JPH10257884A - スフィンゴ脂質セラミドｎ−デアシラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラ
ーゼ、それを用いてリゾスフィンゴ脂質、スフィンゴ脂
質又はスフィンゴ脂質誘導体を製造する方法を提供す
る。 【解決手段】 分子内セラミドに作用して、リゾスフィ
ンゴ脂質と脂肪酸を生成する作用、セラミド、スフィン
ゴ糖脂質及びスフィンゴリン脂質に作用する基質特異
性、及び８〜１０の至適ｐＨをもつスフィンゴ脂質セラ
ミドＮ−デアシラーゼ。該酵素でスフィンゴ脂質を処理
するリゾスフィンゴ脂質の製造方法。該酵素を触媒とし
て用いて、スフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導
体を製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なスフィンゴ脂
質セラミドＮ−デアシラーゼに関する。また、該スフィ
ンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼを用いて、酵素学的
にリゾスフィンゴ脂質を製造する方法、更には少なくと
も異なる２種のスフィンゴ脂質、あるいはリゾスフィン
ゴ脂質と脂肪族カルボン酸又は脂肪族カルボン酸誘導体
とを、該酵素と酵素的に反応させることによるスフィン
ゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体を製造する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、糖脂質中の分子内セラミドに作用
してこのセラミド部分をスフィンゴシン塩基と脂肪酸と
に加水分解し、リゾ糖脂質と脂肪酸を生成する酵素とし
て、ノカルディア属（Nocardia）に属する微生物が生産
する酵素（特開昭６４−６０３７９号公報）が知られて
いる。この酵素は糖脂質セラミドデアシラーゼと命名さ
れているが〔ジャーナル オブ バイオケミストリー
（Journal of Biochemistry)、第１０３巻、第１〜４頁
（１９８８）〕、ＧＤ１ａ、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３等
のいわゆる酸性糖脂質であるガングリオシドには作用す
るが、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミドには
全く作用せず、ラクトシルセラミド、Ｇｂ３、あるいは
アシアロ（asialo) ＧＭ１等の中性糖脂質にはほとんど
作用しない。また、セラミドのスフィンゴシン塩基と脂
肪酸との結合を加水分解する酵素がセラミダーゼ（Cera
midase ;ＥＣ３．５．１．２３）と称されているが〔ジ
ャーナル オブ バイオロジカルケミストリー（Journa
l of Biological Chemistry)、第２４１巻、第３７３１
〜３７３７頁（１９６６）、バイオケミストリー（Bioc
hemistry) 、第８巻、第１６９２〜１６９８頁（１９６
９）、バイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ（Bi
ochimica et Biophysica Acta)、第１７６巻、第３３９
〜３４７頁（１９６９）、サイエンス（Science)、第１
７８巻、第１１００〜１１０２頁（１９７２）〕、この
酵素は糖脂質のセラミド部分のスフィンゴシン塩基と脂
肪酸との結合を加水分解することはできない。すなわ
ち、これらの酵素では中性糖脂質のセラミド部分のスフ
ィンゴシン塩基と脂肪酸との結合を加水分解することは
できなかった。また、スフィンゴ脂質全般に作用する酵
素としてシュードモナス（Pseudomonas ）属に属する細
菌が生産する酵素〔特開平８−８４５８７号公報、ジャ
ーナルオブ バイオロジカル ケミストリー、第２７０
巻、第２４３７０〜２４３７４２頁（１９９５）〕が知
られている。この酵素は中性糖脂質、酸性糖脂質及びス
フィンゴミエリンに作用するがセラミドには非常に作用
しにくい。

【０００３】スフィンゴ脂質は、スフィンゴ糖脂質、ス
フィンゴリン脂質（スフィンゴホスホノリピドを含
む）、セラミド、を含む長鎖塩基スフィンゴイドを持つ
脂質の総称であり、スフィンゴイドのアミノ基に不均一
な鎖長の長鎖脂肪酸を酸アミド結合したセラミドを共通
構造としてもち、下等動物から高等動物にまで広く分布
している。これらスフィンゴ脂質は近年、細胞の増殖、
分化誘導、アポトーシス等のような生物活性において重
要な役割に関与していることが明らかにされつつある。
また、細胞表層の構成成分であることから化粧料等への
添加物としても使用されつつある。また、スフィンゴ脂
質のスフィンゴイドのアミノ基に酸アミド結合した脂肪
酸を欠くスフィンゴ脂質のＮ−脱アシル体はリゾスフィ
ンゴ脂質と呼ばれ、スフィンゴ脂質と同様な生物活性を
持つことが明らかにされつつある。従来知られているリ
ゾスフィンゴ脂質の製造方法については、化学的方法、
酵素を用いる方法、微生物を用いる方法が知られてい
る。化学的方法としては、ヒドラジン分解法やアルコー
ル系溶媒中でのアルカリ加水分解法が知られている。し
かし、これらの方法ではアミノ糖を含むスフィンゴ糖脂
質の場合、糖鎖部分のアミド結合が分解されてデ−Ｎ−
アセチルリゾ糖脂質を生じる。またシアル酸を含む糖脂
質（ガングリオシド）の場合、シアル酸部分の脱アシル
化反応が同時に進行する。そのため、脱アシル化後、脂
質部分のアミノ基に保護基を選択的に導入した後、シア
ル酸部分の再アシル化を行い、その後、保護基を外す必
要がある。これらの一連の化学操作では、様々な副生成
物が生じ、多くの手間と技術的な熟練を要する。しか
も、現在の化学的手法ではシアル酸を複数有する例えば
ＧＱ１ｂのようなポリシアロガングリオシドからリゾ体
を調製することは非常に困難である。一方、酵素を用い
る方法としては、ノカルディア属放線菌の生産するガン
グリオシドセラミダーゼを用いる方法（特開昭６４−６
０３７９号公報）、ロドコッカス（Rhodococcus)属放線
菌の生産する酵素又は菌体処理物を用いる方法（特開平
６−７８７８２号公報）、シュードモナス属細菌の生産
するスフィンゴリピドセラミドデアシラーゼを用いる方
法（特開平８−８４５８７号公報）が知られている。こ
れらの方法では、得られるリゾスフィンゴ脂質は用いる
酵素の基質特異性に左右されるため、目的のリゾスフィ
ンゴ脂質を得るには制限がある。微生物又はその抽出物
を用いる方法として、グリゴスフィンゴリピドセラミド
デアシラーゼ生産能を有するストレプトミセス（Strept
omyces）属放線菌を用いる方法（特開平７−１０７９８
８号公報）が知られているが、効率が悪く、また、基質
特異性により得られるリゾスフィンゴ脂質に制限があ
る。また、リゾスフィンゴ脂質を生物学的に得る方法が
知られている（特開平６−７８７８２号公報）。この方
法では、目的とするリゾスフィンゴ脂質以外に多くの副
産物が生じる。そのため、これら副産物を取り除く必要
があり、工業的にもその操作のステップ、収率の点で問
題があった。

【０００４】一方、スフィンゴリン脂質であるスフィン
ゴミエリンのリゾ体を得る方法としては化学的方法と酵
素的方法が知られており、化学的方法としてアルコール
系溶媒中での塩酸加水分解に依る方法が一般に用いられ
る。しかしこの方法によると天然型のＤ−エリトロ（D-
erythro)（2S,3R)だけではなくＬ−トレオ（L-threo)
（2S,3S)の立体異性体が生じてしまい、天然型のＤ−エ
リトロ（D-erythro)（2S,3R)を得るためには収率の点で
不利でありまたこれらを分離することは非常に困難であ
った。更にコリンリン酸基が外れる可能性があり、収率
の点で問題がある。また、一般に天然のスフィンゴ脂質
のセラミド部分の長鎖脂肪酸の鎖長は、不均一でかなり
の多様性があることから、単一分子からなるスフィンゴ
脂質を得ることは困難である。

【０００５】スフィンゴ脂質の長鎖脂肪酸を修飾あるい
は置換したスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の
製造方法は、リゾスフィンゴ脂質を出発原料として、科
学的、酵素的に合成する方法が知られている。化学的方
法としては、リゾ体のアミノ基に以下の様な方法で脂肪
酸あるいは脂肪酸誘導体を縮合させる方法がある。例え
ば、脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等
の脂肪酸活性エステルを用いる方法、脂肪酸とカルボニ
ルジイミダゾールやジシクロヘキシルカルボジイミドな
どのカップリング試薬を用いる方法、脂肪酸の無水物を
用いる方法、脂肪酸塩化物を用いる方法などが知られて
いる。酸性糖脂質のリゾ体としてリゾガングリオシドを
用いる方法〔メソッズ インエンザイモロジー（Method
s in Enzymology) 第１３８巻、第３１９〜３４１頁
（１９８７）、特開平２−２００６９７号及び特開平７
−３０９８８８号〕、スフィンゴシルホスホリルコリン
（リゾスフィンゴミエリン）を用いる方法〔ジャーナル
オブ リピッド リサーチ（Journal of Lipid Resea
rch)、第２８巻、第７１０〜７１８頁（１９８７）〕が
知られている。これらの方法によるとＯ−アシル化等の
副反応が起こる場合があり、選択的にＮ−アシル化され
た物質を得るためには保護基の使用、精製等に煩雑な操
作が必要である。また、スフィンゴホスホノリピドの一
種セラミドシリアチンやアミノ糖を含むスフィンゴ糖脂
質を化学的に脱アシル化して得られるデ−Ｎ−アセチル
リゾガングリオシドのようにスフィンゴイドのアミノ基
以外にアミノ基をもつスフィンゴ脂質のスフィンゴイド
のアミノ基だけを選択的にアシル化したいときには保護
基の導入、部分的アシル化、アシル化後の部分的脱アシ
ル化といった操作、あるいはデ−Ｎ−アセチルリゾガン
グリオシドをリポソームに取り込ませた後、選択的にＮ
−アシル化する等の煩雑な操作が必要であり困難を伴
う。一方、酵素的合成方法は、有機溶媒中でリパーゼに
より縮合を行う方法（国際公開番号ＷＯ９４／２６９１
９）が知られているが、実質的に無水の有機溶媒が必要
であり、基質の溶解性により基質が限定される。また、
セラミド及びハイブリッドセラミドの酵素的合成方法
（国際公開番号ＷＯ９４／２６９１９）も知られている
が、反応も特異的なものではなくＯ−アシル化物の生成
が見出されており、また化学的合成方法と同様に複数の
アミノ基をもつ場合、スフィンゴイドのアミノ基だけに
特異的に作用させることは困難である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
知られているスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ
と異なる基質特異性の酵素、特にセラミド、スフィンゴ
糖脂質及びスフィンゴリン脂質によく作用するスフィン
ゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼを提供することにあ
る。また、該スフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ
を用いたリゾスフィンゴ脂質を酵素学的に、工業的に製
造する方法を提供することにある。更には、該スフィン
ゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼの逆反応を用いたスフ
ィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体の製造方法を
提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、下記の理化学的性質を有すること
を特徴とするスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ
に関する。 （１）作用：スフィンゴ脂質中の分子内セラミドに作用
して、スフィンゴシン塩基と脂肪酸とに加水分解し、リ
ゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を生成する。 （２）基質特異性：セラミド、スフィンゴ糖脂質及びス
フィンゴリン脂質に作用する。 （３）至適ｐＨ：至適ｐＨが８〜１０である。 また、本発明の第２の発明は、上記第１の発明のスフィ
ンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼを用いてスフィンゴ
脂質を処理することを特徴とするリゾスフィンゴ脂質の
製造方法に関する。また、本発明の第３の発明は、スフ
ィンゴ脂質を、前記第１の発明のスフィンゴ脂質セラミ
ドＮ−デアシラーゼの生産能を有する微生物と接触させ
ることを特徴とするリゾスフィンゴ脂質の製造方法に関
する。更に、本発明の第４の発明は、少なくとも異なる
２種のスフィンゴ脂質、あるいはリゾスフィンゴ脂質と
脂肪族カルボン酸又は脂肪族カルボン酸誘導体とを、前
記第１の発明のスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラー
ゼを用いて酵素的に反応させ、スフィンゴ脂質あるいは
スフィンゴ脂質誘導体を得ることを特徴とするスフィン
ゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の製造方法に関する。

【０００８】本発明者らは、スフィンゴ脂質関連酵素を
得るために、種々のサンプルをスクリーニングに用い
た。このスクリーニングの過程で、驚くべきことに、セ
ラミド及び糖脂質を同程度にスフィンゴシン塩基と脂肪
酸とに加水分解し、それらのリゾ体と脂肪酸を生成す
る、従来知られていない新規なスフィンゴ脂質セラミド
Ｎ−デアシラーゼ活性を見出した。更に、本発明者ら
が、鋭意検討を行った結果、本発明の酵素を生産する微
生物を特定し、該酵素の理化学的性質を明らかにした。
また、該酵素を用いてスフィンゴ脂質を処理することに
より、リゾスフィンゴ脂質を効率よく製造することに成
功し、更に該酵素の逆反応活性を見出し、該反応を用い
てスフィンゴ脂質及びスフィンゴ脂質誘導体を製造する
ことにも成功し、本発明を完成させた。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明について具体的に説
明する。本発明のスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラ
ーゼの製造方法は特に限定されるものではなく、本発明
のスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ生産能を有
する微生物、若しくは細胞等でよい。例えば、非発酵性
グラム陰性桿菌ＡＩ−２が挙げられる。本菌株は、本発
明者らがアトピー性皮膚炎の増悪にスフィンゴ脂質セラ
ミドＮ−デアシラーゼ活性が関与しているのではないか
と考え、アトピー性皮膚炎患者の落屑を採取し、新たに
検索した結果得た菌株であり、その菌学的性質は以下の
とおりである。

【００１０】（１）形態：桿菌 （２）グラム染色性：陰性 （３）胞子：陰性 （４）運動性：陽性 （５）鞭毛：極短毛 （６）酸素に対する態度：好気性 （７）オキシダーゼ：陽性 （８）カタラーゼ：陽性 （９）ＯＦテスト：Ｏ （１０）集落の色調：特徴的集落色素を生成せず （１１）蛍光色素の生成：陰性 （１２）水溶性色素の生成：陰性 （１３）栄養要求性：陽性 （１４）ＰＨＢの蓄積：陰性 （１５）40度での生育：陽性 （１６）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性 （１７）ゼラチンの液化：陽性 （１８）でんぷんの分解：陰性 （１９）Tween 80の分解：陰性 （２０）資化性 グルコース：陽性 βーヒドロキシ酪酸：陰性 （２１）キノン系：Ｑ−８ （２２）ＧＣ含量：６８％ この結果、本菌株は極鞭毛を有するオキシダーゼ陽性の
非発酵性グラム陰性桿菌であり、シュードモナス ＲＮ
Ａ ｇｒｏｕｐＶ及びステノトロフォモナス（Stenotro
phomonas）属に属するのではないか考えられたが、その
性状が完全には一致せず、新菌株の可能性が示唆され
た。

【００１１】本菌株は、ＡＩ−２と命名、表示され、工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６
１２４として寄託されている。

【００１２】本発明の酵素は、例えば上述した菌株を栄
養培地中で培養し、培養後の培養物から酵素を分離する
ことによって得られる。培地に加える栄養源は、該菌株
が利用し本発明の酵素を生産するものであればよく、炭
素源としては例えば、グリセロール、グルコース、スク
ロース、糖蜜等が利用でき、窒素源としては例えば、酵
母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、肉エキ
ス、脱脂大豆、硫安、硝酸アンモニウム等が適当であ
る。その他、ナトリウム塩、カリウム塩、リン酸塩、マ
グネシウム塩、亜鉛塩等の無機質及び金属塩を加えても
よい。また培地中にスフィンゴミエリンなどのスフィン
ゴ脂質を０．０１〜０．５％添加して本発明の酵素の生
産性を高めることができる。本発明の酵素の生産菌を培
養するに当り、酵素の生産量は培養条件によって大きく
変動するが、一般的に培養温度は２０〜３５℃、培地の
ｐＨ６〜８が良く、１日から７日の通気かくはん培養で
本発明の酵素が生産される。培養条件は使用する菌株、
培地組成等に応じて本発明の酵素の生産量が最大になる
ように設定するのは当然のことである。上述した菌株に
よって生産された本発明の酵素は主に菌体外に存在する
ので、培養物を固液分離し、得られた上清を酵素液とし
て用いることができる。また、通常用いられる精製手段
により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩
析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
ー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、凍結乾燥等に
より精製することができる。酵素の純度は例えば、ポリ
アクリルアミドゲルディスク電気泳動法等によって検定
することができる。

【００１３】本発明により得られるスフィンゴ脂質セラ
ミドＮ−デアシラーゼの酵素化学的及び理化学的性質は
次のとおりである。 （１）酵素活性の測定法： スフィンゴ脂質セラミドＮ
−デアシラーゼの酵素活性は測定は次のようにして行
う。終濃度１ｍＭの¹⁴Ｃ放射性同位元素ラベルされた炭
素数１６の脂肪酸を持つガラクトシルセラミド（¹⁴Ｃ−
ＧａｌＣｅｒ）を基質とし、０．５％トリトン（Trito
n）Ｘ−１００を含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）２０μｌ中で３７℃で３時間反応させる。１０
０μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）を加え反
応を止め、濃縮遠心機で反応液を濃縮し、これをＴＬＣ
プレート（シリカゲル６０、メルク社製）にのせ、クロ
ロホルム／メタノール／０．０２％塩化カルシウム水溶
液（５：４：１）で展開した後、イメージングアナライ
ザーＢａｓ１０００（富士写真フィルム社製）を用いガ
ラクトシルセラミドの量を定量する。又は、最終濃度１
ｍＭのガラクトシルセラミドを基質とし、０．５％トリ
トンＸ−１００を含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）２０μｌ中で３７℃で３時間反応させる。１０
０μｌのクロロホルム／メタノール／０．０２％塩化カ
ルシウム水溶液（５：４：１）で展開した後、オルシノ
ール硫酸法で発色させ、クロマトスキャナー（島津ＣＳ
−９０００、島津製作所社製）を用いて波長５４０ｎｍ
で定量する。活性単位は１分間に１ｎｍｏｌのガラクト
シルセラミドを分解する活性を１ｍＵとする。

【００１４】（２）作用： スフィンゴ脂質中の分子内
セラミドに作用して、スフィンゴシン塩基と脂肪酸とに
加水分解し、リゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を生成する。
更に、リゾスフィンゴ脂質のスフィンゴイドのアミノ基
への脂肪酸の再結合、あるいはスフィンゴ脂質のスフィ
ンゴイドに酸アミド結合する脂肪酸と別の脂肪酸との置
換を行い、スフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体を
生成する。

【００１５】（３）基質特異性： （１）の酵素活性の
測定法に従い、¹⁴Ｃ放射性同位元素ラベルされた脂肪酸
を持つガラクトシルセラミド、ガングリオシドＧＭ１、
スフィンゴミエリン、セラミドを基質とし、反応時間を
２時間と１９時間で、本発明の基質特異性を調べたとこ
ろ、下記表１に示すように、スフィンゴ糖脂質、スフィ
ンゴリン脂質及びセラミドに作用して、リゾスフィンゴ
脂質と脂肪酸を生成する。特にセラミド及びセラミドに
単糖が結合したガラクトシルセラミドによく作用する。
表１中、ガングリオシドＧＭ１は、ウシ脳から調製し
〔メソッズ インエンザイモロジー、第８３巻、第１３
９〜１９１頁（１９８２）〕、その他の基質は、シグマ
社製である。

【００１６】

【表１】 表 １ ───────────────────────────── 基 質 反応時間 分解率 （時間） （％） ───────────────────────────── ガラクトシルセラミド 2 15.8 19 42.5 セラミド 2 8.9 19 23.3 ガングリオシドＧＭ１ 2 0.2 19 0.4 スフィンゴミエリン 2 0.7 19 1.8 ─────────────────────────────

【００１７】（４）至適ｐＨ： 本発明の酵素の至適ｐ
Ｈは図１に示すように８〜１０付近に高い活性を有して
いる。活性測定に用いる緩衝液は、０．１５ＭＧＴＡ緩
衝液〔５０ｍＭジメチルグルタル酸、５０ｍＭトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン、５０ｍＭ２−アミ
ノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール〕を塩酸又
はＮａＯＨを用いてｐＨを変化させて用いる。図１は本
発明の酵素の至適ｐＨを示す図であり、縦軸は分解率
（％）、横軸は反応ｐＨを示す。

【００１８】（５）分子量 本発明の酵素の分子量は、スーパーデックス ２００
〔Superdex 200、ファルマシア バイオテク（Pharmaci
a Biotech)社製〕カラム、０．１Ｍ塩化ナトリウム及び
０．３％ルブロールＰＸを含む２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．８）を用い、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件
のゲルろ過法により、約１５２０００を示す。

【００１９】本発明の酵素を用いて、リゾスフィンゴ脂
質を製造するには、該酵素が作用するスフィンゴ脂質で
あればいかなるものでも基質として用いることができ
る。例えば、酸性糖脂質としてはＧＭ１等の各種ガング
リオシド及びスルファチド、中性糖脂質としてはアシア
ロＧＭ１、セレブロシド等、スフィンゴリン脂質として
スフィンゴミエリンが挙げられる。またセラミドも基質
として用いることができる。これらの基質を緩衝液中に
懸濁させ、本酵素を作用させることで各種のリゾスフィ
ンゴ脂質を得ることができる。例えば、反応液中の基質
濃度を１〜２０ｍｇ／ｍｌ、反応温度３７〜４０℃、反
応ｐＨ６〜１０、通常はトリス緩衝液を用いて、緩衝液
の最終濃度が２５ｍＭとなるようにして反応を行う。ま
た、反応液中には界面活性剤としてトリトンＸ−１００
を終濃度０．５％となるように添加する。反応終了後、
ＯＤＳ逆相カラムクロマトグラフィーで反応生成物と未
反応スフィンゴ脂質を分離する。溶出液としては、クロ
ロホルム／メタノール／水（５／４／１、ｖ／ｖ）を用
いることができる。ＨＰＬＣのモニターは、溶出液をＨ
ＰＴＬＣで分析することにより行うことができる。ＨＰ
ＴＬＣの展開溶媒はクロロホルム／メタノール／１０％
酢酸（５／４／１、ｖ／ｖ）、発色は糖脂質及びリゾ糖
脂質はオルシノール硫酸法、スフィンゴミエリン及びリ
ゾスフィンゴミエリン、セラミド及びスフィンゴシンは
クマシーブルー法で行うことができる。リゾスフィンゴ
脂質だけを検出したい場合は、ニンヒドリン法を用いる
ことができる。このように、本発明の酵素を用いてリゾ
スフィンゴ脂質を製造することができる。

【００２０】また、得られたリゾスフィンゴ脂質を再ア
シル化することにより各種の誘導体を得ることができ
る。例えば、リゾスフィンゴ脂質への脂肪酸の導入は、
ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下、脂肪酸とＮ
−ヒドロキシコハク酸イミドとのエステルを合成し、リ
ゾスフィンゴ脂質と反応させる方法、脂肪酸塩化物を合
成し、リゾスフィンゴ脂質と反応させる方法等により再
アシル化された誘導体を得ることができる。

【００２１】また、本発明の酵素を用いて得られるリゾ
スフィンゴ脂質のスフィンゴシン部分のアミノ基を標識
することにより、蛍光標識スフィンゴ脂質誘導体（蛍光
標識ネオスフィンゴ脂質）を合成することができる。例
えば、ダンシルクロリド、４−フルオロ−７−ニトロベ
ンゾフラザン（４−Fluoro−７−nitrobenzofurazan 、
ＮＢＤ−Ｆ）、１０−ピレンデカン酸等による標識が可
能である。

【００２２】更に、本酵素の逆反応を用い、標識を有
し、又は有しない少なくとも２種類のスフィンゴ脂質、
あるいはリゾスフィンゴ脂質と標識を有し、又は有しな
い脂肪族カルボン酸又は脂肪族カルボン酸誘導体を出発
原料とし、種々のスフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂
質誘導体を合成することが可能である。例えば、¹⁴Ｃ−
ＧａｌＣｅｒとスフィンゴミエリンの存在下、本酵素を
作用させることにより、¹⁴Ｃで標識されたスフィンゴミ
エリンを得ることができる。また、例えば、¹⁴Ｃで標識
されたステアリン酸とリゾスフィンゴミエリンの存在
下、本酵素を作用させることにより、¹⁴Ｃで標識された
スフィンゴミエリンを得ることができる。

【００２３】以上、詳細に説明したように、本発明によ
りスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼが提供さ
れ、該スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを用いるリ
ゾスフィンゴ脂質の製造方法が提供される。更には、本
発明のスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼの逆反
応を用いたスフィンゴ脂質又はスフィンゴ脂質誘導体の
製造方法が提供される。該酵素は、スフィンゴ脂質の機
能解明の研究、及び糖質工学等の分野において有用であ
る。また、該酵素を用いて製造したリゾスフィンゴ脂
質、スフィンゴ脂質の脂肪酸に代えて蛍光物質等を導入
した蛍光標識スフィンゴ脂質は、スフィンゴ脂質の細胞
内代謝や輸送経路の解明、スフィンゴ脂質の細胞内での
機能解明等の細胞工学に有用な基質及び試薬になるばか
りでなく、スフィンゴ脂質合成酵素や分解酵素の高感度
な基質になることが期待される。このスフィンゴ脂質の
共通構造であるセラミド部分の長鎖脂肪酸の修飾、置換
を行い、均一な長鎖脂肪酸を有するスフィンゴ脂質やス
フィンゴ脂質誘導体を製造することは工業的において有
用であり、例えば細胞への浸透性、細胞での代謝、ある
いは生物活性を改変した新しいスフィンゴ脂質誘導体を
作出でき医薬、化粧料、細胞工学等への応用が可能であ
る。

【００２４】更に、本発明で初めてアトピー性皮膚炎患
者の落屑からスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ
を生産する微生物が単離されたことにより、該微生物を
用いたアトピー性皮膚炎の増悪に関与する起炎菌を同定
することもできる。本発明の微生物をアトピー性皮膚炎
患者から検出するには、患部から得た各種試料、例えば
患部を拭った滅菌綿球、滅菌ガーゼ、滅菌綿棒や皮膚の
一部、表皮の落屑等を用いて各種選択培地で培養し、ス
フィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ活性を指標にす
ることにより検出することが可能である。また、該微生
物を抗原とする抗体を用いて免疫学的に検出することも
可能である。更には該微生物の遺伝子の配列の一部を取
得し、プローブ又はプライマーとして遺伝子工学的に、
例えばポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣ
Ｒ）法等を用いて検出することも可能である。更に、ア
トピー性皮膚炎の検出を行うことも可能である。

【００２５】

【実施例】次に実施例により本発明を更に具体的に説明
するが、これらの実施例は本発明の一例を示すものであ
り、本発明はこれらになんら限定されるものではない。

【００２６】実施例１ アトピー性皮膚炎患者の皮膚か
らのスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ生産菌の
単離 少量のアトピー性皮膚炎患者の落屑（表皮のはがれ落ち
た物）を１００μｌのＳＭ−ＰＹ培地（０．５％ペプト
ン、０．１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、
０．０５％スフィンゴミエリン、及び０．０５％タウロ
デオキシコール酸ナトリウム）に取り、２５℃で３日間
培養を行う。その培養液から５μｌを取り出し、１００
μｌのＳＭ−ＰＹ培地に植え継いだ。同じ培養操作を数
回繰り返した後、２０μｌの培養上清と¹⁴Ｃ−コリンラ
ベルされたスフィンゴミエリンを含む２０μｌの５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）／０．５％トリトンＸ−１
００を混合して３７℃で一晩反応させた。反応液を乾固
した後、２０μｌのクロロホルム／メタノール（２：
１）液に溶解し、遠心分離により不要物を除いた上清を
ＴＬＣプレート（シリカゲル６０、メルク社製）にの
せ、ブタノール／酢酸／水（２．５：１：１）で展開し
た。この薄層プレートをイメージングプレートにのせた
後、イメージングアナライザーＢａｓ１０００（富士写
真フィルム社製）を用いて反応生成物を確認したとこ
ろ、スフィンゴシルホスホリルコリン（リゾスフィンゴ
ミエリン）のバンドが見られた。培養液をＳＭ含有トリ
プトソーヤ寒天培地〔０．０１％スフィンゴミエリン、
０．０５％タウロデオキシコール酸ナトリウムを含むト
リプトソーヤ寒天培地（日水製薬社製）〕にまき、培養
後得られたコロニーを１００μｌのＳＭ合成培地（０．
０５％リン酸水素二カリウム、０．０５％塩化アンモニ
ウム、０．０５％スフィンゴミエリン、０．０５％タウ
ロデオキシコール酸ナトリウム、０．５％塩化ナトリウ
ム、ｐＨ７．２）で培養した。この培養液中のスフィン
ゴミエリンの分解物を薄層クロマトグラフにより分析
し、分解活性の強いコロニーの選択を行った。薄層クロ
マトグラフは培養液２０μｌを蒸発乾固した試料を２０
μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）液に溶解
し、遠心分離により不要物を除いた上清１０μｌをＴＬ
Ｃプレート（シリカゲル６０、メルク社製）にのせ、ク
ロロホルム／メタノール／１０％酢酸（５：４：１）で
展開した。展開されたＴＬＣプレートはオルシノール−
硫酸で焼き付けた後、クマシーブリリアントブルー染色
液によって染色を行った。また、ニンヒドリンを用いて
アミノ基の確認を行った。選択されたコロニーは上記の
操作を繰り返し行いスフィンゴミエリンをリゾスフィン
ゴミエリンまで分解する菌株の単離を行った。以上の操
作により、スフィンゴミエリンを分解する活性を持つ非
発酵性グラム陰性桿菌ＡＩ−２株を単離した。

【００２７】実施例２ スフィンゴ脂質セラミドＮ−デ
アシラーゼの精製 ０．５％ペプトン、０．１％酵母エキス、０．５％塩化
ナトリウム、及び０．０５％スフィンゴミエリン、及び
０．０５％タウロデオキシコール酸ナトリウムを含む液
体培地に、非発酵性グラム陰性桿菌ＡＩ−２（ＦＥＲＭ
Ｐ−１６１２４）を接種し、３０℃で７２時間培養し
た。培養終了後、培養液を６０００ｒｐｍ、３０分間の
遠心分離によって菌体を除去して培養上清を得た。該培
養上清を粗酵素液とした。また、この粗酵素液を２０ｍ
Ｍ トリス塩酸緩衝液（０．１％ルブロール含有、ｐＨ
７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（DE
AE-Sepharose FF 、ファルマシア社製）に供し、１Ｍ塩
化ナトリウムを含む同緩衝液へのグラジエント溶出によ
り溶出した。活性画分を回収し終濃度０．８Ｍになるよ
うに硫安を加え、２０ｍＭ酢酸緩衝液（０．８Ｍ硫安含
有、ｐＨ６．０）で平衡化したブチル−トヨパール（Bu
tyl-Toyopearl 、東ソー社製）に供し、２０ｍＭ酢酸緩
衝液（０．８Ｍ硫安含有、ｐＨ６．０）、２０ｍＭ酢酸
緩衝液（０．４Ｍ硫安含有、ｐＨ６．０）、２０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ酢酸緩衝液（１．０
％ルブロール含有、ｐＨ６．０）によって順次、溶出を
行った。本酵素は２０ｍＭ酢酸緩衝液（１．０％ルブロ
ール含有、ｐＨ６．０）によって溶出された。活性画分
は更に２０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ塩化ナトリウム
及び０．３％ルブロール含有、ｐＨ６．８）で平衡化し
たスーパーデックス−２００（Superdex-200、ファルマ
シア社製）によってゲルろ過クロマトグラフィーを行い
活性画分を回収し、このようにして得られた活性画分を
精製酵素とした。上述した酵素活性の測定法により、該
精製酵素の活性は１７７ｍＵ／リットルであった。更
に、該精製酵素は¹⁴Ｃ−ＧａｌＣｅｒを加水分解し、Ｇ
ａｌＣｅｒのリゾ体と¹⁴Ｃで標識された脂肪酸を生成す
る活性を有していた。

【００２８】実施例３ ¹⁴Ｃ標識されたスフィンゴミエ
リンの製造 実施例２で得られた粗酵素液に、最終濃度１ｍＭになる
ように¹⁴Ｃ−ＧａｌＣｅｒを加え、３７℃、３時間反応
した後、実施例２と同様の方法で生成物の確認を行った
ところ、ＧａｌＣｅｒのリゾ体及び¹⁴Ｃ標識された脂肪
酸、リゾスフィンゴミエリン及び¹⁴Ｃ標識されたスフィ
ンゴミエリンが確認された。この結果、本酵素の加水分
解反応により¹⁴Ｃ−ＧａｌＣｅｒから遊離した¹⁴Ｃ標識
された脂肪酸が、本酵素の加水分解反応により生成した
リゾスフィンゴミエリンに転移したことにより、¹⁴Ｃ標
識されたスフィンゴミエリンが生成されたことが明らか
となった。したがって、本酵素が加水分解だけでなく、
逆反応の活性も有していることが明らかとなった。

【００２９】

【発明の効果】本発明によって、従来知られている酵素
とは異なる基質特異性のスフィンゴ脂質セラミドＮ−デ
アシラーゼが提供され、該酵素を用いることによって種
々のスフィンゴ脂質からリゾスフィンゴ脂質を製造する
方法が提供された。また、このようにして得られたリゾ
スフィンゴ脂質は、その遊離アミノ基を利用して、例え
ば標識した脂肪酸を再導入したり、あるいは直接蛍光標
識したり、更にはアルブミン等の糖鎖を有しないタンパ
ク質と常法に従って結合させたりすることによってスフ
ィンゴ脂質誘導体に変換することができ、スフィンゴ脂
質関連酵素の活性測定用基質、精製用アフィニティーク
ロマトグラフィーのリガンドとして、及び抗スフィンゴ
脂質抗体の抗原として、あるいはスフィンゴ脂質の機能
解明の研究に用いることができ、スフィンゴ脂質の細胞
内代謝や輸送経路の解明、スフィンゴ脂質の細胞内での
機能解明等に有用な基質及び試薬として用いることがで
きる。また、本発明により、アトピー性皮膚炎の増悪に
関与すると考えられるスフィンゴ脂質セラミドＮ−デア
シラーゼを生産する微生物が単離されたことにより、該
微生物の純粋培養が可能となり、この微生物を駆除する
ことによるアトピー性皮膚炎の治療あるいは症状の軽減
作用を持つ薬剤の新たな開発が可能となる。更に、この
微生物の検出方法の開発が可能となり、アトピー性皮膚
炎の患者における起炎菌の同定が容易になる。また、こ
の微生物の生産するスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシ
ラーゼが得られたことにより、この酵素を不活化するこ
とによりアトピー性皮膚炎の治療あるいは症状の軽減作
用をもつ薬剤の開発が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明により得られるスフィンゴ脂質セラミド
Ｎ−デアシラーゼの至適ｐＨを示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
   とするスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ。 （１）作用：スフィンゴ脂質中の分子内セラミドに作用
   して、スフィンゴシン塩基と脂肪酸とに加水分解し、リ
   ゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を生成する。 （２）基質特異性：セラミド、スフィンゴ糖脂質及びス
   フィンゴリン脂質に作用する。 （３）至適ｐＨ：至適ｐＨが８〜１０である。
2. 【請求項２】 請求項１記載のスフィンゴ脂質セラミド
   Ｎ−デアシラーゼを用いてスフィンゴ脂質を処理するこ
   とを特徴とするリゾスフィンゴ脂質の製造方法。
3. 【請求項３】 スフィンゴ脂質を、請求項１記載のスフ
   ィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼの生産能を有する
   微生物と接触させることを特徴とするリゾスフィンゴ脂
   質の製造方法。
4. 【請求項４】 少なくとも異なる２種のスフィンゴ脂
   質、あるいはリゾスフィンゴ脂質と脂肪族カルボン酸又
   は脂肪族カルボン酸誘導体とを、請求項１記載のスフィ
   ンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼを用いて酵素的に反
   応させ、スフィンゴ脂質あるいはスフィンゴ脂質誘導体
   を得ることを特徴とするスフィンゴ脂質又はスフィンゴ
   脂質誘導体の製造方法。