CN110066814A - β-D-葡萄糖苷酶基因及其编码蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了β‑D‑葡萄糖苷酶基因及其编码蛋白，所述β‑D‑葡萄糖苷酶基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，该β‑D‑葡萄糖苷酶基因的编码蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明的β‑D‑葡萄糖苷酶，在偏酸性的pH条件下，具有良好的稳定性和活性，具有在极端环境下应用的潜力。

Description

β-D-葡萄糖苷酶基因及其编码蛋白

技术领域

本发明涉及生物基因领域，具体涉及一种β-D-葡萄糖苷酶基因及其编码蛋白。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶(cellobias，CB或β-G)和苦杏仁苷酶。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。该酶在自然界中的分布广泛，在植物的种子和微生物中尤为普遍，在动物和真菌体内也发现该酶的存在，微生物来源的报道较多。

β-葡萄糖苷酶的主要功能为水解葡萄糖苷键，释放出葡萄糖作为产物，是生物体糖代谢途径中不可或缺的一类酶。该酶在人类社会的生产和生活中，具有多方面的实际应用价值，例如在生物能源领域，它可以用于降解纤维素，产生葡萄糖；在食品领域，它可以在酿酒时提高酒香，制茶时增加茶叶的香味；在工业领域，它可以大量生产大豆异黄酮苷元产品；在医药领域，其浓度可以作为肠损伤的早期生化指标，同时β-葡萄糖苷酶的底物特异性、转糖苷功能和葡萄糖耐受性等也备受关注。

β-葡萄糖苷酶在使用过程中，反应体系处于pH偏酸性的条件下时，不耐酸的β-D-葡萄糖苷酶会迅速丧失活性，导致催化反应速率下降，而耐酸的β-D-葡萄糖苷酶则会展现出良好的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种β-D-葡萄糖苷酶基因及其编码蛋白。

本发明所提供的β-D-葡萄糖苷酶基因，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述β-D-葡萄糖苷酶基因所编码的蛋白,所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述β-D-葡萄糖苷酶基因，是从10份不同来源的牙菌斑混合物中，通过宏基因组学技术，使用试剂盒提取宏基因组DNA，并直接对提取好的宏基因组DNA进行PCR扩增得到。

本发明β-D-葡萄糖苷酶基因编码的β-D-葡萄糖苷酶具有良好的耐酸性，在偏酸性(pH为3.0左右)条件下依然持有较高的活性，稳定性好，扩展了其应用范围。

附图说明

图1为实施例1步骤1中PCR产物的电泳图谱。

图2为实施例1步骤1中重组质粒图谱。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。以下未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规实验条件或者制造厂商所建议的条件。

本发明所述β-D-葡萄糖苷酶基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述β-D-葡萄糖苷酶基因的编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述β-D-葡萄糖苷酶基因的来源，是从10份不同来源的牙面上的牙菌斑混合物中，通过宏基因组学技术，使用试剂盒(Mobio牌，Power DNA Isolation Kit，14900-50-NF，USA)提取宏基因组DNA，并直接对提取好的宏基因组DNA进行PCR扩增得到。

实施例1

通过分子克隆技术，构建β-D-葡萄糖苷酶基因的蛋白表达载体

1、对提取好的宏基因组DNA做PCR扩增(50μl体系)

上游引物：GTTAGCAGCCGGATCATGCGCACGACATTGACACG

下游引物：ATATGCTCGAGGATCTCAGCGCGGCAGGAC

PCR体系：

PCR程序：

94℃预变性10min，(94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸150s)X 35 cycles，最后72℃延伸10min。

PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示，图1左起第一个泳道是marker，第二个泳道是PCR产物，目的条带位置如图1所示。

本步骤所得PCR产物使用sanger法测序(ABI 3730xl测序仪双向测序，测序引物为上述“上游引物”和“下游引物”，由广州英骏生物公司完成)，得到本发明所述β-D-葡萄糖苷酶基因的核酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

根据三联密码子，将该核酸序列翻译成蛋白序列。该蛋白序列进行NCBI Blast比对搜索，得到的具有最高同源性的序列是Genbank FMZS01000001.1记录下的蛋白序列，具有77％的氨基酸同源性。另外，在本发明的蛋白序列的中间，与FMZS01000001.1相比，多了一段14个氨基酸的插入序列，该14个氨基酸的插入序列为GSGAAVPGKTPFED。

2、胶回收

使用Omega公司胶回收试剂盒，货号D2500-01，对步骤1的PCR产物中的目的条带，进行割胶回收。胶回收的PCR产物(β-D-葡萄糖苷酶基因)作为后续in fusion连接反应的底物，用于连接到表达载体上。

3、线性化表达质粒的制备

质粒载体选择pET15b，先对载体酶切

在37℃下保温30min。

酶切产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，用上述的omega试剂盒回收酶切产物条带。胶回收产物浓度为27ng/μl。以上即为制备好的线性化的质粒载体，用于后续的In fusion反应。

4、In-Fusion连接反应

将纯化好的PCR产物与质粒表达载体相互连接，构建表达载体。

50℃保温15min，然后置于冰上

重组质粒图谱如图2所示。

5、转化

取In-Fusion连接反应获得的连接产物10μl，加入到大肠杆菌NEB-10beta感受态细胞中，混匀冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，涂LB平板(带有氨苄青霉素抗性)，将平板置于培养箱中培养，平板上形成单克隆菌落。

6、验证单克隆

挑取单克隆菌落至10μl无菌水中，吹打混匀，取1μl作模板(10个，编号1～10)进行菌落PCR，验证目的基因是否连接到质粒载体上。

PCR体系：

对照：

PCR程序设定如下：94℃预变性10min；(94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2.5min)，并设置30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物电泳检测，通过目的条带的有无和大小，判断目的基因是否成功连接于载体。

7、测序验证与表达菌株的构建

取有目的条带的样品菌，接种到带有氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，培养过夜，菌液送至广州英骏生物公司测序验证，使用T7上游和下游通用测序引物进行测序，结果显示序列正确。然后提取该样品的质粒DNA，将质粒DNA转化到大肠杆菌ER2566细胞(蛋白表达的宿主菌)内，将ER2566培养过夜。

实施例2

蛋白表达

1、诱导表达

1)取实施例1步骤7中过夜培养的菌液300μL，加入到30mL LB中，再加氨苄青霉素，37℃，200rpm培养。

2)大约2h后测OD值，当OD值达到0.5(0.3～0.5)时，加入IPTG，终浓度0.1mM，然后20℃，200rpm培养12h。

2、酶法裂解细胞(30mL菌液)

1)4000g，10min离心收集菌体，去上清，用高纯水洗一次(高纯水重悬沉淀再离心去除上清)。

2)每30mL菌液对应的沉淀重悬于1.2mL cell lysis buffer(pH 8.5)，buffer需要确保添加有PMSF。

3)加入溶菌酶粉末至终浓度1mg/mL，混匀，冰浴30min。

4)将离心管转移到摇床，旋紧盖子，倾斜45度放置，230rpm，25℃，震荡10min。

5)加入Triton X-100 12μL(终浓度为1％)，DNA酶0.5μL和RNA酶1μL(终浓度均为5μg/mL)，置于摇床上，230rpm，25℃，震荡15min。

6)4℃，12000g离心15min，上清为可溶蛋白组分，沉淀为细胞碎片和不溶蛋白组分。上清液用于后续实验。

上清液中基因工程重组表达的β-D-葡萄糖苷酶，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

3、活性检测

以对-硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物测定β-葡萄糖苷酶的活性，具体实验操作参照参考文献(王霏,王绍琛,曹明明，冯治洋.土壤微生物中新型β-葡萄糖苷酶的挖掘与鉴定[J]进行.微生物学通报,2018,45(1):71-80.)。本申请的上清液中酶活性为102U/mL。

将Genbank记录的FMZS01000001.1的蛋白序列，也用上述方法进行蛋白表达。将本发明的β-D-葡萄糖苷酶，与FMZS01000001.1的酶，各取1000U总量，平行实验操作如下：用10KDa的超滤膜过滤截留蛋白质，用等体积的pH 3.0的高纯水重悬膜上截留的蛋白，30℃保温1小时。在保温前后，各取样测定酶活性。本发明的酶蛋白，在30℃保温1小时后仍保留有77％的酶活性。FMZS01000001.1序列来源的酶蛋白，仅保留有12％的酶活性。以上结果表明，本发明的β-D-葡萄糖苷酶，在偏酸性的pH条件下，具有良好的稳定性和活性，可以在偏酸性的极端环境中应用。例如，在用含β-D-葡萄糖苷酶的复合酶制剂降解木质素时，在催化过程中，反应体系有时会处于pH偏酸性的条件下，此时，不耐酸的β-D-葡萄糖苷酶就会迅速丧失活性，导致催化反应速率下降，而本发明的β-D-葡萄糖苷酶则会展现出良好的效果。

序列表

<110> 福建医科大学附属口腔医院

<120> β-D-葡萄糖苷酶基因及其编码蛋白

<130> 2019

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2679

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgcacga cattgacacg actgggccgc acggccatct gccaggccgt gctgctggcg 60

ctgcccgtgc tggcccatgg cgccgaaatg cgcgccgacg tgcgtgcgga cgtgcgcgcc 120

gacgccgatg cccgggccgg cgcgctggtg gcgcagatga cgctggacga gaagatcggc 180

cagctgctga acgtggcgcc cgccctgccg cgcctgggca tccccgccta caactggtgg 240

acggagtcgc tgcacggcgc gctcggcccc gtgccgacga cgaacttccc tgagccgatc 300

ggcctggccg ccacgttcga cgagaagctg ctgcgcgacg tggcgtccgc catcggcacc 360

gaggtgcagg cgctgcacac gcttgggcgc gagacgggcc gcctgggccg catcggcacc 420

gggctggaca cctggtcgcc gaacatcaac atcttccgcg atccgcgctg gggccgcggc 480

caggagacgt atggcgagga cccgtacctg acggcggcgc tgggcgtggc cttcgtgcag 540

ggcgtgcagg ggccggatcc ggacctgccg aaggtgatcg ccacgcccaa gcacttcgcc 600

gtgcacagcg gcccggaacc gacccggcac gtggccaatg tgttcgtgtc cgaccacgac 660

ctggaagaca cctacctgcc ggccttccgc gccgccatcg tcgacggcaa ggccggctcc 720

gtcatgtgcg cctacaaccg catcaacggc cagccggcct gcggcagcaa cctgctgctg 780

gagcgcacgc tgcgcggcgc ctggggcttc aagggctacg tcgtgtccga ctgcgacgcc 840

gtcaccgaca tctcgatcca cagcaagtac gcgaccgacc cggccgccgc cgtcgccgtc 900

gcgctcaagg ccggcacgga caacgagtgc aatacccaga ccctcagcga cacgccgggc 960

ctggaccagc gctaccgcga agcctatcga cggggcctga tcggcatggc cgacatcgac 1020

cgcgcgctcg tgcggctgtt ctcggcgcgc ctgcgtaatg gcgacctagc cggcctgccg 1080

gcgcgcgcgc acaagcccgt accggtcacg gcgatcgaca cgccggaaca ccgcgcgctg 1140

gcactgaagg cggccgtcga gagcctggtg ctgctgaaga acgacggcgt gctgccgttg 1200

agaagcgatg tccgcatcgc cgtcgccgga ccgctggccg acgccacgcg cgtgctgcgc 1260

gggaattatt cgtcgacgca gagcgcgccg cccgtctccg tcctggacgg cctgcgcgcg 1320

gcgctgcccg gcgcgcgcat ccaggccgtg ccgtccggcg cctcgatcac ggacggcgac 1380

ccggtgccgc cgtcggcgtt tcgcgcgccg gacggcaagc cgggcctgcg tgccgcctac 1440

ttcaaccgca gcggcggcgg atccggcgcc gcggtgcccg gcaagacgcc gttcgaggac 1500

aagcccgccg ccgtgcgcac ggagcccgga ctggaatcgc atgcgctcga actgaaggag 1560

gtggcggacc accacaaggt cgtctggacg ggcttcctcg tcgcgccgga gacgggcacc 1620

taccgcatcg gcgtgaccgg ggtgcagggg cagatgacgg tggccggcaa gccggccgcc 1680

gccgcgaaaa gttattcgcg ctgggccgag ccgctgcaac tggcggaagt gtccctggaa 1740

aaggggaagt cctacccgat ccgctaccag accgagacgg gcgtgaccgc cgtgccgggc 1800

ctgttctgga agcgcatttc gaagaacccg caggccgagc tgaagaaggc cgccgccgac 1860

gcggacgtcg tcgtcgccgt ggtcggcctg acgtcggacc tggagggcga ggaactggcg 1920

ctcaagatcg agggcttcgc gggcggcgac cgcacctcgc tcgacctgcc gcgcgaccag 1980

cgccgcctgc tggaacaggc gaaggcgacc ggcaagccgc tcgtcgtcgt cgtcatgggc 2040

ggcagcgcca tcgacctgtc gtgggcgaag gacaacgcgt cggccatcgt ggcggcctgg 2100

tacccgggcc agtccggcgg gcaggccgtg gccgacgtcg tcagcggcaa gtcggatgcc 2160

ggcggccgcc tgccgctgac gttctaccgc agcgtggccg acctgccgcc gttcgacgac 2220

tacggcatga agggccgcac ctaccgctac ttcacgggca cgcccgtcta tccgttcggc 2280

tttggcctga gctacacgac gttcgcgtac gggccgctgc aagtggagcc cgtcgacggc 2340

gcgccggaga atggcgtgct cgtcaccacc accgtgtcga acacgggccg gcgcgacggc 2400

gacgaggtcg cccagctgta cctgacgccg ccggccttcg agggcgcgcc gcgcgtggcg 2460

ctgcgcggct tccagcgcct gtcgctgaag gccggcgaac gccgcaccgt cagcttccgc 2520

ctgtcgccgc gcgacctgag cttcgtcacg cgcgacggtg tgcgccagct gatgccgggc 2580

acgctgggcg tgagcgtggg gagcggacag ccgggcaccg gcgtcgccgg ccaggcggcc 2640

acggtggtgc tgcagcgtcc cgacgtcctg ccgcgctga 2679

<210> 2

<211> 892

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Thr Thr Leu Thr Arg Leu Gly Arg Thr Ala Ile Cys Gln Ala

1 5 10 15

Val Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala His Gly Ala Glu Met Arg Ala

20 25 30

Asp Val Arg Ala Asp Val Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Gly Ala

35 40 45

Leu Val Ala Gln Met Thr Leu Asp Glu Lys Ile Gly Gln Leu Leu Asn

50 55 60

Val Ala Pro Ala Leu Pro Arg Leu Gly Ile Pro Ala Tyr Asn Trp Trp

65 70 75 80

Thr Glu Ser Leu His Gly Ala Leu Gly Pro Val Pro Thr Thr Asn Phe

85 90 95

Pro Glu Pro Ile Gly Leu Ala Ala Thr Phe Asp Glu Lys Leu Leu Arg

100 105 110

Asp Val Ala Ser Ala Ile Gly Thr Glu Val Gln Ala Leu His Thr Leu

115 120 125

Gly Arg Glu Thr Gly Arg Leu Gly Arg Ile Gly Thr Gly Leu Asp Thr

130 135 140

Trp Ser Pro Asn Ile Asn Ile Phe Arg Asp Pro Arg Trp Gly Arg Gly

145 150 155 160

Gln Glu Thr Tyr Gly Glu Asp Pro Tyr Leu Thr Ala Ala Leu Gly Val

165 170 175

Ala Phe Val Gln Gly Val Gln Gly Pro Asp Pro Asp Leu Pro Lys Val

180 185 190

Ile Ala Thr Pro Lys His Phe Ala Val His Ser Gly Pro Glu Pro Thr

195 200 205

Arg His Val Ala Asn Val Phe Val Ser Asp His Asp Leu Glu Asp Thr

210 215 220

Tyr Leu Pro Ala Phe Arg Ala Ala Ile Val Asp Gly Lys Ala Gly Ser

225 230 235 240

Val Met Cys Ala Tyr Asn Arg Ile Asn Gly Gln Pro Ala Cys Gly Ser

245 250 255

Asn Leu Leu Leu Glu Arg Thr Leu Arg Gly Ala Trp Gly Phe Lys Gly

260 265 270

Tyr Val Val Ser Asp Cys Asp Ala Val Thr Asp Ile Ser Ile His Ser

275 280 285

Lys Tyr Ala Thr Asp Pro Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Leu Lys Ala

290 295 300

Gly Thr Asp Asn Glu Cys Asn Thr Gln Thr Leu Ser Asp Thr Pro Gly

305 310 315 320

Leu Asp Gln Arg Tyr Arg Glu Ala Tyr Arg Arg Gly Leu Ile Gly Met

325 330 335

Ala Asp Ile Asp Arg Ala Leu Val Arg Leu Phe Ser Ala Arg Leu Arg

340 345 350

Asn Gly Asp Leu Ala Gly Leu Pro Ala Arg Ala His Lys Pro Val Pro

355 360 365

Val Thr Ala Ile Asp Thr Pro Glu His Arg Ala Leu Ala Leu Lys Ala

370 375 380

Ala Val Glu Ser Leu Val Leu Leu Lys Asn Asp Gly Val Leu Pro Leu

385 390 395 400

Arg Ser Asp Val Arg Ile Ala Val Ala Gly Pro Leu Ala Asp Ala Thr

405 410 415

Arg Val Leu Arg Gly Asn Tyr Ser Ser Thr Gln Ser Ala Pro Pro Val

420 425 430

Ser Val Leu Asp Gly Leu Arg Ala Ala Leu Pro Gly Ala Arg Ile Gln

435 440 445

Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Ile Thr Asp Gly Asp Pro Val Pro Pro

450 455 460

Ser Ala Phe Arg Ala Pro Asp Gly Lys Pro Gly Leu Arg Ala Ala Tyr

465 470 475 480

Phe Asn Arg Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ala Val Pro Gly Lys Thr

485 490 495

Pro Phe Glu Asp Lys Pro Ala Ala Val Arg Thr Glu Pro Gly Leu Glu

500 505 510

Ser His Ala Leu Glu Leu Lys Glu Val Ala Asp His His Lys Val Val

515 520 525

Trp Thr Gly Phe Leu Val Ala Pro Glu Thr Gly Thr Tyr Arg Ile Gly

530 535 540

Val Thr Gly Val Gln Gly Gln Met Thr Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

545 550 555 560

Ala Ala Lys Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Glu Pro Leu Gln Leu Ala Glu

565 570 575

Val Ser Leu Glu Lys Gly Lys Ser Tyr Pro Ile Arg Tyr Gln Thr Glu

580 585 590

Thr Gly Val Thr Ala Val Pro Gly Leu Phe Trp Lys Arg Ile Ser Lys

595 600 605

Asn Pro Gln Ala Glu Leu Lys Lys Ala Ala Ala Asp Ala Asp Val Val

610 615 620

Val Ala Val Val Gly Leu Thr Ser Asp Leu Glu Gly Glu Glu Leu Ala

625 630 635 640

Leu Lys Ile Glu Gly Phe Ala Gly Gly Asp Arg Thr Ser Leu Asp Leu

645 650 655

Pro Arg Asp Gln Arg Arg Leu Leu Glu Gln Ala Lys Ala Thr Gly Lys

660 665 670

Pro Leu Val Val Val Val Met Gly Gly Ser Ala Ile Asp Leu Ser Trp

675 680 685

Ala Lys Asp Asn Ala Ser Ala Ile Val Ala Ala Trp Tyr Pro Gly Gln

690 695 700

Ser Gly Gly Gln Ala Val Ala Asp Val Val Ser Gly Lys Ser Asp Ala

705 710 715 720

Gly Gly Arg Leu Pro Leu Thr Phe Tyr Arg Ser Val Ala Asp Leu Pro

725 730 735

Pro Phe Asp Asp Tyr Gly Met Lys Gly Arg Thr Tyr Arg Tyr Phe Thr

740 745 750

Gly Thr Pro Val Tyr Pro Phe Gly Phe Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe

755 760 765

Ala Tyr Gly Pro Leu Gln Val Glu Pro Val Asp Gly Ala Pro Glu Asn

770 775 780

Gly Val Leu Val Thr Thr Thr Val Ser Asn Thr Gly Arg Arg Asp Gly

785 790 795 800

Asp Glu Val Ala Gln Leu Tyr Leu Thr Pro Pro Ala Phe Glu Gly Ala

805 810 815

Pro Arg Val Ala Leu Arg Gly Phe Gln Arg Leu Ser Leu Lys Ala Gly

820 825 830

Glu Arg Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Ser Pro Arg Asp Leu Ser Phe

835 840 845

Val Thr Arg Asp Gly Val Arg Gln Leu Met Pro Gly Thr Leu Gly Val

850 855 860

Ser Val Gly Ser Gly Gln Pro Gly Thr Gly Val Ala Gly Gln Ala Ala

865 870 875 880

Thr Val Val Leu Gln Arg Pro Asp Val Leu Pro Arg

885 890

Claims (3)

1.β-D-葡萄糖苷酶基因，其特征在于：所述基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的β-D-葡萄糖苷酶基因所编码的蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的β-D-葡萄糖苷酶基因的β-D-葡萄糖苷酶在酸性环境中的应用。