CN1131317C - 溶血鞘脂的生产方法 - Google Patents

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Abstract

一种通过使用能够特异性水解鞘脂中类鞘脂和脂肪酸之间酸性酰胺键的酶来生产溶鞘脂类的方法，其特征在于酶反应在两相体系的液体反应混合物中进行，所说的混合物中含有至少一种形成水相和分离相的有机溶剂，如果需要可以有表面活性剂存在。

Description

溶血鞘脂的生产方法
技术领域
本发明涉及一种溶血鞘脂(lysosphingolipids)的生产方法。更具体说，本发明涉及生产溶血鞘脂的在工业上有用的方法，所说的溶血鞘脂适合用于化妆品、药物、鞘脂化(sphingo)技术、细胞技术等等，本发明还涉及通过所说生产方法获得的溶血鞘脂。
背景技术
具有类鞘脂(sphingoid)主链作为通式结构的脂类，如鞘糖脂、鞘磷脂(包括鞘膦脂)和神经酰胺总称为鞘脂。鞘脂样化合物主链的氨基与具有多种链长度的长链脂肪酸通过酰胺键连接以形成神经酰胺。
近来，据证实鞘脂广泛分布在生物体内(包括低等动物和高等动物)并且起重要的生物活性作用，例如生长、诱导分化和细胞中的编程性细胞死亡。此外，作为细胞膜组成之一的鞘脂已被用作化妆品或药物的添加剂。
缺少通过酰胺键与神经鞘脂类中类鞘脂的氨基相连接的脂肪酸的鞘脂的N-脱酰基化形式(溶血形式)称为溶血鞘脂。据证实溶血鞘脂与鞘脂相比具有相似的和不同的生物活性。
由于溶血鞘脂在鞘氨醇中含有游离的氨基，因而其可通过再酰化作用用作合成溶血鞘脂衍生物(鞘脂衍生物或鞘脂类似物)的起始原料。例如，可以合成含有同种脂肪酸组成的鞘脂、具有不同的脂肪酸链长度的鞘脂、或含有官能性脂肪酸(如二十二碳六烯酸)的新鞘脂。或者，可以获得用发色团、放射性同位素等标记的鞘脂。此外，可以通过利用溶血鞘脂中的游离氨基来实现固定化到载体上。
溶血鞘脂的常规生产方法包括化学方法、使用酶的方法和使用微生物的方法。
在醇溶剂中的肼解方法和碱性水解方法是已知的由鞘糖脂获得溶血鞘脂的化学方法。然而，当使用例如含有唾液酸的糖鞘脂(神经节苷脂)时，在此方法中唾液酸部分的脱酰基反应同时进行。此外，当使用含有氨基糖的鞘糖脂时N-乙酰基被除去，导致形成脱-N-乙酰基的溶血糖脂。使脱酰化的溶血糖鞘脂具有与天然存在的物质相同的糖链需要非常复杂的工艺。在一个示例性的方法中，将保护基团选择性地引入脂类部分的氨基上，将唾液酸部分再酰化，然后脱去保护基团。在另一个示例性的方法中，在掺入脂质体后将糖部分选择性再酰化。此外，在这些方法中产生了很多副产物。如上所述，通过化学方法生产溶血鞘脂需要大量的劳动和专业技术。
溶血形式的鞘磷脂之一(鞘磷脂)的化学生产通常使用在醇溶剂中使用盐酸水解的方法。然而，使用这种方法会产生各种副产物。例如，除天然存在的D-赤型(2S，3R)外还形成L-苏型(2S，3S)类鞘脂的立体异构体。结果，感兴趣的天然存在的D-赤型的产量较低，并且从反应混合物中纯化D-赤型是非常困难的。
另一方面，使用由鞘脂生产溶血形式的酶的方法是迄今为止已知的方法。已知有以下方法：使用通过诺卡氏菌属的放线菌产生的神经节苷脂神经酰胺酶(ceramidase)的方法(生物化学杂志103：1-4(1988)；JP-A64-60379)；使用通过红球菌属放线菌产生的酶或细胞加工产物的方法(JP-A6-78782)；使用通过假单胞菌属细菌产生的鞘脂神经酰胺N-脱酰基酶的方法(生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587)；使用通过非发酵型革兰氏阴性芽孢杆菌AI-2产生的鞘脂神经酰胺N-脱酰酶的方法(JP-A10-257884)；以及使用通过假单胞菌属细菌产生的神经酰胺酶的方法(JP-A10-14563)。
然而，在这些使用酶的方法中溶血形式的反应产率并不令人满意。例如，当使用鞘脂神经酰胺N-脱酰酶时，尽管产率根据所用的底物而变化，但由神经节苷脂GM2(其最是容易被水解的底物)的产率最多约为70％，而由神经节苷脂GM1的产率最多约为60％。
使用以下微生物或其提取物生产溶血鞘脂的方法是已知的：能够产生糖鞘脂神经酰胺脱酰酶的链霉菌属放线菌[生物科学、生物技术和生物化学59：2028-2032(1995)；JP-A7-107988]；以及产生神经鞘脂神经酰胺N-脱酰酶的假单胞菌属或希瓦氏菌属的细菌[JP-A-10-41792]。
然而，除在向培养基添加底物的过程中含有感兴趣的溶血形式外，反应中还含有诸如染料、糖脂等得自培养基或细胞的大量杂质。因此，为获得高纯度的溶血形式，此方法中需要复杂的纯化过程。此外，出于上述原因，在此方法中处理少量的鞘脂以纯化溶血形式是非常困难的。
在所有的通过使用酶、微生物或其提取物生产溶血鞘脂的常规方法中，反应仅在含水体系中进行。已知没有使用两相体系的方法，所说的两相由水相和有机溶剂相组成，其中有机相形成与水相不可混和的分离相。发明目的
如上所述，通过化学法、酶法或通过使用微生物生产溶血鞘脂的常规方法效率较差、会产生不期望的副产物、导致较低的反应产率、并且需要大量的劳动和专业技术来进行纯化。
因而，本发明的一个目的是提供一种有效生产溶血鞘脂的方法，该方法不产生副产物。
本发明的另一个目的是提供通过上述方法获得的溶血鞘脂。
通过以下的描述并且参考附图，本发明的这些和其它的目的和优点将变得显而易见。
附图简要描述
图1描绘了在有机溶剂的存在下产生溶血形式的最佳pH。
图2描绘了在有机溶剂的存在下或无有机溶剂的存在下影响溶血形式产率的底物特异性。
图3描绘了在表面活性剂和有机溶剂的存在下或无表面活性剂和有机溶剂的存在下产生溶血形式的时间过程。
图4描绘了在有机溶剂的存在下使用不同量的酶时溶血形式的产率。
图5描绘了所添加的有机溶剂的量和溶血形式的产率之间的关系。
发明概述
本发明人已经检验了工业上有利于大量制备高纯度溶血鞘脂的方法，并且发现了可以生产溶血鞘脂而不产生副产物、具有显著的反应产率和具有高纯度。其可以通过在两相体系反应混合物中进行酶反应来实现，所说的两相体系反应混合物含有与水不可混和的有机溶剂，以便使用特异性水解鞘脂中类鞘脂和脂肪酸之间酰胺键的酶来生产溶血鞘脂。此外，本发明人已经深入研究了符用的与水不可混和的有机溶剂，并且意外地发现根据所用的脂溶性有机溶剂，溶血鞘脂的产率大大改变。另外，本发明人已经发现了通过向两相体系反应混合物添加一种或多种表面活性剂可以更有效地生产溶血鞘脂。由此，本发明得以完成。
籍此，本发明提供以下方面：
1、一种通过使用特异性水解鞘脂中类鞘脂和脂肪酸之间酰胺键的酶来生产溶血鞘脂的方法，其中酶反应在两相体系反应混合物中进行，所说的混合物中含有至少一种与水不可混和的有机溶剂；
2、据上述(1)的生产溶血鞘脂的方法，其中酶反应在至少一种表面活性剂的存在下进行；
3、据上述(1)或(2)的生产溶血鞘脂的方法，其中有机溶剂选自烃、醇、酯和醚。
4、据上述(3)的生产溶血鞘脂的方法，其中烃是六碳或更多碳的烃。
5、据上述(3)的生产溶血鞘脂的方法，其中醇是八碳或更多碳的醇。
6、据上述(3)的生产溶血鞘脂的方法，其中酯由六碳或更多碳的羧酸和二碳或更多碳的醇组成。
7、据上述(3)的生产溶血鞘脂的方法，其中醚选自苯基醚、乙二醇二乙醚、二异丙基醚和乙烯基乙醚；
8、据上述(2)的生产溶血鞘脂的方法，其中表面活性剂选自具有甾族化合物主链的表面活性剂、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基醚和聚氧乙烯烷基醚；且
9、通过上述(1)-(8)任一方法获得的溶血鞘脂。
这里所用的“TM”是指商标。发明详细描述
本发明中用作底物的鞘脂包括天然存在的或合成的具有长链骨架、类鞘脂的物质，包括单独的或混和形式的鞘糖脂、鞘磷脂和神经酰胺。
在本文中，溶血鞘脂是指鞘脂的N-脱酰形式，不含有通过酰胺键与类鞘脂的氨基相连接的脂肪酸。
关于本发明中使用的特异性水解鞘脂中类鞘脂和脂肪酸之间酰胺键的酶没有限制。酶可以是已知的可从鞘脂中释放脂肪酸的酶，并且包括，例如：通过诺卡氏菌属放线菌产生的神经节苷脂神经酰胺酶[生物化学杂志103：1-4(1988)；JP-A64-60379]；通过红球菌属放线菌产生的酶(JP-A6-78782)；通过链霉菌属放线菌产生的糖鞘脂神经酰胺脱酰酶[生物科学、生物技术和生物化学59：2028-2032(1995)；JP-A7-107988]；通过假单胞菌属细菌产生的鞘脂神经酰胺N-脱酰酶[生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587]；通过希瓦氏菌属细菌产生的鞘脂神经酰胺N-脱酰酶[JP-A10-45792]；通过假单胞菌属细菌产生的神经酰胺酶[JP-A10-14563]；得自哺乳动物组织的神经酰胺酶[生物化学杂志241：3731-3737(1966)；生物化学8：1692-1698；Biochimica et BiophysicaActa176：339-347(1969)；科学178：1100-1102(1972)]；无脊椎动物神经酰胺酶[WO98/03529]。
其中，通过假单胞菌属细菌产生的鞘脂神经酰胺N-脱酰酶和通过希瓦氏菌属细菌产生的鞘脂神经酰胺N-脱酰酶具有广泛的底物特异性，并且特别优选于生产各种溶血鞘脂。
产生鞘脂神经酰胺N-脱酰酶的假单胞菌属的细菌菌株假单胞菌sp.TK-4被命名为G-182，并且已于1994年6月24日(原始保藏日)遵照布达佩斯条约进行了保藏，其入册登记号为FERM BP-5096。产生鞘脂神经酰胺N-脱酰酶的希瓦氏菌属的细菌菌株海藻希瓦氏菌(Shewanella alga)NS-589已于1996年6月26日保藏，入册登记号为FERM P-15700。这两个菌株已被保藏在通商产业省工业技术院生命工学和人体技术研究所，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号。
这些酶可以酶溶液的形式使用或者被固定化至不溶于水的载体上。
将水或水溶液用于本发明的水相。特别是，同针对各种反应的酶和底物等之中添加缓冲液是优选的。
分离相是与水不可混和的有机溶剂相。有机溶剂选自烃、醇、酯、醚和酮，以致在有机溶剂相和水相之间，脂肪酸(神经鞘脂类的降解产物)在有机溶剂相中的分配比高于水相，并且作为底物的神经鞘脂类在有机相中的分配比低于水相。
有机溶剂包括(但不限制于此)例如烃，包括脂族烃，如己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、壬烷、癸烷、十二烷、十五烷、十七烷、十八烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，2，3-三甲基庚烷、2，2，4-三甲基庚烷、己烯、辛烯、癸烯、十二碳烯、十五碳烯和十七碳烯；脂族环烃，如环己烷、甲基环己烷、环癸烷、环己烯和环癸烯；含卤烃，如二氯乙烷、四氯乙烷、三氯乙烯、四氯化碳、辛基氯化物、二苯乙酮基氯化物、氯苯和二氯苯；以及芳族烃，如苯、甲苯、二甲苯、均三苯、乙苯、丁基苯、异丙基苯和对异丙基甲苯。
醇类包括辛醇、癸醇、十二烷醇、辛烯醇、癸烯醇和环癸醇。
酯类包括己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、硬脂酸丁酯、柠檬酸丁酯和柠檬酸乙酯。
醚类包括苯基醚、乙烯基乙醚、乙二醇二乙醚、二异丙基醚和辛基醚。
酮类包括辛酮、癸酮和十二烷酮。
在上述列出的有机溶剂中，具体说来在本发明的方法中可以优选使用六碳或更多碳的烃(包括脂族、环状、芳族和含卤烃)、八碳或更多碳的醇、由六碳或更多碳的羧酸和二碳或更多碳的醇组成的酯、以及选自苯醚、乙二醇二乙醚、二异丙醚和乙烯基乙醚的醚。
此外，本发明中使用的有机溶剂的数量并不限制于一种。可以混合和使用两种或多种有机溶剂。
本发明中的两相体系包括其中水相和有机溶剂相所处状态为水相分散在有机溶剂相中或者所处状态为有机溶剂相分散在水相中(例如通过搅拌)、或者所处状态为水相和有机溶剂相分离成彼此接触的两个相(例如通过沉降而不分散)的体系。
或者，有机溶剂相和/或水相可以在继续酶反应的同时偶而交换，从而使溶血鞘脂的连续生产成为可能。有机溶剂的添加量可以不受限制，优选50％或更多，通常为水相体积的5-10倍。
水相中可以添加各种盐和表面活性剂。例如，可以添加选自以下物质中的至少一种：具有甾族化合物主链的表面活性剂，如牛磺脱氧胆酸钠和胆酸钠；聚氧乙烯烷基苯基醚，如Triton型表面活性剂和Nonidet P-40TM；聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基醚，如吐温型表面活性剂；以及非离子表面活性剂，如聚氧乙烯烷基醚。优选地，表面活性剂的量不受限制，以反应体系总体积计通常为0.1-2wt％。
关于反应条件没有限制。在所用的各个酶的最佳条件下(包括pH和温度)可以更有效地生产溶血鞘脂。
例如，当在反应中使用由假单胞菌属细菌产生的鞘脂神经酰胺N-脱酰酶时，优选通过添加具有甾族化合物主链的表面活性剂(如牛磺脱氧胆酸钠或胆酸钠)在pH6-10下进行反应。此外，通过联合使用聚氧乙烯烷基苯基醚(如Triton X-100TM或Nonidet P-40TM)可更有效地水解神经鞘脂类。
关于反应时间没有限制。反应可以进行使用酶从所用底物中获得所需量的溶血鞘脂所需要的时间，所说的底物如天然存在或合成的鞘脂，包括糖鞘脂、神经鞘磷脂和神经酰胺。
本发明生产的溶血鞘脂可以根据常规的方法来纯化。
可以通过沉降后分离成两相或者通过使用选择膜或柱来从反应混合物中除去有机溶剂。或者，可以通过减压浓缩或通过蒸馏来除去溶剂。
如此获得的在水相中含有溶血形式的反应混合物中含有少量污染物。因此，通过使用常规提取方法(如反相层析法、借助硅胶的正相层析法或离子交换层析法)可以容易地纯化溶血鞘脂。
此外，通过将有机溶剂蒸发可以获得得自鞘脂的脂肪酸，其中所说的有机溶剂来自从上述去除步骤中分离出的有机相。
通过薄层层析法、液相层析法、质谱法、核磁共振波谱法等的分析，可以证实纯化的溶血鞘脂的结构。
如上所述，根据本发明的方法可以将鞘脂转化成感兴趣的溶血鞘脂。
另外，通过处理本发明获得的溶血鞘脂，可以生产溶血鞘脂的衍生物。例如，可以如下生产溶血鞘脂的衍生物。
可以根据氨基酰胺化的化学或酶的常规方法来进行再酰化作用。
在化学再酰化中，反应可以通过使用标记或未标记的脂族羧酸或其反应性衍生物来进行。本发明中可以使用的脂族羧酸的实例包括饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、以及所有的具有脂族化合物特性的羧酸，例如其中脂肪酸烃链被卤素或诸如取代或未取代的氨基、氧基或羟基的官能团所取代的酸、或者烃链中具有氧、硫或氨基的酸。
酶促再酰化可以通过使用已知的脂肪酶来实现。在一个特别有用的方法中，通过利用特异性水解鞘脂中类鞘脂和脂肪酸之间酰胺键的酶(例如上述的鞘脂神经酰胺N-脱酰酶(WO98/03529))的逆反应，可以容易地进行再酰化反应。
所得溶血鞘脂中神经酰胺的氨基的标记可以通过将形成发色团的物质、荧光物质、生物素、放射性同位素等引入需要标记的部分中来完成。
以下实施例将对本发明作更详细的举例说明，但不要理解为限制本发明的范围。
实施例1
通过添加各种有机溶剂生产溶血鞘脂
将100μl每等分的各种有机溶剂添加到10μl 50mM乙酸缓冲液中(pH6.0)，所说的缓冲液含有2mU得自假单胞菌属细菌假单胞菌sp.TK-4(FERM BP-5069)的鞘脂神经酰胺N-脱酰酶[SCD酶；生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587]、0.8％牛磺脱氧胆酸钠(nacalai tesque)和10nmol GM1(Matreya)。将混合物在37℃下培养16小时。将不含有机溶剂的混合物同样培养作为对照。
使用薄层层析使所得反应混合物展开。使用苔黑酚-硫酸目测检验TLC平板。然后，使用图像光密度计(Bio-Rad)定量测定GM1溶血形式的产率。结果示于表1。
在下表1列出的有机溶剂中，环癸烷来自Aldrich且其它全部来自nacalai tesque。
表1
溶剂                       溶血形式的产率(％)
对照                       68
1-丁醇                            44
1-戊醇                            51
1-己醇                            53
1-庚醇                            62
1-辛醇                            70
2-辛醇                            90
1-癸醇                            83
1-十二烷醇                        100
己烷                              76
辛烷                              89
癸烷                              95
十五烷                            97
十七烷                            97
十八烷                            97
1-己烯                            80
1-辛烯                            91
1-癸烯                            94
1-十二碳烯                        93
环己烷                            87
甲基环己烷                        93
环癸烷                            89
苯                                70
甲苯                              84
二甲苯                            95
均三苯                            97
正乙苯                            97
正丁基苯                          99
对异丙基甲苯                      98
异丙基苯                          96
正辛基氯化物                      99
正二苯乙酮基氯化物                100
氯仿                              62
四氯化碳                      73
乙酸乙酯                      58
乙酸丁酯                      68
乙酸己酯                      60
乙酸苯酯                      55
乙酸苄酯                      67
己酸甲酯                      47
辛酸甲酯                      61
癸酸甲酯                      62
十二碳酸甲酯                  68
丙酸乙酯                      58
丁酸乙酯                      54
己酸乙酯                      73
辛酸乙酯                      73
癸酸乙酯                      75
十二碳酸乙酯                  74
肉豆蔻酸异丙酯                91
硬脂酸正丁酯                  84
苯醚                          97
乙醚                          41
丙醚                          54
丁醚                          64
乙烯基乙醚                    73
乙烯基丁醚                    61
乙二醇二乙醚                  71
二异丙基醚                    91
实施例2
表面活性剂的研究
将100μl等分的正癸烷(nacalai tesque)添加到10μl 50mM乙酸缓冲液中(pH6.0)，所说的缓冲液含有2mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶[生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587]、各种表面活性剂之一种和10nmol GM1(Matreya)。将混合物在37℃下培养16小时。
使用薄层层析使所得反应混合物展开。使用苔黑酚-硫酸目测检验TLC平板。然后，如实施例1所述使用图像光密度计(Bio-Rad)定量测定GM1溶血形式的产率。结果示于表2。
表面活性剂的最终浓度以反应体系的体积计为0.8wt％。在下表2列出的表面活性剂中，Triton X-100TM来自Pierce且其它全部来自nacalai tesque。
表2
表面活性剂                     溶血形式的产率(％)
没有添加                       25
牛磺脱氧胆酸钠                 99
胆酸钠                         92
Triton X-100TM                64
吐温20TM                      42
Nonidet P-40TM                60
Brij-58TM                     66
Lubrol PXTM                   72
实施例3
牛磺脱氧胆酸钠浓度的研究
将100μl等分的正十七烷(nacalai tesque)添加到10μl 50mM乙酸缓冲液中(pH6.0)，所说的缓冲液含有2mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶[生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587]、不同浓度的牛磺脱氧胆酸钠(nacalai tesque)和10nmolGM1(Matreya)。将混合物在37℃下培养16小时。
使用薄层层析使所得反应混合物展开。使用苔黑酚-硫酸目测检验TLC平板。然后，如实施例1所述使用图像光密度计(Bio-Rad)定量测定GM1溶血形式的产率。结果示于表3。表3中表面活性剂的浓度是最终浓度，以反应体系体积计的wt％来表达。
表3
浓度                  溶血形式的产率(％)
0                     25
0.05                  55
0.01                  65
0.2                   80
0.4                   88
0.8                   92
1.0                   92
实施例4
最佳pH的研究
将100μl等分的正癸烷(nacalai tesque)添加到10μl 50mM的各种缓冲液之一种中，所说的缓冲液含有2mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶[生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587]、0.8％牛磺脱氧胆酸钠(nacalai tesque)和10nmol GM1(Matreya)。将混合物在37C下培养16小时。使用如下的缓冲液：pH3-6的乙酸缓冲液、pH6-8的磷酸缓冲液、pH8-9的tris-HCl缓冲液、和pH9-10的甘氨酸-NaOH缓冲液。
使用薄层层析使所得反应混合物展开。使用苔黑酚-硫酸目测检验TLC平板。然后，如实施例1所述使用图像光密度计(Bio-Rad)定量测定GM1的降解率，即溶血形式的产率。结果如图1所示。
图1描绘了在有机溶剂的存在下针对溶血形式产率的最佳pH。在图中，纵轴和横轴分别表示降解率(％)和pH。空心圆圈和空心圆圈、空心三角和空心三角分别代表通过使用乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液和甘氨酸-NaOH缓冲液获得的结果。
实施例5
在有机溶剂存在下的底物特异性
将100μl等分的正十七烷(nacalai tesque)添加到10μl 50mM乙酸缓冲液中(pH6.0)，所说的缓冲液含有2mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶[生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587]、0.8％牛磺脱氧胆酸钠(nacalai tesque)和10nmol各种不同的底物.将混合物在37℃下培养16小时。制备不含正十七烷的反应混合物作为对照。使用以下底物：神经酰胺(Cer)、半乳糖苷神经酰胺(GalCer)、硫苷脂、GM1、脱唾液酸GM1、GD1a、鞘磷脂(所有均来自Matreya)。
在所得的反应混合物中，通过使用薄层层析展开并且使用茚三酮试剂目测检验所产生的鞘氨醇来定量测定得自神经酰胺的溶解形式的产率。通过使用考马斯亮蓝目测检验所产生的溶血鞘磷脂来定量测定鞘磷脂的产率。使用薄层层析使含有其它底物的反应混合物展开。使用苔黑酚-硫酸目测检验TLC平板。然后，如实施例1所述使用图像光密度计(Bio-Rad)定量测定得自各个底物的溶血形式的产率。结果如图2所示。
图2描绘了在有机溶剂存在或缺少的情况下影响溶血形式产率的底物特异性。在图中，纵轴和横轴分别表示产率(％)和各种底物。涂黑条表示在正十七烷存在下的降解率，而透明条表示没有正十七烷存在下的降解率。
实施例6
在有或无牛磺脱氧胆酸钠、Triton X-100TM和有机溶剂存在下溶血形式产率的时间过程
在如下(A)-(D)的反应条件下于37℃下反应0、0.5、1、2、6或16小时后，定量测定产率。使用薄层层析使所得反应混合物展开。使用苔黑酚-硫酸目测检验TLC平板。然后，如实施例1所述使用图像光密度计(Bio-Rad)定量测定GM1的降解率，即溶血形式的产率。结果如图3所示。
图3描绘了在有表面活性剂和有机溶剂或没有表面活性剂和有机溶剂存在下GM1降解率的时间过程。图中，纵轴和横轴分别表示降解率(％)和时间(hr)。符号表示在以下物质的存在下获得的结果：牛磺脱氧胆酸钠和正癸烷(空心圆圈)、牛磺脱氧胆酸钠(空心圆圈)、Triton X-100TM和正癸烷(空心方块)、或Triton X-100TM(空心三角)。
反应条件(A)：将100μl等分的正癸烷(nacalai tesque)添加到10μl 50mM的乙酸缓冲液中(pH6.0)，所说的缓冲液含有2mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶[生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587]、0.8％牛磺脱氧胆酸钠(nacalai tesque)和10nmolGM1(Matreya)，并且培养。
反应条件(B)：10μl等分的50mM乙酸缓冲液(pH6.0)，所说的缓冲液含有2mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶、0.8％牛磺脱氧胆酸钠和100nmol GM1，并且培养。
反应条件(C)：将100μl等分的正癸烷添加到10μl 50mM的乙酸缓冲液中(pH6.0)，所说的缓冲液含有2mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶、0.8％Triton X-100TM(Pierce)和10nmol GM1，并且培养。
反应条件(D)：10μl等分的50mM乙酸缓冲液(pH6.0)，所说的缓冲液含有2mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶、0.8％Triton X-100TM和10nmol GM1，并且培养。
实施例7
在牛磺脱氧胆酸钠、Triton X-100TM和有机溶剂存在下溶血形式产率的研究
将100μl等分的正十七烷(nacalai tesque)添加到10μl 50mM乙酸缓冲液中(pH6.0)，所说的缓冲液含有0.5mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶[生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587]；0.8％牛磺脱氧胆酸钠(nacalai tesque)；0、0.1、0.4或0.8％Triton X-100TM(Pierce)和10nmol GM1(Matreya)，并且在37℃下培养16小时。
使用薄层层析使所得反应混合物展开。使用苔黑酚-硫酸目测检验TLC平板。然后，如实施例1所述使用图像光密度计(Bio-Rad)定量测定GM1的降解率，即溶血形式的产率。结果如图4所示。
图4描绘了在牛磺脱氧胆酸钠、不同浓度Triton X-100TM和有机溶剂的存在下使用不同量的酶的GM1降解率。图中，纵轴和横轴分别表示降解率(％)和Triton X-100TM的浓度(％)。
实施例8
有机溶剂的量的研究
将不同数量的正癸烷(nacalai tesque)或正十七烷(nacalaitesque)添加到10μl 50mM乙酸缓冲液中(pH6.0)，所说的缓冲液含有2mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶[生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587]、0.8％牛磺脱氧胆酸钠(nacalaitesque)、0.1％Triton X-100TM(Pierce)和10nmol GM1(Matreya)。将混合物在37℃下培养16小时。
使用薄层层析使所得反应混合物展开。使用苔黑酚-硫酸目测检验TLC平板。然后，如实施例1所述使用图像光密度计(Bio-Rad)定量测定GM1的降解率，即溶血形式的产率。结果如图5所示。
图5描绘了有机溶剂的量与溶血形式的产率之间的关系。图中，纵轴和横轴分别表示降解率(％)和有机溶剂的量(μl)。透明条表示正癸烷的结果，而涂黑条表示正十七烷的结果。
实施例9
使用低浓度酶时各种表面活性剂的研究
将100μl等分的正十七烷(nacalai tesque)添加到10μl 50mM乙酸缓冲液中(pH6.0)，所说的缓冲液含有0.5mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶[生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587]、各种表面活性剂之一种和10nmol GM1(Matreya)。将混合物在37℃下培养16小时。
使用薄层层析使所得反应混合物展开。使用苔黑酚-硫酸目测检验TLC平板。然后，如实施例1所述使用图像光密度计(Bio-Rad)定量测定GM1的溶血形式的产率。结果如表4所示。
表面活性剂的最终浓度以反应体系的体积计为0.1wt％。在下表4所列出的表面活性剂中，Triton X-100TM来自Pierce并且所有其它的物质均来自nacalai tesque。
表4
浓度                        溶血形式的产率(％)
Triton X-100TM             39
吐温20TM                   51
吐温80TM                   69
Nonidet P-40TM                 64
Brij-58TM                      65
Lubrol PXTM                    67
实施例10
使用含牛磺脱氧胆酸钠和各种表面活性剂的混合物时溶血形式产率的研究
将100μl等分的正十七烷(nacalai tesque)添加到10μl 50mM乙酸缓冲液中(pH6.0)，所说的缓冲液含有0.5mU得自假单胞菌属细菌的SCD酶[生物化学杂志270：24370-24374(1995)；JP-A8-84587]、0.8％牛磺脱氧胆酸钠和各种表面活性剂之一种以及10nmolGM1(Matreya)。将混合物在37℃下培养16小时。使仅含有牛磺脱氧胆酸钠的混合物反应作为对照。
使用薄层层析使所得反应混合物展开。使用苔黑酚-硫酸目测检验TLC平板。然后，如实施例1所述使用图像光密度计(Bio-Rad)定量测定GM1的溶血形式的产率。结果如表5所示。
混合物中表面活性剂的最终浓度以反应体系的体积计为0.1wt％。在下表5所列出的表面活性剂中，Triton X-100TM来自Pierce并且所有其它的物质均来自nacalai tesque。
表5
混合物中的表面活性剂         溶血形式的产率(％)
对照                         53
Triton X-100TM              70
Nonidet P-40TM              68
吐温20TM                    48
吐温80TM                    50
Brij-58TM                   53
Lubrol PXTM                 57
实施例11
溶神经节苷脂GM3的生产
将10mg神经节苷脂GM3(Matreya)溶解于10ml 50mM乙酸缓冲液中(pH6.0)，所说的缓冲液含有0.8％牛磺脱氧胆酸钠。将混合物放入200ml梨形烧瓶中，然后向其中加入2U的SCD酶。其上覆盖100ml等分的正癸烷，并且将混合物在37℃下放置16小时。向水相加入1U的SCD酶，并且将混合物再在37℃下培养16小时。此时，神经节苷脂GM3的降解率为95％。
在反应完成之后，回收水相，将其分成两等份并且使用反相层析进行纯化。将水相加到POROS R2H柱中(Φ4.6×100mm，PerSeptive)，然后用乙腈∶水＝10∶90到乙腈∶甲醇＝10∶90进行梯度洗脱。收集合有溶血神经节苷脂GM3的洗脱级分并且浓缩至干。结果，通过薄层层析、使用苔黑酚-硫酸与重铬酸(bichromic acid)-硫酸混合物目测检验证实获得了5.6mg纯度为95％或者更高的溶血形式。
如上所述，通过本发明的生产方法可以有效地、方便和高纯度地大量工业化制备溶血鞘脂。

Claims (8)

1、一种通过使用特异性水解鞘脂中类鞘脂和脂肪酸之间酰胺键的酶来生产溶血鞘脂的方法，其中酶反应在两相体系反应混合物中进行，所说的混合物中含有至少一种与水不可混和的有机溶剂。
2、据权利要求1的生产溶血鞘脂的方法，其中所述的酶反应在至少一种表面活性剂的存在下进行。
3、据权利要求1或2的生产溶血鞘脂的方法，其中所述有机溶剂选自烃、醇、酯和醚。
4、据权利要求3的生产溶鞘脂类的方法，其中所述的烃是六碳或更多碳的烃。
5、据权利要求3的生产溶鞘脂类的方法，其中所述的醇是八碳或更多碳的醇。
6、据权利要求3的生产溶鞘脂类的方法，其中所述的酯由六碳或更多碳的羧酸和二碳或更多碳的醇组成。
7、据权利要求3的生产溶血鞘脂的方法，其中所述的醚选自苯基醚、乙二醇二乙醚、二异丙基醚和乙烯基乙醚。
8、据权利要求2的生产溶血鞘脂的方法，其中所述的表面活性剂选自具有甾族化合物主链的表面活性剂、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基醚和聚氧乙烯烷基醚。
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