WO1999050433A1 - Methode de production de lysosphingolipides - Google Patents

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WO1999050433A1
WO1999050433A1 PCT/JP1999/001610 JP9901610W WO9950433A1 WO 1999050433 A1 WO1999050433 A1 WO 1999050433A1 JP 9901610 W JP9901610 W JP 9901610W WO 9950433 A1 WO9950433 A1 WO 9950433A1
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WO
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producing
ether
lysosphingolipid
organic solvent
reaction
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PCT/JP1999/001610
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Toyohisa Kurita
Hiroyuki Izu
Mutsumi Sano
Ikunoshin Kato
Original Assignee
Takara Shuzo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing lysosphingolipids, and more specifically, a method for industrially useful production of lysosphingolipids useful for cosmetics, medicines, sphingolipid engineering, cell engineering, etc., and lysosphingolipids obtained by the production method.
  • Conventional technology a method for producing lysosphingolipids, and more specifically, a method for industrially useful production of lysosphingolipids useful for cosmetics, medicines, sphingolipid engineering, cell engineering, etc., and lysosphingolipids obtained by the production method.
  • the sphingo lipid is a generic name of lipids having a sphingoid skeleton as a common structure, such as sphingo glycolipid, sphingo phospholipid (including sphingophosphonolipid), and ceramide.
  • the amino group of the sphingoid skeleton forms a ceramide by acid amide bonding of a long-chain fatty acid having a non-uniform chain length.
  • these sphingolipids have been widely distributed from lower animals to higher animals, and it has been revealed that they are playing important roles in biological activities such as cell proliferation, differentiation induction, apoptosis, etc. is there. Since it is a component of the cell surface, it is also being used as an additive to cosmetics, pharmaceuticals, etc.
  • lyso-sphingolipid N-defasylated form of sphingolipids (lyso-form), which lacks a fatty acid bonded to the amide group of the sphingolipid sphingoid by an acid amide, is called lyso-sphingolipid and differs from sphingolipids in biological activity as well as sphingolipids. It has been shown that it also has activity.
  • the lysosphingolipid has a free amino group in the sphingoid and is useful as a starting material when synthesizing a lysosphingolipid derivative (a sphingolipid derivative or a sphingolipid analog) by re-ascination.
  • a lysosphingolipid derivative a sphingolipid derivative or a sphingolipid analog
  • sphingolipids labeled with a chromophore / radioisotope can be obtained.
  • free amino acids of lysosphingolipids It is also possible to immobilize the compound on a carrier using a thio group.
  • lysosphingolipids As chemical methods for obtaining lysosphingolipids from glycosphingolipids, hydrazinolysis and alkali hydrolysis in alcoholic solvents are known. However, according to these methods, for example, in the case of glycosphingolipids containing sialic acid (ganglioside), the desialylation reaction of the sialic acid portion proceeds simultaneously. In addition, in the case of glycosphingolipids containing amino sugars, elimination of the N-acetyl group occurs, resulting in de-N-acetyl lysoglycolipids.
  • a protecting group was selectively introduced into the amino group of the lipid moiety, and then the sialic acid moiety was re-acylated. After that, very complicated operations such as a method of further removing the protecting group and a method of incorporation into a liposome to selectively resuylate the sugar were required. In addition, these operations produce various by-products. Thus, the production of lysosphingolipids by a chemical method requires a lot of labor and technical skill.
  • sphingoides are not only of the natural D-erythro (2S, 3R) type, but also of the L-threo (L-threo) type (2S, Since various side-reactions occur, such as the generation of 3S) stereoisomer, not only the yield of the target natural D-erythro form is low, but also the Was very difficult to purify.
  • the reaction yield of the lyso form in the method using these enzymes is not satisfactory.
  • the maximum hydrolyzable substrate, ganglioside GM2 is about 70, depending on the substrate. /. And up to about 60% for ganglioside GM1.
  • JP-A Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-107988
  • a bacterium belonging to the genus Pseudomonas or Shewanella that produces sphingolipid ceramide N-deacylase.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-45 Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-45
  • the method of adding to the culture medium requires a large amount of impurities such as pigments and glycolipids derived from the culture medium or cells in addition to the target lyso form. A complicated purification operation was required. Furthermore, in this method, it was very difficult to treat a trace amount of sphingolipids and to purify the lyso form for the reasons described above.
  • an object of the present invention is to provide a method for efficiently producing lysosphingolipids without producing by-products.
  • Another object of the present invention is to provide a lysosphingolipid obtained by the above production method.
  • FIG. 1 is a graph showing an optimal pH that contributes to the yield of a lyso form in the presence of an organic solvent.
  • FIG. 2 is a view showing substrate specificity that contributes to the yield of a lyso form in the presence and absence of an organic solvent.
  • FIG. 3 is a graph showing the time course of the yield of the lyso form in the presence or absence of a surfactant and an organic solvent.
  • FIG. 4 is a graph showing the yield of lyso-form at various enzyme amounts in the presence of an organic solvent.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the amount of the organic solvent added and the yield of the lyso form.
  • the present inventors have studied a method for preparing a large amount of high-purity industrially advantageous lysosphingolipids, and as a result, have found that an enzyme that specifically hydrolyzes the acid amide bond between a sphingoid of a sphingolipid and a fatty acid is obtained.
  • the enzymatic reaction is carried out in a two-phase reaction solution containing an organic solvent immiscible with water, so that by-products do not occur and excellent reaction efficiency is achieved. It has been found that high-purity lysophosphingolipids can be produced.
  • a method for producing lysosphingolipids using an enzyme that specifically hydrolyzes an acid amide bond between a sphingoid and a fatty acid of a sphingolipid comprising at least one organic solvent that forms a separated phase with an aqueous phase.
  • a method for producing lysosphingolipids comprising performing an enzyme reaction in a two-phase reaction solution,
  • ether is an ether selected from the group consisting of phenylene ether, ethyleneglycol monolecithinolene ether, disopropyl ether and vinylethyl ether.
  • the surfactant is selected from the group consisting of a surfactant having a steroid skeleton, polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene sorbitan alkyl ether and boroxixylene alkyl ether.
  • Rhizosph ingolipid obtained by the production method according to any one of the above 1 to 8
  • ⁇ ⁇ means a trade name
  • examples of the sphingolipid used as a substrate include a simple substance of a natural or synthetic substance having a long-chain base sphingoid including glycosphingolipid, sphingolipid, and ceramide, and a mixture thereof.
  • lysosphingolipid means a ⁇ -desacyl derivative of a sphingolipid lacking a fatty acid having an acid amide bond to an amino group of sphingoid.
  • the enzyme used in the present invention that specifically hydrolyzes the acid amide bond between the sphingolipid sphingolipid and the fatty acid is not particularly limited, and may be a known enzyme capable of releasing fatty acid from sphingolipid.
  • ganglioside ceramidase produced by actinomycetes of the genus Nocardia [Journal of Bio-Chemistry, Vol. 103, pp.
  • JP-A-8-84587 sphingolipid ceramide ⁇ -deacylase produced by a bacterium of the genus Schwanella (JP-A-10-45792), a bacterium belonging to the genus Shudoumonas Ceramidase (Japanese Unexamined Patent Publication No. H10-145563), a ceramidase derived from mammals and seori [Journal 'ob' 'Biological' chemistry, Vol. 241, pp. 3731-3737 (1966 ); Biochemistry, Vol. 8, pp. 1692-1698 (1969); Biochemical force
  • sufingolipid ceramide N produced by Pseudomonas sp.
  • Desylases and the sphingolipid ceramide N-deacylase produced by the bacteria of the genus Shewanella have wide substrate specificity and are particularly preferred for producing various lysosphingolipids:
  • a genus of Pseudomonas sp. TK_4, which produces a sphingolipid ceramide N-deacylase, is designated as G-182, and is designated as G-182.
  • These enzymes can be used as an enzyme solution or immobilized on a water-insoluble carrier.
  • the aqueous phase used in the present invention includes water or an aqueous solution, and in particular, a buffer containing an enzyme, a substrate, and the like for various reactions is preferable.
  • the separated phase is an organic solvent phase that is immiscible with water.
  • the distribution ratio of fatty acids, which are decomposition products of sphingolipids, to the organic solvent phase is higher than that of the aqueous phase, and the distribution ratio of sphingolipids, a substrate, to the organic solvent is higher.
  • organic solvent examples include, but are not limited to, hexane, heptane, octane, isooctane, nonane, decane, dodecane, pentadecane, heptadecane, octadecane, 2-methylbentan, and 2,2 as hydrocarbons.
  • alcohols examples include octanol, decanol, dodecanol, otatenol, decenol, cyclodecanol, and the like.
  • esters examples include ethyl hexanoate, ethyl octanoate, ethyl ethyl decanoate, ethyl ethyl dodecanoate, isopropyl myristate, butyl stearate, butyl citrate, and ethyl ethyl citrate.
  • ethers examples include phenyl ether, vinylethynole ether, ethylene glycol getyl ether, diisopropyl ether tenol, and octyl ether.
  • Ketones include octanone, decanone, dodecanone and the like.
  • hydrocarbons with 6 or more carbon atoms including aliphatic, cyclic, aromatic, and halogen-containing hydrocarbons
  • alcohols with 8 or more carbon atoms and carboxylic acid portions with 6 or more carbon atoms
  • an ester selected from alcohols having 2 or more carbon atoms, and ethers selected from phenyl ether, ethylene glycol dimethyl ether, diisopropyl ether and vinyl ethyl ester are particularly preferably used in the method of the present invention. Can be used.
  • organic solvent used in the present invention is not limited to one kind, and two or more kinds can be mixed and used.
  • the two-phase system in the present invention includes an aqueous phase and an organic solvent phase, for example, a state in which an aqueous phase is dispersed in an organic solvent phase, such as a stirring state, or a state in which an organic solvent phase is dispersed in an aqueous phase.
  • ⁇ means a state in which an aqueous phase and an organic solvent phase are in contact with each other in a state of being separated into two layers, not in a dispersed state as in a stationary state.
  • the organic solvent phase and / or the aqueous phase may be exchanged as needed while continuing the enzymatic reaction, thereby making it possible to continuously produce lysosphingolipids.
  • the amount of the organic solvent to be added is not particularly limited, but is preferably 50% or more of the volume of the aqueous phase, usually 5 to 10 times the volume.
  • the aqueous phase contains various salts and surfactants, for example, surfactants having a steroid skeleton such as sodium taurodeoxycholate and sodium cholate, triton surfactants, and nonidet P-40 '" Holoxyethylene alkylphenyl acrylate
  • non-ionic surfactants such as polyoxyethylene sorbitan alkyl ethers such as ters, tween-based surfactants, and borooxyethylene alkyl ethers can be added.
  • the amount of the surfactant is usually preferably about 0.1 to 2% by weight based on the whole reaction system.
  • the reaction conditions are not particularly limited, it is possible to produce lysosphingolipids more efficiently by carrying out the reaction under the optimum conditions of each enzyme such as pH and temperature.
  • the pH is 6 to 10
  • a surfactant such as sodium taurodeoxycholate or sodium cholate is used as a surfactant. It is preferable to add a surfactant having a skeleton of phosphine, and to use sphingo more efficiently by using a boroxyethylene alkylphenyl ether such as Triton X-100 TM or Nonidet P-40 TM in combination. Lipids can be hydrolyzed.
  • the reaction time is also not particularly limited, and a desired amount of lysosphingolipid can be obtained with the enzyme used from the substrate used, for example, a natural or synthetic glycosphingolipid, a sphingophospholipid such as a sphingophospholipid, or a ceramide. You just have to react for time.
  • the lysosphingolipid obtained according to the present invention can be purified by a usual method.
  • the two phases may be separated by standing and then separated, or a selective membrane or column may be used. It may be removed by concentration under reduced pressure or distillation. Since the reaction product containing the lyso-form in the aqueous phase obtained in this way has a small amount of contaminants, it is subjected to a usual extraction method, for example, reverse-phase chromatography, normal-phase gel chromatography using a silica gel, or The lysos-fingolipid can be easily purified by ion-exchange chromatography.
  • the lysosphingolipid derivative obtained by the present invention can be treated to produce a lysosphingolipid derivative.
  • the lysosphingolipid derivative can be produced, for example, as follows.
  • the re-acylation can be performed by a chemical method or an enzymatic method according to a conventional method of acid amidation of an amino group.
  • the reaction may be carried out using aliphatic carboxylic acid with or without a label or a reactive derivative thereof.
  • aliphatic carboxylic acids that can be used in the present invention include saturated fatty acids and unsaturated fatty acids, as well as those in which the hydrocarbon chain of the fatty acid is a halogen, a substituted or unsubstituted amino group, an oxo group, a hydroxyl group.
  • all aliphatic carboxylic acids such as acids having oxygen, sulfur and amino groups in the hydrocarbon chain.
  • a method for enzymatic reacylation there is a method using a known lipase.
  • a particularly useful method is to specifically hydrolyze an acid amide bond between a sphingoid of a sphingolipid and a fatty acid. It can be easily carried out by utilizing the reverse reaction of an enzyme, for example, the above-mentioned sphingolipid ceramide N-deacylase (International Publication W098 / 035929).
  • the labeling method is to introduce a chromophore-forming substance, a fluorescent substance, biotin, a radioisotope, etc. into the labeling portion. good.
  • GM1 [Matoreya (Matreya) Co.] 50 mM acetate buffer containing (pH6. 0) to 1 0 mu 1, by adding various organic solvents 1 00 mu i, at 37 ° C, c which was reacted for 1 6 hr As a control, a reaction solution without the addition of an organic solvent was similarly reacted.c. The resulting reaction solution was developed by thin-layer chromatography, developed with orcinol sulfuric acid, and then developed with an imaging densitometer. GM1 (manufactured by Bio-Rad)]. The results are shown in Table 1.
  • the resulting reaction solution was developed by thin-layer chromatography, colored with orcinol sulfate, and the lyso form of GM1 was analyzed with an imaging densitometer (Bio-Rad) as in Example 1. The yield was quantified. The results are shown in Table 2. The final concentration of the surfactant was 0.8% by weight based on the reaction system. Among the surfactants listed in Table 2 below, Triton X-100 IM was manufactured by Pierce and all others were used. Made by Nacalai Tesque
  • the resulting reaction solution was developed by thin-layer chromatography and colored with orcinol sulfate as in Example 1, and the GM1 lyso form was collected with an imaging densitometer (Bio-Rad). The rate was determined.
  • the results are shown in Table 3: The concentration of the surfactant in Table 3 is the weight of the final concentration relative to the reaction system. It is.
  • the obtained reaction solution was developed by thin-layer chromatography and colored with honoresinol sulfate as in Example 1, and then the GM1 decomposition rate was determined by an imaging densitometer (manufactured by Bio-Rad). The lyso-form yield was quantified.
  • Figure 1 shows the results.
  • FIG. 1 is a graph showing the optimum pH that contributes to the yield of the lyso form in the presence of an organic solvent.
  • the vertical axis indicates the degradation rate (%) and the horizontal axis indicates the pH.
  • White circles indicate acetate buffer
  • black circles indicate phosphate buffer
  • white triangles indicate Tris-HCl buffer
  • black squares indicate glycine NaOH buffer. Show liquid.
  • the reaction was performed at 7 ° C for 16 hours. Controls without the addition of n-heptadecane were also prepared: substrates were ceramide (Cer), galactosylceramide (GalCer), sulfatide, G ⁇ 1, asia mouth GM1, GDla, sphingo myelin (all matreya) It was used.
  • substrates were ceramide (Cer), galactosylceramide (GalCer), sulfatide, G ⁇ 1, asia mouth GM1, GDla, sphingo myelin (all matreya) It was used.
  • the yield of the lyso form of ceramide was determined by thin-layer chromatography, and the color of sphingosine produced by the ninhydrin reagent was developed.
  • sphingomyelin the color of lysosphingomyelin produced by Coomassie brilliant blue was developed.
  • the other substrates were developed by thin-layer chromatography, developed with orcinol sulfuric acid, and then imaged with an imaging densitometer (Bio-Rad), as in Example 1. The yield of the lyso form was quantified. Figure 2 shows the results.
  • FIG. 2 is a diagram showing substrate specificity that contributes to the yield of the lyso form in the presence and absence of an organic solvent.
  • the vertical axis shows the yield (%)
  • the horizontal axis shows each substrate
  • the black bar graph shows the decomposition rate in the presence of n-heptadecane
  • the white bar graph shows the decomposition rate in the absence of n-heptadecane. Show.
  • reaction was carried out at 37 ° C under the following reaction conditions (A) to (D), and 0.5, 0.5, 1, 2,
  • the yield was quantified every 6 and 16 hours.
  • the resulting reaction solution was developed by thin-layer chromatography and color-developed with orcinol sulfuric acid in the same manner as in Example 1, followed by imaging densitometer (Bio-Rad, the rate of GM 1 decomposition, That is, the yield of the lyso form was quantified, and the results are shown in FIG.
  • Figure 3 shows that GM in the presence or absence of a surfactant and an organic solvent
  • FIG. 4 is a diagram showing the time course of the decomposition rate of FIG.
  • the vertical axis shows the decomposition rate (%)
  • the horizontal axis shows the time (hr)
  • the black circles indicate the presence of sodium taurodeoxycholate and n-decane
  • the white circles indicate the presence of sodium taurodeoxycholate
  • the black squares indicates the presence of Triton X- 100 ⁇ and n-decane
  • the open triangle indicates the presence of Triton X-100 TM.
  • the resulting reaction solution was developed by thin-layer chromatography and colored with orcinol sulfuric acid in the same manner as in Example 1. After that, the decomposition rate of GM1 was determined by an imaging densitometer (manufactured by Bio-Rad). Then, the yield of the lyso form was quantified: FIG. 4 shows the results.
  • FIG. 4 is a graph showing the degradation rates of GM1 with various amounts of enzymes in the presence of sodium taurodeoxycholate, various types of Triton ⁇ - 100 ⁇ ′, and an organic solvent.
  • the vertical axis shows the degradation rate (%) and the horizontal axis shows the concentration (%) of Triton X-100 TM. .
  • the resulting reaction solution was developed by thin-layer chromatography and colored with orcinol sulfuric acid in the same manner as in Example 1. After that, the decomposition rate of GM1 was determined by an imaging densitometer (manufactured by Bio-Rad). The lyso-form yield was quantified. Figure 5 shows the results.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the amount of the organic solvent and the yield of the lyso form.
  • the vertical axis shows the decomposition rate (%)
  • the horizontal axis shows the amount of organic solvent ( ⁇ 1)
  • the white bar graph shows ⁇ -decane
  • the black bar graph shows ⁇ -heptadecane.
  • the obtained reaction solution was developed by thin-layer chromatography and color-developed with orcinol sulfate as in Example 1, and then the lyso form of GM1 was analyzed with an imaging densitometer (Bio-Rad). The yield was quantified. Table 5 shows the results. The final concentration of the mixed surfactant is 0.1 weight based on the reaction system. /. Used in: Among the surfactants listed in Table 5 below, Triton X-100 TM is manufactured by Pierce, and all others are Nacalai Tester tt.
  • ganglioside GM3 Dissolve 10 mg of ganglioside GM3 (manufactured by Matreya) in 10 ml of 0.5 OmM acetate buffer (pH 6.0) containing 0.8% sodium taurodeoxycholate and place in a 20 Om1 pear-shaped flask. S CDase2 U was added. Here, 100 ml of n-decane was overlaid and allowed to stand still at 37 ° C. for 16 hours. 1 U of SCDase was added to the aqueous phase, and the mixture was kept at 37 ° C for another 16 hours. At this time, the decomposition rate of ganglioside GM3 was 95%.
  • aqueous phase was recovered and divided into two equal parts, which were subjected to purification by reverse phase chromatography.
  • the eluted lysoganglioside GM 3 fractions were collected, concentrated and dried. As a result, 5.6 mg of a lyso-form having a purity of 95% or more was obtained by color development using a mixed solution of orcinol sulfuric acid and dichromic acid / sulfuric acid after development by thin layer chromatography.
  • the production method of the present invention makes it possible to industrially mass-produce high-purity lysosphingolipids efficiently and simply.

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Description

明 細 書 リゾスフインゴ脂質の製造方法 発明の分野
本発明は、 リゾスフインゴ脂質の製造方法、 さらに詳しくは、 化粧料、 医薬、 スフインゴ脂質工学および細胞工学等に有用なリゾスフインゴ脂質の工業的に有 用な製造方法ならびに該製造方法で得られたリゾスフインゴ脂質に関する。 従来の技術
スフインゴ脂質は、 スフインゴ糖脂質、 スフインゴリン脂質 （スフインゴホス ホノリピドを含む） およびセラミ ド等のスフインゴィド骨格を共通の構造として 持つ脂質の総称である。 また、 スフインゴイド骨格のアミノ基は不均一な鎖長の 長鎖脂肪酸を酸アミ ド結合し、 セラミ ドを形成している。
これらスフインゴ脂質は、 近年、 下等動物から高等動物にまで広く分布し、 細 胞の増殖、 分化誘導、 アポトーシス等のような生物活性において重要な役割に関 与していることが明らかにされつつある。 また、 細胞表層の構成成分であること から、 化粧料や医薬等への添加物としても使用されつつある.、
また、 スフインゴ脂質のスフインゴィドのァミノ基に酸アミ ド結合した脂肪酸 を欠く、 スフインゴ脂質の N—脱ァシル体 （リゾ体） はリゾスフインゴ脂質と呼 ばれ、 スフィンゴ脂質と同様な生物活性だけでなく、 異なる活性をも持つことが 明らかにされてきた。
リゾスフインゴ脂質は、 スフインゴィドに遊離のアミノ基を持っており再ァシ ノレ化により リゾスフインゴ脂質誘導体 （スフインゴ脂質誘導体、 スフインゴ脂質 類縁体） を合成する際の出発原料として有用である。 例えば、 均一な脂肪酸糸且成 を持つスフィンゴ脂質や、 元のスフィンゴ脂質と脂肪酸鎖長の異なるスフィンゴ 脂質またはドコサへキサェン酸の様な機能性脂肪酸を含む新規なスフインゴ脂質 を合成することができる. また、 発色団ゃ放射性同位元素等で標識化されたスフ インゴ脂質を得ることが可能である。 さらに、 リゾスフインゴ脂質の遊離のアミ ノ基を利用して担体に固定化することも可能である。
従来、 リゾスフインゴ脂質の製造方法として、 化学的方法、 酵素を用いる方法 および微生物を用いる方法が知られている。
スフインゴ糖脂質からリゾスフインゴ脂質を得る化学的方法としては、 ヒ ドラ ジン分解法やアルコール系溶媒中でのアルカリ加水分解法が知られている。 しか し、 これらの方法によると、 例えば、 シアル酸を含むスフインゴ糖脂質 （ガング リオシド） の場合には、 シアル酸部分の脱ァシル化反応が同時に進行する。 また、 アミノ糖を含むスフインゴ糖脂質の場合、 N—ァセチル基の脱離が起こり、 デー N—ァセチルリゾ糖脂質が生じる。 これらのような脱ァシル化したリゾスフイン ゴ糖脂質を天然と同じ糖鎖にするためには、 脂質部分のァミノ基に保護基を選択 的に導入した後、 シアル酸部分の再ァシル化を行った後に、 さらに保護基を外す 方法や、 リポソ一ムに取込ませて糖部分選択的再ァシル化する方法のような非常 に煩雑な操作が必要であった。 さらに、 これらの操作では様々な副生成物が生成 する。 このように化学的方法によるリゾスフインゴ脂質の製造には多くの手間と 技術的な熟練を要する。
また、 スフインゴリン脂質であるスフインゴミエリンのリゾ体を化学的に得る 方法としては、 アルコール系溶媒中での塩酸加水分解による方法が一般に用いら れる。 し力 し、 この方法によると、 スフインゴイ ドが天然型の D—エリ トロ （D - erythro) 型 （2 S， 3 R ) のものだけではなく L—トレオ （L— threo) 型 ( 2 S , 3 S ) の立体異性体が生じるなど、 様々な副反応物が生じるため、 目的 とする天然型 D—エリ トロ体の収率が低いのみならず、 反応物中より D—エリ ト 口体のみを精製することは非常に困難であった。
一方、 スフインゴ脂質からリゾ体を生成する酵素を用いる方法がこれまで知ら れている。 ノカルディア 、 car did) 属放線菌の生産するガンダリオシド ·セラ ミダ一ゼを用いる方法 [ジャーナル'ォブ 'バイオケミストリ一 （Journal of
Biochemi stry ) 、 第 103 卷、 第 1〜 4頁 （1988) ；特開昭 6 4— 6 0 3 7 9号 公報] 、 ロドコッカス 、Rhodococcus、 属放線菌の生産する酵素または菌体処理 物を用いる方法 （特開平 6— 7 8 7 8 2号公報） 、 シユードモナス
{Pseudomonas) 属細菌の生産するスフインゴ脂質セラミ ド N—デァシラーゼを 用いる方法 [ジャーナル 'ォブ'バイオロジカル ' ケミス トリー （Journal of Biologi cal Chemi stry] 、 第 270卷、 第 24370 -2437 頁 ( 1995) ；特開平 8— 8 4 5 8 7号公報〕 、 非発酵性グラム陰性桿菌 AI- 2の生産するスフインゴ脂質セ ラミ ド N—デアシラーゼを用いる方法 （特開平 1 0— 2 5 7 8 8 4号公報） 、 シ ユードモナス属細菌の生産するセラミダーゼを用いる方法 （特開平 1 0— 1 4 5
6 3号公報） が知られている。
しかしながら、 これらの酵素を用いる方法におけるリゾ体の反応収率は満足で きるものではない。 例えば、 スフインゴ脂質セラミ ド N—デアシラーゼを使用す る場合、 基質により異なるが、 最も加水分解されやすい基質であるガングリオシ ド G M 2でも最高約 7 0。/。であり、 ガングリオシド G M 1では最高約 6 0 %であ る。
微生物またはその抽出物を用いるリゾスフインゴ脂質の製造方法として、 ダリ コスフインゴリピドセラミ ドデアシラーゼを生産する能力を有するス トレプトミ セス Streptomyces 属放線菌を用いる方法 レくィォサイエンス 'バイオテクノ ロシー · アンド ' · ノヽィオケ ス卜リー (Bioscience, Biotechnology, and
Biochemi stry ) 、 第 59卷、 第 2028〜2032頁 （1995) ；特開平 7— 1 0 7 9 8 8 号公報] 、 スフインゴ脂質セラミ ド N-デアシラーゼを生産するシユードモナス属 細菌あるいはシェワネラ Shewanella) 属細菌を用いる方法 （特開平 1 0— 4 5
7 9 2号公報） が知られている。
しカゝしながら、 培地中に添加する方法では、 目的のリゾ体以外に培地あるいは 菌体由来の色素、 糖脂質等の不純物を大量に含むため、 高純度なリゾ体を得るた めには煩雑な精製操作が必要であった。 さらに、 この方法では、 微量のスフイン ゴ脂質を処理し、 リゾ体を精製することは、 上記のような理由により非常に困難 であった。
これまで知られている酵素を用いる方法や微生物またはその抽出物を用いる方 法によるリゾスフインゴ脂質の製造方法は、 いずれも水溶系のみでの反応であり、 水相と、 それに非混和性の分離相を形成する有機溶媒との 2相系で行う方法は、 これまで全く知られていなかった。 発明の目的
上記したように、 従来の化学的あるいは酵素的にリゾスフインゴ脂質を製造す る方法および微生物を用レ、るリゾスフインゴ脂質の製造方法は、 望ましくない副 産物ができたり、 反応効率が低かったり、 精製に多くの手間と技術的な熟練を要 するなど効率の悪レ、ものであった。
したがって、 本発明の目的は、 副生成物を生ずることなく、 効率よくリゾスフ ィンゴ脂質を製造する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、 上記製造方法により得られたリゾスフィンゴ脂質を提供 することにある。
本発明のこれら、 および他の目的ならびに利点を、 添付の図面を参照して、 以 下の記載により明らかにする。 図面の簡単な説明
図 1は、 有機溶媒存在下でのリゾ体の収率に寄与する至適 p Hを示す図である。 図 2は、 有機溶媒存在下および非存在下でのリゾ体の収率に寄与する基質特 異性を示す図である。
図 3は、 界面活性剤および有機溶媒存在下または非存在下でのリゾ体の収率 の時間経過を示す図である。
図 4は、 有機溶媒存在下、 各種酵素量でのリゾ体の収率を示す図である。 図 5は、 有機溶媒添加量とリゾ体の収率との関係を示す図である。 発明の概要
本発明者らは、 高純度な工業的に有利なリゾスフインゴ脂質の大量調製法につ いて検討を行った結果、 スフインゴ脂質のスフインゴイドと脂肪酸との酸アミ ド 結合を特異的に加水分解する酵素を用いたリゾスフインゴ脂質の製造方法におい て、 水と混和しない有機溶媒を含有する 2相系反応液中で、 酵素反応を行うこと により、 副生産物を生ずることなく、 優れた反応効率で、 しかも、 高純度のリゾ スフインゴ脂質を製造できることを見出した。 また、 水と混和しない有機溶媒に ついて鋭意検討した結果、 驚くべきことに使用する脂溶性有機溶媒により、 リゾ スフインゴ脂質の収率が大きく変動することを見いだした。 さらに、 上記の 2相 系反応液中に、 1種以上の界面活性剤を加えることにより、 さらに効率良く リゾ スフィンゴ脂質を製造できることを見出し、 本発明を完成させた。
すなわち、 本発明は、
1 . スフインゴ脂質のスフインゴイドと脂肪酸との酸アミ ド結合を特異的 に加水分解する酵素を用いたリゾスフインゴ脂質の製造方法において、 水相と分 離相を形成する少なくとも 1種類の有機溶媒を含有する 2相系反応液中で、 酵素 反応を行うことを特徴とするリゾスフインゴ脂質の製造方法、
2 . 少なくとも 1種類の界面活性剤の存在下に、 酵素反応を行う上記 1記 載のリゾスフインゴ脂質の製造方法、
3 . 有機溶媒が、 炭化水素、 アルコール、 エステルまたはェ一テルから選 択される有機溶媒である上記 1または 2記載のリゾスフインゴ脂質の製造方法、
4 . 炭化水素が、 炭素数 6以上の炭化水素である上記 3記載のリゾスフィ ンゴ脂質の製造方法、
5 . アルコールが、 炭素数 8以上のアルコールである上記 3記載のリゾス フインゴ脂質の製造方法、
6 . エステルが、 炭素数 6以上のカルボン酸部分と、 炭素数 2以上のアル コールから構成されるエステルである上記 3記載のリゾスフインゴ脂質の製造方 法、
7 . エーテルが、 フエニノレエ一テル、 エチレングリコ一ノレジェチノレエ一テ ノレ、 ジィソプロピルェ一テルおよびビニルェチルエーテルからなる群から選択さ れるエーテルである上記 3記載の製造方法、
8 . 界面活性剤が、 ステロイ ド骨格を有する界面活性剤、 ポリオキシェチ レンアルキルフエ二ルェ一テル、 ポリォキシエチレンソルビタンアルキルェ一テ ルぉよびボリォキシェチレンアルキルェ一テルからなる群から選択される上記 2 記載のリゾスフインゴ脂質の製造方法、 および
9 . 上記 1〜8のいずれか 1項に記載の製造方法により得られるリゾスフ インゴ脂質
を提供するものである。 本明細書において、 " Τ\ ' は商標名を意味する。 発明の詳細な説明
本発明において、 基質として用いるスフインゴ脂質とは、 スフインゴ糖脂質、 スフインゴリン脂質、 セラミ ドを包含する長鎖塩基スフインゴィ ドを有する天然 物または合成物の単体あるレ、はそれらの混合物等が挙げられる。
また、 本発明において、 リゾスフインゴ脂質とは、 スフインゴイ ドのアミノ基 に酸アミ ド結合した脂肪酸を欠くスフインゴ脂質の Ν—脱ァシル体を意味する。 本発明において用いる、 スフインゴ脂質のスフインゴィドと脂肪酸との酸アミ ド結合を特異的に加水分解する酵素は、 特に限定するものではなく、 公知のスフ インゴ脂質から脂肪酸を遊離する作用をもつ酵素でよく、 例えば、 ノカルディア 属放線菌の生産するガングリオシド ·セラミダ一ゼ [ジャーナル ·ォブ ·バイォ ケミストリー、 第 103卷、 第 1 〜 4頁 （1988) ；特開昭 6 4— 6 0 3 7 9号公 報] 、 口ドコッカス属放線菌の生産する酵素 （特開平 6— 7 8 7 8 2号公報） 、 ストレプトミセス属放線菌の生産するグリコスフインゴリピドセラミ ドデァシラ ーゼ [バイオサイエンス .バイオテクノロジー ·アンド ·バイオケミストリー、 第 59卷、 第 2028〜2032頁 （1995) ；特開平 7 _ 1 0 7 9 8 8号公報〕 、 シユード モナス属細菌の生産するスフインゴ脂質セラミ ド Ν—デアシラーゼ [ジャーナ ノレ ·ォブ ·バイォロジカル ' ケミストリー、 第 270卷、 第 24370 〜24374 頁
(1995) ；特開平 8 _ 8 4 5 8 7号公報〕 、 シュワネラ属細菌の生産するスフィ ンゴ脂質セラミ ド Ν—デアシラーゼ （特開平 1 0— 4 5 7 9 2号公報） 、 シユー ドモナス属細菌の生産するセラミダーゼ （特開平 1 0— 1 4 5 6 3号公報） 、 哺 乳動物,祖織由来セラミダーゼ [ジャーナル 'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリ ―、 第 241 卷、 第 3731〜3737頁 （1966) ；バイオケミストリ一 （Biochemistry) 、 第 8 卷、 第 1692〜1698頁 （1969) ；バイオキミ力 'ェ 'バイオフイジ力 'ァクタ
(Biochimica et Biophysica Acta ) 、 第 176卷、 第 339 〜347 頁 （1969) ；サ ィエンス （Science ) 、 第 178 卷、 第 1100〜1 102頁 （1972) ： 、 無脊椎動物由来 セラミダ一ゼ （国際公開 WO 9 8 / 0 3 5 2 9号公報） 等が挙げられる。
これらの中で、 シユードモナス属細菌の生産するスフインゴ脂質セラミ ド N— デアシラーゼおよびシュワネラ属細菌の生産するスフインゴ脂質セラミ ド N—デ アシラーゼは基質特異性が広く、 いろいろなリゾスフインゴ脂質を製造するのに 特に好ましい：
スフインゴ脂質セラミ ド N—デアシラーゼを生産するシュ一ドモナス属細菌、 Pseudomonas sp. T K _ 4株を、 G— 1 8 2と表示し、 1 9 9 4年 6月 2 4日
(原寄託日） より、 ブタペスト条約の下、 受託番号 F E RM B P— 5 0 9 6で、 また、 スフインゴ脂質セラミ ド N—デアシラーゼを生産するシュワネラ属細菌、 Shewanella alga N S— 5 8 9株を 1 9 9 6年 6月 2 6日より受託番号 F E RM P— 1 5 7 0 0で、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の通商産業省工業技 術院生命工学工業技術研究所に寄託してある。
また、 これら酵素は、 酵素溶液として、 または水不溶性の担体に固定化して用 いることができる。
本発明に用いられる水相とは、 水もしくは水溶液が挙げられ、 特に、 各種反応 のための酵素、 基質等を添加した緩衝液が好ましい。
分離相は、 水と混和しない有機溶媒相である。 該有機溶媒相と水相との間にお いて、 スフインゴ脂質の分解産物である脂肪酸の有機溶媒相への分配比が水相よ りも高く、 基質であるスフインゴ脂質の有機溶媒への分配比が水相よりも低い有 機溶媒のうち炭化水素、 アルコール類、 エステル類、 エーテル類、 ケトン類から 選択される。
このような有機溶媒として、 特に限定するものではないが、 例えば、 炭化水素 としてへキサン、 ヘプタン、 オクタン、 イソオクタン、 ノナン、 デカン、 ドデカ ン、 ペンタデカン、 ヘプタデカン、 ォクタデカン、 2—メチルベンタン、 2， 2 —ジメチルブタン、 2， 2 , 3—トリメチルヘプタン、 2， 2 , 4—トリメチル ヘプタン、 へキセン、 ォクテン、 デセン、 ドデセン、 ペンタデセン、 へブタデセ ン等の脂肪族炭化水素、 シクロへキサン、 メチルシクロへキサン、 シクロデカン、 シクロへキセン、 シクロデセン等の脂肪族環状炭化水素、 ジクロロェタン、 テト ラクロロェタン、 トリクロロエチレン、 四塩化炭素、 塩化ォクチル、 塩化デシル、 クロ口ベンゼン、 ジクロロベンゼン等の含ハロゲン炭化水素、 ベンゼン、 トルェ ン、 キシレン、 メシチレン、 ェチル zくンゼン、 ブチルベンゼン、 クメン、 シメン 等の芳香族炭化水素が挙げられる。
また、 アルコール類として、 ォクタノール、 デカノ一ル、 ドデカノ一ル、 オタ テン一オール、 デセン一オール、 シクロデカノール等が挙げられる。
エステル類として、 へキサン酸ェチル、 オクタン酸ェチル、 デカン酸ェチル、 ドデカン酸ェチル、 ミ リスチン酸イソプロピル、 ステアリン酸プチル、 クェン酸 ブチル、 クェン酸ェチル等が挙げれられる。
エーテノレ類として、 フエニルエーテル、 ビニルェチノレエーテル、 エチレングリ コールジェチルエーテル、 ジイソプロピルェ一テノレ、 ォクチルエーテル等が挙げ られる。
ケトン類として、 ォクタノン、 デカノン、 ドデカノン等が挙げられる。
上記の有機溶媒のうち、 炭素数 6以上の炭化水素 （脂肪族、 環式、 芳香族、 な らびに含ハロゲン炭化水素を含む） 、 炭素数 8以上のアルコール、 炭素数 6以上 のカルボン酸部分と、 炭素数 2以上のアルコールから構成されるエステル、 なら びにフエ二ルェ一テル、 エチレングリコ一ルジェチルエーテル、 ジイソプロピル エーテルおよびビニルェチルェ一テルから選択されるエーテルが、 特に好適に本 発明の方法に使用することができる。
さらに、 本発明で用いる有機溶媒は、 1種類に限定されるものではなく、 2種 類以上を混合し、 使用することができる。
本発明における 2相系には、 水相と有機溶媒相が、 例えば、 攪拌状態のように、 有機溶媒相に水相が分散された状態または水相に有機溶媒相が分散された状態、 あるレ、は静置状態のように分散状態ではなく、 2層に分離した状態で水相と有機 溶媒相が接触している状態が包含される。
また、 有機溶媒相および/または水相を、 酵素反応を継続しながら随時交換し てもよく、 これにより、 連続的にリゾスフインゴ脂質を製造することも可能とな る。 添加される有機溶媒の量は、 特に限定するものではないが、 好ましくは水相 の容量の 5 0 %以上、 通常、 5〜 1 0倍量あればょレ、
水相には各種塩類、 界面活性剤、 例えば、 タウロデオキシコール酸ナトリウム やコール酸ナトリゥムのようなステロイド骨格を持つ界面活性剤、 トリ トン系界 面活性剤や Nonidet P- 40 ' "のようなホリォキシエチレンアルキルフエニルエー テル類、 トウイーン系界面活性剤のようなポリオキシエチレンソルビタンアルキ ルエーテル類、 ボリォキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン性界面活' 14剤 の内、 少なくとも 1種類を添加することができる。 特に限定するものではないが、 界面活性剤の量は、 通常、 反応系全体に対して 0 . 1〜 2重量％程度が好ましい。 反応条件も特に限定するものではないが、 p H、 温度等、 各酵素の至適条件で 反応を行うことにより、 さらに効率よくリゾスフインゴ脂質を製造することがで さる。
例えば、 シユードモナス属細菌の生産するスフインゴ脂質セラミ ド N _デァシ ラ一ゼを用いた反応の場合、 p H 6〜 1 0で、 界面活性剤としてタウロデオキシ コール酸ナトリウム、 コール酸ナトリウムのようなステロイ ド骨格を持つ界面活 性剤を添加することが好ましく、 さらに Tri ton X- 100™や Nonidet P - 40™のよう なボリォキシエチレンアルキルフエニルエーテル類を併用することによりより効 率よくスフィンゴ脂質を加水分解することができる。
反応時間も、 特に限定するものではなく、 用いた基質、 例えば、 天然あるいは 合成のスフインゴ糖脂質、 スフインゴリン脂質、 セラミ ド等のスフインゴ脂質か ら、 用いた酵素で所望の量のリゾスフインゴ脂質が得られる時間、 反応を行えば 良い。
本発明により得られたリゾスフインゴ脂質は通常の方法によって精製されるこ とができる。
反応液からの有機溶媒の除去は、 静置により 2相を分離後、 分液しても良いし、 選択膜やカラムを使用しても良い。 また、 減圧濃縮や蒸留によって除いても良い。 このようにして得られた水相中のリゾ体を含む反応物は混在物が少ないため、 通常の抽出法、 例えば、 逆相クロマトグラフィ一ゃシリ力ゲル力ラムの順相ク口 マトグラフィ一、 またはイオン交換クロマトグラフィーによって、 簡単にリゾス フインゴ脂質を精製することができる。
また、 上記の除去操作により分離された有機溶媒相から有機溶媒を蒸発させる ことによりスフィンゴ脂質由来の脂肪酸を得ることも可能である。
精製したリゾスフインゴ脂質の構造の確認は、 薄層クロマトグラフィ一や液体 クロマトグラフィー、 質量分析、 核磁気共鳴スペク トルなどの分析によって行う ことができる。
このようにして、 本発明の方法により、 スフインゴ脂質から目的のリゾスフィ ンゴ脂質に変換すろことができる。
さらに、 本発明で得られたリゾスフインゴ脂質を処理してリゾスフインゴ脂質 誘導体を製造することができる。 リゾスフインゴ脂質誘導体の製造は、 例えば、 以下のようにして行うことが可能である。
処理として再ァシル化を行う場合、 ァミノ基の酸アミ ド化の常法に従って、 化 学的方法または酵素的方法によって行うことができる。
化学的に再ァシル化を行う方法では、 標識を有し、 または有しない脂肪族カル ボン酸またはその反応性誘導体を用いて反応を行えばよい。 本発明において使用 可能な脂肪族カルボン酸の例には、 飽和脂肪酸、 不飽和脂肪酸はもちろんのこと、 それら脂肪酸の炭化水素鎖が、 ハロゲン、 置換もしくは非置換のアミノ基、 ォキ ソ基、 水酸基等の官能性基で置換されている酸、 または当該炭化水素鎖中に酸素、 硫黄、 アミノ基を有する酸等の脂肪族性をもつカルボン酸が全て含まれる。
酵素的に再ァシル化を行う方法としては、 公知のリパーゼを用いる方法等があ るが、 特に有用な方法としては、 スフインゴ脂質のスフインゴイドと脂肪酸との 酸アミ ド結合を特異的に加水分解する酵素、 例えば、 上記のスフインゴ脂質セラ ミ ド N—デアシラーゼの逆反応 （国際公開 W0 9 8 / 0 3 5 2 9号公報） を利用 することにより、 容易に行うことが可能である。
処理として、 得られたリゾスフインゴ脂質のスフインゴイ ドのアミノ基を標識 する場合、 該標識方法としては、 標識する部分に、 発色団を形成する物質、 蛍光 物質、 ピオチン、 放射性同位元素等を導入すれば良い。
以下、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に示すが、 本発明は以下の実施例 に限定されるものではない：
実施例 1
種々の有機溶媒の添加によるリゾスフインゴ脂質の製造
シユードモナス属細菌、 Pseudomonas sp. T K— 4 ( F E R B P— 5 0 6 9 ) 由来のスフインゴ脂質セラミ ド N—デアシラーゼ [ S C Dase ; ジャ一十 ノレ ·ォブ 'バイオロジカル ' ケミス トリー、 第 270巻、 第 24370 〜24374 頁 (1995) ；特開平 8— 8458 7号公報] 2mL；、 0. 8%タウロデオキシコ一 ル酸ナトリウム [ナカライテスク （nacalai tesque) および 1 O nmo 1
GM1 [マトレャ （Matreya) 社製] を含む 50 mM酢酸緩衝液 （pH6. 0) 1 0 μ 1に、 各種有機溶媒 1 00 μ iを添加し、 37°Cで、 1 6時間反応させた c なお、 コントロールとして、 有機溶媒を添加していないものも同様に反応させた c 得られた反応液を薄層クロマトグラフィ一で展開し、 オルシノール硫酸により 発色させた後、 イメージングデンシトメータ一 [バイオ一ラッド （Bio- Rad) 社 製] で、 GM1のリゾ体の収率の定量を行った。 その結果を表 1に示す。
なお、 下記表 1記載の有機溶媒中、 シクロデカンはアルドリッチ （Aldrich Chem. ) 社製であり、 その他はすべてナカライテスク社製である。 溶媒 リゾ体の収率 （<½) コン卜口一ル 68
1ーブタノ一ル 44
1—ペンタノ一ノレ 5 1
1—へキサノ一ノレ 53
1—ヘプタノ一ノレ 6 2
1ーォクタノール 70
2—才クタノ一ノレ 90
1—デカノ一ル 83
1一ドデカノール 1 00
へキサン 76
オクタン 89
デカン 95
9 7
9 7
ォクタデカン 9 7
1— ^\キセン 80
1ーォクテン 9 1 1ーデセン 9 4 1 一ドデセン 9 3 シク口へキサン 8 7 メチノレシク口へキサン 9 3 シクロデカン 8 9 ベンゼン 7 0 トルエン 8 4
9 5 メシチレン 9 7 n—ェチノレベンゼン 9 7 n—ブチノレベンゼン 9 9 p—シメン 9 8 クメン 9 6 塩化 n—ォクチル 9 9 塩化 n—デシル 1 0 0 クロ口フオノレム 6 2 四塩化炭素 7 3 酢酸ェチル 5 8 酢酸ブチル 6 8 酢酸へキシル 6 0 酢酸フエニル 5 5 醉酸べンジノレ 6 7 へキサン酸メチル 4 7 オクタン酸メチル 6 1 デカン酸メチル 6 2 ドデカン酸メチル 6 8 プロピオン酸ェチル 5 8 酪酸ェチル 5 4 へキサン酸ェチル 7 3 オクタン酸ェチル 73
デカン酸ェチル 75
ドデカン酸ェチル 74
ミ リスチン酸イソプロピル 9 1
ステアリン酸 n—ブチル 84
フエニノレエーテノレ 97
ェチノレエーテノレ 41
プロピルエーテル 54
ブチルエーテル 64
ビニルェチルエーテノレ 73
ビニルブチルェ一テノレ 6 1
エチレングリコ一ルジェチルェ一テル 7 1
ジィソプロピルエーテル 9 1
実施例 2
界面活性剤の検討
シユードモナス属細菌由来 S CDase [ジャーナノレ ·ォブ ·バイォロジカノレ · ケミストリー、 第 270卷、 第 24370 〜24374 頁 （1995) ；特開平 8— 84587 号公報] 2mU、 各種界面活性剤、 l O nmo l GM 1 (マトレャ社製） を含 む 50miM酢酸緩衝液 （pH6. 0) 1 0 μ 1 に、 η—デカン （ナカライテス ク卞 ±$D 1 00 μ 1を添加し、 37°Cで、 1 6時間反応させた。
得られた反応液は実施例 1と同様に、 薄層クロマトグラフィ一で展開し、 オル シノール硫酸により発色させた後、 イメージングデンシトメ—ター （バイオーラ ッド社製） で、 GM 1のリゾ体の収率の定量を行った。 その結果を表 2に示す。 界面活性剤の最終濃度は反応系に対して 0. 8重量％で使用した 下記表 2記 載の界面活性剤中、 Triton X-100IMはピアス （Pierce) 社製であり、 その他はす ベてナカライテスク社製である
表 2
界面活性剤 リゾ体の収率 （％) 無添加 25 タウロデオキシコール酸ナトリウム 99
コール酸ナトリウム 92
Triton X- 100™ 64
Tween 20™ 42
Nonidet P- 40™ 60
Brij-58™ 66
Lubrol PX™ 72
実施例 3
タウロデオキシコール酸ナトリゥム濃度の検討
シユードモナス属細菌由来 S CDase [ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル ' ケミストリー、 第 270卷、 第 24370 〜24374 頁 （1995) ；特開平 8— 84587 号公報] 2mULJ、 各種濃度のタウロデオキシコ一ル酸ナトリウム （ナカラィテ スク社製） および l O nmo l GM1 (マトレャ社製） を含む 50 mM酢酸緩 衝液 （pH6. 0) 10/z lに、 n—ヘプタデカン （ナカライテスクネ ± ) 10 0 i lを添加し、 37°Cで、 16時間反応させた。
得られた反応液は実施例 1と同様に、 薄層クロマトグラフィーで展開し、 オル シノール硫酸により発色させた後、 イメージングデンシトメーター （バイオーラ ッド社製） で、 GM 1のリゾ体の収率の定量を行った。 その結果を表 3に示す： 表 3中の界面活性剤の濃度は反応系に対する最終濃度の重量。んである。
表 3
濃度 （％) リゾ体の収率 （％)
0 25
0. 05 55
0. 01 65
0. 2 80
0. 4 88
0. 8 92
1. 0 92 実施例 4
至適 pHの検討
シュ一ドモナス属細菌由来 S CDase [ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル · ケミス トリ一、 第 270 卷、 第 24370 〜24374 頁 （1995) ；特開平 8— 84587 号公報] 2mU、 0. 8%タウロデオキシコール酸ナトリウム （ナカライテスク 社製） および 10 n m o 1 GM 1 (マトレャ社製） を含む 50 mMの各緩衝液 ΙΟμ Ιに、 η—デカン （ナカライテスク 100 Μ 1 を添加し、 37°Cで、 1 6時間反応させた。 緩衝液は、 p H 3〜 6では酢酸緩衝液、 p H 6〜 8ではリ ン酸緩衝液、 p H 8〜 9ではトリス塩酸緩衝液、 p H 9〜 10ではグリシン Na 〇H緩衝液を用いた。
得られた反応液は実施例 1と同様に、 薄層クロマトグラフィーで展開し、 ォノレ シノール硫酸により発色させた後、 イメージングデンシトメ一ター （バイオーラ ッド社製） で、 GM1の分解率、 すなわち、 リゾ体の収率の定量を行った。 その 結果を図 1に示す。
すなわち、 図 1は、 有機溶媒存在下でのリゾ体の収率に寄与する至適 pHを示 す図である。 図中、 縦軸は分解率 （％) 、 横軸は pHを示し、 白丸印は酢酸緩衝 液、 黒丸印はリン酸緩衝液、 白三角印はトリス塩酸緩衝液、 黒四角印はグリシン NaOH緩衝液を示す。
実施例 5
有機溶媒存在下での基質特異性
シユードモナス属細菌由来 S CDase [ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル · ケミストリー、 第 270 卷、 第 24370 〜24374 頁 （1995) ；特開平 8— 84587 号公報] 2mU、 0. 8%タウロデオキシコール酸ナトリウム （ナカライテスク 社製） および 10 n m o 1の各基質を含む 50 mM酢酸緩衝液 （ p H 6. 0 ) 1 Ο μ ΐに， η—ヘプタデカン （ナカライテスク社製） Ι Ο Ο μ Ιを添加し、 3
7°Cで、 16時間反応させた。 また、 コントロールとして n—ヘプタデカンを添 加しないものも調製した： 基質は、 セラミ ド （Cer) 、 ガラクトシルセラミ ド (GalCer) 、 スルファチド、 G\ 1、 ァシァ口 GM1 、 GD l a、 スフインゴ ミエリン （全てマトレャ を使用した。 得られた反応液のうち、 セラミ ドょりのリゾ体の収率の定量は、 薄層クロマト グラフィ一で展開し、 ニンヒ ドリン試薬により生成したスフインゴシンを発色さ せ行った。 スフインゴミエリンはクマシ一ブリ リアントブル一により生成したリ ゾスフインゴミエリンを発色させ行った。 その他の基質は、 実施例 1と同様に、 薄層クロマトグラフィーで展開し、 オルシノール硫酸により発色させた後、 ィメ —ジングデンシトメ一タ一 （バイオ一ラッド社製） で、 各基質よりのリゾ体の収 率の定量を行った。 その結果を図 2に示す。
すなわち、 図 2は、 有機溶媒存在下および非存在下でのリゾ体の収率に寄与す る基質特異性を示す図である。 図中、 縦軸は収率 （％) 、 横軸は各基質を示し、 黒棒グラフは n—ヘプタデカン存在下での分解率を示し、 白棒グラフは n—ヘプ タデカン非存在下での分解率を示す。
実施例 6
タウロデオキシコール酸ナトリウム、 Triton X- 100™、 および有機溶媒存在下 または非存在下でのリゾ体の収率の時間経過
下記反応条件 （A) 〜 （D) で、 3 7 °Cにて反応させ、 0、 0 . 5、 1、 2、
6および 1 6時間経過毎の収率を定量した。 得られた反応液は実施例 1と同様に、 薄層クロマトグラフィーで展開し、 オルシノール硫酸により発色させた後、 ィメ —ジングデンシトメ一ター （バイオ一ラッド で、 GM 1の分解率、 すなわ ち、 リゾ体の収率の定量を行った。 その結果を図 3に示す。
すなわち、 図 3は、 界面活性剤および有機溶媒存在下または非存在下での GM
1の分解率の時間経過を示す図である。 図中、 縦軸は分解率 （％) 、 横軸は時間 (hr) を示し、 黒丸印はタウロデオキシコール酸ナトリゥムおよび n-デカン存在 下、 白丸印はタウロデオキシコール酸ナトリウム存在下、 黒四角印は Triton X- 100ΐΜおよび n—デカン存在下、 白三角印は Triton X- 100™存在下を示す。
反応条件 （A) ： シユードモナス属細菌由来 S C Dase [ジャーナル 'ォブ ' バイオロジカル . ケミス トリー、 第 270卷、 第 24370 〜24374 頁 （1995) ；特開 平 8— 8 4 5 8 7号公報] 2 m U、 0 . 8 %タウロデオキシコール酸ナトリウム (ナカライテスク社製） および 1 0 n m o 1 GM 1 (マトレャ社製） を含む 5 O m\l酢酸緩衝液 （ρ Η 6 · 0 ) 1 0 1に、 η—デカン （ナカライテスク社 製） 1 00 μ 1を添加して反応を行う。
反応条件 （Β) ： シユードモナス属細菌由来 S CDase2 mU 0. 8%タウ ロデオキシコール酸ナトリゥムおよび 1 00 nmo 1 GM 1を含む 50 mM酢 酸緩衝液 （ p H 6. 0 ) 1 0 μ 1で反応を行う。
反応条件 （C) ：シユードモナス属細菌由来 S CDase2mU 0. 8%
Triton X- 100"' (ピアス社製） および 1 O nmo I GM 1を含む 50 miM酢酸 緩衝液 （pH6. 0) 1 0 // Iに、 n—デカン 1 00 1を添カ卩して反応を行う。 反応条件 （D) ：シユードモナス属細菌由来 S CDase2mU 0. 8% Triton X- 100™および l O nmo l GM 1を含む 50 酢酸緩衝液 （ p H 6. 0) I 0 μ I で反応を行う。
実施例 7
タウロデオキシコール酸ナトリウム、 Triton X- 100ΐΜおよび有機溶媒存在下で のリゾ体の収率の検討
シ ドモナス属細菌由来 S CDase [ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル · ケミストリ一、 第 270卷、 第 24370 24374 頁 （1995) ；特開平 8— 84587 号公報〕 0. 5mU 0. 8%タウロデオキシコール酸ナトリウム （ナカライ テスク社製） 、 0 0. 1 0. 4または 0. 8%Triton X- 100™ (ピアス社 製） および 1 0 nmo 1 GM 1 (マトレャ ¾J¾ を含む 50 mM酢酸緩衝液 (pH6. 0) Ι Ο μ Ιに， η プタデカン （ナカライテスク ¾Μ) 1 00 μ ΐを添加し、 37°Cで、 1 6時間反応させた。
得られた反応液は実施例 1と同様に、 薄層クロマトグラフィ一で展開し、 オル シノール硫酸により発色させた後、 イメージングデンシトメータ一 （バイオーラ ッド社製） で、 GM1の分解率、 すなわち、 リゾ体の収率の定量を行った:. そ の結果を図 4に示す。
すなわち、 図 4は、 タウロデオキシコ一ル酸ナトリウム、 各種 Triton Χ-100Ί' および有機溶媒存在下、 各種酵素量での GM 1の分解率を示す図である。 図中、 縦軸は分解率 （％) 横軸は Triton X-100™ の濃度 （％) を示す。 。
実施例 8
有機溶媒量の検討 シュ一ドモナス属細菌由来 S CDase [ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル · ケミストリー、 第 270卷、 第 24370 〜24374 頁 （1995) ；特開平 8— 84587 号公報] 2mU、 0. 8%タウロデオキシコ一ル酸ナトリウム （ナカライテスク 社製） 、 0. 1 %Triton X-100IM (ピアスネ: t ) 、 10 nmo 1 GM 1 (マト レャ を含む 50 mM酢酸緩衝液 （pH6. 0) 10 μ こ、 η—デカン
(ナカライテスク ） または η—ヘプタデカン （ナカライテスク社製） の量を 変化させて添加し、 37°Cで、 1 6時間反応させた。
得られた反応液は実施例 1と同様に、 薄層クロマトグラフィ一で展開し、 オル シノール硫酸により発色させた後、 イメージングデンシトメータ一 （バイオーラ ッド社製） で、 GM1の分解率、 すなわち、 リゾ体の収率の定量を行った。 そ の結果を図 5に示す。
すなわち、 図 5は、 有機溶媒量とリゾ体の収率との関係を示す図である。 図中、 縦軸は分解率 （％) 、 横軸は有機溶媒量 (μ 1) を示し、 白棒グラフは η—デカ ン、 黒棒グラフは η—へプタデカンを示す。
実施例 9
低濃度の酵素使用下での様々な界面活性剤の検討
シユードモナス属細菌由来 S CDase [ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル · ケミストリ一、 第 270卷、 第 24370 〜24374 頁 （1995) ；特開平 8— 84587 号公報] 0. 5mU、 各種界面活性剤および 10 nmo 1 GM 1 (マトレャ社 製） を含む 50 mM酢酸緩衝液 （pH6. 0) 10 μ 1に、 η—ヘプタデカン
(ナカライテスクネ環） Ι Ο Ο μ Ιを添加し、 37°Cで、 1 6時間反応させた。 得られた反応液は実施例 1と同様に、 薄層クロマトグラフィ一で展開し、 オル シノール硫酸により発色させた後、 イメージングデンシトメ一ター （バイオーラ ッド社製） で、 GM 1のリゾ体の収率の定量を行った。 その結果を表 4に示す： 界面活性剤の最終濃度は反応系に対し、 0. 1重量。 /。で使用した。 下記表 4記 載の界面活性剤中、 Triton X-1001"はピアス社製であり、 その他はすべてナカ ライテスタ である。
表 4
界面活性剤 リゾ体の収率 （％) Triton X-IOO^ 3 9
Tween 20™ 5 1
Tween 80™ 6 9
Nonidet P - 40™ 64
Brij-58™ 6 5
Lubrol PX™ 6 7
実施例 1 0
タウロデオキシコール酸ナトリゥムと各種界面活性剤の混合によるリゾ体の収 率の検討
シユードモナス属細菌由来 S CDase [ジャーナル 'ォブ'バイオロジカル ' ケミストリー、 第 270卷、 第 24370 〜24374 頁 （1995) ；特開平 8— 84 5 8 7 号公報〕 0. 5mU、 0. 8%タウロデオキシコール酸ナトリウム、 各種界面活 性剤および l O nmo l GM1 (マトレャ社製） を含む 5 0 mM酢酸緩衝液 (p H 6. 0) 1 0 μ 1に、 n—ヘプタデカン （ナカライテスク ） 1 00 1を添加し、 3 7°Cで、 1 6時間反応させた。 なお、 コントロールとして、 タウ ロデオキシコール酸ナトリゥムのみのものも同時に反応させた。
得られた反応液は実施例 1と同様に、 薄層クロマトグラフィーで展開し、 オル シノール硫酸により発色させた後、 イメージングデンシトメ一ター （バイオーラ ッド社製） で、 GM 1のリゾ体の収率の定量を行った。 その結果を表 5に示す。 混合した界面活性剤の最終濃度は反応系に対して 0. 1重量。/。で使用した: 下 記表 5記載の界面活性剤中、 Triton X- 100™はピアス社製であり、 その他は全 てナカライテスタ tt である。
表 5 混合した界面活性剤 リゾ体の収率 （％) iン卜口一ル 5 3 Triton X- 1001' 7 0 Nonidet Ρ-40Γ 6 8 Tween 20™ 48
Tween 80™ 50
Brij- 58™ 53
Lubrol PX™ 57 実施例 1 1
リゾガングリオシド GM 3の生産
ガングリオシド GM 3 (マトレャ社製） 10mgを 0. 8%タウロデオキシコ —ル酸ナトリウムを含む 5 OmM酢酸緩衝液 （p H6. 0) 10mlに溶解して 20 Om 1ナシ型フラスコ中に入れ、 ついで S CDase2 Uを添加した。 ここに nーデカン 100 m 1を重層し、 静置状態で 1 6時間、 37 °Cで保温した。 水相 に S CDase 1 Uを追加して、 さらに 16時間、 37 °Cで保温した。 このときの ガングリオシド GM 3の分解率は 95 %であった。
反応終了後、 水相を回収して 2等分し、 これを逆相クロマトグラフィによる精 製に供した。 POROS R2H(04. 6 X 100 mm、 パーセプティブ社 製）カラムに水相を添加し、 ァセトニトリル：水 = 10 ： 90からァセトニトリ ノレ：メタノール = 10 : 90へのグラジェント溶出を行った。 溶出されたリゾガ ングリオシド GM 3画分を回収し濃縮乾燥した。 その結果薄層クロマトグラフィ 一による展開後オルシノ一ル硫酸および重クロム酸 ·硫酸混液による発色で純度 95 %以上のリゾ体 5. 6mgを得ることができた。
以上記載したごとく、 本発明の製造方法により、 効率よく簡便に、 かつ高純度 なリゾスフィンゴ脂質を工業的に大量調製することが可能となった。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . スフインゴ脂質のスフインゴィドと脂肪酸との酸ァミ ド結合を特異的 に加水分解する酵素を用いたリゾスフインゴ脂質の製造方法において、 水相と分 離相を形成する少なくとも 1種類の有機溶媒を含有する 2相系反応液中で、 酵素 反応を行うことを特徴とするリゾスフインゴ脂質の製造方法。
2 . 少なくとも 1種類の界面活性剤の存在下に、 酵素反応を行う請求項 1 記載のリゾスフインゴ脂質の製造方法。
3 . 有機溶媒が、 炭化水素、 アルコール、 エステルまたはエーテルから選 択される有機溶媒である請求項 1または 2記載のリゾスフインゴ脂質の製造方法。
4 . 炭化水素が、 炭素数 6以上の炭化水素である請求項 3記載のリゾスフ インゴ脂質の製造方法。
5 . アルコールが、 炭素数 8以上のアルコールである請求項 3記載のリゾ スフインゴ脂質の製造方法。
6 . エステルが、 炭素数 6以上のカルボ n酸部分と、 炭素数 2以上のアル コ一ルから構成されるエステルである請求項 3記載のリゾスフインゴ脂質の製造 方法。
7 . エーテノレが、 フエニルエーテル、 エチレングリコーノレジェチノレエーテ ノレ、 ジィソプロピルエーテルおよびビエルェチルェ一テルからなる群から選択さ れるェ一テルである請求項 3記載の製造方法。
8 . 界面活性剤が、 ステロイ ド骨格を有する界面活性剤、 ポリオキシェチ レンアルキルフエニルエーテル、 ボリォキシエチレンソノレビタンアルキノレエ一テ ルおよびホリォキシエチレンアルキルェ一テルからなる群から選択される請求項 2記載のリゾスフインゴ脂質の製造方法。
9 . 請求項 1 〜 8のレ、ずれか 1項に記載の製造方法により得られるリゾス フインゴ脂質。
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