KR100585471B1 - 리소스핑고리피드의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
원하는 경우, 계면활성제 존재 하에 수성 상 및 분리 상을 형성하는 적어도 하나의 유기 용매를 포함하는 2상 계 액체 반응 혼합물 중에서 효소 반응을 수행함을 특징으로 하는, 스핑고리피드 중에서 스핑고이드 및 지방산 사이의 산 아마이드 결합을 특이적으로 가수분해하는 효소를 사용하여 리소스핑고리피드를 제조하는 방법.
Description
본 발명은 리소스핑고리피드(lysosphingolipid)의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 화장품, 의약, 스핑고 공학, 세포 공학 등에 유용한 리소스핑고리피드의 산업적으로 유용한 제조 방법 뿐만 아니라 상기 제조 방법에 의하여 수득한 리소스핑고리피드에 관한 것이다.
공통적인 구조로서 스핑고이드(sphingoid) 골격을 갖는 리피드(lipid), 예를 들어, 스핑고글리코리피드, 스핑고포스포리피드(스핑고포스포노리피드 포함) 및 세라마이드는 모두 스핑고리피드라 칭할 수 있다. 스핑고 골격의 아미노기는 산 아마이드 결합을 통하여, 불균일(heterogeneous)의 쇄 길이를 갖는 장쇄 지방산에 결합하여 세라마이드를 형성한다.
최근에, 스핑고리피드는 하등 동물 및 고등 동물을 포함하는 유기체에 널리 분포하며, 생물학적 활성, 예를 들어, 세포의 성장, 분화 유도 및 사멸에서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 세포 막 성분인 스핑고리피드는 화장품 또는 의약의 첨가제로서 사용되었다.
산 아마이드 결합을 통하여 스핑고리피드에서 스핑고이드(sphingoid)의 아미노기에 결합한 지방산이 없는 스핑고리피드의 N-데아실화 형태(리소-형태)는 리소 스핑고리피드라 칭한다. 리소스핑고리피드는 스핑고리피드의 생물학적 활성과 비교할 때 유사하면서 상이한 그것을 갖는다는 것이 밝혀졌다.
리소스핑고리피드는 스핑고이드에 유리 아미노기를 갖기 때문에, 이것은 재-아실화에 의하여 리소스핑고리피드 유도체(스핑고리피드 유도체 또는 스핑고리피드 유사체)를 합성하기 위한 출발 물질로서 유용하다. 예를 들어, 균일(homogeneous)의 지방산 조성물을 갖는 스핑고리피드, 출발 스핑고리피드의 지방산 쇄 길이와 상이한 지방산 쇄 길이를 갖는 스핑고리피드, 또는 기능성 지방산, 예를 들어, 도코사헥사에노산을 포함하는 신규 스핑고리피드를 합성할 수 있다. 대안으로, 발색단, 방사성동위원소 등으로 표지된 스핑고리피드를 수득할 수 있다. 또한, 리소스핑고리피드의 유리 아미노기를 이용하여 담체에 고정할 수 있다.
리소스핑고리피드의 통상적인 제조 방법은 화학적 방법, 효소를 사용하는 방법 및 미생물을 사용하는 방법을 포함한다.
스핑고글리코리피드로부터 리소스핑고리피드를 화학적으로 수득하기 위하여 하이드라진 분해(hydrazinolysis) 방법 및 알콜 용매 중에서의 알칼리 가수분해 방법이 공지되어 있다. 그러나, 시알 산을 포함하는 글리코스핑고리피드(강글리오사이드)를 사용하는 경우, 상기 방법에서 예를 들어, 시알 산 부분의 데아실화 반응이 동시에 진행된다. 또한, 아미노 당을 포함하는 스핑고글리코리피드가 사용되는 경우, N-아세틸기가 제거되고, 데-N-아세틸 리소글리코리피드가 생성된다. 천연적으로 생성되는 것과 동일한 당 쇄를 갖는 데아실화된 리소글리코스핑고리피드를 제조하기 위하여 매우 복잡한 방법이 요구된다. 하나의 예시적인 방법에서, 보호기 를 리피드 부분의 아미노기에 선택적으로 도입하고, 시알 산 부분을 재-아실화하고, 이후, 보호기를 이탈시킨다. 또다른 예시적인 방법에서, 리포솜(liposome)에의 혼입(incorporation) 후, 당 부분을 선택적으로 재-아실화한다. 또한, 이러한 방법에서 다양한 부산물이 생성된다. 상기한 바와 같이, 화학적 방법에 의하여 리소스핑고리피드를 제조하기 위하여 수많은 노력 및 기술적 숙련이 요구된다.
하나의 스핑고포스포리피드, 스핑고마이엘린의 리소-형태를 화학적으로 수득하기 위하여 알콜 용매 중에서 염산-가수분해를 사용하는 방법이 일반적으로 사용된다. 그러나, 상기 방법을 사용함에 의하여 다양한 부산물이 생성된다. 예를 들어, 천연적으로 생성되는 하나의 D-에리스로-타입(2S,3R)에 더하여 L-스레오-타입 (2S,3S)의 스핑고이드의 입체이성체가 형성된다. 결과적으로, 관심있는, 천연적으로 생성되는 D-에리스로-형태의 수율은 낮고, 반응 혼합물로부터 D-에리스로-형태를 정제하는 것은 매우 어렵다.
다른 한편으로, 스핑고리피드로부터 리소-형태를 생성하는 효소가 사용되는 방법이 현재까지 알려져 있다. 다음의 방법이 알려져 있다: 노카르디아 (Nocardia)속의 방선균(Actinomycete)으로 제조한 강글리오사이드 세라마이다제를 사용하는 방법[Journal of Biochemistry, 103:1-4(1988); JP-A 64-60379]; 로도코커스(Rhodococcus) 속의 방선균으로 제조한 효소 또는 세포의 처리물을 사용하는 방법[JP-A 6-78782]; 수도모나스(Pseudomonas) 속의 박테리아로 제조한 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제를 사용하는 방법[Journal of Biological Chemistry, 270:24370-24374(1995); JP-A 8-84587]; 비-발효성 그람-음성 바실러스(bacillus) AI-2 로 제조한 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제를 사용하는 방법[JP-A 10-257884]; 및 수도모나스 속의 박테리아로 제조한 세라마이다제를 사용하는 방법[JP-A 10-14563].
그러나, 이러한 효소를 사용하는 방법에서 리소-형태의 반응 수율은 만족스럽지 않다. 예를 들어, 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제를 사용하는 경우, 비록 수율이 사용되는 기질에 따라 다양하지만, (가수분해에 가장 민감한 기질인) 강글리오사이드 GM2 로부터의 수율은 기껏해야 약 70%인 반면, 강글리오사이드 GM1 으로부터의 수율은 기껏해야 60%이다.
다음의 미생물 또는 이로부터의 추출물을 사용하는 리소스핑고리피드의 제조 방법이 공지되어 있다: 글리코스핑고리피드 세라마이드 데아실라제를 생산할 수 있는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속의 방선균[Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 59:2028-2032(1995); JP-A 7-107988]; 및 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제를 생산하는 수도모나스 속 또는 셰와넬라(Shewanella) 속의 박테리아[JP-A 10-45792].
그러나, 반응은 기질을 배지에 가하는 과정 중에 관심있는 리소-형태에 더하여 많은 양의 불순물, 예를 들어, 배지 또는 세포로부터 유래된 색소, 글리코리피드 등을 포함한다. 따라서, 상기 방법에서 리소-형태를 고순도로 수득하기 위하여 복잡한 정제 공정이 필요하다. 또한, 상기한 이유로, 공정 중에 리소-형태를 정제하기 위한 소량의 스핑고리피드를 다루기가 매우 어렵다.
효소, 또는 미생물 또는 그의 추출물을 사용하여 리소스핑고리피드를 제조하 기 위한 모든 종래 방법에서, 반응은 오직 수성 계에서만 수행한다. 수성 상 및 수성 상과 혼화할 수 없는 분리 상을 형성하는 유기 용매 상으로 구성된 2상 계를 사용하는 방법은 전혀 알려져 있지 않다.
발명의 목적
상기한 바와 같이, 화학적으로, 효소적으로 또는 미생물을 사용하여 리소스핑고리피드를 제조하는 종래의 방법은 불충분하고, 목적하지 않은 부산물을 생성하며, 낮은 반응 수율을 야기하고, 정제를 위한 많은 양의 노동 및 기술적 숙련을 요구한다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 부산물의 생성없이 리소스핑고리피드를 효과적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 방법으로 수득한 리소스핑고리피드를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 목적 및 기타 목적 및 잇점은 첨부한 도면과 관련한 하기 기술로부터 명백하다.
도 1 은 유기 용매 존재 하에 리소-형태의 수득을 위한 최적 pH 를 나타낸다.
도 2 는 유기 용매의 존재 또는 부재 하에 리소-형태의 수득에 영향을 주는 기질 특이성을 나타낸다.
도 3 은 계면활성제 및 유기 용매의 존재 또는 부재 하에 리소-형태 수득의 시간 경로를 나타낸다.
도 4 는 유기 용매의 존재 하에 다양한 양의 효소를 사용하는 리소-형태의 수율을 나타낸다.
도 5 는 첨가된 유기 용매의 양과 리소-형태의 수율 간의 관계를 나타낸다.
발명의 요약
본 발명자들은 대량의 리소스핑고리피드를 고순도로 제조하는, 산업적으로 유리한 방법을 연구하고, 부산물의 생성없이 우수한 반응 수율 및 고순도로 리소스핑고리피드를 제조할 수 있음을 밝혀내었다. 이것은 스핑고리피드 중에서 스핑고이드 및 지방산 사이의 산 아마이드 결합을 특이적으로 가수분해하는 효소를 사용하여 리소스핑고리피드를 제조하기 위해서, 물과 혼화할 수 없는 유기 용매를 포함하는 2상 계 반응 혼합물 중에서 효소 반응을 수행하여 이룰 수 있다. 또한, 본 발명자들은 사용되는 물과 혼화할 수 없는 유기 용매를 집중적으로 연구하였고, 놀랍게도 리소스핑고리피드의 수율은 사용되는 지방-용해성 유기 용매에 따라 매우 다양함을 밝혀내었다. 또한, 본 발명자들은 하나 이상의 계면활성제를 2상 계 반응 혼합물에 가하여 리소스핑고리피드를 더욱 효과적으로 제조할 수 있음을 밝혀내었다. 이렇게 본 발명은 완성되었다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다:
1. 스핑고리피드 중에서 스핑고이드 및 지방산 사이의 산 아마이드 결합을 특이적으로 가수분해하는 효소를 사용하여, 물과 혼화할 수 없는 적어도 하나의 유기 용매를 포함하는 2상 계 반응 혼합물 중에서 효소 반응을 수행하는, 리소스핑고리피드를 제조하는 방법;
2. 상기 (1) 에 있어서, 적어도 하나의 계면활성제 존재 하에 효소 반응을 수행하는 리소스핑고리피드 제조 방법;
3. 상기 (1) 또는 (2) 에 있어서, 유기 용매가 탄화수소, 알콜, 에스테르 및 에테르로 구성된 군으로부터 선택되는 리소스핑고리피드 제조 방법;
4. 상기 (3) 에 있어서, 탄화수소가 탄소수 6 이상의 탄화수소인 리소스핑고리피드 제조 방법;
5. 상기 (3) 에 있어서, 알콜이 탄소수 8 이상의 탄화수소인 리소스핑고리피드 제조 방법;
6. 상기 (3) 에 있어서, 에스테르가 탄소수 6 이상의 카복실 산 및 탄소수 2 이상의 알콜로 구성되는 리소스핑고리피드 제조 방법;
7. 상기 (3) 에 있어서, 에테르가 페닐 에테르, 에틸렌 글리콜 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르 및 비닐 에틸 에테르로 구성된 군으로부터 선택되는 리소스핑고리피드 제조 방법;
8. 상기 (2) 에 있어서, 계면활성제가 스테로이드 골격을 갖는 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 알킬 에테르 및 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르로 구성된 군으로부터 선택되는 리소스핑고리피드 제조 방 법; 및
9. 상기 (1) 내지 (8) 중의 어느 하나에 따른 방법에 의하여 수득한 리소스핑고리피드.
본 명세서에서, "TM" 은 상표를 나타낸다.
본 발명에서 기질로 사용된 스핑고리피드는 장쇄 염기, 스핑고이드, 예를 들어, 스핑고글리코리피드, 스핑고포스포리피드 및 세라마이드를 갖는 천연물질 또는 합성물질을 단독으로 또는 이들의 혼합물로 포함한다.
리소스핑고리피드는 여기의 산 아마이드 결합을 통하여 스핑고이드의 아미노기에 결합한 지방산이 없는 스핑고리피드의 N-데아실화 형태를 의미한다.
스핑고리피드 중의 스핑고이드 및 지방산 사이의 산 아마이드 결합을 특이적으로 가수분해하는, 본 발명에서 사용되는 효소에 관한 제한은 없다. 효소는 스핑고리피드로부터 유래하는 지방산을 유리시키는 공지된 효소일 수 있고, 예를 들어, 다음을 포함한다: 노카르디아 속의 방선균으로 제조한 강글리오사이드 세라마이다제[Journal of Biochemistry, 103:1-4(1988); JP-A 64-60379]; 로도코커스 속의 방선균으로 제조한 효소[JP-A 6-78782]; 스트렙토마이세스 속의 방선균으로 제조한 글리코스핑고리피드 세라마이드 데아실라제[Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 59:2028-2032 (1995); JP-A 7-107988]; 수도모나스 속의 박테리아로 제조한 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제[Journal of Biological Chemistry, 270:24370-24374(1995); JP-A 8-84587]; 셰와넬라 속의 박테리아로 제조한 스핑고 리피드 세라마이드 N-데아실라제[JP-A 10-45792]; 수도모나스 속의 박테리아로 제조한 세라마이다제[JP-A 10-14563]; 포유류 조직으로부터 유래하는 세라마이다제[Journal of Biological Chemistry, 241:3731-3737 (1966); Biochemistry, 8:1692-1698; Biochimica et Biophysica Acta, 176:339-347(1969); Science, 178:1100-1102 (1972)]; 무척추동물의 세라마이다제[WO 98/03529].
이들 가운데, 수도모나스 속의 박테리아로 제조한 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제 및 셰와넬라 속의 박테리아로부터 제조한 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제가 폭넓은 기질 특이성을 갖고, 다양한 리소스핑고리피드의 제조에 특히 바람직하다.
스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제를 생산하는 수도모나스 속의 박테리아 균주, 수도모나스(Pseudomonas) sp. TK-4 는 G-182로 확인되었고, 부다페스트 조약 하에 수탁번호 FERM BP-5096 하에 1994년 6월 24일(원기탁일) 기탁되었다. 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제를 생산하는 셰와넬라 속의 박테리아 균주, 세와넬라 알가(alga) NS-589 는 수탁번호 FERM P-15700 하에 1996년 6월 26일 기탁되었다. 두 균주는 일본 이바라키-켄 츠쿠바-시 히가시 1-초메 1-3 에 소재하는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되었다.
이들 효소는 효소 용액에서 또는 수-불용성 담체에 고정화되어 사용될 수 있다.
본 발명의 수성 상으로 물 또는 수용액이 사용된다. 구체적으로, 다양한 반응을 위해서 효소 및 기질 등을 가한 완충액이 바람직하다.
분리 상은 물과 혼화할 수 없는 유기 용매 상이다. 유기 용매는 유기 용매 상 및 수성 상 사이에서 유기 용매 중의 (스핑고리피드의 분해물인) 지방산의 분배 비율이 수성 상보다 높고, 유기 상에서 기질로서 스핑고리피드의 분배 비율이 수성 상보다 낮은 탄화수소, 알콜, 에스테르, 에테르 및 케톤으로 구성된 군으로부터 선택된다.
유기 용매는 탄화수소, 예컨대, 지방족 탄화수소, 예를 들어, 헥산, 헵탄, 옥탄, 이소옥탄, 노난, 데칸, 도데칸, 펜타데칸, 헵타데칸, 옥타데칸, 2-메틸펜탄, 2,2-디메틸부탄, 2,2,3-트리메틸헵탄, 2,2,4-트리메틸헵탄, 헥센, 옥텐, 데센(decene), 도데센(dodecene), 펜타데센 및 헵타데센, 지방족 사이클릭 탄화수소, 예를 들어, 사이클로헥산, 메틸사이클로헥산, 사이클로데칸, 사이클로헥센 및 사이클로데센, 할로겐-함유 탄화수소, 예를 들어, 디클로로에탄, 테트라클로로에탄, 트리클로로에틸렌, 사염화탄소, 옥틸 클로라이드, 데실 클로라이드, 클로로벤젠 및 디클로로벤젠 뿐만 아니라, 방향족 탄화수소, 예를 들어, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 메시틸렌, 에틸벤진, 부틸벤젠, 큐멘 및 시멘(cymene)을 포함하는 탄화수소를 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
알콜은 옥탄올, 데칸올, 도데칸올, 옥텐-올, 데센-올, 사이클로데칸올을 포함한다.
에스테르는 에틸 헥사노에이트, 에틸 옥타노에이트, 에틸 데카노에이트, 에틸 도데카노에이트, 이소프로필 미스티레이트, 부틸 스테아레이트, 부틸 시트레이트 및 에틸 시트레이트를 포함한다.
에테르는 페닐 에테르, 비닐 에틸 에테르, 에틸렌 글리콜 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르 및 옥틸 에테르를 포함한다.
케톤은 옥탄온, 데칸온 및 도데칸온을 포함한다.
상기 유기 용매 중에서, 탄소수 6 이상의 탄화수소(지방족, 사이클릭, 방향족 및 할로겐-함유 탄화수소 포함), 탄소수 8 이상의 알콜, 탄소수 6 이상의 카복실 산 및 탄소수 2 이상의 알콜로 구성된 에스테르 뿐만 아니라, 페닐 에테르, 에틸렌 글리콜 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르 및 비닐 에틸 에테르로 구성된 군으로부터 선택되는 에테르가 특히 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용될 유기 용매의 수는 하나로 제한되지 않는다. 2 이상의 유기 용매가 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 2-상 계는 수성 상 및 유기 용매 상이, 예를 들어, 교반하여 수성 상이 유기 용매 상 중에 분산된 상태 또는 유기 용매 상이 수성 상에 분산된 상태, 또는 예를 들어, 분산 없이 정치시켜 수성 상 및 유기 용매 상이 서로 접촉하는 2 상으로 분리된 상태인 것을 포함한다.
대안으로, 유기 용매 상 및/또는 수성 상은 경우에 따라 효소 반응이 계속되는 동안 교환될 수 있으며, 이는 리소스핑고리피드의 연속적인 생산을 가능하게 한다. 첨가될 유기 용매의 양은 제한이 없지만, 바람직하게는 수성 상 부피의 50% 이상, 보통 5-10배 일 수 있다.
다양한 염 및 계면활성제가 수성 상에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 스테로 이드 골격을 갖는 계면활성제, 예를 들어, 소듐 타우로데옥시콜레이트 및 소듐 콜레이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 예를 들어, 트리톤-타입 계면활성제 및 노니데트(Nonidet) P-40TM, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 알킬 에테르, 예를 들어, 트윈(Tween)-타입 계면활성제, 및 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 계면활성제가 첨가될 수 있다. 바람직하게는 계면활성제의 양은 제한이 없지만, 보통 반응계의 총 부피에 대하여 0.1-2 중량%이다.
반응 조건에 관한 제한은 없다. 사용되는 각각의 효소에 대한, pH 및 온도를 포함하는 최적의 조건 하에 반응시켜 리소스핑고리피드를 더욱 효과적으로 제조할 수 있다.
예를 들어, 수도모나스 속의 박테리아로 제조한 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제가 반응에 사용되는 경우, 스테로이드 골격을 갖는 계면활성제, 예를 들어, 소듐 타우로데옥시콜레이트 또는 소듐 콜레이트를 가하여 pH 6-10에서 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 예를 들어, 트리톤(Triton) X-100TM 또는 노니데트 P-40TM 을 배합하여 사용하여 스핑고리피드를 더욱 효과적으로 가수분해할 수 있다.
반응 시간에 관한 제한은 없다. 사용될 기질, 예를 들어, 천연 또는 합성 스핑고리피드, 예컨대, 글리코스핑고리피드, 스핑고포스포리피드 및 세라마이드로부터의 효소를 사용하여 목적하는 양의 리소스핑고리피드를 수득하는데 필요한 시 간 동안 반응을 수행할 수 있다.
본 발명에 의하여 제조한 리소스핑고리피드는 통상적인 방법에 따라 정제할 수 있다.
정치(settlement) 후 2 상으로 분리하거나 선택적 막 또는 컬럼을 사용하여 유기 용매를 반응 혼합물로부터 제거할 수 있다. 대안으로, 감압 하에 농축시키거나 증류하여 용매를 제거할 수 있다.
수성 상 중에 리소-형태를 포함하는, 상기 수득한 반응 혼합물은 보다 적은 오염물질(contaminant)을 포함한다. 따라서, 통상의 추출 방법, 예를 들어, 역상 크로마토그래피, 실리카겔과의 순상(normal phase) 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 리소스핑고리피드를 용이하게 정제할 수 있다.
또한, 상기 제거 단계에서 분리된 유기 상으로부터 유기 용매를 증발시켜 스핑고리피드로부터 유래하는 지방산을 수득할 수 있다.
박층 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 질량 분석기, 핵자기 공명 장치 등으로 분석하여 정제된 리소스핑고리피드의 구조를 확인할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 스핑고리피드를 관심있는 리소스핑고리피드로 전환시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 의하여 수득한 리소스핑고리피드를 처리하여 리소스핑고리피드 유도체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 리소스핑고리피드 유도체를 다음과 같이 제조할 수 있다.
아미노 기의 산 아미드화를 위한 통상의 화학적 또는 효소적 방법에 따라 재-아실화를 수행할 수 있다.
화학적 재-아실화에서, 표지된 또는 표지되지 않은 지방족 카복실 산 또는 그의 반응성 유도체를 사용하여 반응을 수행할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 지방족 카복실 산의 예는 포화 지방산, 불포화 지방산, 뿐만 아니라 지방족의 특성을 갖는 모든 카복실 산, 예를 들어 지방산의 탄화수소 쇄가 할로겐 또는 기능성 기, 예들 들어, 치환 또는 비치환된 아미노기, 옥소기, 또는 하이드록실기로 치환된 산, 또는 탄화수소 쇄 중에 산소, 황 또는 아미노기를 갖는 산을 포함한다.
공지된 리파제를 사용하여 효소적 재-아실화할 수 있다. 특히 유용한 방법 중에서, 스핑고리피드에서 스핑고이드 및 지방산 사이의 산 아마이드 결합을 특이적으로 가수분해하는 효소, 예를 들어, 상기 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제(WO 98/03529)의 역반응을 이용하여 재-아실화를 용이하게 수행할 수 있다.
발색단을 형성하는 기질, 형광 기질, 바이오틴, 방사성동위원소 등을 표지할 부분에 도입하여, 생성된 리소스핑고리피드 중의 스핑고이드의 아미노기를 표지할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 더욱 상세히 나타내지만, 그 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
다양한 유기 용매의 첨가에 의한 리소스핑고리피드의 제조
수도모나스 속의 박테리아, 수도모나스 sp. TK-4 (FERM BP-5069)로부터 유래한 2mU 의 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제[SCDase; Journal of Biological Chemistry, 270: 24370-24374 (1995); JP-A 8-84587], 0.8% 소듐 타우로데옥시콜레이트(nacalai tesque) 및 10nmol GM1(Matreya)를 포함하는 10㎕의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 다양한 유기 용매 100㎕ 분량 각각을 가하였다. 혼합물을 37℃에서 16시간 인큐베이션하였다. 대조군으로서 유기 용매가 없는 혼합물을 유사하게 인큐베이션하였다.
박층 크로마토그래피를 사용하여, 생성된 반응 혼합물을 전개하였다. 오시놀(orcinol)-황산을 사용하여 TCL 플레이트를 발색시켰다. 이후, 영상화 농도계(Bio-Rad)를 사용하여 GM1의 리소-형태의 수율을 정량하였다.
하기 표 1에 나타낸 유기 용매 중에, 사이클로데칸은 Aldrich에서 제조한 것이고, 다른 모든 것은 nacalai tesque에서 제조한 것이다.
[표 1]
용매 리소-형태의 수율(%)
대조군 68
1-부탄올 44
1-펜탄올 51
1-헥산올 53
1-헵탄올 62
1-옥탄올 70
2-옥탄올 90
1-데칸올 83
1-도데칸올 100
헥산 76
옥탄 89
데칸 95
펜타데칸 97
헵타데칸 97
옥타데칸 97
1-헥센 80
1-옥텐 91
1-데센 94
1-도데센 93
사이클로헥산 87
메틸사이클로헥산 93
사이클로데칸 89
벤젠 70
톨루엔 84
크실렌 95
메시틸렌 97
n-에틸벤젠 97
n-부틸벤젠 99
p-시멘 98
큐멘 96
n-옥틸 클로라이드 99
n-데실 클로라이드 100
클로로포름 62
사염화탄소 73
에틸 아세테이트 58
부틸 아세테이트 68
헥실 아세테이트 60
페닐 아세테이트 55
벤질 아세테이트 67
메틸 헥사노에이트 47
메틸 옥타노에이트 61
메틸 데카노에이트 62
메틸 도데카노에이트 68
에틸 프로피오네이트 58
에틸 부티레이트 54
에틸 헥사노에이트 73
에틸 옥타노에이트 73
에틸 데카노에이트 75
에틸 도데카노에이트 74
이소프로필 미리스테이트 91
n-부틸 스테아레이트 84
페닐 에테르 97
에틸 에테르 41
프로필 에테르 54
부틸 에테르 64
비닐 에틸 에테르 73
비닐 부틸 에테르 61
에틸렌 글리콜 디에틸 에테르 71
디이소프로필 에테르 91
실시예 2
계면활성제 시험
수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 2mU 의 SCDase[Journal of Biological Chemistry, 270: 24370-24374 (1995); JP-A 8-84587], 각종 계면활성제 중 하나 및 10nmol GM1(Matreya)를 포함하는 10㎕의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 n-데칸 (nacalai tesque) 100㎕ 분량을 가하였다. 혼합물을 37℃에서 16시 간 인큐베이션하였다.
박층 크로마토그래피를 사용하여, 생성된 반응 혼합물을 전개하였다. 오시놀(orcinol)-황산을 사용하여 TCL 플레이트를 발색시켰다. 이후, 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 영상화 농도계(Bio-Rad)를 사용하여 GM1 의 리소-형태의 수율을 정량하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.
계면활성제의 최종 농도는 반응계의 부피에 대하여 0.8 중량%이었다. 하기 표 2에 나타낸 계면활성제 중에, 트리톤 X-100TM 은 Pierce에서 제조한 것이고, 다른 모든 것은 nacalai tesque에서 제조한 것이다.
[표 2]
계면활성제 리소-형태의 수율(%)
무첨가 25
소듐 타우로데옥시콜레이트 99
소듐 콜레이트 92
트리톤 X-100TM 64
트윈 20TM 42
노니데트 P-40TM 60
Brij-58TM 66
루브롤 PXTM 72
실시예 3
소듐 타우로데옥시콜레이트의 농도 시험
수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 2mU 의 SCDase[Journal of Biological Chemistry, 270: 24370-24374 (1995); JP-A 8-84587], 다양한 농도의 소듐 타우로데옥시콜레이트(nacalai tesque) 및 10nmol GM1(Matreya)를 포함하는 10㎕의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 n-헵타데칸 (nacalai tesque) 100㎕ 분량을 가하였다. 혼합물을 37℃에서 16시간 인큐베이션하였다.
박층 크로마토그래피를 사용하여, 생성된 반응 혼합물을 전개하였다. 오시놀(orcinol)-황산을 사용하여 TCL 플레이트를 발색시켰다. 이후, 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 영상화 농도계(Bio-Rad)를 사용하여 GM1 의 리소-형태의 수율을 정량하였다. 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3에서 계면활성제의 농도는 반응계의 부피에 대한 중량% 로서 나타낸 최종 농도이다.
[표 3]
농도 리소-형태의 수율(%)
0 25
0.05 55
0.01 65
0.2 80
0.4 88
0.8 92
1.0 92
실시예 4
최적 pH의 시험
수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 2mU 의 SCDase[Journal of Biological Chemistry, 270: 24370-24374 (1995); JP-A 8-84587], 0.8% 소듐 타우로데옥시콜레이트(nacalai tesque) 및 10nmol GM1(Matreya)를 포함하는 10㎕의 각종 50mM 완충액 중 하나에 n-데칸 (nacalai tesque) 100㎕ 분량을 가하였다. 혼합물을 37℃에서 16시간 인큐베이션하였다. 다음의 완충액을 사용하였다: pH 3-6의 아세테이트 완충액; pH 6-8 의 인산 완충액; pH 8-9 의 Tris-HCl 완충액; pH 9-10 의 글리신-NaOH 완충액.
박층 크로마토그래피를 사용하여, 생성된 반응 혼합물을 전개하였다. 오시놀-황산을 사용하여 TCL 플레이트를 발색시켰다. 이후, 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 영상화 농도계(Bio-Rad)를 사용하여 GM1 의 분해율, 즉, 리소-형태의 수율을 정량하였다. 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1 은 유기 용매 존재 하에 리소-형태의 수득을 위한 최적 pH 를 나타낸다. 도면에서, 세로축 및 가로축은 각각 분해율(%) 및 pH를 나타낸다. 흰 원, 검은 원, 흰 삼각형 및 검은 사각형은 각각 아세테이트 완충액, 인산 완충액, Tris- HCl 완충액 및 글리신-NaOH 완충액을 사용하여 수득한 결과를 나타낸다.
실시예 5
유기 용매 존재 하의 기질 특이성
수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 2mU 의 SCDase[Journal of Biological Chemistry, 270: 24370-24374 (1995); JP-A 8-84587], 0.8% 소듐 타우로데옥시콜레이트(nacalai tesque) 및 10nmol 의 각종 기질 중 하나를 포함하는 10㎕의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 n-헵타데칸 (nacalai tesque) 100㎕ 분량을 가하였다. 혼합물을 37℃에서 16시간 인큐베이션하였다. n-헵타데칸이 없는 반응 혼합물을 대조군으로 제조하였다. 다음의 기질을 사용하였다: 세라마이드(Cer); 갈락토실세라마이드(GalCer); 설파타이드; GM1; 아시알로 GM1; GD1a; 스핑고마이엘린(모두 Matreya 제조).
박층 크로마토그래피 상에서 전개하고, 닌히드린 시약을 사용하여, 생성된 스핑고신을 발색시켜, 생성된 반응 혼합물 중에서 세라마이드로부터의 리소-형태의 수율을 정량하였다. 쿠마시 브릴런트 블루를 사용하여, 생성된 리소스핑고마이엘린을 발색시켜 스핑고마이엘린의 수율을 정량하였다. 박층 크로마토그래피를 사용하여 다른 기질을 포함하는 반응 혼합물을 전개하였다. 오시놀-황산을 사용하여 TCL 플레이트를 발색시켰다. 이후, 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 영상화 농도계(Bio-Rad)를 사용하여 각각의 기질로부터의 리소-형태의 수율을 정량하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2 는 유기 용매의 존재 또는 부재 하에 리소-형태의 수득에 영향을 주는 기질 특이성을 나타낸다. 도면에서, 세로축 및 가로축은 수율(%) 및 각종 기질을 나타낸다. 검은 막대는 n-헵타데칸의 존재 하에 분해율을 나타내고, 흰 막대는 n-헵타데칸 부재 하에 분해율을 나타낸다.
실시예 6
소듐 타우로데옥시콜레이트, 트리톤 X-100TM 및 유기 용매의 존재 또는 부재 하에 리소-형태의 수율의 시간 경로
0, 0.5, 1, 2, 6 또는 16 시간 동안 하기한 반응 조건 (A)-(D) 하에 37℃에서 반응시킨 후, 수율을 정량하였다. 박층 크로마토그래피를 사용하여, 생성된 반응 혼합물을 전개하였다. 오시놀-황산을 사용하여 TCL 플레이트를 발색시켰다. 이후, 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 영상화 농도계(Bio-Rad)를 사용하여 GM1 의 분해율, 즉, 리소-형태의 수율을 정량하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3 은 계면활성제 및 유기 용매의 존재 또는 부재 하에 GM1 의 분해율의 시간 경로를 나타낸다. 도면에서, 세로축 및 가로축은 각각 분해율(%) 및 시간(hr)을 나타낸다. 기호는 다음의 존재 하에 수득한 결과를 나타낸다: 소듐 타우로데옥시콜레이트 및 n-데칸(검은 원); 소듐 타우로데옥시콜레이트(흰 원); 트리톤 X-100TM 및 n-데칸(검은 사각형); 또는 트리톤 X-100TM(흰 삼각형).
반응 조건 (A) : 수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 2mU 의 SCDase[Journal of Biological Chemistry, 270: 24370-24374 (1995); JP-A 8-84587], 0.8% 소듐 타우로데옥시콜레이트(nacalai tesque) 및 10nmol 의 GM1 (Matreya)을 포함하는 10㎕의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 n-데칸 (nacalai tesque) 100㎕ 분량을 가하고, 인큐베이션하였다.
반응 조건 (B) : 수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 2mU 의 SCDase, 0.8% 소듐 타우로데옥시콜레이트 및 100nmol 의 GM1을 포함하는 10㎕ 분량의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)을 인큐베이션하였다.
반응 조건 (C) : 수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 2mU 의 SCDase, 0.8% 트리톤 X-100TM (Pierce) 및 10nmol 의 GM1을 포함하는 10㎕의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 n-데칸 100㎕ 분량을 가하고, 인큐베이션하였다.
반응 조건 (D) : 수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 2mU 의 SCDase, 0.8% 트리톤 X-100TM 및 10nmol 의 GM1을 포함하는 10㎕ 분량의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)을 인큐베이션하였다.
실시예 7
소듐 타우로데옥시콜레이트, 트리톤 X-100TM 및 유기 용매 존재 하에 리소-형태의 수율 시험
수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 0.5mU 의 SCDase[Journal of Biological Chemistry, 270: 24370-24374 (1995); JP-A 8-84587], 0.8% 소듐 타우 로데옥시콜레이트(nacalai tesque), 0, 0.1, 0.4 또는 0.8% 트리톤 X-100TM (Pierce) 및 10nmol GM1(Matreya)를 포함하는 10㎕의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 n-헵타데칸 (nacalai tesque) 100㎕ 분량을 가하고, 37℃에서 16시간 인큐베이션하였다.
박층 크로마토그래피를 사용하여, 생성된 반응 혼합물을 전개하였다. 오시놀-황산을 사용하여 TCL 플레이트를 발색시켰다. 이후, 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 영상화 농도계(Bio-Rad)를 사용하여 GM1 의 분해율, 즉, 리소-형태의 수율을 정량하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4 는 소듐 타우로데옥시콜레이트, 다양한 농도의 트리톤 X-100TM 및 유기 용매의 존재 하에 다양한 양의 효소를 사용하는 GM1 의 분해율을 나타낸다. 도면에서, 세로축 및 가로축은 각각 분해율(%) 및 트리톤 X-100TM 의 농도(%)를 나타낸다.
실시예 8
유기 용매 양의 시험
수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 2mU 의 SCDase[Journal of Biological Chemistry, 270: 24370-24374 (1995); JP-A 8-84587], 0.8% 소듐 타우로데옥시콜레이트(nacalai tesque), 0.1% 트리톤 X-100TM (Pierce) 및 10nmol GM1(Matreya)를 포함하는 10㎕의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 다양한 양의 n-데칸(nacalai tesque) 또는 n-헵타데칸(nacalai tesque)을 가하였다. 혼합물을 37℃에서 16시간 인큐베이션하였다.
박층 크로마토그래피를 사용하여, 생성된 반응 혼합물을 전개하였다. 오시놀-황산을 사용하여 TCL 플레이트를 발색시켰다. 이후, 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 영상화 농도계(Bio-Rad)를 사용하여 GM1 의 분해율, 즉, 리소-형태의 수율을 정량하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5 는 유기 용매의 양과 리소-형태의 수율 사이의 관계를 나타낸다. 도면에서, 세로축 및 가로축은 분해율(%) 및 유기 용매의 양(㎕)을 나타낸다. 흰 막대는 n-데칸의 결과를 나타내고, 검은 막대는 n-헵타데칸의 결과를 나타낸다.
실시예 9
저농도의 효소를 사용하는 각종 계면활성제의 시험
수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 0.5mU 의 SCDase[Journal of Biological Chemistry, 270: 24370-24374 (1995); JP-A 8-84587], 각종 계면활성제 중 하나 및 10nmol GM1(Matreya)를 포함하는 10㎕의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 100㎕ 분량의 n-헵타데칸(nacalai tesque)을 가하였다. 혼합물을 37℃에서 16시간 인큐베이션하였다.
박층 크로마토그래피를 사용하여, 생성된 반응 혼합물을 전개하였다. 오시놀-황산을 사용하여 TCL 플레이트를 발색시켰다. 이후, 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 영상화 농도계(Bio-Rad)를 사용하여 GM1 의 리소-형태의 수율을 정량하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.
계면활성제의 최종 농도는 반응계의 부피에 대하여 0.1중량%이었다. 하기 표 4에 나타낸 계면활성제 중에, 트리톤 X-100TM 은 Pierce에서 제조한 것이고, 다른 모든 것은 nacalai tesque에서 제조한 것이다.
[표 4]
계면활성제 리소-형태의 수율(%)
트리톤 X-100TM 39
트윈 20TM 51
트윈 80TM 69
노니데트 P-40TM 64
Brij-58TM 65
루브롤 PXTM 67
실시예 10
소듐 타우로데옥시콜레이트 및 다양한 계면활성제를 포함하는 혼합물을 사용하는 리소-형태의 수율 시험
수도모나스 속의 박테리아로부터 유래한 0.5mU 의 SCDase[Journal of Biological Chemistry, 270: 24370-24374 (1995); JP-A 8-84587], 0.8% 소듐 타우로데옥시콜레이트, 각종 게면활성제 중 하나 및 10nmol GM1(Matreya)를 포함하는 10㎕의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 100㎕ 분량의 n-헵타데칸(nacalai tesque)을 가하였다. 혼합물을 37℃에서 16시간 인큐베이션하였다. 소듐 타우로데옥시콜레이트만을 포함하는 혼합물을 대조군으로 반응시켰다.
박층 크로마토그래피를 사용하여, 생성된 반응 혼합물을 전개하였다. 오시놀-황산을 사용하여 TCL 플레이트를 발색시켰다. 이후, 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 영상화 농도계(Bio-Rad)를 사용하여 GM1 의 리소-형태의 수율을 정량하였다. 결과를 표 5에 나타내었다.
혼합물 중의 계면활성제의 최종 농도는 반응계의 부피에 대하여 0.1중량%이었다. 하기 표 5에 나타낸 계면활성제 중에, 트리톤 X-100TM 은 Pierce에서 제조한 것이고, 다른 모든 것은 nacalai tesque에서 제조한 것이다.
[표 5]
혼합물 중의 계면활성제 리소-형태의 수율(%)
......................................................
대조군 53
트리톤 X-100TM 70
노니데트 P-40TM 68
트윈 20TM 48
트윈 80TM 50
Brij-58TM 53
루브롤 PXTM 57
실시예 11
리소강글리오사이드 GM3 의 제조
0.8% 소듐 타우로데옥시콜레이트를 포함하는 10㎖ 의 50mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 10mg의 강글리오사이드 GM3(Matreya)를 용해시켰다. 혼합물을 200㎖ 의 배(pear)-형 플라스크에 넣고, 2U의 SCDase를 가하였다. 100㎖ 분량의 n-데칸을 그 위에 놓고, 혼합물을 37℃에서 16시간 방치하였다. 1U의 SCDase를 수성 상에 가하고, 혼합물을 37℃에서 추가로 16시간 인큐베이션하였다. 이 때, 강글리오사이드 GM3 의 분해율은 95% 이었다.
반응이 완료된 후, 수성 상을 회수하고, 2등분하고, 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 수성 상을 POROS R2H 컬럼(ψ 4.6×100mm, PerSeptive)에 가하고, 아세토니트릴:물=10:90 내지 아세토니트릴:메탄올=10:90 으로부터 구배 용출시켰다. 리소강글리오사이드 GM3를 포함하는 용출 분획을 모으고, 농축 건조시켰다. 그 결과, 오시놀-황산 및 중크롬산-황산 혼합물로 발색된 박층 크로마토그 래피에 의하여 나타나는 바와 같이, 5.6mg의 순도 95% 이상의 리소-형태를 수득하였다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 제조 방법에 의하여 대량의 리소스핑고리피드를 효과적이고, 용이하게 고순도로 산업적으로 제조할 수 있다.
Claims (9)
- 스핑고리피드 세라마이드 N-데아실라제를 사용하여, 물과 혼화할 수 없는 적어도 하나의 유기용매를 포함하는 2상 계 반응 혼합물 중에서 효소 반응을 수행하되,상기에서, 수성상과 유기용매상은 서로 접촉하고 있는 2상으로 분리되어 있으며, 상기 유기용매는 옥탄, 데칸, 펜타데칸, 헵타데칸, 옥타데칸, 1-헥센, 1-옥텐, 1-데센, 1-도데센, 사이클로헥산, 메틸사이클로헥산, 사이클로데칸, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 메시틸렌, n-에틸벤젠, n-부틸벤젠, p-시멘, 큐멘, n-옥틸 클로라이드, n-데실 클로라이드, 1-옥탄올, 2-옥탄올, 1-데칸올, 1-도데칸올, 에틸 헥사노에이트, 에틸 옥타노에이트, 에틸 데카노에이트, 에틸 도데카노에이트, 이소프로필 미리스테이트, n-부틸 스테아레이트, 페닐 에테르, 비닐 에틸 에테르, 에틸렌 글리콜 디에틸 에테르 및 디이소프로필 에테르로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리소스핑고리피드의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 계면활성제 존재 하에 효소 반응을 수행하는 리소스핑고리피드의 제조 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 2 항에 있어서, 계면활성제가 스테로이드 골격을 갖는 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 알킬 에테르 및 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르로 구성된 군으로부터 선택되는 리소스핑고리피드의 제조 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법에 의하여 수득한 리소스핑고리피드.
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