JPH0710231B2 - 固定化酵素および固定化酵素を用いたエステル合成方法 - Google Patents

固定化酵素および固定化酵素を用いたエステル合成方法

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JPH0710231B2
JPH0710231B2 JP62311549A JP31154987A JPH0710231B2 JP H0710231 B2 JPH0710231 B2 JP H0710231B2 JP 62311549 A JP62311549 A JP 62311549A JP 31154987 A JP31154987 A JP 31154987A JP H0710231 B2 JPH0710231 B2 JP H0710231B2
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【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、脂質分解酵素(リパーゼ、ホスホリパーゼ、
コレステロールエステラーゼ等、以後酵素と略称する場
合もある)を用いた、エステル結合の合成および交換反
応に適した固定化酵素およびそれを用いたエステル合成
方法に関するものである。
〔従来の技術〕
エステル類の合成反応は、脂肪族1価アルコールと脂肪
酸によるワックスエステルの合成、モノグリセリド、ポ
リグリセリン脂肪酸エステル、糖エステルといった多価
アルコールと脂肪酸によるエステル合成、コレステリル
パルミテート等のステロイドエステル類、ゲラニルブチ
レート等のテルペンアルコールエステル類の製造方法と
して重要な技術である。
リン脂質についても、通常トランスホスファチジレーシ
ョンとして知られる塩基交換反応は有用な生理活性物質
等の製造法として重要な技術である。
脂質分解酵素の1種であるリパーゼは温和な条件下で反
応すること、位置選択性、アルキル選択性等の特異性を
有することを利用して油脂及びエステル類の合成・交換
反応に利用されている。しかし、これらの反応はリパー
ゼ本来の加水分解反応と異なり水分の限定された系での
み進みうる反応である。一方リパーゼのエステル合成活
性や交換活性を増大せしめるためには、酵素として少量
の水分を必要とする。特開昭55−71797号公報に開示さ
れた低水分系の反応では、充分な反応速度が得られず、
また反応速度を増大させるために必要以上の水分を与え
ると、エステルの分解反応が優先的に進行するという問
題点がある。また特開昭60−19495号公報及び特開昭60
−203196号公報に開示された、反応を多水分系の分解工
程と、水分を除去する合成工程の二段階に分けて行う方
法の提案もあるが、後者の合成反応速度は通常のエステ
ル交換速度に比して充分であるとは言えず、工程操作の
複雑化も避けられない。
以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用す
る目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。
リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りであ
る。従来リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に均
一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼを
不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分散
可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるた
め、低水分下でのエステル合成・交換反応が行いやすく
なる。また触媒としてコストの高いリパーゼの回収再使
用がしやすく、エステル合成反応または交換反応の工業
的実施においても反応装置の連続化が容易となる点等で
ある。
しかし、以上のような利点を有する固定化酵素において
も、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保
持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立する
には至っていない。
例えば、Journal of American oil Chemist's Society,
第60巻,291−294(1983)にも微量な水分を与えた場合
加水分解反応が進行することが指摘されている。また、
水に代えてグリセリンのような多価アルコールを添加し
た場合では加水分解反応はある程度抑制されるが、エス
テル合成・交換反応は遅くなる。また、酵素水分の保持
を狙い多孔質担体、高級水性樹脂をキトサンで包括結合
後、粉砕した担体を用いる方法(特開昭59−213390号公
報)によっても固定化酵素のエステル合成・交換反応と
分解反応を両立させるため、二段階反応法(特開昭60−
203196号公報)を採用している。また特開昭60−98984
号公報および特開昭61−202688号公報には耐熱性を持ち
80℃までの反応が可能なエステル交換、エステル合成を
目的とした固定化酵素についての開示もあるが、その特
徴とする60℃〜80℃という温度では、ジグリセリドの1,
2位から1,3位への酵素的および非酵素的転移が速く、カ
カオ脂に類似したグリセリドの2位にオレイン酸を多く
含有する対称型油脂の製造を目的とする場合には、より
エステル交換反応速度の速い固定化酵素の開発が望まれ
る。
〔発明が解決しようとする問題点〕
以上のようにエステル合成および交換反応においては反
応系内の水分を確実にコントロールするか、またはより
エステル合成および交換活性の高い固定化酵素の開発が
望まれる。
エステル合成反応についてみると、従来の方法ではほと
んどの例がリパーゼを水溶液として使用しており、分解
と合成の平衡関係が大きく分解にかたよっており、目的
とするエステルの収量は低いものにとどまっている(特
開昭51−7754号公報、特開昭61−187795号公報)。しか
し固定化酵素によって反応を行えば、より低水分条件下
においてもエステル合成が行われ、酵素の回収も容易で
あるが、この場合においても通常の化学的方法と同等の
反応速度を得るためには、より高活性な固定化酵素の開
発が望まれる。
リパーゼのエステル合成およびエステル交換活性を増加
させる方法として、特開昭60−251884号公報に開示され
たリパーゼに油脂を加え加水分解反応をさせることによ
り、油脂と脂肪酸の共存下で固定化を行う方法や、特開
昭62−134090号公報に開示された脂肪酸誘導体の共存下
に乾燥する方法があるが、こうした方法により得られた
固定化リパーゼのエステル合成活性およびエステル交換
活性は前述の工業的実施にあたっては実質的には未だ充
分であるとは言えない。
一方酵素固定化における、活性収率の面から見ると、特
開昭62−87293号公報に開示されたイオン交換樹脂の有
機金属誘導体を担体としてリパーゼを固定化する方法
や、特開昭53−27787号公報に開示された多糖類の高級
脂肪酸エステルを担体としてリパーゼを固定化する方
法、あるいはEur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.に記載
されたY.Kimura等のイオン交換樹脂にリパーゼを単にイ
オン結合により固定化する方法等の従来の方法ではいず
れも低収率にとどまり、他の夾雑物の共存下でリパーゼ
を選択的に固定化することは極めて困難であると考えら
れていた。
〔問題点を解決するための手段〕
そこで、本発明者らは脂脂分解酵素のエステル合成及び
エステル交換活性を増大させる因子について鋭意研究を
重ねた結果、脂質分解酵素に脂肪酸又はその誘導体を共
存させることによりエステル合成及びエステル交換活性
の増大が見られる事実を発見した。更に本発明者らはこ
の事実をもとに、脂肪酸又はその誘導体を種々の不溶性
担体上に吸着させる事に応用し、本発明を完成するに致
ったのである。
即ち、本発明は、脂肪酸またはその誘導体を予め吸着処
理して得た不溶性担体と、脂質分解酵素とを水性媒体中
で吸着固定化して得られるエステル交換活性およびエス
テル合成活性の高い固定化酵素に係わるものである。
従来、リパーゼと脂肪酸又はその誘導体との関係につい
ては、醗酵生産において誘導基質として添加されたり、
ある種の不飽和脂肪酸または脂肪酸誘導体がある種のリ
パーセの分解活性を活性化することが報告されているに
すぎない。詳細には、サッカロマイセス リポリティカ
のリパーゼの分解活性をオレイン酸(Agric.Biol.Che
m.,46,2885(1982))やヒドロキシ脂肪酸(3,5−ジヒ
ドロキシ−7−テトラデセン酸)が活性化すること(Ag
ric.Biol.Chem.,50,2523(1986))、ヒマ種子中のリパ
ーゼがヒドロキシ脂肪酸誘導体(リシノレート・テトラ
マー(Ricinoleate tetramer))の分解活性発現に必要
なことが報告されているにすぎない。
また、リパーゼとリン脂質との関係についても、岩井ら
により1969年に日本生化学会において報告されて以来、
多くの報告がなされたが、加水分解反応での基質特異性
の変化についてか、または醗酵生産の安定化、誘導につ
いてのみであり、エステル合成およびエステル交換反応
での活性化についての報告はほとんど見られない。
これに対し本発明においては、具体的には脂質分解酵素
を含む溶液に不溶性担体を添加し該担体上に脂質分解酵
素を固定化する際に、予め不溶性担体に脂肪酸又はその
誘導体を吸着させた後、乾燥もしくは乾燥せずにそのま
ま酵素を固定化させる事により、酵素の選択的吸着とエ
ステル合成活性およびエステル交換活性の著しい上昇が
見られたのである。
本発明の方法の最も好ましい点としては、第一に酵素を
含む培養液など他の夾雑蛋白質や他の物質の中から酵素
を短時間かつ高収率に固定化できる点である。
第二にリパーゼ等の脂質分解酵素においては、当然のこ
とながら水と油脂の界面で働くため、水溶液で使用した
場合には、界面と水溶液中にリパーゼの分散する平衡が
存在すると考えられ、水溶液中の酵素を全て有効に使用
できない。しかし固定化により担体表面上に並べること
ができれば、用いた酵素を効率良く利用する事が可能と
なる。
第三に担体に脂肪酸又はその誘導体を吸着させておくこ
とにより脂質分解酵素を活性化して固定化できる事がわ
かった。これは、前述した様に界面で働く脂質分解酵素
は、界面に配向した時に活性を発現する高次構造をと
る。このため、界面に配向しかつ活性化した状態で酵素
を固定化する事が重要である。この高活性な状態を作り
出すのに必要な水不溶性の物質として脂肪酸又はその誘
導体が非常に良好であり、かつただ単にヘキサンのよう
な非極性の界面を作る物質ではその効果が無いことも分
かった。またこの様にして製造した固定化酵素は従来難
しいとされていた固定化酵素中の水分が2%以下でも十
分に活性を発現する。
すでに本発明者らはこれらの知見を応用して、少量の水
と油脂の共存下でリパーゼと不溶性担体を接触させ、界
面に配向させると同時に固定化を行うという発明を完成
し特許出願した(特開昭60−251884号公報)。今回本発
明者らは、さらにこれらの事実を解明し、各種の不溶性
担体に脂肪酸又はその誘導体を予め吸着させることに応
用し、該担体と酵素を接触固定化する際に、酵素を活性
化すると同時に短時間でかつ高濃度に該担体上に固定化
が可能となり、高活性な固定化酵素を製造できるという
本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法においては、水不溶性の担体に脂肪酸又は
その誘導体を水又は有機溶剤中で接触させる事により該
担体上に吸着処理し、必要に応じて該溶液から濾過した
後乾燥するか、またはそのまま酵素水溶液もしくは酵素
を含む培養液と接触させる。接触時間としては1分〜20
時間、好ましくは30分〜2時間がよい。次いで該溶液よ
り不溶性担体を濾過し水または緩衝液により洗浄する。
こうして得られた固定化酵素を乾燥させ本発明の固定化
酵素を得る。
本発明に用いる脂質分解酵素としては、リパーゼ、ホス
ホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴ
ミエリエーゼおよび各種のエステラーゼが挙げられる。
これらのうちリパーゼとしては、グリセリドの1,3位に
のみ反応し、位置選択性に優れたリゾプス(Rhizopus)
属、アスペルギルス(Aspergillus)属、ムコール(Muc
our)属、脂肪酸特異性を有するジオトリケム(Geotric
hum)属、特異性を示さないキャンディダ(Candida)
属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ペニシリウム
(Penicillium)属、クロモバクテリウム(Chromobacte
rium)属等の微生物起源のリパーゼ及び膵臓リパーゼ等
の動物リパーゼが挙げられる。これらのうち、特に合成
活性の増加し易いリパーゼとしては中鎖以上のアルキル
基に活性位の強いリゾプス属、ムコール属、クロモバク
テリウム属起源のリパーゼが一層好ましい。
コレステロールエステラーゼの例としては、キャンディ
ダ(Candida)属等の微生物起源のものが挙げられる。
また、ホスホリパーゼの例としては、キャベツ、ピーナ
ッツ、ニンジン等の植物やコケ植物由来のもの、および
ストレプトマイセス属等の微生物起源のものなどが挙げ
られる。
本発明に用いられる不溶性の担体としては、水およびア
ルコール、各種有機溶剤、油脂類に不溶性の担体なら何
れでも良く、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、モ
レキュラーシーブ、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシ
ウム、セラミックス等の無機担体、およびセルロースパ
ウダー、ポリビニルアルコール、キトサン、イオン交換
樹脂、吸着樹脂等の有機高分子の様なリパーゼ活性に影
響を与えず、操作上から物理的・化学的に安定なもので
あれば何れも使用できる。特に、不溶性担体内に疎水性
の部分を持つもの、例えば樹脂中の−CH2−部分の多い
もの、官能基にアルキル基の入ったものが、脂質分解酵
素の吸着性や基質としての脂質との相性からも好まし
い。また担体の疎水性が特に高い場合は、固定化時にア
ンチカオトロピックイオンとなる塩(硫安など)を加え
ると固定化収率が良好に保てる。また担体の形状として
は、粉末状、顆粒状、繊維状、スポンジ状等種々がある
が、そのいずれでも使用できる。特に工程操作上の面か
らは400〜1000μmの粒径を有し、細孔径100〜1500Åの
多孔性の担体を用いるものが好適である。特に好ましい
固定化担体としては特開昭60−98984号公報記載のマク
ロ多孔性弱アニオン交換樹脂があり、市販入手可能なも
のとしてダイヤモンドシャムロック社のデュオライトA-
568、デュオライトS-762等のマクロ多孔性の弱アニオン
交換樹脂及び吸着樹脂が挙げられる。
本発明で用いられる脂肪酸としては、炭素数2〜36のも
のが好ましく、更に好ましくは8〜18のものであり、例
えばカプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等の直鎖飽
和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、
リシノール酸等のヒドロキシ脂肪酸、もしくはイソステ
アリン酸等の分岐状の脂肪酸が挙げられる。
本発明に用いられる脂肪酸誘導体としては、炭素数2〜
36好ましくは8〜18の脂肪酸と水酸基を有する化合物と
のエステルが挙げられ、1価アルコールエステル、多価
アルコールエステル、リン脂質、あるいはこれらのエス
テルにさらにエチレンオキシドを付加した誘導体等が例
示される。1価アルコールエステルとしては、メチルエ
ステル、エチルエステル等が、多価アルコールエステル
としては、モノグリセリド、ジグリセリド、およびそれ
らの誘導体、あるいはプロピレングリコール、ポリグリ
セリン等の多価アルコールの脂肪酸エステル、ソルビタ
ン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル等が挙げられ
る。
本発明に用いるリン脂質の例としては、市販大豆レシチ
ン、卵黄レシチン等の粗製およびまたは精製混合レシチ
ン等を用いてもよく、またこれらを分画して得たホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジ
ルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホ
スファチジン酸、カルジオリピン等を単独または混合し
て用いてもよい。また各種合成法により得た合成リン脂
質およびこれらの誘導体を用いることができる。
上記の脂肪酸及びその誘導体はいずれも常温で液状であ
ることが工程操作上好ましいが、これに限定されるもの
ではない。またこれらは単体で用いてもよいが、適当な
組み合わせにより一層の効果が発揮される。また広範な
脂肪酸誘導体が使用可能なのは、これら誘導体が水性媒
体中では化学的に、もしくはリパーゼにより酵素的に加
水分解され、脂肪酸を生成するためと想像される。
脂肪酸又はその誘導体と水不溶性担体との接触方法とし
ては、水もしくは有機溶剤中にこれらの物質をそのまま
加えても良いが、分解性を良くするため溶剤に脂肪酸又
はその誘導体を一旦分散・溶解させた後、水に分散させ
た担体に加えることもよい。適当な有機溶剤としてはク
ロロホルム、n−ヘキサン等が挙げられる。脂肪酸又は
その誘導体と不溶性担体の比率は、不溶性担体1重量部
(乾燥重量)に対し脂肪酸又はその誘導体0.01〜1重量
部、より好ましくは0.05〜0.5重量部が適当であるが、
これに限定されるものではない。適当な接触温度として
は0〜100℃、好ましくは20〜60℃がよい。適当な処理
時間としては5分〜5時間程度で良く、これらの接触処
理した後の担体は必要に応じて該溶液より濾別した後一
旦乾燥する。適当な乾燥温度としては室温〜100℃が良
く、減圧下での乾燥が乾燥速度の点から好ましいが、こ
れに限定されるものではない。
本発明において固定化を行う温度としては、酵素の失活
の起きない温度であればよく、0〜60℃、好ましくは20
〜40℃がよい。また酵素溶液のpHは酵素の変性が起きな
いような範囲であればよく、pH3〜9であればよい。特
に至適pHが酸性とされている酵素を用いる場合に最大の
活性を得るには、pH4〜6とすることがよい。またアル
カリ性に至適pHをもつものはpH7〜9が好ましい。また
酵素溶液に用いる緩衝液の種類は特に規定しないが、一
般的な酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等
を用いることができる。
本発明における固定化方法において、水溶液中の酵素濃
度は特に限定されないが、固定化効率の点から前記酵素
の溶解度以下でかつ充分な濃度であることが望ましい。
また必要に応じて不溶部を遠心分離により除去し、上澄
を使用しても良い。また酵素と固定化担体の使用割合は
固定化担体1重量部に対して、酵素0.01〜10重量部、特
に0.05〜5重量部が好ましいが、特にこれに限定される
ものではない。
本発明における固定化酵素を用いたエステル合成反応の
例として、通常のメタノール、エタノール、プロパノー
ル、オレイルアルコール等の1価アルコール、ないしは
プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトールおよ
びポリグリセリン等の多価アルコール、またはゲラニオ
ール、シトロネロール、メントール等のテルペンアルコ
ール、あるいはコレステロール等のステロールと、炭素
数2〜36、好ましくは6〜24の飽和もしくは不飽和の脂
肪酸又はその低級アルコールエステルとのエステル化反
応が挙げられる。またエステル交換反応の例としては、
エステルと脂肪酸によるアシドリシス反応、エステルと
アルコールによるアルコリシス反応、エステル同士によ
るインターエステル化反応、リン脂質と各種アルコール
とのトランスホスファチジレーション等の反応が挙げら
れる。
エステル合成反応は20〜90℃、より好ましくは30〜80℃
で無溶剤、もしくは炭化水素、エーテル等の不活性溶剤
中で行う。またアルコールと脂肪酸の量はこれらの価
数、目的物に応じ適宜調整する。例えばジグリセリドの
合成を目的とする場合はグリセリン1モルに対して脂肪
酸約2モル、モノグリセリドの合成を目的とするときは
グリセリン1モルに対し、脂肪酸約1モルを反応させ
る。
本発明において、固定化前の担体に、多官能性試薬を用
いて架橋することにより、固定化酵素の繰り返し使用に
おける耐久性向上をはかることができる。多官能性の架
橋試薬としては、グリオキザール、グリタルアルデヒ
ド、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒドなどのポ
リアルデヒド類が好ましく、ヘキサメチレンジチオイソ
シアネート、N,N′−エチエンビスマレイミドなども使
用可能である。また、カルボジイミド類も使用できる。
〔発明の効果〕
本発明の方法は、リパーゼ等の脂質分解酵素の持つ合成
活性を十分に発揮させる為のものであり、脂肪酸又はそ
の誘導体を不溶性担体上に予め吸着させておくことによ
り、酵素の選択的吸着固定化が可能となり、同時にエス
テル交換活性、合成活性の増大が起こる事を発見した結
果から得たものである。
また、特開昭62−134090号公報に開示された方法と異な
り、脂肪酸もしくはその誘導体と、担体、酵素とを共存
させて固定化させるのでなく、担体を脂肪酸又はその誘
導体で前処理するため、この前処理段階で巾広い溶媒の
選択が可能となる。すなわちステアリン酸等の固体脂肪
酸をブタノール、ヘキサン等の溶剤に溶解し、担体への
吸着終了後、溶剤を除去し、固定化操作に供することも
可能である。
またエステル類の合成においては、従来の酵素法では反
応の進行に伴って生成する水分により反応が平衡に到達
するため、エステル化が進行しなくなる。そこで反応系
を減圧にする等の脱水操作によってエステル化をさらに
進めようとするが、こうした操作により酵素のエステル
合成活性の低下は避けられない。こうした場合に本発明
の方法による固定化酵素を用いると、低水分条件下にお
いても十分なエステル合成活性を保持しているため、短
時間の間に高いエステル化率が達成され、反応の長時間
化による着色および異臭の生成等、品質の低下が見られ
ないという利点を有する。
以上のように本発明により、脂質分解酵素を界面での活
性型にした状態で固定化することによりエステル合成お
よびエステル交換活性が増大することを発見し、工業的
実施にあたって簡便かつ廉価に固定化酵素を製造するこ
とができる。
〔実施例〕
以下、本発明を実施例、比較例をもって詳細に説明す
る。
実施例1 市販の弱アニオン交換樹脂〔フェノールホルムアルデヒ
ド系樹脂、商品名:デュオライト(Duolite)A−568、
ダイヤモンドシャムロック社製〕10gを100mlのイオン交
換水に加え、次いでオレイン酸(商品名:ルナックO−
LL、花王株式会社製)2gを加え30℃で30分攪拌した。次
に該樹脂を溶液から濾別した後イオン交換水にて洗浄し
た。
市販のリパーゼ〔リゾプス・ジャポニカス(Rhizopus・
japonicus)起源のリパーゼ製剤、商品名:リリパーゼ
・A10、大阪細菌研究所株式会社製、19,000Unit/g〕10g
をpH4.5の10mMの酢酸緩衝液100mlに溶解した。この溶液
に先に調整した樹脂を全量加え2時間攪拌した。次に該
懸濁液より樹脂を濾別し、水で洗浄した。このとき濾液
中のリパーゼ活性より求めた活性収率は96%となり、加
えたリパーゼのほとんどが吸着固定化されている事が分
かった。次いで水分5%となるように常温にて減圧乾燥
を行い固定化リパーゼを得た。
こうして得られた固定化リパーゼ1gを、グリセリン23g
(水分含量0.8%、花王株式会社製)及びオレイン酸70.
5gと混合し、40℃にて攪拌しながらエステル化反応を行
った。経時的に反応液の一部を試料として取り出し、基
準油脂分析試験法に従って試料の酸価を測定した。試料
の酸価より次式によりエステル化率を求めた。結果を第
1表に示す。
ここでAVt:t時間後の試料の酸価 AVo:反応前の混合試料の酸価を表す。
比較例1 実施例1で用いた市販の樹脂をオレイン酸で処理するこ
となく、そのままリパーゼを固定化した以外は実施例1
と同様の方法で固定化リパーゼを得、同様の方法で酵素
の吸着率及びエステル化率を求めた。結果は第1表に示
す。
実施例2 この例では実施例1の樹脂の前処理工程において、オレ
イン酸にかえて、脂肪酸エステルとしてオレイン酸トリ
グリセリド(試薬、東京化成製)、オレイン酸ジグリセ
リド(試薬、東京化成製)、オレイン酸モノグリセリド
(商品名:エキセルO−95、花王株式会社製)、オレイ
ン酸エチル(試薬、東京化成製)をそれぞれ用いた以外
は全く同様の操作を行った。
本実施例及び実施例1及び比較例1で得られた固定化リ
パーゼをそれぞれ1g用いて、パーム油中融点部(沃素価
32.5、ジグリセリド含量4.6%)10gと市販のステアリン
酸〔商品名:ルナックS−90、ステアリン酸純度93%、
花王株式会社製〕10gを加えて70℃で2時間反応を行っ
た。反応後カラムクロマトグラフィー(固定相フロリジ
ル、フロリジン社製、展開溶剤:ヘキサン/エチルエー
テル=2/3)によりグリセリド画分を分離し、グリセリ
ド中に含まれるステアリン酸含量をガスクロマトグラフ
ィーにより分析し、次式で示される平衡値を100%とし
た反応率を算出した。
上の式において、 St:t時間後の油脂中のステアリン酸含量 So:原料油脂中のステアリン酸含量 S∞:1,3ランダム平衡時のステアリン酸含量を意味す
る。
結果は第2表にまとめて示した。いずれの実施例の場合
も5時間以内に反応が平衡に到達し、副生物の生成も比
較例に比べ少なかった。
実施例3 実施例1の樹脂の前処理工程において、オレイン酸にか
えて、リノール酸、ラウリン酸、ステアリン酸、リシノ
ール酸(以上いずれも試薬、東京化成製)、イソステア
リン酸(商品名:ダイヤドール10−GA、三菱化成工業
製)を用いた以外は全く同様の操作を行った。ここで得
られた固定化酵素を用いて実施例2と同様にエステル交
換反応を行った。
これらの結果は第3表にまとめて示した。
実施例4 実施例1の樹脂の前処理工程において、オレイン酸に変
えて脂肪酸誘導体(脂肪酸の多価アルコールエステル〕
としてのプロピレングリコールモノオレエート(商品
名:サンソフト25-0、太陽化学株式会社製)、ソルビタ
ンモノオレエート(商品名:エマゾールO−10、花王株
式会社製)、トリグリセロールペンタオレエート(商品
名:PO−310、阪本薬品株式会社製)、ショ糖モノオレエ
ート(商品名:リョートーエステルO−1570、三菱化成
食品株式会社製)を各々用いた以外は全く同様の操作を
行った。得られた固定化酵素を用いて実施例2と同様の
エステル交換反応を行った。
これらの結果は第4表に示した。
実施例5 この例は有機担体についての検索を行った例である。
実施例1で用いた弱アニオン交換樹脂にかえて、マクロ
多孔性弱アニオン交換樹脂としてデュオライトA-7、デ
ュオライトES-562、デュオライトES-771、デュオライト
A-368、フェノール系吸着樹脂としてデュオライトS-762
(以上ダイヤモンドシャムロック社製)、スチレン系マ
クロ多孔性弱アニオン交換樹脂としてダイヤイオンWA30
〔三菱化成工業製)、有機高分子としてキトサン(商品
名:キトパールBC-3000、冨士紡積製)をそれぞれ用い
た以外は実施例1と同様の操作を行った。
ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例2と同
様にエステル交換反応を行った。結果は第5表に示し
た。
実施例6 この例では無機担体についての検索を行った。
実施例1で用いた弱アニオン交換樹脂にかえて、ケイ酸
カルシウム(商品名:フローライトR、徳山曹達株式会
社製)、合成ゼオライト(商品名:ミズカシーブス5A、
水沢化学製)、シリカビーズ(商品名:Silbead N、水沢
化学製)、球状アルミナ(商品名:Neobead D、水沢化学
製)を用いた以外は実施例1と同様の固定化操作を行っ
た。
ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例2と同
様にエステル交換反応を行った。結果は第6表に示し
た。
以上の結果に示すようにイオン交換樹脂以外にも多孔性
の吸着樹脂、天然の有機高分子、多孔性の無機担体にお
いても効果が認められた。
実施例7 実施例1において、市販リパーゼとしてリゾプス デレ
マー(Rhizopus delemar)起源のリパーゼ(商品名:タ
リパーゼ、田辺製薬株式会社製)を用いた以外は全く同
様の固定化操作を行った。
実施例8 実施例1において、市販リパーゼとしてムコールsp.起
源のリパーゼ(商品名:リパーゼM−10、天野製薬株式
会社製)を用いた以外は同様の固定化操作を行った。
実施例9 実施例1において、市販リパーゼとしてペニシリウム
シクロピウム起源のリパーゼ(商品名:リパーゼG、天
野製薬株式会社製)を用いた以外は同様の固定化操作を
行った。
比較例2 実施例7において、担体をオレイン酸で処理することな
く、そのままリパーゼを固定化した以外は同様な操作を
行った。
比較例3 実施例8において、担体をオレイン酸で処理することな
く、そのままリパーゼを固定化した以外は同様な操作を
行った。
比較例4 実施例9において、担体をオレイン酸で処理することな
く、そのままリパーゼを固定化した以外は同様な操作を
行った。
以上の実施例7〜実施例9、及び比較例2〜比較例4で
得られた固定化リパーゼを用いて実施例1と同様のエス
テル化反応を行った。結果は第7表にまとめて示した。
これらの結果からいくつかの他のリパーゼでも同様に活
性が発現した。
実施例10 実施例2で用いた脂肪酸誘導体にかえて市販の大豆レシ
チン(試薬、和光純薬製)、及びホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトー
ル、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン
酸をそれぞれ単独で用いた以外は実施例2と同様の固定
化操作を行った。このときリン脂質の分散剤としてブタ
ノールを各々10ml用いた。
次いで実施例2と同様のエステル交換反応を行い、結果
を第8表にまとめて示した。
第8表から明らかな様にリン脂質についても顕著な効果
が認められた。
試験例1 実施例1で得られた固定化酵素50gを125mlのジャケット
付カラムに充填し、そこに実施例2で用いたパーム中融
点部とステアリン酸を等量溶解したものをカラム内温度
70℃、180g/Hrの流量で連続通液しカラム出口での反応
率を調べた。1400時間後も出口の反応率は85%を維持し
ており、この間に固定化酵素1kgあたり約5000kgの油脂
を処理した。
この結果から本発明の方法による処理固定化酵素の耐久
性は極めて高いものであることが確かめられた。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】脂肪酸またはその誘導体を予め吸着処理し
    て得た不溶性担体と、脂質分解酵素とを水性媒体中で吸
    着固定化して得られる固定化酵素。
  2. 【請求項2】脂質分解酵素がリパーゼ、ホスホリパー
    ゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴミエリエ
    ーゼより選ばれたものである特許請求の範囲第1項記載
    の固定化酵素。
  3. 【請求項3】不溶性担体がマクロ多孔性担体である特許
    請求の範囲第1項又は第2項記載の固定化酵素。
  4. 【請求項4】脂肪酸またはその誘導体を予め吸着処理し
    て得た不溶性担体を、脂質分解酵素と水性媒体中で接触
    させて得られる固定化酵素の存在下、低級1価もしくは
    多価アルコールと高級脂肪酸とを反応させることを特徴
    とするエステル合成方法。
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