JPH10257884A - スフィンゴ脂質セラミドn−デアシラーゼ - Google Patents
スフィンゴ脂質セラミドn−デアシラーゼInfo
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- JPH10257884A JPH10257884A JP9083387A JP8338797A JPH10257884A JP H10257884 A JPH10257884 A JP H10257884A JP 9083387 A JP9083387 A JP 9083387A JP 8338797 A JP8338797 A JP 8338797A JP H10257884 A JPH10257884 A JP H10257884A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラ
ーゼ、それを用いてリゾスフィンゴ脂質、スフィンゴ脂
質又はスフィンゴ脂質誘導体を製造する方法を提供す
る。 【解決手段】 分子内セラミドに作用して、リゾスフィ
ンゴ脂質と脂肪酸を生成する作用、セラミド、スフィン
ゴ糖脂質及びスフィンゴリン脂質に作用する基質特異
性、及び8〜10の至適pHをもつスフィンゴ脂質セラ
ミドN−デアシラーゼ。該酵素でスフィンゴ脂質を処理
するリゾスフィンゴ脂質の製造方法。該酵素を触媒とし
て用いて、スフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導
体を製造する方法。
ーゼ、それを用いてリゾスフィンゴ脂質、スフィンゴ脂
質又はスフィンゴ脂質誘導体を製造する方法を提供す
る。 【解決手段】 分子内セラミドに作用して、リゾスフィ
ンゴ脂質と脂肪酸を生成する作用、セラミド、スフィン
ゴ糖脂質及びスフィンゴリン脂質に作用する基質特異
性、及び8〜10の至適pHをもつスフィンゴ脂質セラ
ミドN−デアシラーゼ。該酵素でスフィンゴ脂質を処理
するリゾスフィンゴ脂質の製造方法。該酵素を触媒とし
て用いて、スフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導
体を製造する方法。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なスフィンゴ脂
質セラミドN−デアシラーゼに関する。また、該スフィ
ンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼを用いて、酵素学的
にリゾスフィンゴ脂質を製造する方法、更には少なくと
も異なる2種のスフィンゴ脂質、あるいはリゾスフィン
ゴ脂質と脂肪族カルボン酸又は脂肪族カルボン酸誘導体
とを、該酵素と酵素的に反応させることによるスフィン
ゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体を製造する方法に
関する。
質セラミドN−デアシラーゼに関する。また、該スフィ
ンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼを用いて、酵素学的
にリゾスフィンゴ脂質を製造する方法、更には少なくと
も異なる2種のスフィンゴ脂質、あるいはリゾスフィン
ゴ脂質と脂肪族カルボン酸又は脂肪族カルボン酸誘導体
とを、該酵素と酵素的に反応させることによるスフィン
ゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体を製造する方法に
関する。
【0002】
【従来の技術】従来、糖脂質中の分子内セラミドに作用
してこのセラミド部分をスフィンゴシン塩基と脂肪酸と
に加水分解し、リゾ糖脂質と脂肪酸を生成する酵素とし
て、ノカルディア属(Nocardia)に属する微生物が生産
する酵素(特開昭64−60379号公報)が知られて
いる。この酵素は糖脂質セラミドデアシラーゼと命名さ
れているが〔ジャーナル オブ バイオケミストリー
(Journal of Biochemistry)、第103巻、第1〜4頁
(1988)〕、GD1a、GM1、GM2、GM3等
のいわゆる酸性糖脂質であるガングリオシドには作用す
るが、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミドには
全く作用せず、ラクトシルセラミド、Gb3、あるいは
アシアロ(asialo) GM1等の中性糖脂質にはほとんど
作用しない。また、セラミドのスフィンゴシン塩基と脂
肪酸との結合を加水分解する酵素がセラミダーゼ(Cera
midase ;EC3.5.1.23)と称されているが〔ジ
ャーナル オブ バイオロジカルケミストリー(Journa
l of Biological Chemistry)、第241巻、第3731
〜3737頁(1966)、バイオケミストリー(Bioc
hemistry) 、第8巻、第1692〜1698頁(196
9)、バイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ(Bi
ochimica et Biophysica Acta)、第176巻、第339
〜347頁(1969)、サイエンス(Science)、第1
78巻、第1100〜1102頁(1972)〕、この
酵素は糖脂質のセラミド部分のスフィンゴシン塩基と脂
肪酸との結合を加水分解することはできない。すなわ
ち、これらの酵素では中性糖脂質のセラミド部分のスフ
ィンゴシン塩基と脂肪酸との結合を加水分解することは
できなかった。また、スフィンゴ脂質全般に作用する酵
素としてシュードモナス(Pseudomonas )属に属する細
菌が生産する酵素〔特開平8−84587号公報、ジャ
ーナルオブ バイオロジカル ケミストリー、第270
巻、第24370〜243742頁(1995)〕が知
られている。この酵素は中性糖脂質、酸性糖脂質及びス
フィンゴミエリンに作用するがセラミドには非常に作用
しにくい。
してこのセラミド部分をスフィンゴシン塩基と脂肪酸と
に加水分解し、リゾ糖脂質と脂肪酸を生成する酵素とし
て、ノカルディア属(Nocardia)に属する微生物が生産
する酵素(特開昭64−60379号公報)が知られて
いる。この酵素は糖脂質セラミドデアシラーゼと命名さ
れているが〔ジャーナル オブ バイオケミストリー
(Journal of Biochemistry)、第103巻、第1〜4頁
(1988)〕、GD1a、GM1、GM2、GM3等
のいわゆる酸性糖脂質であるガングリオシドには作用す
るが、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミドには
全く作用せず、ラクトシルセラミド、Gb3、あるいは
アシアロ(asialo) GM1等の中性糖脂質にはほとんど
作用しない。また、セラミドのスフィンゴシン塩基と脂
肪酸との結合を加水分解する酵素がセラミダーゼ(Cera
midase ;EC3.5.1.23)と称されているが〔ジ
ャーナル オブ バイオロジカルケミストリー(Journa
l of Biological Chemistry)、第241巻、第3731
〜3737頁(1966)、バイオケミストリー(Bioc
hemistry) 、第8巻、第1692〜1698頁(196
9)、バイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ(Bi
ochimica et Biophysica Acta)、第176巻、第339
〜347頁(1969)、サイエンス(Science)、第1
78巻、第1100〜1102頁(1972)〕、この
酵素は糖脂質のセラミド部分のスフィンゴシン塩基と脂
肪酸との結合を加水分解することはできない。すなわ
ち、これらの酵素では中性糖脂質のセラミド部分のスフ
ィンゴシン塩基と脂肪酸との結合を加水分解することは
できなかった。また、スフィンゴ脂質全般に作用する酵
素としてシュードモナス(Pseudomonas )属に属する細
菌が生産する酵素〔特開平8−84587号公報、ジャ
ーナルオブ バイオロジカル ケミストリー、第270
巻、第24370〜243742頁(1995)〕が知
られている。この酵素は中性糖脂質、酸性糖脂質及びス
フィンゴミエリンに作用するがセラミドには非常に作用
しにくい。
【0003】スフィンゴ脂質は、スフィンゴ糖脂質、ス
フィンゴリン脂質(スフィンゴホスホノリピドを含
む)、セラミド、を含む長鎖塩基スフィンゴイドを持つ
脂質の総称であり、スフィンゴイドのアミノ基に不均一
な鎖長の長鎖脂肪酸を酸アミド結合したセラミドを共通
構造としてもち、下等動物から高等動物にまで広く分布
している。これらスフィンゴ脂質は近年、細胞の増殖、
分化誘導、アポトーシス等のような生物活性において重
要な役割に関与していることが明らかにされつつある。
また、細胞表層の構成成分であることから化粧料等への
添加物としても使用されつつある。また、スフィンゴ脂
質のスフィンゴイドのアミノ基に酸アミド結合した脂肪
酸を欠くスフィンゴ脂質のN−脱アシル体はリゾスフィ
ンゴ脂質と呼ばれ、スフィンゴ脂質と同様な生物活性を
持つことが明らかにされつつある。従来知られているリ
ゾスフィンゴ脂質の製造方法については、化学的方法、
酵素を用いる方法、微生物を用いる方法が知られてい
る。化学的方法としては、ヒドラジン分解法やアルコー
ル系溶媒中でのアルカリ加水分解法が知られている。し
かし、これらの方法ではアミノ糖を含むスフィンゴ糖脂
質の場合、糖鎖部分のアミド結合が分解されてデ−N−
アセチルリゾ糖脂質を生じる。またシアル酸を含む糖脂
質(ガングリオシド)の場合、シアル酸部分の脱アシル
化反応が同時に進行する。そのため、脱アシル化後、脂
質部分のアミノ基に保護基を選択的に導入した後、シア
ル酸部分の再アシル化を行い、その後、保護基を外す必
要がある。これらの一連の化学操作では、様々な副生成
物が生じ、多くの手間と技術的な熟練を要する。しか
も、現在の化学的手法ではシアル酸を複数有する例えば
GQ1bのようなポリシアロガングリオシドからリゾ体
を調製することは非常に困難である。一方、酵素を用い
る方法としては、ノカルディア属放線菌の生産するガン
グリオシドセラミダーゼを用いる方法(特開昭64−6
0379号公報)、ロドコッカス(Rhodococcus)属放線
菌の生産する酵素又は菌体処理物を用いる方法(特開平
6−78782号公報)、シュードモナス属細菌の生産
するスフィンゴリピドセラミドデアシラーゼを用いる方
法(特開平8−84587号公報)が知られている。こ
れらの方法では、得られるリゾスフィンゴ脂質は用いる
酵素の基質特異性に左右されるため、目的のリゾスフィ
ンゴ脂質を得るには制限がある。微生物又はその抽出物
を用いる方法として、グリゴスフィンゴリピドセラミド
デアシラーゼ生産能を有するストレプトミセス(Strept
omyces)属放線菌を用いる方法(特開平7−10798
8号公報)が知られているが、効率が悪く、また、基質
特異性により得られるリゾスフィンゴ脂質に制限があ
る。また、リゾスフィンゴ脂質を生物学的に得る方法が
知られている(特開平6−78782号公報)。この方
法では、目的とするリゾスフィンゴ脂質以外に多くの副
産物が生じる。そのため、これら副産物を取り除く必要
があり、工業的にもその操作のステップ、収率の点で問
題があった。
フィンゴリン脂質(スフィンゴホスホノリピドを含
む)、セラミド、を含む長鎖塩基スフィンゴイドを持つ
脂質の総称であり、スフィンゴイドのアミノ基に不均一
な鎖長の長鎖脂肪酸を酸アミド結合したセラミドを共通
構造としてもち、下等動物から高等動物にまで広く分布
している。これらスフィンゴ脂質は近年、細胞の増殖、
分化誘導、アポトーシス等のような生物活性において重
要な役割に関与していることが明らかにされつつある。
また、細胞表層の構成成分であることから化粧料等への
添加物としても使用されつつある。また、スフィンゴ脂
質のスフィンゴイドのアミノ基に酸アミド結合した脂肪
酸を欠くスフィンゴ脂質のN−脱アシル体はリゾスフィ
ンゴ脂質と呼ばれ、スフィンゴ脂質と同様な生物活性を
持つことが明らかにされつつある。従来知られているリ
ゾスフィンゴ脂質の製造方法については、化学的方法、
酵素を用いる方法、微生物を用いる方法が知られてい
る。化学的方法としては、ヒドラジン分解法やアルコー
ル系溶媒中でのアルカリ加水分解法が知られている。し
かし、これらの方法ではアミノ糖を含むスフィンゴ糖脂
質の場合、糖鎖部分のアミド結合が分解されてデ−N−
アセチルリゾ糖脂質を生じる。またシアル酸を含む糖脂
質(ガングリオシド)の場合、シアル酸部分の脱アシル
化反応が同時に進行する。そのため、脱アシル化後、脂
質部分のアミノ基に保護基を選択的に導入した後、シア
ル酸部分の再アシル化を行い、その後、保護基を外す必
要がある。これらの一連の化学操作では、様々な副生成
物が生じ、多くの手間と技術的な熟練を要する。しか
も、現在の化学的手法ではシアル酸を複数有する例えば
GQ1bのようなポリシアロガングリオシドからリゾ体
を調製することは非常に困難である。一方、酵素を用い
る方法としては、ノカルディア属放線菌の生産するガン
グリオシドセラミダーゼを用いる方法(特開昭64−6
0379号公報)、ロドコッカス(Rhodococcus)属放線
菌の生産する酵素又は菌体処理物を用いる方法(特開平
6−78782号公報)、シュードモナス属細菌の生産
するスフィンゴリピドセラミドデアシラーゼを用いる方
法(特開平8−84587号公報)が知られている。こ
れらの方法では、得られるリゾスフィンゴ脂質は用いる
酵素の基質特異性に左右されるため、目的のリゾスフィ
ンゴ脂質を得るには制限がある。微生物又はその抽出物
を用いる方法として、グリゴスフィンゴリピドセラミド
デアシラーゼ生産能を有するストレプトミセス(Strept
omyces)属放線菌を用いる方法(特開平7−10798
8号公報)が知られているが、効率が悪く、また、基質
特異性により得られるリゾスフィンゴ脂質に制限があ
る。また、リゾスフィンゴ脂質を生物学的に得る方法が
知られている(特開平6−78782号公報)。この方
法では、目的とするリゾスフィンゴ脂質以外に多くの副
産物が生じる。そのため、これら副産物を取り除く必要
があり、工業的にもその操作のステップ、収率の点で問
題があった。
【0004】一方、スフィンゴリン脂質であるスフィン
ゴミエリンのリゾ体を得る方法としては化学的方法と酵
素的方法が知られており、化学的方法としてアルコール
系溶媒中での塩酸加水分解に依る方法が一般に用いられ
る。しかしこの方法によると天然型のD−エリトロ(D-
erythro)(2S,3R)だけではなくL−トレオ(L-threo)
(2S,3S)の立体異性体が生じてしまい、天然型のD−エ
リトロ(D-erythro)(2S,3R)を得るためには収率の点で
不利でありまたこれらを分離することは非常に困難であ
った。更にコリンリン酸基が外れる可能性があり、収率
の点で問題がある。また、一般に天然のスフィンゴ脂質
のセラミド部分の長鎖脂肪酸の鎖長は、不均一でかなり
の多様性があることから、単一分子からなるスフィンゴ
脂質を得ることは困難である。
ゴミエリンのリゾ体を得る方法としては化学的方法と酵
素的方法が知られており、化学的方法としてアルコール
系溶媒中での塩酸加水分解に依る方法が一般に用いられ
る。しかしこの方法によると天然型のD−エリトロ(D-
erythro)(2S,3R)だけではなくL−トレオ(L-threo)
(2S,3S)の立体異性体が生じてしまい、天然型のD−エ
リトロ(D-erythro)(2S,3R)を得るためには収率の点で
不利でありまたこれらを分離することは非常に困難であ
った。更にコリンリン酸基が外れる可能性があり、収率
の点で問題がある。また、一般に天然のスフィンゴ脂質
のセラミド部分の長鎖脂肪酸の鎖長は、不均一でかなり
の多様性があることから、単一分子からなるスフィンゴ
脂質を得ることは困難である。
【0005】スフィンゴ脂質の長鎖脂肪酸を修飾あるい
は置換したスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の
製造方法は、リゾスフィンゴ脂質を出発原料として、科
学的、酵素的に合成する方法が知られている。化学的方
法としては、リゾ体のアミノ基に以下の様な方法で脂肪
酸あるいは脂肪酸誘導体を縮合させる方法がある。例え
ば、脂肪酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル等
の脂肪酸活性エステルを用いる方法、脂肪酸とカルボニ
ルジイミダゾールやジシクロヘキシルカルボジイミドな
どのカップリング試薬を用いる方法、脂肪酸の無水物を
用いる方法、脂肪酸塩化物を用いる方法などが知られて
いる。酸性糖脂質のリゾ体としてリゾガングリオシドを
用いる方法〔メソッズ インエンザイモロジー(Method
s in Enzymology) 第138巻、第319〜341頁
(1987)、特開平2−200697号及び特開平7
−309888号〕、スフィンゴシルホスホリルコリン
(リゾスフィンゴミエリン)を用いる方法〔ジャーナル
オブ リピッド リサーチ(Journal of Lipid Resea
rch)、第28巻、第710〜718頁(1987)〕が
知られている。これらの方法によるとO−アシル化等の
副反応が起こる場合があり、選択的にN−アシル化され
た物質を得るためには保護基の使用、精製等に煩雑な操
作が必要である。また、スフィンゴホスホノリピドの一
種セラミドシリアチンやアミノ糖を含むスフィンゴ糖脂
質を化学的に脱アシル化して得られるデ−N−アセチル
リゾガングリオシドのようにスフィンゴイドのアミノ基
以外にアミノ基をもつスフィンゴ脂質のスフィンゴイド
のアミノ基だけを選択的にアシル化したいときには保護
基の導入、部分的アシル化、アシル化後の部分的脱アシ
ル化といった操作、あるいはデ−N−アセチルリゾガン
グリオシドをリポソームに取り込ませた後、選択的にN
−アシル化する等の煩雑な操作が必要であり困難を伴
う。一方、酵素的合成方法は、有機溶媒中でリパーゼに
より縮合を行う方法(国際公開番号WO94/2691
9)が知られているが、実質的に無水の有機溶媒が必要
であり、基質の溶解性により基質が限定される。また、
セラミド及びハイブリッドセラミドの酵素的合成方法
(国際公開番号WO94/26919)も知られている
が、反応も特異的なものではなくO−アシル化物の生成
が見出されており、また化学的合成方法と同様に複数の
アミノ基をもつ場合、スフィンゴイドのアミノ基だけに
特異的に作用させることは困難である。
は置換したスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の
製造方法は、リゾスフィンゴ脂質を出発原料として、科
学的、酵素的に合成する方法が知られている。化学的方
法としては、リゾ体のアミノ基に以下の様な方法で脂肪
酸あるいは脂肪酸誘導体を縮合させる方法がある。例え
ば、脂肪酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル等
の脂肪酸活性エステルを用いる方法、脂肪酸とカルボニ
ルジイミダゾールやジシクロヘキシルカルボジイミドな
どのカップリング試薬を用いる方法、脂肪酸の無水物を
用いる方法、脂肪酸塩化物を用いる方法などが知られて
いる。酸性糖脂質のリゾ体としてリゾガングリオシドを
用いる方法〔メソッズ インエンザイモロジー(Method
s in Enzymology) 第138巻、第319〜341頁
(1987)、特開平2−200697号及び特開平7
−309888号〕、スフィンゴシルホスホリルコリン
(リゾスフィンゴミエリン)を用いる方法〔ジャーナル
オブ リピッド リサーチ(Journal of Lipid Resea
rch)、第28巻、第710〜718頁(1987)〕が
知られている。これらの方法によるとO−アシル化等の
副反応が起こる場合があり、選択的にN−アシル化され
た物質を得るためには保護基の使用、精製等に煩雑な操
作が必要である。また、スフィンゴホスホノリピドの一
種セラミドシリアチンやアミノ糖を含むスフィンゴ糖脂
質を化学的に脱アシル化して得られるデ−N−アセチル
リゾガングリオシドのようにスフィンゴイドのアミノ基
以外にアミノ基をもつスフィンゴ脂質のスフィンゴイド
のアミノ基だけを選択的にアシル化したいときには保護
基の導入、部分的アシル化、アシル化後の部分的脱アシ
ル化といった操作、あるいはデ−N−アセチルリゾガン
グリオシドをリポソームに取り込ませた後、選択的にN
−アシル化する等の煩雑な操作が必要であり困難を伴
う。一方、酵素的合成方法は、有機溶媒中でリパーゼに
より縮合を行う方法(国際公開番号WO94/2691
9)が知られているが、実質的に無水の有機溶媒が必要
であり、基質の溶解性により基質が限定される。また、
セラミド及びハイブリッドセラミドの酵素的合成方法
(国際公開番号WO94/26919)も知られている
が、反応も特異的なものではなくO−アシル化物の生成
が見出されており、また化学的合成方法と同様に複数の
アミノ基をもつ場合、スフィンゴイドのアミノ基だけに
特異的に作用させることは困難である。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
知られているスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ
と異なる基質特異性の酵素、特にセラミド、スフィンゴ
糖脂質及びスフィンゴリン脂質によく作用するスフィン
ゴ脂質セラミドN−デアシラーゼを提供することにあ
る。また、該スフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ
を用いたリゾスフィンゴ脂質を酵素学的に、工業的に製
造する方法を提供することにある。更には、該スフィン
ゴ脂質セラミドN−デアシラーゼの逆反応を用いたスフ
ィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体の製造方法を
提供することにある。
知られているスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ
と異なる基質特異性の酵素、特にセラミド、スフィンゴ
糖脂質及びスフィンゴリン脂質によく作用するスフィン
ゴ脂質セラミドN−デアシラーゼを提供することにあ
る。また、該スフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ
を用いたリゾスフィンゴ脂質を酵素学的に、工業的に製
造する方法を提供することにある。更には、該スフィン
ゴ脂質セラミドN−デアシラーゼの逆反応を用いたスフ
ィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体の製造方法を
提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第1の発明は、下記の理化学的性質を有すること
を特徴とするスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ
に関する。 (1)作用:スフィンゴ脂質中の分子内セラミドに作用
して、スフィンゴシン塩基と脂肪酸とに加水分解し、リ
ゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を生成する。 (2)基質特異性:セラミド、スフィンゴ糖脂質及びス
フィンゴリン脂質に作用する。 (3)至適pH:至適pHが8〜10である。 また、本発明の第2の発明は、上記第1の発明のスフィ
ンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼを用いてスフィンゴ
脂質を処理することを特徴とするリゾスフィンゴ脂質の
製造方法に関する。また、本発明の第3の発明は、スフ
ィンゴ脂質を、前記第1の発明のスフィンゴ脂質セラミ
ドN−デアシラーゼの生産能を有する微生物と接触させ
ることを特徴とするリゾスフィンゴ脂質の製造方法に関
する。更に、本発明の第4の発明は、少なくとも異なる
2種のスフィンゴ脂質、あるいはリゾスフィンゴ脂質と
脂肪族カルボン酸又は脂肪族カルボン酸誘導体とを、前
記第1の発明のスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラー
ゼを用いて酵素的に反応させ、スフィンゴ脂質あるいは
スフィンゴ脂質誘導体を得ることを特徴とするスフィン
ゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の製造方法に関する。
発明の第1の発明は、下記の理化学的性質を有すること
を特徴とするスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ
に関する。 (1)作用:スフィンゴ脂質中の分子内セラミドに作用
して、スフィンゴシン塩基と脂肪酸とに加水分解し、リ
ゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を生成する。 (2)基質特異性:セラミド、スフィンゴ糖脂質及びス
フィンゴリン脂質に作用する。 (3)至適pH:至適pHが8〜10である。 また、本発明の第2の発明は、上記第1の発明のスフィ
ンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼを用いてスフィンゴ
脂質を処理することを特徴とするリゾスフィンゴ脂質の
製造方法に関する。また、本発明の第3の発明は、スフ
ィンゴ脂質を、前記第1の発明のスフィンゴ脂質セラミ
ドN−デアシラーゼの生産能を有する微生物と接触させ
ることを特徴とするリゾスフィンゴ脂質の製造方法に関
する。更に、本発明の第4の発明は、少なくとも異なる
2種のスフィンゴ脂質、あるいはリゾスフィンゴ脂質と
脂肪族カルボン酸又は脂肪族カルボン酸誘導体とを、前
記第1の発明のスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラー
ゼを用いて酵素的に反応させ、スフィンゴ脂質あるいは
スフィンゴ脂質誘導体を得ることを特徴とするスフィン
ゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の製造方法に関する。
【0008】本発明者らは、スフィンゴ脂質関連酵素を
得るために、種々のサンプルをスクリーニングに用い
た。このスクリーニングの過程で、驚くべきことに、セ
ラミド及び糖脂質を同程度にスフィンゴシン塩基と脂肪
酸とに加水分解し、それらのリゾ体と脂肪酸を生成す
る、従来知られていない新規なスフィンゴ脂質セラミド
N−デアシラーゼ活性を見出した。更に、本発明者ら
が、鋭意検討を行った結果、本発明の酵素を生産する微
生物を特定し、該酵素の理化学的性質を明らかにした。
また、該酵素を用いてスフィンゴ脂質を処理することに
より、リゾスフィンゴ脂質を効率よく製造することに成
功し、更に該酵素の逆反応活性を見出し、該反応を用い
てスフィンゴ脂質及びスフィンゴ脂質誘導体を製造する
ことにも成功し、本発明を完成させた。
得るために、種々のサンプルをスクリーニングに用い
た。このスクリーニングの過程で、驚くべきことに、セ
ラミド及び糖脂質を同程度にスフィンゴシン塩基と脂肪
酸とに加水分解し、それらのリゾ体と脂肪酸を生成す
る、従来知られていない新規なスフィンゴ脂質セラミド
N−デアシラーゼ活性を見出した。更に、本発明者ら
が、鋭意検討を行った結果、本発明の酵素を生産する微
生物を特定し、該酵素の理化学的性質を明らかにした。
また、該酵素を用いてスフィンゴ脂質を処理することに
より、リゾスフィンゴ脂質を効率よく製造することに成
功し、更に該酵素の逆反応活性を見出し、該反応を用い
てスフィンゴ脂質及びスフィンゴ脂質誘導体を製造する
ことにも成功し、本発明を完成させた。
【0009】
【発明の実施の形態】以下、本発明について具体的に説
明する。本発明のスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラ
ーゼの製造方法は特に限定されるものではなく、本発明
のスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ生産能を有
する微生物、若しくは細胞等でよい。例えば、非発酵性
グラム陰性桿菌AI−2が挙げられる。本菌株は、本発
明者らがアトピー性皮膚炎の増悪にスフィンゴ脂質セラ
ミドN−デアシラーゼ活性が関与しているのではないか
と考え、アトピー性皮膚炎患者の落屑を採取し、新たに
検索した結果得た菌株であり、その菌学的性質は以下の
とおりである。
明する。本発明のスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラ
ーゼの製造方法は特に限定されるものではなく、本発明
のスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ生産能を有
する微生物、若しくは細胞等でよい。例えば、非発酵性
グラム陰性桿菌AI−2が挙げられる。本菌株は、本発
明者らがアトピー性皮膚炎の増悪にスフィンゴ脂質セラ
ミドN−デアシラーゼ活性が関与しているのではないか
と考え、アトピー性皮膚炎患者の落屑を採取し、新たに
検索した結果得た菌株であり、その菌学的性質は以下の
とおりである。
【0010】(1)形態:桿菌 (2)グラム染色性:陰性 (3)胞子:陰性 (4)運動性:陽性 (5)鞭毛:極短毛 (6)酸素に対する態度:好気性 (7)オキシダーゼ:陽性 (8)カタラーゼ:陽性 (9)OFテスト:O (10)集落の色調:特徴的集落色素を生成せず (11)蛍光色素の生成:陰性 (12)水溶性色素の生成:陰性 (13)栄養要求性:陽性 (14)PHBの蓄積:陰性 (15)40度での生育:陽性 (16)アルギニンジヒドロラーゼ:陰性 (17)ゼラチンの液化:陽性 (18)でんぷんの分解:陰性 (19)Tween 80の分解:陰性 (20)資化性 グルコース:陽性 βーヒドロキシ酪酸:陰性 (21)キノン系:Q−8 (22)GC含量:68% この結果、本菌株は極鞭毛を有するオキシダーゼ陽性の
非発酵性グラム陰性桿菌であり、シュードモナス RN
A groupV及びステノトロフォモナス(Stenotro
phomonas)属に属するのではないか考えられたが、その
性状が完全には一致せず、新菌株の可能性が示唆され
た。
非発酵性グラム陰性桿菌であり、シュードモナス RN
A groupV及びステノトロフォモナス(Stenotro
phomonas)属に属するのではないか考えられたが、その
性状が完全には一致せず、新菌株の可能性が示唆され
た。
【0011】本菌株は、AI−2と命名、表示され、工
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−16
124として寄託されている。
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−16
124として寄託されている。
【0012】本発明の酵素は、例えば上述した菌株を栄
養培地中で培養し、培養後の培養物から酵素を分離する
ことによって得られる。培地に加える栄養源は、該菌株
が利用し本発明の酵素を生産するものであればよく、炭
素源としては例えば、グリセロール、グルコース、スク
ロース、糖蜜等が利用でき、窒素源としては例えば、酵
母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、肉エキ
ス、脱脂大豆、硫安、硝酸アンモニウム等が適当であ
る。その他、ナトリウム塩、カリウム塩、リン酸塩、マ
グネシウム塩、亜鉛塩等の無機質及び金属塩を加えても
よい。また培地中にスフィンゴミエリンなどのスフィン
ゴ脂質を0.01〜0.5%添加して本発明の酵素の生
産性を高めることができる。本発明の酵素の生産菌を培
養するに当り、酵素の生産量は培養条件によって大きく
変動するが、一般的に培養温度は20〜35℃、培地の
pH6〜8が良く、1日から7日の通気かくはん培養で
本発明の酵素が生産される。培養条件は使用する菌株、
培地組成等に応じて本発明の酵素の生産量が最大になる
ように設定するのは当然のことである。上述した菌株に
よって生産された本発明の酵素は主に菌体外に存在する
ので、培養物を固液分離し、得られた上清を酵素液とし
て用いることができる。また、通常用いられる精製手段
により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩
析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
ー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、凍結乾燥等に
より精製することができる。酵素の純度は例えば、ポリ
アクリルアミドゲルディスク電気泳動法等によって検定
することができる。
養培地中で培養し、培養後の培養物から酵素を分離する
ことによって得られる。培地に加える栄養源は、該菌株
が利用し本発明の酵素を生産するものであればよく、炭
素源としては例えば、グリセロール、グルコース、スク
ロース、糖蜜等が利用でき、窒素源としては例えば、酵
母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、肉エキ
ス、脱脂大豆、硫安、硝酸アンモニウム等が適当であ
る。その他、ナトリウム塩、カリウム塩、リン酸塩、マ
グネシウム塩、亜鉛塩等の無機質及び金属塩を加えても
よい。また培地中にスフィンゴミエリンなどのスフィン
ゴ脂質を0.01〜0.5%添加して本発明の酵素の生
産性を高めることができる。本発明の酵素の生産菌を培
養するに当り、酵素の生産量は培養条件によって大きく
変動するが、一般的に培養温度は20〜35℃、培地の
pH6〜8が良く、1日から7日の通気かくはん培養で
本発明の酵素が生産される。培養条件は使用する菌株、
培地組成等に応じて本発明の酵素の生産量が最大になる
ように設定するのは当然のことである。上述した菌株に
よって生産された本発明の酵素は主に菌体外に存在する
ので、培養物を固液分離し、得られた上清を酵素液とし
て用いることができる。また、通常用いられる精製手段
により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩
析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
ー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、凍結乾燥等に
より精製することができる。酵素の純度は例えば、ポリ
アクリルアミドゲルディスク電気泳動法等によって検定
することができる。
【0013】本発明により得られるスフィンゴ脂質セラ
ミドN−デアシラーゼの酵素化学的及び理化学的性質は
次のとおりである。 (1)酵素活性の測定法: スフィンゴ脂質セラミドN
−デアシラーゼの酵素活性は測定は次のようにして行
う。終濃度1mMの14C放射性同位元素ラベルされた炭
素数16の脂肪酸を持つガラクトシルセラミド(14C−
GalCer)を基質とし、0.5%トリトン(Trito
n)X−100を含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH
7.5)20μl中で37℃で3時間反応させる。10
0μlのクロロホルム/メタノール(2:1)を加え反
応を止め、濃縮遠心機で反応液を濃縮し、これをTLC
プレート(シリカゲル60、メルク社製)にのせ、クロ
ロホルム/メタノール/0.02%塩化カルシウム水溶
液(5:4:1)で展開した後、イメージングアナライ
ザーBas1000(富士写真フィルム社製)を用いガ
ラクトシルセラミドの量を定量する。又は、最終濃度1
mMのガラクトシルセラミドを基質とし、0.5%トリ
トンX−100を含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH
7.5)20μl中で37℃で3時間反応させる。10
0μlのクロロホルム/メタノール/0.02%塩化カ
ルシウム水溶液(5:4:1)で展開した後、オルシノ
ール硫酸法で発色させ、クロマトスキャナー(島津CS
−9000、島津製作所社製)を用いて波長540nm
で定量する。活性単位は1分間に1nmolのガラクト
シルセラミドを分解する活性を1mUとする。
ミドN−デアシラーゼの酵素化学的及び理化学的性質は
次のとおりである。 (1)酵素活性の測定法: スフィンゴ脂質セラミドN
−デアシラーゼの酵素活性は測定は次のようにして行
う。終濃度1mMの14C放射性同位元素ラベルされた炭
素数16の脂肪酸を持つガラクトシルセラミド(14C−
GalCer)を基質とし、0.5%トリトン(Trito
n)X−100を含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH
7.5)20μl中で37℃で3時間反応させる。10
0μlのクロロホルム/メタノール(2:1)を加え反
応を止め、濃縮遠心機で反応液を濃縮し、これをTLC
プレート(シリカゲル60、メルク社製)にのせ、クロ
ロホルム/メタノール/0.02%塩化カルシウム水溶
液(5:4:1)で展開した後、イメージングアナライ
ザーBas1000(富士写真フィルム社製)を用いガ
ラクトシルセラミドの量を定量する。又は、最終濃度1
mMのガラクトシルセラミドを基質とし、0.5%トリ
トンX−100を含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH
7.5)20μl中で37℃で3時間反応させる。10
0μlのクロロホルム/メタノール/0.02%塩化カ
ルシウム水溶液(5:4:1)で展開した後、オルシノ
ール硫酸法で発色させ、クロマトスキャナー(島津CS
−9000、島津製作所社製)を用いて波長540nm
で定量する。活性単位は1分間に1nmolのガラクト
シルセラミドを分解する活性を1mUとする。
【0014】(2)作用: スフィンゴ脂質中の分子内
セラミドに作用して、スフィンゴシン塩基と脂肪酸とに
加水分解し、リゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を生成する。
更に、リゾスフィンゴ脂質のスフィンゴイドのアミノ基
への脂肪酸の再結合、あるいはスフィンゴ脂質のスフィ
ンゴイドに酸アミド結合する脂肪酸と別の脂肪酸との置
換を行い、スフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体を
生成する。
セラミドに作用して、スフィンゴシン塩基と脂肪酸とに
加水分解し、リゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を生成する。
更に、リゾスフィンゴ脂質のスフィンゴイドのアミノ基
への脂肪酸の再結合、あるいはスフィンゴ脂質のスフィ
ンゴイドに酸アミド結合する脂肪酸と別の脂肪酸との置
換を行い、スフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体を
生成する。
【0015】(3)基質特異性: (1)の酵素活性の
測定法に従い、14C放射性同位元素ラベルされた脂肪酸
を持つガラクトシルセラミド、ガングリオシドGM1、
スフィンゴミエリン、セラミドを基質とし、反応時間を
2時間と19時間で、本発明の基質特異性を調べたとこ
ろ、下記表1に示すように、スフィンゴ糖脂質、スフィ
ンゴリン脂質及びセラミドに作用して、リゾスフィンゴ
脂質と脂肪酸を生成する。特にセラミド及びセラミドに
単糖が結合したガラクトシルセラミドによく作用する。
表1中、ガングリオシドGM1は、ウシ脳から調製し
〔メソッズ インエンザイモロジー、第83巻、第13
9〜191頁(1982)〕、その他の基質は、シグマ
社製である。
測定法に従い、14C放射性同位元素ラベルされた脂肪酸
を持つガラクトシルセラミド、ガングリオシドGM1、
スフィンゴミエリン、セラミドを基質とし、反応時間を
2時間と19時間で、本発明の基質特異性を調べたとこ
ろ、下記表1に示すように、スフィンゴ糖脂質、スフィ
ンゴリン脂質及びセラミドに作用して、リゾスフィンゴ
脂質と脂肪酸を生成する。特にセラミド及びセラミドに
単糖が結合したガラクトシルセラミドによく作用する。
表1中、ガングリオシドGM1は、ウシ脳から調製し
〔メソッズ インエンザイモロジー、第83巻、第13
9〜191頁(1982)〕、その他の基質は、シグマ
社製である。
【0016】
【表1】 表 1 ───────────────────────────── 基 質 反応時間 分解率 (時間) (%) ───────────────────────────── ガラクトシルセラミド 2 15.8 19 42.5 セラミド 2 8.9 19 23.3 ガングリオシドGM1 2 0.2 19 0.4 スフィンゴミエリン 2 0.7 19 1.8 ─────────────────────────────
【0017】(4)至適pH: 本発明の酵素の至適p
Hは図1に示すように8〜10付近に高い活性を有して
いる。活性測定に用いる緩衝液は、0.15MGTA緩
衝液〔50mMジメチルグルタル酸、50mMトリス
(ヒドロキシメチル)アミノメタン、50mM2−アミ
ノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール〕を塩酸又
はNaOHを用いてpHを変化させて用いる。図1は本
発明の酵素の至適pHを示す図であり、縦軸は分解率
(%)、横軸は反応pHを示す。
Hは図1に示すように8〜10付近に高い活性を有して
いる。活性測定に用いる緩衝液は、0.15MGTA緩
衝液〔50mMジメチルグルタル酸、50mMトリス
(ヒドロキシメチル)アミノメタン、50mM2−アミ
ノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール〕を塩酸又
はNaOHを用いてpHを変化させて用いる。図1は本
発明の酵素の至適pHを示す図であり、縦軸は分解率
(%)、横軸は反応pHを示す。
【0018】(5)分子量 本発明の酵素の分子量は、スーパーデックス 200
〔Superdex 200、ファルマシア バイオテク(Pharmaci
a Biotech)社製〕カラム、0.1M塩化ナトリウム及び
0.3%ルブロールPXを含む20mMリン酸緩衝液
(pH6.8)を用い、流速0.5ml/minの条件
のゲルろ過法により、約152000を示す。
〔Superdex 200、ファルマシア バイオテク(Pharmaci
a Biotech)社製〕カラム、0.1M塩化ナトリウム及び
0.3%ルブロールPXを含む20mMリン酸緩衝液
(pH6.8)を用い、流速0.5ml/minの条件
のゲルろ過法により、約152000を示す。
【0019】本発明の酵素を用いて、リゾスフィンゴ脂
質を製造するには、該酵素が作用するスフィンゴ脂質で
あればいかなるものでも基質として用いることができ
る。例えば、酸性糖脂質としてはGM1等の各種ガング
リオシド及びスルファチド、中性糖脂質としてはアシア
ロGM1、セレブロシド等、スフィンゴリン脂質として
スフィンゴミエリンが挙げられる。またセラミドも基質
として用いることができる。これらの基質を緩衝液中に
懸濁させ、本酵素を作用させることで各種のリゾスフィ
ンゴ脂質を得ることができる。例えば、反応液中の基質
濃度を1〜20mg/ml、反応温度37〜40℃、反
応pH6〜10、通常はトリス緩衝液を用いて、緩衝液
の最終濃度が25mMとなるようにして反応を行う。ま
た、反応液中には界面活性剤としてトリトンX−100
を終濃度0.5%となるように添加する。反応終了後、
ODS逆相カラムクロマトグラフィーで反応生成物と未
反応スフィンゴ脂質を分離する。溶出液としては、クロ
ロホルム/メタノール/水(5/4/1、v/v)を用
いることができる。HPLCのモニターは、溶出液をH
PTLCで分析することにより行うことができる。HP
TLCの展開溶媒はクロロホルム/メタノール/10%
酢酸(5/4/1、v/v)、発色は糖脂質及びリゾ糖
脂質はオルシノール硫酸法、スフィンゴミエリン及びリ
ゾスフィンゴミエリン、セラミド及びスフィンゴシンは
クマシーブルー法で行うことができる。リゾスフィンゴ
脂質だけを検出したい場合は、ニンヒドリン法を用いる
ことができる。このように、本発明の酵素を用いてリゾ
スフィンゴ脂質を製造することができる。
質を製造するには、該酵素が作用するスフィンゴ脂質で
あればいかなるものでも基質として用いることができ
る。例えば、酸性糖脂質としてはGM1等の各種ガング
リオシド及びスルファチド、中性糖脂質としてはアシア
ロGM1、セレブロシド等、スフィンゴリン脂質として
スフィンゴミエリンが挙げられる。またセラミドも基質
として用いることができる。これらの基質を緩衝液中に
懸濁させ、本酵素を作用させることで各種のリゾスフィ
ンゴ脂質を得ることができる。例えば、反応液中の基質
濃度を1〜20mg/ml、反応温度37〜40℃、反
応pH6〜10、通常はトリス緩衝液を用いて、緩衝液
の最終濃度が25mMとなるようにして反応を行う。ま
た、反応液中には界面活性剤としてトリトンX−100
を終濃度0.5%となるように添加する。反応終了後、
ODS逆相カラムクロマトグラフィーで反応生成物と未
反応スフィンゴ脂質を分離する。溶出液としては、クロ
ロホルム/メタノール/水(5/4/1、v/v)を用
いることができる。HPLCのモニターは、溶出液をH
PTLCで分析することにより行うことができる。HP
TLCの展開溶媒はクロロホルム/メタノール/10%
酢酸(5/4/1、v/v)、発色は糖脂質及びリゾ糖
脂質はオルシノール硫酸法、スフィンゴミエリン及びリ
ゾスフィンゴミエリン、セラミド及びスフィンゴシンは
クマシーブルー法で行うことができる。リゾスフィンゴ
脂質だけを検出したい場合は、ニンヒドリン法を用いる
ことができる。このように、本発明の酵素を用いてリゾ
スフィンゴ脂質を製造することができる。
【0020】また、得られたリゾスフィンゴ脂質を再ア
シル化することにより各種の誘導体を得ることができ
る。例えば、リゾスフィンゴ脂質への脂肪酸の導入は、
ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下、脂肪酸とN
−ヒドロキシコハク酸イミドとのエステルを合成し、リ
ゾスフィンゴ脂質と反応させる方法、脂肪酸塩化物を合
成し、リゾスフィンゴ脂質と反応させる方法等により再
アシル化された誘導体を得ることができる。
シル化することにより各種の誘導体を得ることができ
る。例えば、リゾスフィンゴ脂質への脂肪酸の導入は、
ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下、脂肪酸とN
−ヒドロキシコハク酸イミドとのエステルを合成し、リ
ゾスフィンゴ脂質と反応させる方法、脂肪酸塩化物を合
成し、リゾスフィンゴ脂質と反応させる方法等により再
アシル化された誘導体を得ることができる。
【0021】また、本発明の酵素を用いて得られるリゾ
スフィンゴ脂質のスフィンゴシン部分のアミノ基を標識
することにより、蛍光標識スフィンゴ脂質誘導体(蛍光
標識ネオスフィンゴ脂質)を合成することができる。例
えば、ダンシルクロリド、4−フルオロ−7−ニトロベ
ンゾフラザン(4−Fluoro−7−nitrobenzofurazan 、
NBD−F)、10−ピレンデカン酸等による標識が可
能である。
スフィンゴ脂質のスフィンゴシン部分のアミノ基を標識
することにより、蛍光標識スフィンゴ脂質誘導体(蛍光
標識ネオスフィンゴ脂質)を合成することができる。例
えば、ダンシルクロリド、4−フルオロ−7−ニトロベ
ンゾフラザン(4−Fluoro−7−nitrobenzofurazan 、
NBD−F)、10−ピレンデカン酸等による標識が可
能である。
【0022】更に、本酵素の逆反応を用い、標識を有
し、又は有しない少なくとも2種類のスフィンゴ脂質、
あるいはリゾスフィンゴ脂質と標識を有し、又は有しな
い脂肪族カルボン酸又は脂肪族カルボン酸誘導体を出発
原料とし、種々のスフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂
質誘導体を合成することが可能である。例えば、14C−
GalCerとスフィンゴミエリンの存在下、本酵素を
作用させることにより、14Cで標識されたスフィンゴミ
エリンを得ることができる。また、例えば、14Cで標識
されたステアリン酸とリゾスフィンゴミエリンの存在
下、本酵素を作用させることにより、14Cで標識された
スフィンゴミエリンを得ることができる。
し、又は有しない少なくとも2種類のスフィンゴ脂質、
あるいはリゾスフィンゴ脂質と標識を有し、又は有しな
い脂肪族カルボン酸又は脂肪族カルボン酸誘導体を出発
原料とし、種々のスフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂
質誘導体を合成することが可能である。例えば、14C−
GalCerとスフィンゴミエリンの存在下、本酵素を
作用させることにより、14Cで標識されたスフィンゴミ
エリンを得ることができる。また、例えば、14Cで標識
されたステアリン酸とリゾスフィンゴミエリンの存在
下、本酵素を作用させることにより、14Cで標識された
スフィンゴミエリンを得ることができる。
【0023】以上、詳細に説明したように、本発明によ
りスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼが提供さ
れ、該スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを用いるリ
ゾスフィンゴ脂質の製造方法が提供される。更には、本
発明のスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼの逆反
応を用いたスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の
製造方法が提供される。該酵素は、スフィンゴ脂質の機
能解明の研究、及び糖質工学等の分野において有用であ
る。また、該酵素を用いて製造したリゾスフィンゴ脂
質、スフィンゴ脂質の脂肪酸に代えて蛍光物質等を導入
した蛍光標識スフィンゴ脂質は、スフィンゴ脂質の細胞
内代謝や輸送経路の解明、スフィンゴ脂質の細胞内での
機能解明等の細胞工学に有用な基質及び試薬になるばか
りでなく、スフィンゴ脂質合成酵素や分解酵素の高感度
な基質になることが期待される。このスフィンゴ脂質の
共通構造であるセラミド部分の長鎖脂肪酸の修飾、置換
を行い、均一な長鎖脂肪酸を有するスフィンゴ脂質やス
フィンゴ脂質誘導体を製造することは工業的において有
用であり、例えば細胞への浸透性、細胞での代謝、ある
いは生物活性を改変した新しいスフィンゴ脂質誘導体を
作出でき医薬、化粧料、細胞工学等への応用が可能であ
る。
りスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼが提供さ
れ、該スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを用いるリ
ゾスフィンゴ脂質の製造方法が提供される。更には、本
発明のスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼの逆反
応を用いたスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の
製造方法が提供される。該酵素は、スフィンゴ脂質の機
能解明の研究、及び糖質工学等の分野において有用であ
る。また、該酵素を用いて製造したリゾスフィンゴ脂
質、スフィンゴ脂質の脂肪酸に代えて蛍光物質等を導入
した蛍光標識スフィンゴ脂質は、スフィンゴ脂質の細胞
内代謝や輸送経路の解明、スフィンゴ脂質の細胞内での
機能解明等の細胞工学に有用な基質及び試薬になるばか
りでなく、スフィンゴ脂質合成酵素や分解酵素の高感度
な基質になることが期待される。このスフィンゴ脂質の
共通構造であるセラミド部分の長鎖脂肪酸の修飾、置換
を行い、均一な長鎖脂肪酸を有するスフィンゴ脂質やス
フィンゴ脂質誘導体を製造することは工業的において有
用であり、例えば細胞への浸透性、細胞での代謝、ある
いは生物活性を改変した新しいスフィンゴ脂質誘導体を
作出でき医薬、化粧料、細胞工学等への応用が可能であ
る。
【0024】更に、本発明で初めてアトピー性皮膚炎患
者の落屑からスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ
を生産する微生物が単離されたことにより、該微生物を
用いたアトピー性皮膚炎の増悪に関与する起炎菌を同定
することもできる。本発明の微生物をアトピー性皮膚炎
患者から検出するには、患部から得た各種試料、例えば
患部を拭った滅菌綿球、滅菌ガーゼ、滅菌綿棒や皮膚の
一部、表皮の落屑等を用いて各種選択培地で培養し、ス
フィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ活性を指標にす
ることにより検出することが可能である。また、該微生
物を抗原とする抗体を用いて免疫学的に検出することも
可能である。更には該微生物の遺伝子の配列の一部を取
得し、プローブ又はプライマーとして遺伝子工学的に、
例えばポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PC
R)法等を用いて検出することも可能である。更に、ア
トピー性皮膚炎の検出を行うことも可能である。
者の落屑からスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ
を生産する微生物が単離されたことにより、該微生物を
用いたアトピー性皮膚炎の増悪に関与する起炎菌を同定
することもできる。本発明の微生物をアトピー性皮膚炎
患者から検出するには、患部から得た各種試料、例えば
患部を拭った滅菌綿球、滅菌ガーゼ、滅菌綿棒や皮膚の
一部、表皮の落屑等を用いて各種選択培地で培養し、ス
フィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ活性を指標にす
ることにより検出することが可能である。また、該微生
物を抗原とする抗体を用いて免疫学的に検出することも
可能である。更には該微生物の遺伝子の配列の一部を取
得し、プローブ又はプライマーとして遺伝子工学的に、
例えばポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PC
R)法等を用いて検出することも可能である。更に、ア
トピー性皮膚炎の検出を行うことも可能である。
【0025】
【実施例】次に実施例により本発明を更に具体的に説明
するが、これらの実施例は本発明の一例を示すものであ
り、本発明はこれらになんら限定されるものではない。
するが、これらの実施例は本発明の一例を示すものであ
り、本発明はこれらになんら限定されるものではない。
【0026】実施例1 アトピー性皮膚炎患者の皮膚か
らのスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ生産菌の
単離 少量のアトピー性皮膚炎患者の落屑(表皮のはがれ落ち
た物)を100μlのSM−PY培地(0.5%ペプト
ン、0.1%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム、
0.05%スフィンゴミエリン、及び0.05%タウロ
デオキシコール酸ナトリウム)に取り、25℃で3日間
培養を行う。その培養液から5μlを取り出し、100
μlのSM−PY培地に植え継いだ。同じ培養操作を数
回繰り返した後、20μlの培養上清と14C−コリンラ
ベルされたスフィンゴミエリンを含む20μlの50m
M酢酸緩衝液(pH6.0)/0.5%トリトンX−1
00を混合して37℃で一晩反応させた。反応液を乾固
した後、20μlのクロロホルム/メタノール(2:
1)液に溶解し、遠心分離により不要物を除いた上清を
TLCプレート(シリカゲル60、メルク社製)にの
せ、ブタノール/酢酸/水(2.5:1:1)で展開し
た。この薄層プレートをイメージングプレートにのせた
後、イメージングアナライザーBas1000(富士写
真フィルム社製)を用いて反応生成物を確認したとこ
ろ、スフィンゴシルホスホリルコリン(リゾスフィンゴ
ミエリン)のバンドが見られた。培養液をSM含有トリ
プトソーヤ寒天培地〔0.01%スフィンゴミエリン、
0.05%タウロデオキシコール酸ナトリウムを含むト
リプトソーヤ寒天培地(日水製薬社製)〕にまき、培養
後得られたコロニーを100μlのSM合成培地(0.
05%リン酸水素二カリウム、0.05%塩化アンモニ
ウム、0.05%スフィンゴミエリン、0.05%タウ
ロデオキシコール酸ナトリウム、0.5%塩化ナトリウ
ム、pH7.2)で培養した。この培養液中のスフィン
ゴミエリンの分解物を薄層クロマトグラフにより分析
し、分解活性の強いコロニーの選択を行った。薄層クロ
マトグラフは培養液20μlを蒸発乾固した試料を20
μlのクロロホルム/メタノール(2:1)液に溶解
し、遠心分離により不要物を除いた上清10μlをTL
Cプレート(シリカゲル60、メルク社製)にのせ、ク
ロロホルム/メタノール/10%酢酸(5:4:1)で
展開した。展開されたTLCプレートはオルシノール−
硫酸で焼き付けた後、クマシーブリリアントブルー染色
液によって染色を行った。また、ニンヒドリンを用いて
アミノ基の確認を行った。選択されたコロニーは上記の
操作を繰り返し行いスフィンゴミエリンをリゾスフィン
ゴミエリンまで分解する菌株の単離を行った。以上の操
作により、スフィンゴミエリンを分解する活性を持つ非
発酵性グラム陰性桿菌AI−2株を単離した。
らのスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ生産菌の
単離 少量のアトピー性皮膚炎患者の落屑(表皮のはがれ落ち
た物)を100μlのSM−PY培地(0.5%ペプト
ン、0.1%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム、
0.05%スフィンゴミエリン、及び0.05%タウロ
デオキシコール酸ナトリウム)に取り、25℃で3日間
培養を行う。その培養液から5μlを取り出し、100
μlのSM−PY培地に植え継いだ。同じ培養操作を数
回繰り返した後、20μlの培養上清と14C−コリンラ
ベルされたスフィンゴミエリンを含む20μlの50m
M酢酸緩衝液(pH6.0)/0.5%トリトンX−1
00を混合して37℃で一晩反応させた。反応液を乾固
した後、20μlのクロロホルム/メタノール(2:
1)液に溶解し、遠心分離により不要物を除いた上清を
TLCプレート(シリカゲル60、メルク社製)にの
せ、ブタノール/酢酸/水(2.5:1:1)で展開し
た。この薄層プレートをイメージングプレートにのせた
後、イメージングアナライザーBas1000(富士写
真フィルム社製)を用いて反応生成物を確認したとこ
ろ、スフィンゴシルホスホリルコリン(リゾスフィンゴ
ミエリン)のバンドが見られた。培養液をSM含有トリ
プトソーヤ寒天培地〔0.01%スフィンゴミエリン、
0.05%タウロデオキシコール酸ナトリウムを含むト
リプトソーヤ寒天培地(日水製薬社製)〕にまき、培養
後得られたコロニーを100μlのSM合成培地(0.
05%リン酸水素二カリウム、0.05%塩化アンモニ
ウム、0.05%スフィンゴミエリン、0.05%タウ
ロデオキシコール酸ナトリウム、0.5%塩化ナトリウ
ム、pH7.2)で培養した。この培養液中のスフィン
ゴミエリンの分解物を薄層クロマトグラフにより分析
し、分解活性の強いコロニーの選択を行った。薄層クロ
マトグラフは培養液20μlを蒸発乾固した試料を20
μlのクロロホルム/メタノール(2:1)液に溶解
し、遠心分離により不要物を除いた上清10μlをTL
Cプレート(シリカゲル60、メルク社製)にのせ、ク
ロロホルム/メタノール/10%酢酸(5:4:1)で
展開した。展開されたTLCプレートはオルシノール−
硫酸で焼き付けた後、クマシーブリリアントブルー染色
液によって染色を行った。また、ニンヒドリンを用いて
アミノ基の確認を行った。選択されたコロニーは上記の
操作を繰り返し行いスフィンゴミエリンをリゾスフィン
ゴミエリンまで分解する菌株の単離を行った。以上の操
作により、スフィンゴミエリンを分解する活性を持つ非
発酵性グラム陰性桿菌AI−2株を単離した。
【0027】実施例2 スフィンゴ脂質セラミドN−デ
アシラーゼの精製 0.5%ペプトン、0.1%酵母エキス、0.5%塩化
ナトリウム、及び0.05%スフィンゴミエリン、及び
0.05%タウロデオキシコール酸ナトリウムを含む液
体培地に、非発酵性グラム陰性桿菌AI−2(FERM
P−16124)を接種し、30℃で72時間培養し
た。培養終了後、培養液を6000rpm、30分間の
遠心分離によって菌体を除去して培養上清を得た。該培
養上清を粗酵素液とした。また、この粗酵素液を20m
M トリス塩酸緩衝液(0.1%ルブロール含有、pH
7.5)で平衡化したDEAE−セファロースFF(DE
AE-Sepharose FF 、ファルマシア社製)に供し、1M塩
化ナトリウムを含む同緩衝液へのグラジエント溶出によ
り溶出した。活性画分を回収し終濃度0.8Mになるよ
うに硫安を加え、20mM酢酸緩衝液(0.8M硫安含
有、pH6.0)で平衡化したブチル−トヨパール(Bu
tyl-Toyopearl 、東ソー社製)に供し、20mM酢酸緩
衝液(0.8M硫安含有、pH6.0)、20mM酢酸
緩衝液(0.4M硫安含有、pH6.0)、20mM酢
酸緩衝液(pH6.0)、20mM酢酸緩衝液(1.0
%ルブロール含有、pH6.0)によって順次、溶出を
行った。本酵素は20mM酢酸緩衝液(1.0%ルブロ
ール含有、pH6.0)によって溶出された。活性画分
は更に20mMリン酸緩衝液(0.1M塩化ナトリウム
及び0.3%ルブロール含有、pH6.8)で平衡化し
たスーパーデックス−200(Superdex-200、ファルマ
シア社製)によってゲルろ過クロマトグラフィーを行い
活性画分を回収し、このようにして得られた活性画分を
精製酵素とした。上述した酵素活性の測定法により、該
精製酵素の活性は177mU/リットルであった。更
に、該精製酵素は14C−GalCerを加水分解し、G
alCerのリゾ体と14Cで標識された脂肪酸を生成す
る活性を有していた。
アシラーゼの精製 0.5%ペプトン、0.1%酵母エキス、0.5%塩化
ナトリウム、及び0.05%スフィンゴミエリン、及び
0.05%タウロデオキシコール酸ナトリウムを含む液
体培地に、非発酵性グラム陰性桿菌AI−2(FERM
P−16124)を接種し、30℃で72時間培養し
た。培養終了後、培養液を6000rpm、30分間の
遠心分離によって菌体を除去して培養上清を得た。該培
養上清を粗酵素液とした。また、この粗酵素液を20m
M トリス塩酸緩衝液(0.1%ルブロール含有、pH
7.5)で平衡化したDEAE−セファロースFF(DE
AE-Sepharose FF 、ファルマシア社製)に供し、1M塩
化ナトリウムを含む同緩衝液へのグラジエント溶出によ
り溶出した。活性画分を回収し終濃度0.8Mになるよ
うに硫安を加え、20mM酢酸緩衝液(0.8M硫安含
有、pH6.0)で平衡化したブチル−トヨパール(Bu
tyl-Toyopearl 、東ソー社製)に供し、20mM酢酸緩
衝液(0.8M硫安含有、pH6.0)、20mM酢酸
緩衝液(0.4M硫安含有、pH6.0)、20mM酢
酸緩衝液(pH6.0)、20mM酢酸緩衝液(1.0
%ルブロール含有、pH6.0)によって順次、溶出を
行った。本酵素は20mM酢酸緩衝液(1.0%ルブロ
ール含有、pH6.0)によって溶出された。活性画分
は更に20mMリン酸緩衝液(0.1M塩化ナトリウム
及び0.3%ルブロール含有、pH6.8)で平衡化し
たスーパーデックス−200(Superdex-200、ファルマ
シア社製)によってゲルろ過クロマトグラフィーを行い
活性画分を回収し、このようにして得られた活性画分を
精製酵素とした。上述した酵素活性の測定法により、該
精製酵素の活性は177mU/リットルであった。更
に、該精製酵素は14C−GalCerを加水分解し、G
alCerのリゾ体と14Cで標識された脂肪酸を生成す
る活性を有していた。
【0028】実施例3 14C標識されたスフィンゴミエ
リンの製造 実施例2で得られた粗酵素液に、最終濃度1mMになる
ように14C−GalCerを加え、37℃、3時間反応
した後、実施例2と同様の方法で生成物の確認を行った
ところ、GalCerのリゾ体及び14C標識された脂肪
酸、リゾスフィンゴミエリン及び14C標識されたスフィ
ンゴミエリンが確認された。この結果、本酵素の加水分
解反応により14C−GalCerから遊離した14C標識
された脂肪酸が、本酵素の加水分解反応により生成した
リゾスフィンゴミエリンに転移したことにより、14C標
識されたスフィンゴミエリンが生成されたことが明らか
となった。したがって、本酵素が加水分解だけでなく、
逆反応の活性も有していることが明らかとなった。
リンの製造 実施例2で得られた粗酵素液に、最終濃度1mMになる
ように14C−GalCerを加え、37℃、3時間反応
した後、実施例2と同様の方法で生成物の確認を行った
ところ、GalCerのリゾ体及び14C標識された脂肪
酸、リゾスフィンゴミエリン及び14C標識されたスフィ
ンゴミエリンが確認された。この結果、本酵素の加水分
解反応により14C−GalCerから遊離した14C標識
された脂肪酸が、本酵素の加水分解反応により生成した
リゾスフィンゴミエリンに転移したことにより、14C標
識されたスフィンゴミエリンが生成されたことが明らか
となった。したがって、本酵素が加水分解だけでなく、
逆反応の活性も有していることが明らかとなった。
【0029】
【発明の効果】本発明によって、従来知られている酵素
とは異なる基質特異性のスフィンゴ脂質セラミドN−デ
アシラーゼが提供され、該酵素を用いることによって種
々のスフィンゴ脂質からリゾスフィンゴ脂質を製造する
方法が提供された。また、このようにして得られたリゾ
スフィンゴ脂質は、その遊離アミノ基を利用して、例え
ば標識した脂肪酸を再導入したり、あるいは直接蛍光標
識したり、更にはアルブミン等の糖鎖を有しないタンパ
ク質と常法に従って結合させたりすることによってスフ
ィンゴ脂質誘導体に変換することができ、スフィンゴ脂
質関連酵素の活性測定用基質、精製用アフィニティーク
ロマトグラフィーのリガンドとして、及び抗スフィンゴ
脂質抗体の抗原として、あるいはスフィンゴ脂質の機能
解明の研究に用いることができ、スフィンゴ脂質の細胞
内代謝や輸送経路の解明、スフィンゴ脂質の細胞内での
機能解明等に有用な基質及び試薬として用いることがで
きる。また、本発明により、アトピー性皮膚炎の増悪に
関与すると考えられるスフィンゴ脂質セラミドN−デア
シラーゼを生産する微生物が単離されたことにより、該
微生物の純粋培養が可能となり、この微生物を駆除する
ことによるアトピー性皮膚炎の治療あるいは症状の軽減
作用を持つ薬剤の新たな開発が可能となる。更に、この
微生物の検出方法の開発が可能となり、アトピー性皮膚
炎の患者における起炎菌の同定が容易になる。また、こ
の微生物の生産するスフィンゴ脂質セラミドN−デアシ
ラーゼが得られたことにより、この酵素を不活化するこ
とによりアトピー性皮膚炎の治療あるいは症状の軽減作
用をもつ薬剤の開発が可能となる。
とは異なる基質特異性のスフィンゴ脂質セラミドN−デ
アシラーゼが提供され、該酵素を用いることによって種
々のスフィンゴ脂質からリゾスフィンゴ脂質を製造する
方法が提供された。また、このようにして得られたリゾ
スフィンゴ脂質は、その遊離アミノ基を利用して、例え
ば標識した脂肪酸を再導入したり、あるいは直接蛍光標
識したり、更にはアルブミン等の糖鎖を有しないタンパ
ク質と常法に従って結合させたりすることによってスフ
ィンゴ脂質誘導体に変換することができ、スフィンゴ脂
質関連酵素の活性測定用基質、精製用アフィニティーク
ロマトグラフィーのリガンドとして、及び抗スフィンゴ
脂質抗体の抗原として、あるいはスフィンゴ脂質の機能
解明の研究に用いることができ、スフィンゴ脂質の細胞
内代謝や輸送経路の解明、スフィンゴ脂質の細胞内での
機能解明等に有用な基質及び試薬として用いることがで
きる。また、本発明により、アトピー性皮膚炎の増悪に
関与すると考えられるスフィンゴ脂質セラミドN−デア
シラーゼを生産する微生物が単離されたことにより、該
微生物の純粋培養が可能となり、この微生物を駆除する
ことによるアトピー性皮膚炎の治療あるいは症状の軽減
作用を持つ薬剤の新たな開発が可能となる。更に、この
微生物の検出方法の開発が可能となり、アトピー性皮膚
炎の患者における起炎菌の同定が容易になる。また、こ
の微生物の生産するスフィンゴ脂質セラミドN−デアシ
ラーゼが得られたことにより、この酵素を不活化するこ
とによりアトピー性皮膚炎の治療あるいは症状の軽減作
用をもつ薬剤の開発が可能となる。
【図1】本発明により得られるスフィンゴ脂質セラミド
N−デアシラーゼの至適pHを示す図である。
N−デアシラーゼの至適pHを示す図である。
Claims (4)
- 【請求項1】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とするスフィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼ。 (1)作用:スフィンゴ脂質中の分子内セラミドに作用
して、スフィンゴシン塩基と脂肪酸とに加水分解し、リ
ゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を生成する。 (2)基質特異性:セラミド、スフィンゴ糖脂質及びス
フィンゴリン脂質に作用する。 (3)至適pH:至適pHが8〜10である。 - 【請求項2】 請求項1記載のスフィンゴ脂質セラミド
N−デアシラーゼを用いてスフィンゴ脂質を処理するこ
とを特徴とするリゾスフィンゴ脂質の製造方法。 - 【請求項3】 スフィンゴ脂質を、請求項1記載のスフ
ィンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼの生産能を有する
微生物と接触させることを特徴とするリゾスフィンゴ脂
質の製造方法。 - 【請求項4】 少なくとも異なる2種のスフィンゴ脂
質、あるいはリゾスフィンゴ脂質と脂肪族カルボン酸又
は脂肪族カルボン酸誘導体とを、請求項1記載のスフィ
ンゴ脂質セラミドN−デアシラーゼを用いて酵素的に反
応させ、スフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体
を得ることを特徴とするスフィンゴ脂質又はスフィンゴ
脂質誘導体の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP08338797A JP3868052B2 (ja) | 1997-03-18 | 1997-03-18 | スフィンゴ脂質セラミドn−デアシラーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP08338797A JP3868052B2 (ja) | 1997-03-18 | 1997-03-18 | スフィンゴ脂質セラミドn−デアシラーゼ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10257884A true JPH10257884A (ja) | 1998-09-29 |
JP3868052B2 JP3868052B2 (ja) | 2007-01-17 |
Family
ID=13801019
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP08338797A Expired - Fee Related JP3868052B2 (ja) | 1997-03-18 | 1997-03-18 | スフィンゴ脂質セラミドn−デアシラーゼ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3868052B2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999050433A1 (fr) * | 1998-03-31 | 1999-10-07 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Methode de production de lysosphingolipides |
WO2000058448A1 (fr) * | 1999-03-26 | 2000-10-05 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Gene de ceramidase |
JP2006516279A (ja) * | 2003-01-20 | 2006-06-29 | ネーデルランドセ オルガニサティエ フォール トエゲパストナトールヴェテンシャッペリク オンデルゾエク ティエヌオー | 吸収促進剤としてスフィンゴミエリン及びリソスフィンゴミエリンを使用する方法 |
-
1997
- 1997-03-18 JP JP08338797A patent/JP3868052B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999050433A1 (fr) * | 1998-03-31 | 1999-10-07 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Methode de production de lysosphingolipides |
WO2000058448A1 (fr) * | 1999-03-26 | 2000-10-05 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Gene de ceramidase |
US6830919B1 (en) | 1999-03-26 | 2004-12-14 | Takara Bio Inc. | Ceramidase gene |
US7449553B2 (en) | 1999-03-26 | 2008-11-11 | Takara Bio Inc. | Antibody that binds ceramidase |
JP2006516279A (ja) * | 2003-01-20 | 2006-06-29 | ネーデルランドセ オルガニサティエ フォール トエゲパストナトールヴェテンシャッペリク オンデルゾエク ティエヌオー | 吸収促進剤としてスフィンゴミエリン及びリソスフィンゴミエリンを使用する方法 |
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---|---|
JP3868052B2 (ja) | 2007-01-17 |
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