JPH0665650B2 - インタ−リユ−キン療法に関する改良 - Google Patents

インタ−リユ−キン療法に関する改良

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JPH0665650B2
JPH0665650B2 JP60075265A JP7526585A JPH0665650B2 JP H0665650 B2 JPH0665650 B2 JP H0665650B2 JP 60075265 A JP60075265 A JP 60075265A JP 7526585 A JP7526585 A JP 7526585A JP H0665650 B2 JPH0665650 B2 JP H0665650B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明はインターリユーキン療法に関するものであ
る。
〔背景技術および発明の記載〕 インターリユーキン−２（以下、IL−２と記す）は、19
76年に初めて発見された天然の蛋白質因子である。これ
は抗原またはレクチンにより活性化されたＴ細胞から生
産され、Ｔ細胞の増殖にとつて必要不可欠な因子であ
る。種々の構造を有するIL−２は、例えばマウス並びに
てながざる（gibbon）、ひとにざる（ape）およびひと
のような霊長類等多くの動物種から単離されてきた。ひ
とおよび他のIL−２は、末梢血液リンパ球、扁桃リンパ
球、ひ臓リンパ球、Ｔ細胞白血病およびＴ細胞ハイブリ
ドーマ培養物のような種々の原料から精製されてきた。
前述したようにIL−２はＴ細胞の増殖にとつて必要不可
欠な因子であり、これ自体は体内の免疫応答機構に密接
にかかわるものである。IL−２は、治療上、無限の広が
りをもつ潜在能力を有するものと思われる。特に、IL−
２は例えば腫瘍抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞を増殖さ
せるものであり、これらＴ細胞は腫瘍の成長を抑制する
ことができるので、腫瘍の治療に有効である。また、IL
−２は、ガンマーインターフエロンの産生を誘発し、ナ
チユラルキラー細胞を活性化することが知られている。
また、IL−２は、新生物疾患、バクテリアまたはウイル
ル感染症、免疫不全症、自己免疫疾患などのような免疫
学上の疾患に対して様々な適用性を有すると思われる
〔ビー・ペーパーマスター等、アドブ・イムノフアーム
（Adv. Immunopharm.）1980年、507頁参照〕。
遺伝子工学の出現以前は、インターフエロンのような他
の天然の産生物と同様に、IL−２は少量でしか得られな
かつた。
しかしながら、他の蛋白質（例、ガンマーインターフエ
ロン）に関して以前に発表されたものと類似の方法体系
により、ひとIL−２についてのクローン遺伝子の構造決
定および表現がなされた〔エス・タニグチ等、ネイチヤ
ー（Nature）（1983年）302巻、頁305〜310、およびヨ
ーロツパ特許公開第91539号（この２つの内容を引用し
て説明の一部とする）参照〕。この特定のIL−２につい
ては、以下公知のIL−２と称する。
ヌクレオチドの暗号化配列に基づき、ひとIL−２ポリペ
プチドのアミノ酸配列、すなわち前記ネイチヤー誌の記
事中第3a図で１〜153の番号付けされたアミノ酸を含有
する配列が推定された。しかしながら、この配列の最初
の20までのアミノ酸は経膜的な移動で開裂するものと仮
定された。したがつて成熟したひとIL−２は、21位のAI
aから始まる133のアミノ酸で構成されていることにな
る。
このひとIL−２の構造は、これまで当研究所および他の
研究所で確認されてきた。
また、組換え体DNA技術を用いて異なる構造のIL−２を
製造することも可能である。例えば、前述のヨーロツパ
特許公開、特にその23〜25頁で記載されているような、
１個またはそれ以上のアミノ酸が欠けているか、または
他のアミノ酸と置き換えられている、ひとIL−２ポリペ
プチドの修飾体は、ひとIL−２の遺伝子に対応する修飾
を施して製造する。例えば、所望により、システイン残
基を、例えばシータス（Cetus）ヨーロツパ特許公開第1
09748号およびベルギー国特許第898016号に記載されて
いる（ここに、その内容を引用して説明の一部とす
る）、例えばIL−２−セリン−125のように、セリンの
ごとき他のアミノ酸と置き換えることができる。
このようなインターリユーキン類のさらに別の例がPCT
特許公開WO85／00817に開示されており、ここに、その
内容を引用して説明の一部とする。これらには、IL−2
Gin−26、IL−2 Phe−121およびIL−2 Stop121が含まれ
る。
さらに、てながざる、ひとにざるのような異なる原料由
来のIL−２が組換え体DNA技術により製造させ、またこ
れらの装飾体も同様の方法で製造される。また、すでに
述べたようにIL−２は天然原料から（比較的少量ではあ
るが）単離されるものであり、例えば糖蛋白質化におい
て組み換え体DNA技術により製造される生成物とは異な
る。さらに対立遺伝子変異体も生産される。
また、IL−２類を、例えば誘導物質の存在下においてひ
との細胞を培養することにより製造することもできる。
これらの例としては、デンマーク国特許出願第3317／84
号およびヨーロツパ特許公開第132359号に記載されてい
るように、IL−2 A−１、IL−2 A−２、IL−2 B−１、I
L−2 B−２などが挙げられるが、これらの内容をここに
引用して説明の一部とする。
以下に用いる「インターリユーキン」の語は、天然原料
から単離されるものであろうと、合成または生合成法に
より製造されるものであろうと、IL−２活性を有する任
意のポリペプチドを意味し、この明細書で既に記載され
ているものを含むがこれに限定するわけではない。この
発明によると、好ましいインターリユーキンはひとIL−
２またはその修飾体であり、組換え体DNA法により製造
されるものが好ましい。インターリユーキンを実際に使
用する場合、例えば静脈注射による注入が試みられてき
た。これらの試みの結果、例えばひとIL−２には５分間
未満という非常に短い半減期しかないことがわかつた。
充分長い作用期間をもたらすインターリユーキンの特効
性非経口的投与形態が明らかに必要であるが、しかしな
がら、これまでのところインターリユーキンに関する個
々のガレヌス剤形についてはほとんど発表されなかつ
た。
さらに、当研究所で実施した試みの結果、例えば静脈内
投与のような投与法でもなおIL−２活性を示すリポソー
ム形態中に、インターリユーキンを含有させ得ることが
判明した。さらに、この発明のリポソームは半減期がこ
れまでより長いものであり、受動的に、ひ臓、肺、骨髄
またはリンパ節中の働きかけるものである。
したがつて、この発明はインターリユーキンを含有する
リポソームを提供するものである。
この発明によるリポソームは、リポソーム形成物質にイ
ンターリユーキンを封入することにより製造することが
できる。
リポソームは、完全に密閉された２層膜（２分子膜）で
あり、その中にインターリユーキンと共に水相を含有し
ている。インターリユーキンは水相および／または膜体
中に存在し得る。これらは単一ラメラ小胞、または水層
により互いに分離された同心膜性二層構造体の小ラメラ
（小重層）または名ラメラ（多重層）小胞の形をとり得
る。
これらは多くの異なる方法で製造され得るが〔エフ・シ
ヨカおよびデー・パパハジヨポウロス、「リポソームズ
・アンド・ゼア・ユーズイーズ・イン・バイオロジー・
アンド・メデイシン（Liposomes and their uses in bi
ology and medicine）」、アナルズ・オブ・ザ・ニユー
ヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Ann.N.Y.
Acad.Sci）308巻、１〜462頁（1978年）、およびアール
・エル・ジユリアノおよびデイー・レイトン、ドラツグ
・デリバリー・システムの「リポソームズ・アズ・ア・
ドラツグ・デリバリー・システム（Liposomes as a dru
g delivery system）」、189〜236頁、オツクスフオー
ド・ユニバーシテイ・インコーポレイテツド・ニユーヨ
ーク（1980年）参照。これらの記載をここに引用して説
明の一部とする〕、この発明は特に興味ある特性を有す
るリポソームを提供するという点で好ましいものであ
る。すなわち、この発明の方法で製造されたリポソーム
は、例えばインターリユーキン漏出に対して特に安定し
ているため、この発明の方法は商業生産に好適なもので
ある。
リポソーム類は、小胞壁を形成し得る種々の脂質から作
ることができる。好ましい脂質としては、天然レシチン
（例、卵または大豆レシチン）、合成レシチン、ケフア
リン類およびスフインゴミエリン類のようなホスホリピ
ドが含まれる。別のものとしては、他のホスフアチジル
コリン類、ホスフアチジル酸、リソホスフアチジルコリ
ン類、スフインゴリピド類、ホスフアチジルグリセリ
ン、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類およ
びセレブロシド類が用いられ得る。
レシチンの例には、西ドイツ国ハンブルグ28在ルーカス
・マイヤー社市販のエピクロン（EPIKURONS）がある。
一例としては、次の成分を含有するものがある：ホスホ
リピドとして、ホスフアチジルコリン44〜７％、ホスフ
アチジルエタノールアミン22〜25％、ホスフアチジルイ
ノシツト０〜２％、脂肪酸として、飽和：パルミチン酸
９〜11％、ステアリン酸２〜４％、不飽和：リノール酸
63〜67％、リノレン酸５〜８％、オレイン酸14〜18％。
この例はエピクロン145Vとして知られている。
また別の例には、エピクロン200として知られている、
次の成分から成るものがある：ホスフアチジルコリン95
％以上（例、95〜98％）および主として例えばオレイン
酸10〜12％、リノール酸62〜65％、リノール酸５〜６％
というような不飽和酸並びに例えばパルミチン酸15〜17
％、ステアリン酸３〜４％のような飽和酸。
成分として不飽和酸を高率で含有するのが好ましい。所
望により、レチシンとして例えばステアリン酸のような
飽和酸を高率で含みホスフアチジルコリンを95％または
それ以上含むもの、例ソーヤ・ホスフイチド・エヌシー
95（SOJA PHOSPHITID NC95）または医薬用途に適した純
粋な均等物、例えば西ドイル国ケルン在、ナツテルマン
・ヘミー・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル
・ハフツング市販のものを用い得る。
合成ホスホリピドは、ヒドロキシル基、分岐状炭素鎖環
状誘導体、芳香族誘導体、エーテル類、アミド類、ポリ
不飽和誘導体、ハロゲン化誘導体のような変形脂肪族部
分、または炭水化物、グリコール、ホスフエート・ホス
ホネート、第四級アミン、スルフエート、スルホネー
ト、カルボキシ、アミン、メルカプトおよびイミダゾー
ル基を、例えばジミリストイルー、ジパルミトイル−ま
たはジステアロイル−ホスフアトコリン誘導体の場合の
ように、含有してもよい。
所望により、最終的なリポソームにおいて、二層膜が例
えばコレステロールのごときステロイドのような他の脂
質を例えば50（モル）パーセンとまで含んでいてもよ
い。
最終的なリポソームにおいてコレステロールのようなス
テロイドの存在する方が好ましい。脂質対ステロイドの
好適な重量比率は6:1〜1:1が適当である。
所望により、二層膜は、例えばジセチルホスフエート、
ホスフアチジン酸、タウロコール酸ナトリウム、ホスフ
アチジルセリン（メルク、Merck）のごとき酸類のよう
なアニオン化合物または例えばステアリルアミンのごと
きアミン類のようなカチオン化合物等、混合率を増加さ
せるような添加物を10（モル）パーセントまでを含有す
る、レシチン、ケフアリンまたはスフインゴミエリンを
含しでいてもよい。ホスフアチジルセリ（例西ドイツ国
メルク社より入手可能）を用いるが好ましい。
脂質が余分の賦形剤を含有する場合、例えば反応容器中
で、メチレンクロライドに入れた脂質と賦形剤の溶液を
濃縮し、脂質をインターリユーキンと混合する前に容器
の表面に資質フイルムを形成させるのが好ましい。
リポソームは、インターリユーキンが破壊されるのを防
げるような穏やかな条件下で例えば超音波処理のような
例えば照射にする、公知技術により製造することができ
る。脂質の均質混合物は、例えばクロロホルムのような
好適な有機溶媒に例えばレシチンやコレステロールのよ
うな脂質を溶かした溶液を形成することにより製造され
る。次いで反応容器の溶液を濃縮して脂質フイルムを生
成する。
常套方法により、リポソームを単離し、滅菌することが
できる。
この発明により得られたリポソームにおいて、インター
リユーキンの濃度は、水相１ミリリツトル中約５〜約50
0マイクログラム、好ましくは20〜200マイクログラム／
ミリリツトルである。
脂質農度は、好ましく水相1ml中約１〜約200mg、特に10
〜100mg／mlである。
次に処理に用いるリポソームの平均直径は、好ましくは
約25ナノメートルないし20ミクロン、特に好ましくは10
0〜500ナノメートルである。
最終的なリポソームは、例えば−20℃〜＋５℃の低温中
で保管するのが好ましい。
貯蔵性を改良するためには、この発明によるリポソーム
を例えば担体物質としてマンニトール、シユクロース、
ポリビニルピロリドンまたはゼラチンを用いて例えば凍
結乾燥することにより乾燥粉末にすればよい。その場合
工程Ab）に関して後述する凍結乾燥の場合と同じ条件下
で行なえばよい。使用する前に、滅菌水を加えてリポソ
ームを再構成する。次いで、このリポソームを、例えば
静脈注射液または注入液に適した系と混合する。
リポソームの純度は従来の分析技術で測定することがで
きる。
所望により、生成したリポソーム中に酸化防止剤が例え
ば脂質の１％以内好ましくは0.1％存在していてもよ
い。好ましい酸化防止剤には、ビタミンＥ（酢酸トコフ
エロール）、ビタミンＣ（パルミチン酸塩）およびBHT
（ブチル化ヒドロキシトルエン）がある。
他のインターリユーキン安定剤として、例えばマンニト
ール、アラビノース、ソルビトールもしくはシユクロー
スなどの糖、または例えばひとセリン（血清）アルブミ
ンのようなアルブミンを用いることができる。これらの
安定剤は、リポソーム形成前に緩衝液中に混入するうこ
とができる。好ましくは、これらの生成したリポソーム
中脂質の20％モル重量以内で存在し得る。
好ましいリポソーム形成方法は、以下の工程からなる方
法ａ）である： Aa）有機溶媒中の脂質とインターリユーキンの溶液を形
成し、 Ab）溶液から溶媒を除去して残留物を得、 Ac）緩衝液に残留物をけんだくし、 Ad）リポソームが生成するまでけんだく液を撹拌、ホモ
ジネート化し、そして Ae）リポソームを単離する。
工程Aa）において、「溶液」の語は、乳液のような「プ
ソイド（疑似）」溶液を包含する。しかしながら、均質
澄明な溶液を製造する方が好ましい。インターリユーキ
ンおよび脂質を溶解または可溶性にするならばいずれの
溶媒系でも用いることができる。この系は単一溶媒でも
複数の溶媒の混合物でもよい。また例えば15％以下の水
を含み得る。所望により界面活性剤が存在してもよい。
溶媒系は、濃縮により脂質から除去され得る適当な有機
溶媒を包含することができる。広範な種類におよぶジエ
チルエーテルやジイソプロピルエーテルのようなエーテ
ル類、酢酸エチルのようなエステル類、メタノールやｔ
−ブタノールのようなアルコール類、およびメチレンク
ロライドやクロロホルムのようなハロゲン化炭化水素類
を用いることができる。所望により酢酸が存在してもよ
い。ジエチルエーテル、メチレンクロライドまたはｔ−
ブタノールを用いるのが好ましい。
工程Ab）において、高度真空下の場合はｔ−ブタノー
ル、低度真空下の場合はメチレンクロライドが好ましい
ことが判明した。
工程Ab）の場合、インターリユーキンの感受性に留意し
ながら多くの常套手段により溶媒を除去し得る。好まし
いものとしては、例えば10〜50mmHgの低度真空下で濃縮
するか、または例えば、0.1mmHgのような5mmHg以下の高
度真空下で凍結乾燥を行う手段がある。
この発明によると、凍結乾燥の方が特に好ましいことが
判明した。
この工程は好ましくは室温より低い温度で行ない、濃縮
される混合物が周囲より約１〜３℃低くなるように減圧
状態および温度を調整する。このような調整は従来方法
で行なえばよい。凍結乾燥の典型的プログラムは約−60
℃で始まり、12時間かけて−15℃まで上昇させる。次い
で温度を＋10℃まで上昇させたまま２時間維持する。
工程Ac）の場合、用いる緩衝液は例えばpH4〜７（例、
５〜6.5）のりん酸緩衝液が好ましい。好ましくは、水
相は例えば300モスモル／リツトル以下、特に290モスモ
ル／リツトル以下の低浸透性である。生成したけんだく
液は、好ましくは約0.001〜約0.2g脂質／mlを含有す
る。
工程Ad）の場合、超音波照射によりホモジネート化をも
たらす。このような照射の好適な周波数は例えば30〜80
KHzである。通常の出力はホモジネート化または撹拌さ
れる混合物約10mlあたり200〜400ワツトである。当然の
ことながらホモジネート化される化合物を、金属による
汚染を避けるため超音波発生器に付随するチタニウム他
の金属から離すことが好ましい。
温度は好ましくは約10〜70℃である。不飽和脂質の場合
は室温、飽和脂質の場合は60〜70℃が好ましい。
この段階の間に集塊をともなうリポソームの乳液が生成
する。
所望により、調音波処理後、例えば10000〜27000rpmの
速度で高速機械的撹拌器を用いて撹拌をしてもよい。し
かしながら、この作業は省いた方が好ましく、ホモジネ
ート化の場合と同じ条件下で、また超音波処理により撹
拌した方がよい。
工程Ae）では、この発明のリポソームを常套技術、例べ
ば限外過、遠心分離、イオン交換またはゲルクロマト
グラフイー、透析などにより単離する。好ましくは例え
ば0.1〜１ミクロンの微細孔のフイルターを通してリポ
ソームを過、滅菌することができる。所望により、こ
の過を、脂質の相転移点より上の、例えば30〜70℃の
温度で行なう。好ましくはリポソームを例えば10000〜2
0000gの高速遠心分離により単離する。
方法ａ）の例： ａ′ａ）インターリユーキンの親水性溶液と有機溶媒に
溶かした脂質を混合し、 ａ′ｂ）濃縮により水と有機溶媒を除去し、 ａ′ｃ）pH4〜７の緩衝液に残留物を吸収させてけんだ
く液を得、 ａ′ｂ）けんだく液に超音波を照射してリポソームを形
成させ、そして ａ′ｅ）リポソームを単離する。
方法ａ）の別の例： ａ′ａ）インターリユーキンの親水性溶液と有機溶媒に
溶かした脂質を混合し、 ａ′ｂ）混合物を凍結乾燥して凍結乾燥物を得、 ａ′ｃ）凍結乾燥物を緩衝液（pH4〜７）にけんだく
し、 ａ′ｄ）リポソームおよび／または集塊が生成するまで
溶液を撹拌し、 ａ′ｅ）機械的手段により混合物をホモジネート化し、
そして ａ′ｆ）リポソームを単離する。
これらの方法は、方法ａ）と類似の方法で行なえばよ
い。
一方、この発明は、次の工程からなるインターリユーキ
ン含有リポソームを製造する方法ｂ）を提供する： ba）インターリユーキンの水性を基礎とする溶液と脂質
の有機溶液を混合し、 bb）ある程度リポソームおよび／または集塊が形成させ
るまで混合物を超音波処理に付し、 bc）例えば、 bi）混合物から有機溶媒を除去してゲル状中間相を形成
し、そして bii）ゲル状中間相をリポソームに転化することにより
混合物からリポソームを回収する。
工程ba）において、「溶液」の語は、乳液のような「プ
ソイド（疑似）」溶液を包含する。しかしながら、均質
澄明な溶液を製造するのが好ましい。脂質を溶解または
可溶性にするものならいずれの溶媒系を用いてもよい。
この系は単一溶媒または複数の溶媒の混合物であり得
る。また例えば15％以内の水を含んでいてもよい。所望
により、界面活性剤も存在し得る。
溶媒系は、蒸発による脂質から除去される適当な有機溶
媒を含むことができる。広範な種類のジエチルエーテル
やジイソプロピルエーテルのようなエーテル類、酢酸エ
チルのようなエステル類、メタノールや第三級ブタノー
ルのようなアルコール類およびメチレンクロライドやク
ロロホルムのようなハロゲン化炭化水素類を用いること
ができる。
所望により酢酸が存在してもよい。第三級ブタノールま
たは好ましくはジエチルエーテルまたはメチレンクロラ
イドを用いるのが好ましい。
インターリユーキンを水または好ましくはpH4〜7.4
（例、５〜6.5）の水性緩衝系に溶解する。
水性緩衝液は例えば300モスモル／リツトル以下、特に2
90モスモル／リツトル以下の低張液が好ましい。得られ
た混合物は好ましくは1ml当たり約0.001〜約0.2gの脂質
を含有する。
工程bb）の場合、照射は超音波により行なうことができ
る。このような照射の周波数は例えば30〜80kHzであり
得る。通常の出力は照射される混合物の各々10mlに対し
て200〜400ワツトである。当然のことながら、金属によ
る汚染を避けるため照射される混合物を超音波発生器の
チタニウムや他の金属から離すのが好ましい。
温度は好ましくは約10〜70℃である。不飽和脂質の場合
は室温、飽和脂質の場合は60〜70℃が好ましい。
この段階の間に集塊をともなうリポソームの乳濁液が生
成する。
従来方法でリポソームを回収することができ、最も収率
を良くするように処置する。
工程ｉ）において、有機溶媒を例えば10〜600mmHgの程
度減圧下で除去するのが好都合であり、水相のほとんど
はそのまま残る。例えば室温または例えば45℃までの僅
かな加温といつた低温が好ましい。
工程ii）において、得られたゲル状中間相を水または所
望により前述の緩衝液で処理してリポソームを製造す
る。
一方、この発明は次の工程からなるインターリユーキン
含有リポソームを製造する方法ｃ）を提供する： ca）インターリユーキン、pH4〜８の水性に基づく緩衝
液および有機溶媒に溶かした脂質を混合し、 cb）得られたけんだく液に超音波を照射してリポソーム
または集塊を形成し、および cc）例えば ci）例えばゲル状中間相により、混合物から溶媒を濃縮
し、および cii）ゲル状中間相をリポソームに転化することにより
混合物からリポソームを回収する。
工程ca）において、「溶媒」の語は、乳液のような「プ
ソイド」溶液を包含する。しかしながら、均質澄明な溶
液を製造するのが好ましい。脂質を溶解または可溶化す
るものならいずれも溶媒系を用いてもよい。この系は単
一溶媒または複数の溶媒の混合物であり得る。また例え
ば15％以下の水を含んでいてもよい。所望により、界面
活性剤が存在してもよい。溶媒系は、濃縮により脂質か
ら除去され得る任意の適当な有機溶媒を含み得る。
広範な種類のジエチルエーテルやジイソプロピルエーテ
ルのようなエーテル類、酢酸エチルようなエステル類、
メタノールや第三級ブタノールのようなアルコール類お
よびメチレンクロライドやクロロホルムのようなハロゲ
ン化炭化水素類を用いることができる。所望により酢酸
が存在してもよい。ジエチルエーテル、メチレンクロラ
イドまたは第三級ブタノールを用いるのが好ましい。
粉末形態のインターリユーキンを用いることができ、例
えばその粒径は、直径60ミクロンの最大粒径を有するも
のが孔都合でかる。
工程ca）の場合、用いる緩衝液は例えばpH4〜7.4、特に
４〜７、特に５〜6.5のりん酸緩衝液が好ましい。好ま
しくは水相に例えば300モスモル／リツトル以下、特に2
90モスモル／リツトル以下の低張液である。生成したけ
んだく液は好ましくは1ml当たり約0.001〜約0.2gの脂質
を含有する。
工程cb）の場合、超音波により照射を行なうことができ
る。このような照射の好適な周波数は例えば30〜80kHz
である。通常出力は照射される混合物約10mlに対して20
0〜400ワツトである。当然のことながら、金属による汚
染を避けるため照射される混合物を超音波発生器のチタ
ニウムや他の金属から遠ざけるのが好ましい。
温度は好ましくは約10〜70℃である。不飽和脂質の場合
は室温、飽和脂質の場合は60〜70℃が好ましい。
この段階の間に集塊をともなうリポソームを乳液を生成
する。
従来方法によりリポソームを回収すればよいが、リポソ
ームの収率を最高にするような処理をとるべきである。
工程ci）において、例えば10〜600mmHgの圧力で例えば
水流ポンプを用いて程度減圧下に有機溶媒を除去するの
が好便であり、一方ほとんどの水相はそのまま残る。例
えば室温または例えば45℃以下を僅かな加温といつた低
温が好ましい。
工程cii）において、生成したゲル状中間相を水または
所望により前述の緩衝液で処理してリポソームを製造す
る。
けんだく液が生成し得る。所望によりさらに濃縮して有
機溶媒および酸リポソーム形成物の残留痕跡を除去す
る。
この発明によるリポソームを、さらに例えば工程ae）の
方法のように従来技術により単離する。
リポソームの純度は従来技術により測定することができ
る。
リポソーム中のインターリユーキンの混入状態を測定す
るために、予備精製の粗製混合物を希釈し、例えば３〜
24時間遠心分離を行ない、上清液中のインターリユーキ
ンの量を測定する。次に残留したインターリユーキンを
リポソーム沈澱物にとり込む。
さらに、後の実施例で記載するように、標準的高速液体
クロマトグラフイー技術により精製リポソーム中のイン
ターリユーキン混入量を測定することができる。
また、投与後の本発明によるリポソームの分布を例えば
動物試験における従来の薬物動力学技術により追跡する
ことができる。よう素−125とインターリユーキンを反
応させるか、または例えば硫黄35により放射能で標識付
けしたアミノ酸からインターリユーキンを製造すること
により、放射性インターリユーキンを生成する。例えば
炭素−14により放射能で標識付けした脂質から製造され
たリポソーム中にこのインターリユーキンを混入し、マ
ウスに注入する。１時間後マウスを殺し、例えばひ臓の
ような各々の器管に存在する放射能の量と型を測定す
る。
この発明のリポソームは、インターリユーキンについて
公知の、様々な適用形態に使用され得る。これらの適用
として、培養および他の試験管内実験における動物細胞
の成長促進用途があり、また種々の状態を処置するため
の治療用途もある。
バイオアツセイ試験として試験として後述する一試験で
は、マウス−Ｔ−リンパ球細胞系列（CTLL細胞）増殖の
インターリユーキン濃度依存刺激作用に基づいてインタ
ーリユーキンバイオアツセイを行なう〔エス・ギリス
ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）19
78年、120巻、頁2027〜2032参照〕。
インターリユーキン依存細胞培養のＴ細胞を洗浄してIL
−２を除去し、この発明によるリポソームで処理し、IL
−２不含有培地でインキユベートした。次いで試験細胞
を常套的な系列希釈試験（希釈培地RPM1−1640、10％う
し胎仔血清を追加）に付した。24時間にわたるインキユ
ベーシヨン後、リポソーム濃度の増加に対応する細胞増
殖状態を測定した。各希釈液について2.105の細胞を用
いた。
増殖は〔3H〕−チミジンの混和または光度測定MTT試験
により測定する〔MTT＝３′（4,5−ジメチルチアゾール
−２−イル）−2,5−ジフエニルテトラゾリンブロミ
ド〕。生きている細胞の黄色MTTを対応する暗青色ホル
マザンに変換し、これを酸性イソプロパノールに溶解後
分光化学的に測定する。
最大増殖率の50％を示すサンプルの希釈液を測定する。
この発明によるリポソームの活性は、純粋なインターリ
ユーキンの活性の約1.2〜20培以下である。前記試験に
おいて1.3ng／mlより大きい活性を有するリポソームを
用いるのが好ましい。
また、Ｔ−リンパ球細胞が低下したマウス、例えばヌー
ドマウスにおけるIL−２活性の標準的生体内試験によ
り、活性を確認することができる。一つの試験では、90
mg／kgのシクロスポリンＡを毎日投与してこのようなマ
ウスを製造し、これをひつじ赤血球（SRC）で免疫処置
すると、ジヤーンプラーク細胞形成アツセイによりひ臓
中の特異的抗体細胞（PFC）の数が減少する（80〜97
％）。抗原を静脈注入した後、マウスを数群に分け（１
群当たり動物６〜７匹）、５日間にわたり１日２回皮下
注射または好ましくは静脈内注射により約２〜５マイク
ログラムのIL−２を含有する用量のIL−２製剤を与え
る。ジヤーン試験によりひ臓中の特異的抗体細胞の数を
測定して動物の免疫回復を測定した。この発明のリポソ
ームの活性は、封入されていないインターリユーキンと
同じオーダーを有する。
この発明のリポソームは、例えば本明細書の冒頭で述べ
たようなインターリユーキンに認められる免疫調整特性
に基づく特に興味ある治療用途、特に、重度複合免疫不
全症候群（SCIDS）、後天的免疫不全症候群（AIDS）、
老齢による免疫不全症状および先天的免疫不全症のよう
な免疫不全に起因する状態の処置用途に用いるのが好ま
しい。しかしながら、またインターリユーキンは、サイ
トメガロウイルス感染症およびヘルペスウイルス感染症
のような種々のウイルス性疾患の処置、ならびに結核や
ハンセン氏病のようなバクテリア感染症の処理における
抗真菌剤として用いることができる。これらの治療用途
に必要なリポソームの用量は、処理される状態、症状の
重さ、混入されたインターリユーキンの効力や量などの
公知の要因により異なる。
しかしながら、0.1μｇ〜30μｇ／kg体重の範囲のイン
ターリユーキンの１日用量を例えば人間の患者のような
哺乳動物に投与すると、一般に満足すべき結果が得られ
る。一般に好適な無菌媒体を用いた静脈内投与が好まし
い。
インターリユーキンは、培養におけるＴ細胞成長促進能
力に基づく広範な種類の個別用途を有するが、その中に
は診断法および補助的治療処置における適用がある。診
断法上の用途は、尺度として細胞中における放射性チミ
ジンの取り込みを用い、インターリユーキン添加後の試
験管内におけるＴリンパ球成長の程度を測定することに
より、ある種の病気の存在を検出するといる公知の能力
を基づく。抗腫瘍処理のような補助的治療処置を行なう
場合、インターリユーキンは、患者または他の融和性ド
ナーから得たＴリンパ球の成長を試験管内で促進するの
に用いることができ、次いで得られた増殖リンパ球を患
者に再注入し、闘病を補助することになる。一般に、培
養および他の試験管内実験においてＴ細胞の成長を助け
るのに用いるインターリユーキンの量は、その活性およ
びその系におけるひとインターリユーキンとの比較に関
する文献から決定され、日常的な研空により、特定な状
況に対して最も有効に用いられる。
以下、実施例によりこの発明を説明する。
以後用いられている「レシチン」の語は大豆レシチンを
指す。
特記しない限り、超音波放射は50KHzおよび350Wで行な
う。
工程Ａ 実施例A1 リポソームの製造 2mgのひとIL−２を酢酸1mlに溶かす。精製レシチン１グ
ラムを別に第３ブタノール5mlに溶かす。２つの溶液を
一緒に混合し、−30℃で凍結乾燥して、凍結乾燥物を得
る。この凍結乾燥物を、0.05M燐酸緩衝液（pH5）に10ml
になるまで吸収させ、けんだく液をつくる。
けんだく液に５分間浴中で超音波に照射する。つぎにけ
んだく液を窒素気流下約15000rpmの速度で高速撹拌器
〔タイプ・ポリトロン・タイプ（Type Polytron Type）
10−30〕を用いて15分間ホモジネート化する。次にリポ
ソーム溶液を、レシチンの相点移点よりも高い温度、例
えば20℃で滅菌フイルター（0.2ミクロン）に押圧す
る。次に得られたリソポソーム溶液を凍結乾燥する。
所望により、高速攪拌段階を省いてもよく、また照射を
15分間続けてもよく、および／またはリポソームを遠心
分離により単離してもよい。
リポソームの分析 従来の逆相高速液体クロマトグラフイー（HPLC）技術を
用いてこの発明のリポソームを分析する。
米国ブローリー・ラボラトリーズ・インコーポレイテツ
ド市販の広い孔（約300オングストローム）の球状Ｃ−
８炭化水素支持材、10ミクロン〔例、カラム RP300アク
アポア（Aqua−pore）20×4.6mmm〕を用いるのが好まし
い。
好ましい溶離剤系は、0.1％トリフルオロ酢酸含有水／
アセトニトリル勾配系であり、例えば次の２つの溶離剤
形を用いる： 系A:50％アセトニトリル、H2O（＋0.1％トリフルオロ酢
酸） 系B:70％アセトニトリル、H2O（＋0.1％トリフルオロ酢
酸）。
模範的な流速は3ml／分で、10分間にわたり100パーセン
ト系Ａ〜100パーセント系Ｂの勾配を有する。このよう
な好ましい条件下、ひとIL−２は約7.5分の保持時間で
溶離し、インターリユーキンの量は状法によるピークの
集積によつて得られる。
HPLCの前に、この発明のリポソームを以下のように予備
処理する： ｉ）pH2.5〜４の酢酸緩衝液による希釈、その後、リポ
ソーム物質はインターリユーキンを放出しながらHPLCカ
ラム上で分解する。
ii）リポソームに混入されたインターリユーキンからリ
ポソーム賦形剤を徹底的な除去、ホスホリピドを除去す
るための例えば水のよびメタノール／メチレンクロライ
ドの使用、次いで得られたインターリユーキン含有水溶
液の注入。
iii）カラム切替技術により、この発明のリポソームに
混入されたインターリユーキンからリポソーム賦形剤を
カチオン型イオン交換剤上で分離する。その後インター
リユーキンをカチオン型イオン交換剤から逆相カラムへ
溶出して常法によりクロマトグラフイーに付す。好まし
いカチオン型イオン交換剤カラムは30×4.6mmの大きさ
を有し、10μｍの支持物を詰めこんだものである（米国
ブローリー・ラボラトリーズ・インコーポレイテツド市
販のSC×10）。
リポソームは、ひとIL−２の約50％を含有していること
が見い出されている。
活性および用途 リポソームは、前述のバイオアツセイ試験の場合のひと
IL−２それ自体と同じ活性オーダーを示すことがわか
る。
実施例A2 リポソーム（V3）の製造 0.5mgのひとIL−２を酢酸1mlに溶解する。レシチン（エ
ピクロン（EPIKURON）145V）500mgを別にｔ−ブタノー
ル50mlに溶解する。この２つの溶液を一緒に混合し、約
16時間にわたり−15℃で凍結乾燥して、凍結乾燥物を得
る。この凍結乾燥物を0.05Mりん酸緩衝液（pH6.5）に吸
収されて10mlとし、けんだく液を得る。
このけんだく液に室温（約20℃）で５分間浴槽内で超音
波を照射する。次いでけんだく液を室温において約1500
0rpmの速度で高速攪拌器（タイプ・ポリトロン PT15）
を用いて10分間ホモジネート化する。
リポソームを４時間４℃、150000gで遠心分離により単
離する。
実施例A3 リポソームの製造 超音波放射および室温の代わりに70℃の温度で高速攪拌
ホモジネート化を行ない、実施例A2を繰り返す。ここで
用いるレシチンは、ソーヤ（大豆）ホスフアチドNC95H
であつた。遠心分離時間は２時間であつた。
実施例A4 リポソームの製造 0.5mgのひとIL−２、レシチン（エピクロン（EPIKURO
N）145V）450mgおよびホスフアチジルセリン50mgをｔ−
ブタノール10mlと一緒に混合し、室温で10分間照射して
溶液を生成する。これを約18時間−40℃で凍結乾燥し、
凍結乾燥物を形成する。
この凍結乾燥物を、10mlとなるまで0.05Mりん酸緩衝液
（pH6.3）に吸収させてけんだく液を得る。室温（20
℃）で10分間浴槽中でこのけんだく液に超音波を照射
し、次いで10分間実施例２の場合と同様ホモジネート化
する。リポソームを４℃、150000gで、４時間遠心分離
して単離する。
実施例A5 リポソームの製造 レシチン450mgとホスフアチジルセリン50mgの代わりに
レシチン500mgを用いて実施例A4を繰り返す。
実施例A6 リポソームの製造 レシチン450mgとホスフアチジルセリン50mgの代わりに
レシチン425mgとコレステリン75mgを用いて実施例A4を
繰り返す。
実施例A7 ポリソームの製造 高速攪拌工程を除き、実施例A2を繰り返す。超音波照射
を15分間続ける。
実施例A8 リポソームの製造 高速攪拌工程を除き、実施例A3〜６をそれぞれ繰り返
す。
リポソームの分析 上清液 遠心分離後の上清液を前述の逆相高速液体クロマトグラ
フイー技術により分析すると、10％以下の純粋ひとIL−
２を含有していた。
生物学的活性 リポソームを、前述の試験（エス・ギルスら）にしたが
い、IL−２依存CTLL−（16）細胞における３〔Ｈ〕−チ
ミジンの混入に基づく系列希釈試験により分析する。24
時間後に104の細胞の最大成長の50％をもたらすIL−２
の濃度を製造後直ちに測定する（値Ａ、μｇ／ml）。こ
の試験においてリポソーム形成のための出発原料として
用いるひとIL−２それ自体は0.2μｇ／mlの値を示し
た。
結果 上記生体内試験において、前記試験で試験管内活性1.7n
g／mgを有する実施例A2の貯蔵バツチのリポソームにつ
いて以下の結果が得られた。
実施例９ リポソームの製造 0.5mgのひとIL−２を酢酸1mlに溶かし、この溶液をメチ
レンクロライド50mlに溶かしたレシチン500mg（エピク
ロン（EPIKURON）145V）の溶液に加える。
混合物を１時間10〜50mmHgの減圧下30℃の温度で、次い
で３時間50℃の温度で回転エバポレータに入れて濃縮
し、脂質フイルムを得る。このフイルムをpH5における
りん酸緩衝液（0.02M）10mlに分散する。次いで、分散
液を超音波浴槽に入れ、室温（20℃）で30分間照射する
と、リポソームが生成する。
リポソームを４時間40℃、15000gで遠心分離により単離
する。
実施例A10 リポソームの製造 超音波放射処理を室温ではなく70℃の温度で行なつて実
施例９を繰り返す。ここで用いるレシチンはソーヤ・ホ
スフアチツク（Soja phosphat−ic）NC 95 Hであつた。
遠心分離を２時間行なう。
リポソームの分析 実施例A4と同様にして分析を行なう。
結果 実施例 Ａ゜（ng／ml） A2（ng／ml） A9 0.8 0.9 A10 2.5 3.5 方法Ｂ 実施例B1 リポソームの製造 レシチン100mgをメチレンクロライド5mlに溶かし、丸底
フラスコに入れる。0.2mgのひとIL−２、20mgのＬ−シ
ステインおよび0.05Mりん酸緩衝液（pH5）1mlからなる
水溶液を加える。混合物を20℃で５分間超音波浴槽内で
乳化する（周波数80KHz）。
次いで乳液（予備形成リポソームおよび集塊をある程度
含有している）を減圧下（20〜30mmHg）20℃で濃縮し、
得られたゲルを2mlの緩衝液に加え、混合物をゆつくり
攪拌する。水性リポソームけんだく液が生成する。
次の工程にしたがい、リポソームを非混合活性剤から分
離する： ａ） 遠心分離（５分、20゜、5000G）。非混合活性剤
が上清液に残留。リポソーム沈澱物を再けんだくする。
ｂ） ゲルカラクロマトグラフイー〔バイオゲル（Biog
el）A1.5またはセフアデツクス（Ｓ−ephadex）G 50を
用いる〕。リポソーム含有溶出液の限外濾過または0.9
％食塩水に対する透析により濃縮する。
得られたリポソームけんだく液を凍結乾燥する。
分析 リポソームは、約50〜90％のひとIL−２を含有している
ことがわかる。
活性および実用性 リポソームは、前述のバイオアツセイ試験におけるひと
IL−２そのものと同じ活性オーダーを示すことがわか
る。
実施例B2 リポソームの製造 500mgのレシチン（エピクロン145V）をメチレクロライ
ド200mlに溶かし、丸底フラスコに入れる。0.5mgのひと
IL−２、100mgのＬ−システインおよび0.05Mのりん酸緩
衝液（pH5）10mlを加える。
混合物を室温（20℃）で10分間、超音波浴槽中で乳化す
る。次に得られた乳液（予備形成リポソームおよび集塊
をある程度含有している）を減圧下（20〜30mmHg）10分
間35℃で濃縮して得られたゲルに緩衝液10mlを加える。
混合物を室温で30分間攪拌する。
リポソームを、４時間、４℃、150000gで遠心分離によ
り単離する。
実施例B3 リポソームの製造 実施例B2と同様に行なうが、ただし10分間35℃ではなく
５分間80℃で濃縮する。ここで用いるレシチンはソーヤ
・ホスフエートNB 95Hであつた。４時間ではなく２時間
遠心分離を行なつた。
実施例B4およびB5 リポソームの製造 実施例２および３と同様にして行なうが、ただしＬ−シ
ステインは存在させない。
リポソームの分析 上清液 遠心分離後の上清液の前述の逆相高速液体クロマトグラ
フイー技術により分析する。10％以下の原形ひとIL−２
を含有する。
生物学的活性 前述の試験（エス・ギルスら）にしたがい、IL−２依存
CHL−１（16）細胞中の３〔Ｈ〕−チミジンの混入に基
づく系列希釈試験により、リポソームを分析する。24時
間後に104の細胞の最大成長の50％をもたらすIL−２の
濃度を、製造直後（値Ａ゜、ng／ml）および４℃で貯蔵
２週間後（値A2、mg／ml）に測定する。この試験におい
て、ひとIL−２物質自体は0.2ng／mlの値を示した。
結果 実施例 Ａ゜（ng／ml） A2（ng／ml） B2 0.8 2.4 B3 20.0 35.0 方法Ｃ 実施例C1 リポソームの製造 精製レシチン50マイクロモルおよびコレステロール50マ
イクロモルをクロロホルム20mlに溶かし、窒素気流下回
転エバポレータで濃縮する。残留物をジエチルエーテル
5mlに吸収する。600マイクログラムのひとIL−２（例え
ば粒径５〜50ミクロンの粉末で）を加える。この溶液
に、0.05モルのりん酸緩衝液1.5mlを加える。
次に混合物を５分間５℃超音波プローベを用いて照射
し、ホモジネート化物を得る。生成した乳液を２段階に
分けて回転エバポレータで濃縮する。第１段階では圧力
は約400トールHgであり、粘稠性ゲルが生じるまでその
ままにしておく。このゲルを0.05Mりん酸緩衝液（pH5）
1.5mlで処理し、軽く容器ごと振ると、水性けんだく液
が得られる。次いでこの水性けんだく液を室温および常
圧で15分間第２濃縮段階に進め、リポソームの不透明け
んだく液を得る。
有機溶媒の最終痕跡を除去するために、イオン交換カラ
ム（セフアデツクス650）上で限外過を行なう。
リポソームの分析 リポソームは、約50〜90％のひとIL−２を混入している
ことがわかる。
活性および実用性 リポソームは、前述のバイオアツセイ試験におけるひと
IL−２自体と同じ活性オーダーを示すことがわかる。
実施例C2 リポソームの製造 500mgのレシチン（エピクロン（EPIKURON）145V）およ
び0.5mgのひとIL−２をメチレンクロライド20mlに溶か
す。0.05モルのりん酸緩衝液10mlを加える。
次に混合物を室温（約20℃）で５分間、超音波浴槽内で
照射する。得られた乳液を、粘稠性ゲルが生じるまで、
10分間35℃で回転エバポレータに入れて濃縮する。次に
0.05Mリン酸緩衝液（pH5）10mlを加え、室温で30分間容
器を回転する。
４時間４℃、150000gで遠心分離を行ない、リポソーム
を単離する。
実施例C3 リポソームの製造 実施例C2を繰り返して濃縮するが、ただし35℃で10分間
ではなく80℃で５分間続ける。
レシチンとしてソーヤ・ホスフアテイツクNC95Hを用い
た。２時間遠心分離を行なつた。
リポソームの分析 上清液 遠心分離後を上清液を、前述の逆相高速液体クロマトグ
ラフイー技術により分析する。10％以下の原形のひとIL
−２を含有する。
生物学的活性 前述の試験（エス・ギルスら）にしたがい、IL−２依存
CHLL−（16）細胞における３〔Ｈ〕−チミジンの混入に
基づく系列希釈試験によりリポソームを分析する。
24時間後に104の細胞を最大成長を50％をもたらすIL−
２の濃度を、製造直後（値Ａ゜、ng／ml）および４℃で
貯蔵２週間後（値A2、ng／ml）に測定する。この試験で
は、ひとIL−２物質自体は0.2ng／mlの値を示した。
結果 実施例 Ａ゜（ng／ml） A2（ng／ml） C2 1.2 2.9 C3 12.5 20.0 方法Ａ、ＢまたはＣに関する任意の前記実施例におい
て、ひとIL−２をIL−２−セリン125、IL−2 A−１、IL
−2 A−２、IL−2 B−１、IL−2 B−２、IL−2 Gln 2
6、IL−2 Phe−121またはIL−2 Stop121と置き換えるこ
とができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ８４２０３８１ (32)優先日 1984年８月10日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ８４２３７００ (32)優先日 1984年９月19日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ８４２３７０１ (32)優先日 1984年９月19日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (56)参考文献 特開 昭55−153713（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−127308（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−151718（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−157723（ＪＰ，Ａ)

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】IL−２活性をもつインターリューキンを含
    むリポソーム。
  2. 【請求項２】インターリューキンがひとIL−２である、
    特許請求の範囲第１項記載のリポソーム。
  3. 【請求項３】インターリューキンがIL−２−セリン125
    である、特許請求の範囲第１項記載のリポソーム。
  4. 【請求項４】インターリューキンがIL−２ Ａ−１、IL
    −２ Ａ−２、IL−２ Ｂ−１またはIL−２ Ｂ−２で
    ある、特許請求の範囲第１項記載のリポソーム。
  5. 【請求項５】インターリューキンがIL−２ Gln−26、I
    L−２ Phe−121またはIL−２ stop−121である、特許
    請求の範囲第１項記載のリポソーム。
  6. 【請求項６】静脈内投与のためのものである、特許請求
    の範囲第１項記載のリポソーム。
  7. 【請求項７】IL−２活性をもつインターリューキンを含
    むリポソームの製造方法であり、 ａ）有機溶媒中の脂質と該インターリューキンの溶液を
    形成し、 ｂ）溶液から溶媒を除去して残留物を得、 ｃ）残留物を緩衝液に懸濁し、 ｄ）リポソームが生成するまで懸濁液を攪拌、ホモジネ
    ート化し、および ｅ）リポソームを単離する ことからなる方法。
  8. 【請求項８】IL−２活性をもつインターリューキンを含
    むリポソームの製造方法であり、 ａ）該インターリューキンの水溶液と脂質の有機溶液と
    を混合し、 ｂ）リポソームおよび／または集塊が形成するまで混合
    液に超音波放射線を照射し、 ｃ）混合液からリポソームを回収する ことからなる方法。
  9. 【請求項９】ｉ）混合液から溶媒を蒸発させてゲル状中
    間相を形成し、 ii）ゲル状中間相をリポソームに転化させることにより
    リポソームを回収する、特許請求の範囲第８項記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】IL−２活性をもつインターリューキンを
    含むリポソームの製造方法であり、 ａ）該インターリューキン、pH4〜８の水性緩衝液およ
    び有機溶媒に溶かした脂質を混合し、 ｂ）生成懸濁液を超音波処理してリポソームまたはその
    集塊を形成し、 ｃ）混合物からリポソームを回収する ことからなる方法。
  11. 【請求項１１】緩衝液がpH4〜７のものである、特許請
    求の範囲第10項記載の方法。
  12. 【請求項１２】ｉ）混合物から溶媒を蒸発させてゲル状
    中間相を形成し、そして ii）ゲル状中間相をリポソームに転化させることにより
    リポソームを回収する、 特許請求の範囲第10項記載の方法。
  13. 【請求項１３】IL−２活性をもつインターリューキンを
    含むリポソームの製造方法であり、 ａ）該インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶
    かした脂質と混合し、 ｂ）水および有機溶媒を蒸発留去し、 ｃ）pH4〜７の緩衝液に残留物を吸収させて懸濁液を形
    成し、 ｄ）懸濁液に超音波を照射してリポソームを形成し、お
    よび ｅ）リポソームを単離する ことからなる方法。
  14. 【請求項１４】IL−２活性をもつインターリューキンを
    含むリポソームの製造方法であり、 ａ）該インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶
    かした脂質と混合し、 ｂ）混合物を凍結乾燥して凍結乾燥物を得、 ｃ）凍結乾燥物をpH4〜７の緩衝剤溶液に懸濁し、 ｄ）リポソームおよび／または集塊が生成するまで溶液
    を攪拌し、 ｅ）混合物を機械的手段でホモジネート化し、および、 ｆ）リポソームを単離する ことからなる方法。
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