JPH0240644B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は活性物質、特に生理活性物質を含有す
るリポゾームに関する。 従来、薬物のごとき生理活性物質を生体内に直
接投与した場合には(1)薬物に対する抗体増殖と云
う免疫学的問題、(2)薬物が標的以外の組織にまで
も取り込まれて生ずる副作用拡大の問題、あるい
は逆に、(3)薬剤が標的組織を透過し難いために生
ずる問題、更に(4)薬剤が体内酵素による分解その
他で活性を維持し難い問題の生ずる場合が多い。 而して、上掲したごとき問題は、薬物のような
生理活性物質を、それを保護しつつ生体内の標的
組織に直接に運び得る担体に担持して投与すれば
解決されることになる。 上述した見地から、近年、特開昭49−118826号
は、一般式Ｘ―Ｙ（式、Ｘは極性親水性基を、Ｙ
は非極性疎水性基を示す）で表わされる化合物、
例えばレシチン、ホスフアチジルエタノールアミ
ン、ホスフアチジルセリンなどの純粋なリン脂質
を膜材として用いて形成した、少くとも１層の２
分子層を有する閉鎖ラメラ（ミセル）構造を有す
る小胞、すなわち、リポゾームの内胞水溶液中に
生理活性物質を含有して成るリポゾームを提案し
ている。この活性物質含有リポゾームは、過酷な
条件下、例えば、胃腸内においてもリポゾームを
形成している壁膜がその内胞水溶液中の活性物質
を保護しているので、該リポゾームを経口投与し
た場合でも上記活性物質の活性が損われることが
ない。また、このリポゾームはその粒径に応じて
生体内の組織に対する浸透性が変化するので、こ
の粒径の大きさを調整することにより上記組織に
対する活性物質の浸透性を高めることが可能とな
る。したがつて、上記リポゾームはそれが含有す
る生理活性物質を特定の生体組織へ選択的に供給
することを可能にするものとして極めて注目され
る。 しかしながら、上記提案されたリポゾームを形
成している。上述したごとき純粋なリン脂質から
成つている壁膜は柔軟性に欠けていると共に、そ
の機械的強度も不充分であるという欠点がある。
また、このリポゾームにおいてはその内胞に含ま
れる生理活性物質の外部への流出速度が過大であ
るため、生理活性物質を生体内で緩除に放出する
性質、いわゆる上記活性物質の徐放性の点で必ず
しも満足的でない。特に、上記リポゾームはそれ
を形成している壁膜のゲルーゾル遷移温度以上の
温度条件下では上記活性物質の流出速度が著しく
上昇する欠点を有する。 上記リポゾームにみられる上記諸欠点のうち、
リポゾームを形成している壁膜の強度を改善する
目的でコレステロールのごときステロール系脂質
を、膜材としての前記リン脂質に混在させること
が提案されている。しかし、この提案によるとリ
ポゾームを形成する壁膜の強度は幾らか増大する
が、上記活性物質の除放性は未だ不満足である。 本発明者は、活性物質含有リポゾームにおける
上述した現況にかんがみ、壁膜の強度が高く、か
つ生理活性物質の体内における徐放性が良好なリ
ポゾームを提供すべく検討した結果、粗レシチン
のごとき、油性分子を含有するリン脂質を膜材と
して用いて形成したリポゾームの壁膜が、従来公
知の純粋なリン脂質を膜材として用いて形成した
リポゾームの壁膜に比して柔軟性に富むと同時
に、その内胞に含まれる生理活性物質の生体内に
おける徐放性に優れていることを見出した。 すなわち、油性物質の分子が混在又は結合した
リン脂質から形成されるリポゾームが上述したご
とき特性を示すことは驚異的であると言い得る。 本発明の目的は、活性物質含有リポゾームにお
いて、その壁膜の強度が高く、かつ上記活性物質
の生体内における除放性が良好な新規なリポゾー
ムを提供することである。 本発明のその他の目的は以下の記載から明らか
になるであろう。 本発明の特徴は、ミセル膜層から成る壁膜によ
り形成される小胞内に活性物質を包含するリポゾ
ームにおいて、油性物質の分子が存在するリン脂
質から成るミセル膜層を該リポゾームの壁膜とし
て用いることにある。 また、本発明の上記壁膜を用いて形成した活性
物質含有リポゾームの特徴は、ここに添付の第１
図に示すごときＷ／Ｏ／Ｗ型の複合エマルジヨン
形態を有し、生体内において上記活性物質のリポ
ゾーム外部への優れた徐放性を示すことにある。
第１図において、Ｘは親水性基を、Ｙは疎水性基
をそれぞれ示し、Ｐは水性溶液を含有する小胞を
示し、Ｑはリポゾームの外側における水性溶液を
示す。 本発明のリポゾームを形成するための壁膜は上
述のごとくリン脂質に油性物質が混在又は結合し
たものから成る。ここで用いるリン脂質は、従来
リポゾームの膜層として用いられているものであ
れば特に限定されるものでなく、例えばレシチ
ン，フオスフアチジル―エタノールアミン，リゾ
レシチン，リゾフオスフアチジルエタノールアミ
ン，フオスフアチジルセリン，フオスフアチジル
イノシトール、スフインゴミリエリン，カルジオ
リピンなどの単独または、それらの混合物であつ
て、必要に応じコレステロール，エルゴステロー
ルなどのステロール類を含有していてもよい。 上記リン脂質に混在又は結合させる油性物質
は、天然油脂、例えば、大豆油、綿実油又はゴム
油のごとき植物油から選ばれる。 本発明においては、粗レシチンは単独またはこ
れに上掲したごとき油性物質を混合して用いるの
が特に好ましい。 ここで用いる“粗レシチン”という用語は、卵
黄，大豆油のごとき物質から由来するリン脂質に
富む成分をアルミナカラムクロマトグラフイで分
別する際、クロロホルム又はクロロホルムとメタ
ノールの混合液（100：１乃至３：２の割合の混
合液）で溶出する留分であつて、純粋のレシチン
に97乃至80％３乃至20重量％の油性物質、例えば
トリグリセリドおよびカロチノイドが混在した混
合物から成るものを意味する。この粗レシチンを
膜材として用いてリポゾームを形成するに当つて
は、形成されるリポゾームの壁膜中に上記油性物
質が３乃至20重量％、好ましくは５乃至15重量％
存在するように粗レシチン中油性物質の含量を調
整する。なお、上記壁膜中の油性物質の含量が20
重量％を越えると該壁膜の形成が損われてリポゾ
ームの収率が低下するので留意すべきである。一
方、上記壁膜中の油性物質の含量が３重量％より
低くなると上述した本発明の目的が達成されなく
なる。 また、本発明のリポゾームの形成に際して、上
記膜材にコレステロール，エルゴステロールのご
ときステロール類およびリポゾーム表面の荷電状
態を変化し得る物質、例えば負の電荷付与のため
のホスフアチド酸、リン酸ジセチルまたは牛脳の
ガングリオキシド或いは正の電荷付与のためのス
テアリルアミンなどを第三成分として混在せしめ
てもよい。この第三成分の添加量は使用するリン
脂質の性質に応じて適当に定めればよく、通常膜
材の０〜10重量％である。 上記リン脂質と油性物質が混在する混合物を膜
材として用いて本発明のリポゾームを形成するに
は、従来法を適用し得る。例えば、上記膜材を薄
層フイルムに形成し、このフイルムを活性物質を
含有する連続相と接触させて撹拌分散させたの
ち、この分散系に超音波振動を与える方法、或は
水に不溶な溶媒に上記膜材を溶解した溶液と、上
記活性物質を含有する水系溶液とを混合後、超音
波処理してリポゾーム前駆体を形成せしめ、次い
で前駆体を含む溶液を水系溶媒の共存下に超遠心
処理を行なう方法、更にガラスビーズなどの表面
に上記膜材を被覆した後に、この被覆ビーズを上
記活性物質含有溶液と混合して該溶液中に分散さ
せる方法を適用し得る。上記リポゾームの形成に
際して用いる上記膜材の量はリポゾームが懸濁し
ている液１ml当り１〜500mgである。 上述のごとくして得られる本発明のリポゾーム
はそれを形成している膜材中のリン脂質が有する
疎水性基と膜材中に存在する油性物質の分子とが
相互に作用して形成したものであつて公知の純粋
なリン脂質ミセル型のリポゾームとはその構造が
本質的に相違していると言い得る。 また、本発明のリポゾームの壁膜を構成してい
る油性物質は、膜材からのリポゾームの形成に際
してリポゾーム収率の向上、およびリポゾームの
形成後のリポゾームの分離操作の容易性，リポゾ
ームの粒径の均一性，リポゾームの壁膜の柔軟性
と強度の向上，リポゾームの内胞に包含される活
性物質の生体内における徐放性の改善をもたらす
ものである。 本発明のリポゾームの形成に際して使用される
活性物質、特に生理活性物質としては、インシユ
リン，オキシトシン，バゾプレシン，副腎皮質刺
戟ホルモン（ACTH）、黄体ホルモン放出ホルモ
ン（LH―RH）カルシトニン，スタチンのごと
きペプチドホルモン，黄体ホルモン，卵胞ホルモ
ン，副腎皮質ホルモンのごときステロイドホルモ
ンおよびプロスタグランジン，アデノシン―3′，
5′―サイクリツクモノホスフエートのごときその
他のホルモン、或いはクロラムブチル，ストレプ
トゾトシン，メソトレキセート，５―フルオロウ
ラシル，シトシンアラビノシド，マイトマイシン
Ｃ，ブレオマシン，多糖体系抗腫瘍剤などの抗腫
瘍剤，ペニシリン，セフアロスポリン，ストレプ
トマイシンなどの抗生物質，アミノグルコシダー
ゼ，インベルターゼなどの酵素剤を例示すること
ができる。 本発明のリポゾームは、平均粒径0.01〜10ミク
ロン程度の粒子径分布の狭い粒子からなつており
特に平均粒径0.5〜５ミクロン程度の比較的大型
のリポゾーム粒子で粒子径の均一なものが容易に
得られる。この粒子は柔軟性に富み、かつ2000〜
4000r.p.m.程度の低速遠心による濃縮が可能であ
り、更に濃縮後の再分散は、特に超音波処理によ
らず短時間振盪するだけで行われて、もとの分離
状態に復帰するなどの優れた性質を有する。 本発明のリポゾームは、上述したごとき特性か
ら理解されるように、従来のリン脂質ミセル型リ
ポゾームと比較してその内胞に含有する活性物質
の保持能力が格段に優れており、かつ、既述した
ごとく上記活性物質の徐放性も良好であるので、
生体内の不安定な薬物、および不可避的な過剰量
の投与により副作用を生ずる薬物の保護剤として
特に好適である。したがつて、本発明のリポゾー
ムは医薬として有効に利用し得る。 例えば、本発明のリポゾームをインシユリン注
射剤として適用すると従来日量0.1〜４mgのイン
シユリンを３回に分け、毎日筋肉注射していた成
人に対し、本発明による製剤0.2〜20mgを２〜７
日に１回筋肉注射して同一効果を得ることができ
る。 本発明のリポゾームは医薬として利用する場合
には、経口，経皮，皮下，筋肉内，腹腔内，静脈
内，直腸内，局所などの諸経路による投与が可能
であり、特に皮下、筋肉内或いは局所投与が好ま
しい。投与量は投与式、経路、活性物質の種類な
らびに治療の程度に左右されるが、大略は、通常
１日当り活性物質投与量の0.1〜１倍であつて、
かつ投与間隔の延長が可能である。 なお、本発明のリポゾームは生理的食塩水に懸
濁させることにより注射薬剤として使用し得る。 特に、本発明のリポゾームにおいて活性物質と
してペプチドホルモン類を含む各種ペプチド性生
理活性物質を含有したリポゾームは皮下又は筋肉
内注射剤として適用すると卓効を発揮する。一般
に、ペプチド性生理活性物質は生体内での分解が
速いのでその効果を維持するためには該物質の頻
回投与（注射）が必要となり、したがつて、患者
の負担が大きくなるのみでなく、上記物質の血中
濃度に大きな変動がみられ、その結果該物質の投
与効果が低下し、かつ副作用が発現し易くなる。 これに対し、本発明のリポゾームは後記実施例
に示すごとく、皮下又は筋肉内注射においても優
れた徐放性を示すので投与回数を大巾に減らし得
ると共に、ペプチド性生理活性物質の血中濃度を
均一に保持し得、したがつて、該物質の効果を十
分に発揮することができ、かつ副作用も抑制し得
る。 本発明のリポゾームを形成するための前記膜材
の急性毒性を、以下に示す各実施例で用いた膜材
についてラツトを用いて皮下注射および静脈注射
を行つて測定した結果、何れも1000mg／Kgまでは
何らの毒性徴候も認められなかつた。したがつ
て、本発明のリポゾームは医薬として安全に適用
し得る。 以下に実施例を示して本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ 市販粗卵黄レシチン（メルク社製）100mg、コ
レステロール11.6mgおよびステアリルアミン2.7
mgを10mlのクロロホルムに溶解し、この溶液を内
容25mlの丸底フラスコに入れ、このフラスコを回
転蒸発機に設置して、減圧下38℃でクロロホルム
を留去することによつてフラスコ内壁にフイルム
を形成せしめた。このフラスコにアデノシン―
3′，5′―サイクリツクモノホスフエート（以下Ｃ
―AMPと略称する）の１重量％水溶液を１ml加
え、フラスコを30分振盪してフイルムをフラスコ
内壁から剥離・分散せしめた後、生成した分散液
を超音波処理機（日本精機製，NS200―２型）で
20分間超音波処理して平均粒径１〜２ミクロンの
粒子の懸濁分散液を得た。次いでこの懸濁分散液
の６倍容の生理的食塩水をこれに加え、3000r.p.
m.10分間の遠心分離操作を３回行つて、形成さ
れたリポゾームとリポゾーム内に取り込まれなか
つたＣ―AMP（溶液）とを完全に分離した。かく
て得られたリポゾームを１―１とする。比較の為
に、第１表に比較例として示す組成の膜材料を用
い、上記と同様な方法でリポゾーム４種、即ち１
―２，１―３，１―４および１―５を得た。 これらのリポゾームのＣ―AMPの捕収率およ
びＣ―AMPの膜外放出度の測定値を第１表に示
す。第１表に見るごとく、本発明による膜材、粗
レシチンを使用することにより従来の膜材を使用
したものよりも、捕収率および保持率が格段に改
良された。

【表】

【表】 実施例 ２ 実施例１におけるＣ―AMP水溶液の代りに20
重量％のグルコース水溶液１mlを用い、その他は
実施例１に記載と全く同様な手順で下記第２表に
示す組成の各種膜材からリポゾーム（２―１乃至
２―12）を形成した。膜材の一成分である綿実油
の量と各リポゾームのグルコース捕収率の関係を
第２図に示す。また、試料２―７，２―８および
２―９について37℃で行つたグルコースの透過性
試験の結果を第３図に示す。これらの図から本発
明のリポゾームの優位性が明らかに認められる。

【表】

【表】 実施例 ３ 下記第３表に示す組成の膜材料を用い、実施例
１に記載と同様の手順でフラスコ内壁にフイルム
を形成せしめ、これらの各々に、クエン酸緩衝液
（PH2.3）10ml当りインシユリン10mgを含む溶液１
mlを添加した後、実施例１に記載と同様の手順で
１〜２ミクロン程度の粒径のリポゾーム粒子懸濁
分散液を調製した。これを室温に24時間放置した
後、６mlの生理的食塩水で１回、生理的食塩水に
クエン酸緩衝液を混合した液（容量比６：１）で
２回処理し、遠心分離してリポゾームを得た。こ
のようにして得られたリポゾームに更にクエン酸
緩衝液を加えて、インシユリン濃度を40IU／ml
（IUは国際単位）に調整した後、下記の実験に供
した。 実験：生体内におけるインシユリンリポゾーム持
続性試験 ストレプトゾシンによる人工糖尿病罹患SD系
雌ラツトに上記で製造したそれぞれのインシユリ
ンリポゾームを皮下注射し、このインシユリンリ
ポゾームの投与前後の血糖値の推移を測定した。
第４図は、その結果を示すもので、縦軸は注射前
の血中グルコース濃度に対する注射後の血中グル
コース濃度の比（％）を示し、横軸は注射後の経
過日数を示す。なお、対照としてインシユリン注
射剤投与の結果をも併せて示した。第４図に見る
ごとく、本来油性物質を含有している粗レシチン
を用いて調製した本発明のリポゾームを適用した
ラツト体内にインシユリンの持続性（低い血糖値
が長時間保たれること）は、油性物質を含有しな
い精製インシユリンを用いて調製した従来のリポ
ゾームを適用した場合に比し遥かに優れている。

【表】 実施例 ４ 本例は本発明のリポゾームに内包された活性物
質が生体内において如何なる推移を示すかを示し
たものであつて、上記活性物質としてトリチウム
で標識した黄体形成ホルモンを放出するホルモン
（New England Nuclear社製）を用いて下記の
各試験を行つた。 なお、各試験に用いたリポゾームは次のような
手順で調製した。 市販粗卵黄レシチン（メルタ社製）100mg、コ
レステロール11.6mgおよびステアリルアミン2.7
mgを10mlのクロロホルムに溶解し、この溶液を内
容25mlの丸庭フラスコに入れ、このフラスコを回
転蒸発機に設置して、減圧下38℃でクロロホルム
を留去することによつてフラスコ内壁にフイルム
を形成せしめた。 上記フラスコにトリチウムで標識した、黄体形
成ホルモンの放出ホルモン（250μCi／7.3μg，
New England Nuclear社製，以下該ホルモンを
³H―LH―RHと略称する）の1μg／ml含有生理
的食塩水溶液を１ml加え、ついで上記フラスコを
30分振盪してフイルムをフラスコ内壁から剥離・
分散せしめた後、生成した分散液を超音波処理機
（日本精機製，NS200―２型）で５分間超音波処
理して平均粒径１〜２ミクロンの粒子の懸濁分散
液を得た。次いでこの懸濁分散液の６倍容の生理
的食塩水をこれに加え、3000r.p.m.10分間の遠心
分離操作を２回行つて、形成されたリポゾームと
リポゾーム内に取り込まれなかつた ³H―LH―
RHの溶液とを完全に分離した。リポゾームの
³H―LH―RHの捕収率は10％by weightであつ
た。上述のようにして得られたリポゾームに生理
的食塩水を加えて濃度3.42μCi／mlにしたものを
試料として用いた。 実験 １ 上記のようにして調製したリポゾーム試料とリ
ポゾーム形態にしていない遊離形態の ³H―LH
―RHを各々マウスに皮下注射し、血中ラジオア
イソトープ（RI）量の経時的推移を調べた。使
用マウスはICRマウス雄、体重30〜32ｇのもので
１群３匹とした。投与量は一匹当り0.34μCiとし
た。血中RI量はマウス血液を0.25ml採取し、サン
プルオキシダイザー（パツカート社製）で処理
後、液体シンチレーシヨンカウンターで測定し
た。投与後15分の血中RI量を100として、各経過
時間ごとの結果を第５図に示した。 第５図から見られるごとく、本発明により調整
したリポゾームに内包されたホルモンは生体内で
緩徐に放出される。 実験 ２ 上記リポゾーム試料と上記遊離形態の ³H―
LH―RHをそれぞれラツトに皮下注射し、尿お
よび糞中のRI排泄量の経時的推移を調べた。使
用ラツトはSDラツト雄、体重100〜110ｇのもの
であつて、一群３匹とした。上記リポゾーム試料
ならびに ³H―LH―RHの各投与量は一匹当り
0.68μCiとした。RIの生体から排出量は、尿の場
合蒸留水で100mlに希釈後、又糞の場合は粉末状
とした後、サンプルオキシダイザーで処理し、液
体シンチレーシヨンカウンターで測定した。結果
は上記投与量を100とした各時間毎の回収RI量を
積算した形で第６図に示した。なお糞中にはRI
は検出されなかつた。 第６図から、本発明により調製したリポゾーム
に内包されたホルモンは生体内で緩徐に放出され
ることが理解し得る。 実験 ３ 上記リポゾーム試料と遊離形態の ³H―LH―
RHをマウスに皮下注射し、その各投与部位にお
ける経時的残留RI量を追跡して測定した。使用
動物はICRマウス雄で、体重30〜32ｇのものを１
群２匹とした。上記各試料の投与量は一匹当り
0.165μCiとした。残留RI量は投与部位を取り出
し、SOLUENE（パツカード社製）で溶解後、液
体シンチレーシヨンカウンターで測定した。試験
結果は遊離形態の ³H―LH―RHを投与した場合
は第７図に示すとおりRIの残留量は短時間で著
しく減少するが、これに対しリポゾーム形態の試
料を投与した場合は第８図に示すとおりRIの残
留量は極めて緩徐に減少する。 上掲の実験１―３の結果から本発明のリポゾー
ムに内包される活性物質の優れた徐放性が立証し
得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のリポゾームの模式図を示した
ものであり、第２図は活性物質としてグルコース
を内包した本発明のリポゾームにおいて該リポゾ
ームを形成している膜材中の油性分子の混在量と
上記グルコースの捕収率との関係を示したもので
あり、第３図は活性物質としてグルコースを内包
した本発明のリポゾームと比較例のリポゾームと
における上記グルコースのリポゾームに対する透
過性の比較を示したものである。第４図は活性物
質としてインシユリンを内包した本発明のリポゾ
ームの生体内におけるインシユリンの血糖降下作
用の持続性を比較例と対比して示したものであ
り、第５図乃至第８図は本発明のリポゾームのそ
れが内包した活性物質の生体内における徐放性を
示したものであつて、第５図は活性物質として該
物質をラジオアイソトープで標識したものを用い
て形成したリポゾームを皮下注射したのちの血中
のラジオアイソトープの量の経時的変化を示して
おり、第６図は上記のごとく標識した活性物質を
内包したリポゾームを皮下注射したのちの尿中の
ラジオアイソトープの量の経時的変化を示してお
り、第７図は比較例として上記標識した活性物質
をそのまま皮下注射したのち投与部位におけるラ
ジオアイソトープの残留量の経時的変化を示して
おり、および第８図は上記標識した活性物質を内
包したリポゾームを皮下注射したのち投与部位に
おけるラジオアイソトープの残留量の経時的変化
を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ リン脂質の２分子層内に該リン脂質に対して
   ３乃至20重量％の天然油脂の１種又は２種以上の
   混合物である油性物質の分子が存在している構造
   を有する壁膜から形成されている平均粒径0.5〜
   10ミクロン程度のリポゾームであつて、その内胞
   に活性物質を含有して成る活性物質含有リポゾー
   ム。 ２ 上記リン脂質がレシチンである特許請求の範
   囲第１項に記載のリポゾーム。 ３ 上記壁膜が少なくとも１種の油性物質を少な
   くとも３重量％含有する粗レシチンから成る特許
   請求の範囲第１項記載のリポゾーム。