선별 단계에 의해서 선별된 부분 펩티드 서열들 중 가장 짧은 길이를 갖는 부분 펩티드 서열의 종료점을 종료점으로 하는 펩티드 서열을 선별하는 단계를 포함하는 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 서열의 동정방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면,
상기 카르복실 말단 쪽이 절단된 부분 펩티드 서열들은 Pro-290 내지 Glu-294, Pro-290 내지 Pro-299, Pro-290 내지 Lys-304, Pro-290 내지 Thr-309, Pro- 290 내지 Pro-314 및 Pro-290 내지 Lys-320의 6개 펩티드 서열들로 이루어지고, 아미노 말단부터 보존된 도메인 부위의 절단 돌연변이 시리즈는 △ENTH, △ANTH, △~314, △~320 및 포스포-세린(phospho-serine)일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 벡터는 강화 녹색 형광 단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) 벡터 또는 myc가 태깅(tagging)된 pCMV-myc 벡터일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 상기 포스포리파아제 D 발현 세포는 KATOⅢ 세포일 수 있다.
본 발명에 따르면 PLD를 특이적으로 억제하여 PLD가 관여하는 다양한 세포 신호 전달을 효과적으로 조절할 수 있으며, 더 나아가 암세포의 항암제 내성 획득을 억제함으로써 기존 항암제들의 항암 작용을 획기적으로 개선할 수 있는 PLD의 활성을 억제하는 펩티드 서열 및 그 동정방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
전술한 바와 같이, 본 발명자들은 래트(rat)의 뇌세포 세포질로부터 분리된 클래스린 조립 단백질인 AP180의 Pro-290부터 Lys-320까지의 펩티드 서열이 PLD와 결합하여 PLD의 활성을 억제한다는 사실을 보고한 바 있다(The Journal of Biological Chemistry, vol. 272, No.25, Issue of June 20, pp. 15986-15992, 1997). 구체적으로, 상기 논문에서 본 발명자들은 AP180이 래트의 뇌세포 세포질에 서 분리된 또 다른 PLD 억제 단백질인 시냅토자닌과는 면역학적으로 상이한 특성을 나타내며, 이노시톨 헥사키스포스페이트 및 예비 조립된 클래스린 골격과 강한 친화도를 나타내지만 이들과의 결합에 의해서 AP180의 PLD 억제 활성이 영향을 받지는 않음을 밝혔고, 또한 PI(4,5)P2와도 낮은 친화도를 나타내지만, 이 역시 PLD 억제 활성에 영향을 주지는 않음을 밝혔다. 인 비트로 결합 분석의 결과로부터 유추해 볼 때, AP180의 PLD 억제 활성은 양자 간의 직접적인 결합에 의해서 발생되는 것으로 판단되며, GST 융합 단백질을 사용한 실험으로부터 상기 결합에는 AP180의 Pro-290부터 Lys-320까지의 펩티드 서열이 관여한다는 결론을 얻은 바 있다.
따라서, 본 발명자들은 human AP180(이하, hAP180이라 한다.)의 Pro-290부터 Lys-320까지의 펩티드 서열 중에서도 구체적으로 어떠한 모티브가 PLD와의 직접적 결합에 관여하는지를 알아내기 위한 일련의 연구들을 수행하였으며, 그 결과 하기의 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 PLD의 억제 활성에 직접적으로 관여함을 밝혔다. 본 발명에 의한 펩티드는 통상적인 화학 합성법에 따라 합성하여 얻을 수 있다.
(1) Thr - Val - Thr - Ser - Pro - Asn - Ser - Thr - Pro - Ala - Lys
(2) Thr - Val - Thr - Ser - Pro
(3) Asn - Ser - Thr - Pro - Ala - Lys
(4) Thr - Ser - Pro
다양한 돌연변이 실험을 통하여 상기 세린이 결실되거나, 치환되는 경우에는 PLD 활성의 억제 능력이 크게 훼손되는 것으로 나타났는데, 이에 따라 서열번호 (1) 또는 (2)의 네 번째 아미노산 잔기 또는 (4)의 두 번째 아미노산 잔기인 세린은 PLD의 활성 억제에 핵심적인 역할을 하는 것으로 추측된다.
한편, 본 발명은, 클래스린 조립 단백질인 hAP180의 펩티드 서열 중 Pro-290부터 Lys-320까지의 펩티드 서열을, 카르복실 말단 쪽이 절단된 Pro-290을 개시점으로 하고 Gly-291부터 Lys-320까지의 임의의 지점까지를 종료점으로 하는 서로 다른 길이의 복수 개 부분 펩티드 서열들로 분획하고, 아미노 말단 보존 도메인 부위를 서로 다른 길이의 복수 개 부분 펩티드 서열들로 분획하는 단계; 상기 부분 펩티드 서열들을 코딩하는 핵산 서열들에 프라이머를 접합시켜서 중합효소 연쇄 반응에 의하여 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 각각의 핵산 서열들을 벡터에 삽입한 다음 포스포리파아제 D 발현 세포에 도입하여 포스포리파아제 D 활성도를 측정함으로써 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 부분 펩티드 서열들을 선별하는 단계; 및 상기 선별 단계에 의해서 선별되지 않은 부분 펩티드 서열들 중 가장 긴 길이를 갖는 부분 펩티드 서열의 종료점 직후 아미노산을 개시점으로 하고, 상기 선별 단계에 의해서 선별된 부분 펩티드 서열들 중 가장 짧은 길이를 갖는 부분 펩티드 서열의 종료점을 종료점으로 하는 펩티드 서열을 선별하는 단계를 포함하는 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 서열의 동정방법을 제공한다.
먼저, 상기 논문에서 밝힌 바와 같이 클래스린 조립 단백질인 hAP180의 펩티드 서열 중 Pro-290 내지 Lys-320 서열이 PLD 억제 활성을 나타내므로, 이러한 서열 중 어떠한 특정 서열이 PLD 억제 활성에 핵심적인 역할을 수행하는지를 분석하기 위해서 상기 Pro-290 내지 Lys-320 서열을 적당한 크기를 갖는 부분 펩티드 서 열들로 분획하는 단계를 수행한다.
이때, 부분 펩티드 서열들은 각각 Pro-290을 개시점으로 하고 Gly-291부터 Lys-320까지의 임의의 지점까지를 종료점으로 하며, 그 길이는 서로 다르다. 예를 들어, Pro-290 내지 Lys-320 서열을 Pro-290을 개시점으로 하여 5개씩의 아미노산을 더 포함하는 부분 펩티드 서열들로 분획할 경우, 가능한 부분 펩티드 서열들은 Pro-290 내지 Glu-294, Pro-290 내지 Pro-299, Pro-290 내지 Lys-304, Pro-290 내지 Thr-309, Pro-290 내지 Pro-314 및 Pro-290 내지 Lys-320의 6개 펩티드 서열들이 될 것이다.
도 1의 B에는 전술한 방식에 의해서 Pro-290 내지 Lys-320 서열을 6개의 부분 펩티드 서열들로 분획한 개념도를 도시하였다. 도 1의 B을 참조하면, Pro-290 내지 Lys-320 서열까지의 전체 서열 중 Thr-310 내지 Pro-314가 PLD 활성을 억제하는 펩티드 서열이라고 할 때, Pro-290 내지 Glu-294, Pro-290 내지 Pro-299, Pro-290 내지 Lys-304 및 Pro-290 내지 Thr-309에는 PLD 활성 억제 펩티드 서열이 포함되지 않지만, Pro-290 내지 Pro-314 및 Pro-290 내지 Lys-320에는 PLD 활성 억제 펩티드 서열이 포함된다.
또한 본 발명에서 아미노 말단부터 보존된 도메인 부위의 절단 돌연변이 시리즈는 △ENTH, △ANTH, △~314, △~320 및 포스포-세린(phospho-serine)일 수 있다. 도 1의 C는 hAP180의 보존부위(conserved domain)와 구조적 인산화 가능 부위를 제거한 돌연변이 시리즈에 대한 예시를 나타내고 있다. 도면에 나타난 △ENTH는 wild hAP180의 아미노기 말단에서부터 Epsin N-말단 Homology 도메인까지 결실된 돌연변이를 의미하고, △ANTH는 wild hAP180의 아미노기 말단에서부터 AP180 N 말단 Homology 도메인까지 결실된 돌연변이를 의미한다. Δ314은 wild hAP180의 아미노기 말단에서부터 314번 아미노산까지 결실된 돌연변이를 의미하고, Δ320은 wild hAP180의 아미노기 말단에서부터 320번 아미노산까지 결실된 돌연변이를 의미하며, Δp-Ser은 wild hAP180의 아미노기 말단에서부터 포스포-세린까지 결실된 돌연변이를 의미한다.
이어서, 상기 부분 펩티드 서열들을 코딩하는 핵산 서열들을 통상의 방법에 의해서 합성하고, 합성된 핵산 서열에 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하기 위한 프라이머를 접합시켜서 PCR 반응을 수행하게 된다. PCR 반응을 위한 프라이머의 선택 및 구체적 PCR 조건은 당업계에 공지된 통상의 방법에 의할 수 있다.
다음 단계로는, 상기 증폭된 각각의 핵산 서열들을 벡터에 삽입한 다음 PLD 발현 세포에 도입하여 PLD의 활성도를 측정하는 단계를 수행하게 되는데, 이때 사용가능한 벡터로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 강화 녹색 형광 단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) 벡터 또는 pCMV-myc 벡터를 예로 들 수 있고, 포스포리파아제 D 발현 세포로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, KATOⅢ cell을 예로 들 수 있다. 또한, PLD의 활성도 측정에는 당업계에 공지된 PLD 분석법(Can J Biochem Physiol, vol 37, pp. 911-917, 1959)을 사용할 수 있다.
마지막으로, 상기 PLD 활성도 측정 결과로부터 PLD의 활성을 억제하는 펩티드 서열을 동정할 수 있게 되는데, 다시 도 1을 참조하면, Thr-310 내지 Pro-314가 PLD 활성을 억제하는 펩티드 서열이라고 가정할 때, PLD 분석법의 결과로부터 Pro-290 내지 Glu-294, Pro-290 내지 Pro-299, Pro-290 내지 Lys-304 및 Pro-290 내지 Thr-309에서는 PLD 활성 억제가 관찰되지 않을 것이지만, Pro-290 내지 Pro-314 및 Pro-290 내지 Lys-320에서는 PLD 활성 억제가 관찰될 것이다.
따라서, 이러한 PLD 분석법의 결과로부터, PLD 활성 억제가 관찰되지 않는 부분 펩티드 서열들 중 가장 긴 길이를 갖는 부분 펩티드 서열, 즉 Pro-290 내지 Thr-309(140)의 종료점 직후 아미노산, 다시 말해서 Thr-310이 동정하고자 하는 펩티드 서열의 개시점이 될 것이며, PLD 활성 억제가 관찰되는 부분 펩티드 서열들 중 가장 짧은 길이를 갖는 부분 펩티드 서열, 즉 Pro-290 내지 Pro-314의 종료점, 다시 말해서 Pro-314가 동정하고자 하는 펩티드 서열의 종료점이 될 것이다.
전술한 방법에서는 Pro-290 내지 Lys-320 서열까지의 서열을 5개의 펜타펩티드 및 1개의 헥사펩티드로 분획하는 경우를 예로 들어 설명하였지만, 상기 서열을 더욱 작은 단위의 펩티드들로 분획하는 실험을 수행할 경우에는 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 서열을 더욱 작은 길이의 펩티드 서열로 동정할 수도 있을 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예와 실험예에 의하여 더욱 상세하게 설명하기로 하지만, 본 발명의 범위가 하기 실시예와 실험예만으로 한정되는 것은 아니며, 하기 실시예와 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 서술된 것이다.
실시예 1 : PLD의 정제
문헌(Kim, JH et al.,Biochemistry,23, 3763-3769(1999))의 방법에 따라 PLD1을 발현 및 정제하였다. 즉, PLD의 N 말단에 6개 히스티딘이 붙어있는(His 6)-PLD의 유전자를 포함하는 재조합 DNA(미국 에모리 대학(Emory University)로부터 입수함)를 바쿨로바이러스에 넣은 후 이 바쿨로바이러스(2x108/디쉬)를 Sf9 곤충 세포(3x107 세포수/150 ㎜ 디쉬: 10 디쉬의 세포)에 감염시키고 27 ℃에서 3일 동안 배양하였다. 건강하게 자란 세포를 수확하고 여기에 완충 용액 A(20 mM HEPES, pH 8.0, 2% 소디움 콜레이트, 0.6 M NaCl, 1 mM MgCl2 , 10 ㎎/㎖ 류펩틴, 10 ㎎/㎖ 아프로티닌(aprotinin), 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드) 10 ㎖를 가하고 4 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다. 이 반응액을 2,000 x g에서 20분 동안 원심분리한 후 상층액 20 ㎖를 Ni2+-NTA-아가로즈 0.5 ㎖와 혼합하고 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 이 반응액을 Poly-Prep 칼럼(Bio-rad사)에 가한 다음, 완충 용액 B(20 mM HEPES, pH 8.0, 1 M NaCl, 1mM MgCl2, 0.1 mM DTT, 1% β-옥틸글루코피라노사이드) 10 ㎖를 흘려보내어 수지에 비특이적으로 결합하는 단백질을 제거하였다. 이어서 20 mM, 50 mM, 80 mM 및 200 mM 이미다졸이 포함된 완충 용액 C(20 mM HEPES, pH 8.0, 0.6 NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1 mM DTT, 1% β-옥틸글루코피라노사이드)를 이용하여 단백질을 용출시켜 분획을 얻었다. 얻어진 분획에 대해 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏을 수행하여 분석하였다.
실시예 2 : 인간 cDNA 라이브러리로부터 hAP180 유전자의 클로닝
1) PCR 반응을 이용한 유전자의 증폭
hAP180 유전자를 PCR 기법을 통하여 cDNA library(human fetus Marathon-Ready cDNA(Cat #639338), Clontech사)로부터 클로닝하였다. 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 hAP180 유전자 염기서열을 근거로 제작하였는데, 포워드 프라이머는 5' → 3' 방향으로 hAP180-CDS-F1: 5'-GAATTCGCCACCATGTCGGGCCAAACGC-3'(kozak(GCCACC) 서열포함)이었고, 리버스 프라이머는 TAG 정지 코돈으로부터 단백질의 N' 방향으로 hAP180-CDS-R2724: 5'-TTACAAGAAATCCTTGATGTTAAG ATCC-3' 이었다.
상기 cDNA 라이브러리 100 ng을 10 X PCR buffer(50mM KCl, 10 mM Tris pH 9.0, 0.1 % Triton X-100, MgCl2 1 mM) 5 μl와 dNTP mix(2.5 mM) 5 μl와, 5 M betaine(final 1.3 M) 13 μl와 포워드 프라이머(100 pM) 0.5 μl와 리버스 프라이머(100 pM) 0.5 μl 그리고 Taq polymerase(10 unint/μl, pyrovest, Takara Shuzo사, 일본) 1μl를 혼합하였다. 이 혼합물은 증류수를 이용하여 최종 50 μl로 맞추었다. PCR 중합반응은 95℃ 에서 5분 반응 후, 변성(denaturation)을 위해 98℃에서 10초, 접합(annealing)을 위해 65 ~ 60℃(touchdown 기법 이용)에서 30초, 증폭(extension)을 위해 72℃에서 50초를 1회전으로 총 30회전의 중합반응을 시켰으며 마지막 증폭을 위해 72℃에서 15분간 반응하였다.
증폭된 DNA는 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)가 함유된 아가로스 젤에 전기영동시킨 후 자외선 조사하여 관찰하였다.
2) PCR 산물의 정제 및 발현 벡터로의 클로닝 및 hAP180 돌연변이 제작
도 1의 A는 PCR로 hAP180 유전자를 증폭한 후, pGEM 클로닝 벡터 시스템(Promega, 미국 메디슨)을 이용하여 클로닝된 hAP180 유전자에 대한 구조를 나타내는 모식도이다. PCR 산물 정제 키트(Cosmogenetech사, 대한민국)을 이용하여 PCR 산물을 정제한 후, pGEM 클로닝 벡테 시스템을 이용하여 클로닝함으로써 도 1의 B내지 C에 도시된 바와 같은 돌연변이 시리즈를 제조하였다.
도 1의 B는 mammalian 발현 벡터(pCMV-myc)을 이용하여 제작한, hAP180 유전자의 카르복실 말단 절단 돌연변이 시리즈의 모식도이고, 도 1의 C는 pCMV-myc을 이용하여 제작한, hAP180 유전자의 아미노기 말단 절단 돌연변이 시리즈의 모식도이다.
도 1의 B에 나타난 돌연변이 시리즈는 종래의 래트 AP180과 동일한 방법으로 인간 AP180을 이용하여 결실 돌연변이 시리즈를 제작한 것으로, 도 1의 A의 hAP180 와일드 타입 유전자를 이용하여 제작한 것이다. 즉, 클로닝된 hAP180 유전자를 PCR 기법 혹은 제한효소 처리를 하여 카르복실 말단(C-ter) 절단 돌연변이 시리즈를 pCMV-myc을 이용하여 제작하였다. 도 1에서 C의 돌연변이 시리즈는 hAP180의 보존부위(conserved domain)와 구조적 인산화 가능 부위를 제거한 돌연변이 시리즈에 대한 예시를 나타내는 것이다. pCMV-Myc 벡터의 특징에 의해 클로닝된 hAP180 N-말단에 Myc이 태깅된다.
클로닝된 hAP180은 염기서열 분석법을 통하여 그 서열을 확인하였으며, NCBI hAP180 mRNA sequence(NCBI NM_014841)와 비교하여 서열의 정확성을 확인하였다. 도면에 나타난 △ENTH는 wild hAP180의 아미노기 말단에서부터 Epsin N-말단 호몰로지(Homology) 도메인까지 결실된 돌연변이를 의미하고, △ANTH는 wild hAP180의 아미노기 말단에서부터 AP180 N 말단 호몰로지 도메인까지 결실된 돌연변이를 의미한다. Δ314은 wild hAP180의 아미노기 말단에서부터 314번 아미노산까지 결실된 돌연변이를 의미하고, Δ320은 wild hAP180의 아미노기 말단에서부터 320번 아미노산까지 결실된 돌연변이를 의미하며, Δp-Ser은 wild hAP180의 아미노기 말단에서부터 phospho-Serine까지 결실된 돌연변이를 의미한다.
실시예 3: PLD 분석법
각각의 mammalian 발현 벡터에 클로닝된 6개의 양성 클론을 KATOⅢ 세포에 형질전환(transfection)시키기 위해서, 형질전환 수행 하루 전에 세포들을 6 웰 플레이트에 접종하였다. 형질전환을 위해서는 세포 밀도가 배양 용기의 50% 내지 70% 정도 되어야 하므로, 세포를 분주한 후, 헤모사이토미터(hemocytometer)를 이용하여 세포 개수를 세어 35 mm 정도의 지름을 갖는 웰(6 웰 플레이트)의 경우에는 약 2 ㅧ 105 개 정도의 세포들이 플레이팅되게 하였다. 상기 개수는 세포주에 따라 다소 다르므로, 예비실험을 통하여 다양한 농도로 세포들을 플레이팅한 뒤, 다음날 현미경으로 세포 밀도를 관찰하고 적당한 개수를 정하여 실험에 사용하는 것이 바 람직하다.
먼저 10 cm 접시의 세포들을 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 트립신-EDTA를 처리한 후, FCS가 함유된 DMEM을 10 ml 넣고, 50 ml 원추관(cornical tube)으로 옮긴 다음, 피펫으로 현탁시켜서 단일 세포로 잘 부유시켰다. 이중, 20㎕를 에펜도르프 튜브로 옮기고 트리판 블루(tryphan blue) 20㎕를 섞었다. 헤모사이토미터의 덮개 유리를 덮고, 3의 혼합물에서 10㎕를 취하여 헤모사이토미터의 V-모양 홈에 로딩하여 모세관 현상에 의하여 고르게 로딩되도록 하였다. 현미경 하에서 세포수 측정기를 이용하여 세포 개수를 측정하였다. 6 웰 플레이트에 필요한 세포 수를 계산하고 세포 현탁액에서 필요한 부피를 취하여 다른 원추관에 넣었다. 6 웰 플레이트의 한 웰에는 2 ml의 배지를 사용하므로 필요량의 배지를 더 첨가하여 섞은 후, 웰마다 2 ml씩 분주하였다. CO2 배양기(incubator)에서 넣은 후, 다음 날 형질전환에 사용하였으며, 그 다음날 PBS, 혈청 및 항생제가 첨가되지 않은 배지를 30분 전에 37℃ 물 중탕에 담가 두었다.
클린 벤치 내에서 멸균된 에펜도르프 튜브에 상기 제작된 양성 클론을 혼합하였다(6 웰 기준, 1 웰 당 1 ㎍ 정도). 무혈청 배지 또는 Opti-MEM 100 ㎕와 트랜스펙션 플러스 시약(Transfection plus reagent) 4 ㎕를 혼합하여 이를 피펫을 사용하여 양성 클론과 잘 혼합한 후, 15분간 상온에서 배양하였다. 이어서, 무혈청 배지 또는 Opti MEM 100 ㎕에 리포펙타민(lipofectamine) 2 ㎕를 가하고, 이를 상기 양성 클론과 혼합한 다음 15분 동안 상온에서 배양하였다. 배양하는 동안, 6 웰 플레이트를 PBS(1 ml/well)로 2회 세척하였다. 다음으로, 무혈청 배지를 웰 당 0.8 ml씩 가하고, 양성 클론 혼합물을 6의 웰에 넣고 플레이트를 가볍게 흔들어 골고루 섞어 주었다.
CO2 배양기에서 3시간 동안 배양한 후, 혈청 및 항생제가 포함되어 있는 완전 배지(complete medium)로 교체하고, 다시 CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 후 6 웰 플레이트 상에서 배양한 각각의 양성 클론이 형질전환된 KATOⅢ 세포 주를 미리 냉각한 2 ml의 인산완충 생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 2차례 세척 후 부유시켰다. 상기 부유액을 2 ml 에펜도르프 튜브에 옮겨 4 ℃에서 3,000 rpm(865 ㅧg)으로 10분간 원심 분리하여 세포를 수획한 후, 흡입(aspiration)에 의해서 상등액을 제거하고, 4℃로 미리 냉각한 메탄올 500㎕를 첨가한 후 세포를 현탁시켰다.
세포 현탁액에 클로로포름 350㎕를 첨가한 후 1분간 교반하여 상온에서 1시간 방치하였다. 이어서, 클로로포름 350㎕와 증류수 500㎕를 첨가한 후, 1분간 교반하여 상온 및 10,000rpm의 조건 하에서 10분간 원심분리하였다.　다음으로, 유기 용매층만을 새로운 에펜도르프 튜브에 옮긴 후 다시 클로로포름 500㎕를 첨가하여 1분간 교반한 후 상온 및 10,000rpm의 조건 하에서 10분간 원심분리하였다.　유기 용매층의 혼합은 물이나 단백질 등을 제거하기 위한 것이며, 이어서 진공건조기 등을 사용한 진공건조에 의해서 유기용매를 제거하였다.　유기용매층을 건조시킨 후, 100㎕의 클로로포름과 메탄올 혼합용액(1:1, v/v)에 다시 녹여서 박층 크로마토그 라피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석을 수행하였다. TLC 전개용매(에틸아세테이트:이소옥탄:초산:물 = 110:50:20:100, v/v)를 사용하여 포스파티딜부탄올(PBt)을 분리한 후, 80% 아세톤(v/v)에 희석된 0.002% 프리뮬린(w/v) 용액으로 위치를 확인하였다. 확인된 PBt를 회수하여 LSC(Liquid Scintillation Counter)로 정량하였다.
실험예 1 : C 말단이 결실된 돌연변이의 PLD 활성 억제 측정
도 2는 도 1의 B에서 표시된 돌연변이를 이용하여 PLD의 활성 억제를 시험한 결과이다. 도 2를 참조하면, 아미노산 서열 310번에서 320번까지가 존재할 때만이 활성을 억제할 수 있는 것으로 확인할 수 있다. 도 2에서 상단의 아가로스 젤 사진은 구축된 각각의 돌연변이를 PCR기법을 통해 확인했음을 나타내는 것이다(mRNA expression). 도 2에서 하단의 그래프는 각각의 돌연변이를 KATOⅢ 세포에 도입한 후 PLD 효현제인 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)(200nM)로 30분간 자극한 다음에 PLD 활성을 측정한 결과를 나타내는 것이다.
실험예 2 : N 말단이 결절된 돌연변이의 PLD 활성 억제 측정
도 3은 도 1의 C에서 표시된 돌연변이를 이용하여 PLD의 활성 억제를 시험한 결과이다. 도 3을 참조하면, 아미노산 서열 310번에서 320번이 결절(truncated)된 돌연변이에서는 PLD 활성을 억제할 수 있는 능력이 없는 것을 확인할 수 있다. 도 3에서 좌측 상단 사진은 구축된 각각의 돌연변이를 PCR기법을 통해 확인한 것을 나 타내는 것이다(mRNA expression). 도 3에서 좌측 하단 사진은 각각의 돌연변이를 KATOⅢ 세포에 도입한 후 웨스턴 블랏을 통하여 단백질 수준에서의 발현을 확인한 결과이다. 도 3에서 우측 그래프는 각각의 돌연변이를 KATOⅢ 세포에 도입한 후 PMA(200nM)로 30분간 자극한 다음에 PLD 활성을 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 2와 도 3의 결과를 종합해 볼 때 구체적으로 310번부터 320번까지의 아미노산 서열이 PLD 활성 억제에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3 : 돌연변이 유전자 도입에 의한 암세포 생존율 측정
도 4는 각각의 돌연변이 유전자가 도입된 KATOⅢ 세포에 항암제를 투여하여 암세포의 생존율을 비교한 결과이고, 도 5은 항암제 투여에 의한 inhibition concentration(IC50) 검정 결과이다. 본 실험에서 사용한 항암제는 Taxotere와 Etoposide이고, 이들 항암제를 암세포에 투여하였을 때 PLD가 세포사를 막는 생존인자임이 이미 알려져 있다. 도 5을 참조하면, Taxotere와 Etoposide의 억제 농도 검정 결과로서 IC50은 각각 10μM과 60μg/ml인 것을 알 수 있다. 먼저 각각의 N-truncated mutants와 PLD1 혹은 PLD2 유전자를 함께 KATOⅢ 세포에 임시 도입하였고 상기 유전자 도입 후 48시간 경과한 다음 항암제인 Taxotere와 Etoposide를 가하였다. 도 5의 A와 B를 참조하면, 특히 △314, △320 및 △p-Ser 돌연변이에서는 PLD 활성을 억제하지 못해서 PLD1에 의한 세포사 억제율이 그대로 유지되었다. 따라서PLD1의 활성 억제에 310번부터 320번까지의 아미노산 서열이 매우 중요함을 확인할 수 있다.
실험예 4 : 면역침강법에 의한 확인
도 6은 PLD 억제 활성에서 중요한 310번부터 320번까지의 아미노산 서열이 단백질 수준에서 PLD와 상호 작용한다는 사실을 면역 침강법을 이용하여 확인한 결과이다. 돌연변이 △320과 △p-Ser에서는 PLD1과의 상호작용이 사라졌다.
실험예 5 : 310-TVTSPNSTPAK-320 펩티드의 PLD 활성 억제 측정
지금까지의 결과를 토대로 hAP180의 아미노산 서열 중 활성 억제에 밀접하게 관련이 있는 것으로 판명된 310-TVTSPNSTPAK-320 까지의 11개 아미노산으로 이루어진 펩티드를 인비트로(in-vitro) 상에서 합성하였다. 또한 상기 펩티드의 후단인 NSTPAK 아미노산으로 이루어진 펩티드와 전단인 TVTSP 아미노산으로 이루어진 펩티드를 각각 합성하여 리포펙타민을 이용하여 KATOⅢ 세포 내로 임시 도입 후 PMA에 의한 PLD 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 도 7에서 A는 상기 TVTSPNSTPAK 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 KATOⅢ 세포에 도입하여 PLD의 활성을 측정한 결과이다. 도 7을 참조하면, 상기 11개 아미노산으로 이루어진 펩티드를 도입하였을 때 PLD 활성이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있다. 도 7에서 B는 상기 TVTSP 아미노산 서열을 가지는 펩티드와 상기 NSTPAK 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 각각 KATOⅢ 세포에 도입하여 PLD의 활성을 측정한 결과이다. 도 7을 참조하면, 상기 카르복실 말단쪽 6개 부분인 NSTPAK 보다 아미노 말단 5개 부분인 TVTSP을 도입하였을 경우가 PLD 활성 억제에 더 효과적인 것을 알 수 있었다.
실험예 6 : 아미노산 수준에서의 PLD 활성 억제 부위 확인
상기의 결과를 토대로 310번에서 314번까지의 아미노산을 사이트 다이렉티드돌연변이생성법(site directed mutagensis)을 이용하여 각각의 아미노산을 알라닌으로 치환한 후, PLD 활성 억제를 측정하였다.
도 8의 A는 310번부터 314번까지 각각의 아미노산이 유전자 수준에서 치환이 이루어졌음을 확인한 염기서열 시퀀싱 결과이다. 도 8의 B는 도 8의 A에서 확인된 각각의 돌연변이를 세포 내로 임시 도입한 후 PLD 활성 변화를 측정한 결과이다. 도 7의 B를 참조하면, T312A와 S313A와 P314A 돌연변이 구간에서 PLD 활성 억제능이 사라짐을 확인할 수 있다. 이는 PLD 활성 억제에 T312, S313 및 P314가 관여함을 시사한다. 도 8의 C는 각각의 단일 아미노산 치환 돌연변이와 PLD1 또는 PLD2와의 상호 작용을 면역 침강법을 이용하여 확인한 결과이다. 도 8의 C를 참조하면, 313번 세린이 알라닌으로 치환된 돌연변이는 PLD1과 상호 작용이 나타나지 않음을 확인할 수 있다. 대조군으로는 N320 돌연변이를 사용하였고 PLD2와의 상호 작용은 관찰되지 않았다.(WT : wild type, + : PMA 200nM, 30분)
상술한 실험의 결과들을 종합하여 볼 때 hAP180의 아미노산 수준에서 활성 억제에 관여하는 중요 모티프는 310번부터 320번까지의 아미노산 서열이고, 이 중에에서도 310번부터 314번까지 아미노산 서열이 중요한 모티프이다. 또한 310번부터 314번 아미노산 중에서도 T312, S313 및 P314가 hAP180의 활성 억제에 있어 가장 중요하며, 특히 S313이 PLD와의 상호작용에 있어서 중요하게 관여하는 아미노산 이다.
도 1은 본 발명에 따른 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 서열의 동정방법에 의해서 Pro-290부터 Lys-320까지의 서열을 6개의 부분 펩티드 서열로 분획하고, 아미노 말단부터 보존된 도메인 부위를 5개의 돌연변이 시리즈로 분획한 개념을 나타내는 도면이다.
도 2는 도 1의 B에 표시된 돌연변이를 이용하여 PLD의 활성 억제를 시험한 결과이다.
도 3는 도 1의 C에 표시된 돌연변이를 이용하여 PLD의 활성 억제를 시험한 결과이다.
도 4는 각각의 돌연변이 유전자가 도입된 KATOⅢ 세포에 항암제를 투여하여 암세포의 생존율을 비교한 결과이다.
도 5은 항암제 투여에 의한 억제율(IC50) 검정 결과이다.
도 6은 PLD 억제 활성에서 중요한 310번부터 320번까지의 모티프가 단백질 수준에서 PLD와의 상호 작용함을 면역 침강법을 이용하여 확인한 결과이다.
도 7은 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 KATOⅢ 세포에 도입하여 PLD의 활성을 측정한 결과이다.
도 8는 아미노산 수준에서의 PLD 활성 억제에 관여하는 중요 모티브를 찾기 위한 단일 아미노산 치환을 이용한 돌연변이 제작과 관련된 돌연변이 시퀀싱 결과 및 면역 침강법을 이용한 확인 결과이다.
<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Peptide inhibiting the activities of phospholipase D and method for identification of the peptide sequence <150> KR10-2007-0070301 <151> 2007-07-12 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Val Thr Ser Pro Asn Ser Thr Pro Ala Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Val Thr Ser Pro 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asn Ser Thr Pro Ala Lys 1 5 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Ser Pro 1

Claims (5)

  1. 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된, 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드.
  2. 클래스린 조립 단백질인 hAP180의 펩티드 서열 중 Pro-290부터 Lys-320까지의 펩티드 서열을, 카르복실 말단 쪽이 절단된 Pro-290을 개시점으로 하고 Gly-291부터 Lys-320까지의 임의의 지점까지를 종료점으로 하는 서로 다른 길이의 복수 개 부분 펩티드 서열들로 분획하고, 아미노 말단부터 보존된 도메인 부위를 서로 다른 길이의 복수 개 부분 펩티드 서열들로 분획하는 단계;
    상기 부분 펩티드 서열들을 코딩하는 핵산 서열들에 프라이머를 접합시켜서 중합효소 연쇄 반응에 의하여 증폭시키는 단계;
    상기 증폭된 각각의 핵산 서열들을 벡터에 삽입한 다음 포스포리파아제 D 발현 세포에 도입하여 포스포리파아제 D의 활성도를 측정함으로써 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 부분 펩티드 서열들을 선별하는 단계; 및
    상기 선별 단계에 의해서 선별되지 않은 부분 펩티드 서열들 중 가장 긴 길이를 갖는 부분 펩티드 서열의 종료점 직후 아미노산을 개시점으로 하고, 상기 선별 단계에 의해서 선별된 부분 펩티드 서열들 중 가장 짧은 길이를 갖는 부분 펩티드 서열의 종료점을 종료점으로 하는 펩티드 서열을 선별하는 단계를 포함하는 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 서열의 동정방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 카르복실 말단 쪽이 절단된 부분 펩티드 서열들은 Pro-290 내지 Glu-294, Pro-290 내지 Pro-299, Pro-290 내지 Lys-304, Pro-290 내지 Thr-309, Pro-290 내지 Pro-314 및 Pro-290 내지 Lys-320의 6개 펩티드 서열들로 이루어지고, 아미노 말단부터 보존된 도메인 부위의 절단 돌연변이 시리즈는 △ENTH, △ANTH, △~314, △~320 및 포스포-세린(phospho-serine)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 서열의 동정방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 강화 녹색 형광 단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) 벡터 또는 pCMV-myc 벡터인 것을 특징으로 하는 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 서열의 동정방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 포스포리파아제 D 발현 세포는 KATOⅢ 세포인 것을 특징으로 하는 포스포리파아제 D의 활성을 억제하는 펩티드 서열의 동정방법.
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