CN110312527A - 用于干细胞移植的非基因毒性预处理方案 - Google Patents

用于干细胞移植的非基因毒性预处理方案 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种临床适用的干细胞移植方法,所述方法有助于植入并重建受者的免疫能力,而不需要放疗或化疗,并且不会产生GVHD或移植排斥。

Description

用于干细胞移植的非基因毒性预处理方案
交叉参考
本申请要求2017年1月30日提交的美国临时专利申请号62/452,218的权益,所述申请以引用方式整体并入本文。
背景技术
干细胞通过这些细胞自我更新和产生分化细胞的能力为生物体提供维持和修复某些组织的手段。临床上,广泛使用骨髓和造血干细胞移植作为向患者提供产生血细胞的能力的手段,通常在这种情况下患者已经通过高剂量化疗或放射消耗了内源性干细胞。
造血细胞移植(HCT)通常涉及自体或同种异体造血细胞的静脉内输注,所述自体或同种异体造血细胞的活性子集是造血干细胞(HSC);这些造血细胞是从骨髓、外周血或脐带血中收集的,并经移植以在骨髓或免疫系统受损或有缺陷的患者中重新建立造血功能。该程序常常作为疗法的一部分进行,以消除骨髓浸润过程(诸如白血病),或矫正先天性免疫缺陷病症。另外,使用HCT使癌症患者能够接受剂量比骨髓通常可以耐受的剂量更高的化疗;然后通过用先前收获的干细胞替换骨髓来挽救骨髓功能。富集或纯化的HSC群体也可以移植,并且不受其它细胞污染,所述其它细胞中的许多细胞对宿主是有害的。
预备或预处理方案是造血细胞移植(HCT)中的关键要素。在成功的移植中,必须实现骨髓微环境(bone-marrow niche)的清除以供供者造血干细胞(HSC)植入。预备方案还可以提供足够的免疫抑制,以防止移植的移植物排斥,并根除正在进行移植的疾病。目前清除微环境空间的方法依赖于辐射和/或化疗,所述辐射和/或化疗可能会产生毒副作用,这些毒副作用极大地限制了BMT的潜在临床效用。传统上,进行清髓性预处理。
清髓性方案可以分为含辐射或不含辐射的方案,所述清髓性方案是通过将辐射剂量或特定药物剂量增加至最大耐受剂量而开发的疗法。全身辐照和环磷酰胺或白消安和环磷酰胺是常用的清髓性疗法。这些方案尤其用于侵袭性恶性肿瘤,诸如白血病。然而,就对患者的毒性而言,此类治疗具有许多缺点。
干细胞(包括造血干细胞)的植入方法的改进具有重要的临床意义。本发明满足了这一需要。
发明内容
提供了通过如下方式在受者体内进行干细胞(包括但不限于造血干细胞)的长期多谱系植入的方法和组合物:用移植前非清髓性、非基因毒性预处理方案治疗受者;并且施用有效剂量的包含外源性干细胞的细胞群。所述预处理方案包括出于各种目的,施用作用于内源性细胞群的剂。所述方法允许植入以治疗血液学病症,并且还可以用于使受者耐受供者型HLA以便未来的器官移植。
通过预处理方案消耗内源性干细胞。消耗内源性干细胞的剂包括但不限于对c-kit有特异性的抗体和阻滞CD47活性的剂。这些剂在施用后也能够消耗外源性干细胞,因此从施用剂时到施用外源性干细胞时需要“洗脱”期。洗脱期足以将消耗内源性干细胞的剂的血清水平降低至不会导致干细胞消耗的无毒水平。
在一些实施方案中,在预处理方案中包括至少一种提供细胞毒性淋巴细胞的瞬时免疫抑制的剂。多种生物和非清髓性药物制剂均可用于此目的,包括但不限于抑制CD40/CD40L活性的剂;霉酚酸(mycophenolic acid)、环孢菌素A(cyclosporine A)、雷帕霉素(rapamycin)、FK506、皮质类固醇等。在一些实施方案中,剂抑制CD40L,并且是对CD40L有特异性的抗体。瞬时免疫抑制剂可以在外源性干细胞之前施用或与之同时施用,只要该剂在施用外源性干细胞时有活性即可。
在一些实施方案中,在预处理方案中包括至少一种消耗T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞中的一种或两种的剂。消耗T细胞的剂具体包括但不限于包括对CD3、CD4、CD8等有特异性的抗体在内的剂。消耗T细胞和NK细胞的剂包括但不限于包括对CD2、CD52、CD45有特异性的抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)等在内的剂。消耗NK细胞的剂具体包括但不限于包括对CD122、CD56等有特异性的抗体在内的剂。消耗剂可以在输注外源性干细胞之前施用,并且任选地在输注后有活性,只要在施用外源性干细胞时靶向细胞已被消耗即可。
在一个实施方案中,提供了在移植之前选择和施用一组适用于非基因毒性预处理的剂的方法。本文显示,对于成功植入干细胞的预处理方案的要求根据某些参数而变化,所述参数包括施用给受者的供者细胞数量;供者细胞的纯度;供者与受者之间主要组织相容性错配的程度;及受者的免疫状态。为个体选择一组适当的剂以及施用剂的时限可以优化移植的治疗结果。
在一些实施方案中,本文描述的方法可包括以下步骤:对供者和受者进行HLA分型以确定HLA匹配或HLA错配的配对;从所述供者获得包含CD34+造血干细胞和祖细胞(可称为HSPC)的造血细胞;任选地分离所需表型的HSPC,例如CD34+细胞,并配制有效剂量的HSPC;在输注所述造血细胞之前,根据施用给所述受者的供者细胞数量、所述供者细胞的纯度、供者与受者之间主要组织相容性错配的程度及所述受者的免疫状态,选择一组用于所述受者的非基因毒性预处理方案的剂;施用所述组的用于非基因毒性预处理的剂;输注所述造血细胞;以及监测所述受者的造血干细胞植入。本文描述的方法适用于HLA匹配和HLA错配的两种移植条件,例如HLA错配和非单倍型相合移植、单倍型相合移植;等等。
在一些实施方案中,HSPC获自供者造血细胞样品。在一些实施方案中,造血细胞样品是骨髓。在一些实施方案中,HSPC获自脐带血。在一些实施方案中,造血细胞样品通过从供者动员的外周血单采获得。在一些实施方案中,HSPC是体外产生的。HSPC供者可以是同种异体的或自体的,例如其中在再输注之前,例如在离体培养期间通过遗传物质的引入或缺失对HSPC进行基因工程改造。同种异体供者可以是与受者MHC匹配的。供者可以是与受者单倍型相合的或非单倍型相合的。供者可以在一个或多个MHC基因座处错配,例如在有关MHC匹配的主要基因座中的1、2、3、4、5或6个基因座处错配。
任选地从造血细胞样品中分离HSPC用于表达CD34。分离还可包括选择用于表达CD90。纯化的HSPC可为至少约45%纯度,正如由群体中为CD34+的细胞百分比定义的那样,可为至少约50%纯度,至少约60%纯度,至少约70%纯度,至少约80%纯度,至少约90%纯度。CD34+细胞的有效剂量可为约105至约107个CD34+细胞/kg受者体重,并且可为至少约5x105个CD34+细胞/kg受者体重,至少约106个CD34+细胞/kg受者体重,至少约3x 106个CD34+细胞/kg受者体重,至少约5x 106个CD34+细胞/kg受者体重,并且可为107个CD34+细胞/kg受者体重或更高。CD34+细胞的剂量;细胞的纯度和递送的细胞总数,即输注液中CD34+和CD34-细胞的总剂量是选择非基因毒性预处理剂的重要参数。
随HSPC组合物递送的CD3+细胞的最大数量可能不超过约106个CD3+细胞/kg受者体重,不超过约5x 105个CD3+细胞/kg受者体重,不超过约3x 105个CD3+细胞/kg受者体重,不超过约104个CD3+细胞/kg受者体重。输注液中CD3+细胞的数量可能是选择抑制细胞毒性淋巴细胞的剂的参数,其中CD3+细胞的数量增加可能需要在即将输注时或在输注的同时施用一种或多种消融T细胞的剂,包括但不限于对CD3、CD4、CD8等有特异性的抗体。
在一些实施方案中,移植在不存在清髓性预处理的情况下进行。在一些实施方案中,受者有免疫能力。必要时重复施用移植前预处理方案以达到所需的消融水平。
在一些实施方案中,通过施用可溶性SIRPα多肽来实现CD47阻滞,所述多肽可以是高亲和力SIRPα变体多肽。在其它实施方案中,施用对SIRPα和CD47中的一种或两种有特异性的抗体。
在移植供者干细胞后,受者可以是供者细胞的嵌合体或混合嵌合体。在不存在非选择性消融方法,例如辐射或化疗的情况下,本发明的方法允许干细胞有效植入,所述非选择性消融方法具有消融参与靶向组织功能的分化细胞的不良作用以及对其它组织(例如对胃肠系统细胞、毛发生长)的不良副作用,以及增加继发性恶性肿瘤的风险的不良作用。
在本发明的一个实施方案中,干细胞是自体造血干细胞、经遗传修饰的造血干细胞和同种异体造血干细胞中的一种或多种,通常是同种异体干细胞。此类干细胞可用于治疗各种血液病症,例如遗传性病症,包括再生障碍性贫血;镰状细胞疾病;地中海贫血;严重免疫缺陷;骨髓衰竭状态、免疫缺陷、血红蛋白病、白血病、淋巴瘤、免疫耐受诱导,可通过骨髓移植治疗的遗传性病症,和其它血液病症等。
本发明的方法也可用于在患者中诱导耐受性,例如对供者组织的耐受性,例如在器官移植中;对自身抗原的耐受性,例如在治疗自身免疫性疾病的背景下;等等。在本发明的一个实施方案中,提供了一种在患者中诱导耐受性的方法,其包括向患者施用靶向干细胞的剂,包括但不限于对c-kit有特异性的抗体和阻滞CD47活性的剂;所述施用联合有效剂量的一种或一组降低细胞毒性淋巴细胞的数量或活性的剂的施用进行,所述细胞毒性淋巴细胞可包括但不限于T细胞和自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中,包括至少一种提供细胞毒性淋巴细胞的瞬时免疫抑制的剂,包括但不限于抑制CD40/CD40L活性的剂。在一些实施方案中,所述剂是对CD40L有特异性的抗体。在一些实施方案中,所述方法在不存在基因毒性预处理的情况下进行。在预处理方案之后,向受者输注有效剂量的造血干细胞和祖细胞,从而提供对供者细胞的免疫耐受性,以便未来的器官移植。
附图说明
结合附图阅读以下详细描述时本发明得到最佳理解。要强调的是,根据惯例,附图的各种特征不成比例。相反,为清楚起见,各种特征的尺寸任意地放大或缩小。附图中包括以下各图。
图1A-1F。ACK2、克隆3、MR-1和CD122能够使单倍型相合全骨髓有效植入有免疫能力的动物中。图1A收获30e6 AKR x Hz F1全骨髓并将其眶后移植至每个Balb/c x C57BL/6受者中。通过CD45等位基因差异测定嵌合率。图1B在标记日期给予每种抗体以进行预处理。在第-8天,给予100ug克隆3;在随后的所有日期,给予500ug克隆3。在第-6天,给予500ug的ACK2。在第-1天,给予250ug的Tm-b1。在第0天,给予500ug的MR1。C-F。使用每种抗体的不同组合对小鼠进行预处理。除T细胞(图1D)、B细胞(图1E)和粒细胞(图1F)嵌合率外,还在13周内测量了总供者嵌合率(图1C)。审查ACK2+克隆3+MR1组群中的非嵌合小鼠。
图2。经抗体预处理的小鼠的16周供者嵌合率。图中示出了每个组群中嵌合小鼠的百分比以及总供者、T细胞、B细胞和粒细胞嵌合率的平均水平。审查ACK2+克隆3+MR1组群中的非嵌合小鼠。
图3A-3F。植入低细胞剂量骨髓需要消耗NK细胞。图3A收获各种量的AKR x Hz F1全骨髓并将其眶后移植至每个Balb/c x C57BL/6受者中。通过CD45等位基因差异测定嵌合率。图3B在标记日期给予每种抗体进行预处理。在第-8天,给予100ug克隆3;在随后的所有日期,给予500ug克隆3。在第-6天,给予500ug的ACK2。在第-2天,给予250ug的Tm-b1。在第0天,给予500ug的MR1。C-F。用最少量的克隆3、ACK2和MR1对每组进行预处理。还向两个标注的组群中添加了CD122;两个标注的组群因而接受所有四种抗体。经预处理的小鼠接受30x106、106、3x 106或105全骨髓。除T细胞(图3D)、B细胞(图3E)和粒细胞(图3F)嵌合率外,还在3周时测量了总供者嵌合率(图3C)。
图4。单克隆抗体混合物可诱导长期多谱系造血重建。(a)使用AKRB6F1供者和CB6F1受者的单倍型相合移植模式。(b)对供者和受者品系上的I类MHC进行的流式细胞术分析。(c)预处理方案的给药时间表。(d)在抗体预处理后,长期HSC区室(Lin-c-KIT+Sca1+CD150+Flk2-CD34-)中的供者嵌合率。(e-g)抗体预处理允许WBM移植后的长期多谱系嵌合。(h)第0天WBM抗体预处理后的CBC。(i)在有或无NK细胞消耗的情况下,各个WBM剂量下嵌合动物的百分比。
图5。单克隆抗体混合物可以诱导低剂量纯化HSC的长期多谱系造血重建。(a)用于计算和分离LSK和c-KIT+细胞以进行移植的分选方案。(b)各种造血细胞移植后的粒细胞嵌合率。(c)LSK抗体预处理的给药时间表。(d)LSK抗体预处理后骨髓中的成熟免疫细胞群丰度。(e)LSK移植后的总外周血供者嵌合率。(f)在排除LSK抗体混合物的各种组分后嵌合动物的百分比。
图6。通过非基因毒性预处理方案进行的低剂量LSK移植允许耐受供者组织。(a-b)WBM(a)和LSK(b)移植后外周血中供者反应性宿主T细胞的丰度。(c)耳-心移植示意图。(d)供者心脏存活率。(e)组织移植34天后的代表性耳-心移植物的肉眼检查、H&E和IF。
图7。尽管完全MHC错配,但可以植入造血干细胞。(a)移植示意图,其中DBA1/J是供者,CB6F1是宿主。(b)8周后WBM和LSK移植后供者植入的百分比。(c)移植动物的总体存活率。(d)描述全抗体预处理方案的概述,所述全抗体预处理方案可以消耗内源性HSC,并通过靶向宿主T细胞和NK细胞提供瞬时免疫抑制。
图8。(a)通过宿主和供者之间的CD45等位基因差异测定外周血嵌合率的分选方案。示出了WBM移植16周后多谱系外周血中(b)T细胞、(c)B细胞和(d)粒细胞的嵌合率。
图9。使用单克隆抗体进行单一治疗性预处理后的外周血供者嵌合率。
图10。在未移植的情况下,完成预处理一天后的来自动物的全血计数(a)、外周血亚群计数(b)和脾脏亚群计数(c)。
图11。在LSK抗体预处理发生改变后的16周外周血嵌合率。
具体实施方式
提供了在输注包含干细胞和祖细胞的细胞组合物之前通过用非基因毒性、非清髓性预处理进行治疗,在受试者中植入干细胞的方法。
本发明的一个目的是提供一种临床适用的干细胞移植方法,所述方法有助于植入并重建受者的免疫能力,而不需要放疗或化疗,或者不会发展GVHD或移植排斥。还提供了用于根据供者干细胞群的性质和剂量以及供者与受者之间的HLA匹配程度选择适当的预处理方案的指南。
本发明的方面是基于以下发现:将靶向内源性干细胞的剂(例如抗c-kit抗体)与通过阻断CD47和SIRPα的相互作用增强对内源性干细胞的杀伤的剂组合使用,并任选地与瞬时免疫抑制组合,以及任选地与消耗T细胞和/或NK细胞的剂组合,可实现可促进造血干细胞(HSC)高效植入的内源性干细胞微环境的消耗,允许供者细胞安全地植入。具体而言,本发明将这种改良的内源性干细胞的选择性消融与向受者施用外源性干细胞相组合,引起高效、长期的植入和耐受性。
应理解,本发明不限于描述的特定方法、产品、装置和因素,因为此类方法、装置和制剂当然可以变化。还应理解,本文所用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的,而非意图限制本发明的范围,本发明的范围将仅受所附权利要求限制。
必须注意,除非上下文另外明确指出,否则如本文和所附权利要求中所用单数形式“一(a/an)”和“所述(该)”包括复数个指示物。因此,例如,对“一种药物候选物”的提及是指对此类候选物中的一种或其混合物的提及,并且对“该方法”的提及包括对本领域技术人员已知的等效步骤和方法的提及,等等。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文提到的所有出版物均出于描述和公开在出版物中描述并且可以结合当前描述的发明使用的装置、制剂和方法的目的而以引用方式并入本文。
在提供值的范围时,应当理解,除非上下文另外明确指出,否则介于该范围上限与下限之间的每个居间值(至下限单位的十分之一)以及该所述范围内的任何其它所述值或居间值均涵盖在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内并且也涵盖在本发明内,受所述范围内任何明确排除的限值的限制。在所述范围包括所述限值中的一个或两个的情况下,排除那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
在以下描述中,阐述了许多具体细节以便提供对本发明更透彻的理解。然而,对本领域的技术人员来说将显而易见的是,本发明可在没有这些具体细节中的一个或多个的情况下实践。在其它情况下,未描述本领域技术人员熟知的特征和程序,以便避免使本发明模糊不清。
通常,在本发明中采用蛋白质合成、重组细胞培养和蛋白质分离的常规方法,以及本领域技术范围内的重组DNA技术。此类技术在文献中有全面解释,参见,例如,Maniatis,Fritsch和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);Sambrook,Russell和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2001);Harlow,Lane和Harlow,Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol No.I,ColdSpring Harbor Laboratory(1998);及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory;(1988)。
定义
预处理方案。进行同种异体造血干细胞移植(HSCT)的患者使用所谓的预处理方案进行准备,该预处理方案可以抑制受者的免疫系统并消耗内源性干细胞,以便允许植入供者干细胞。
常规预处理方案的强度可以显著变化。方案的描述可以指基因毒性或非基因毒性方案,其可能与清髓性或非清髓性方案重叠。参见,例如,Bacigalupo等(2009)Biol BloodMarrow Transplant.15(12):1628-1633,其特定地以引用方式并入本文。
基因毒性方案至少部分地包括施用对DNA具有如下直接或间接影响的剂:诱导突变,不合时宜的事件激活和导致突变的直接DNA损伤。基因毒性剂的实例包括辐射和某些化学治疗药物,诸如烷化剂、嵌入剂和参与DNA复制的酶的抑制剂。本发明的方法是非基因毒性的,因此不包括此类剂的使用。
清髓性预处理方案是预计在施用后1-3周内会导致严重的全血细胞减少(pancytopenia)和骨髓细胞清除(myeloablation)的剂的组合;全血细胞减少是持久的,通常是不可逆的,并且在大多数情况下是致命的,除非通过造血干细胞输注恢复造血。实例包括全身辐照和/或施用烷化剂;氟达拉滨(fludarabine)、二甲基白消安、依托泊苷(etoposide)(VP16);等等。基因毒性和清髓性剂中存在显著重叠。
非清髓性预处理方案通常引起最低限度的血细胞减少,并且早期毒性小,但是具有一定程度的免疫抑制性,即在随后施用有效剂量的HSPC时,将会导致供者淋巴-造血干细胞植入的程度。
本文提供的预处理方案是非基因毒性和非清髓性的,并且主要利用靶向剂来消耗阻止植入的内源性细胞,而不会引起持久的全血细胞减少。所述方法不利用基因毒性化学治疗剂或放射,但是在一些情况下,非基因毒性的靶向免疫抑制剂(诸如环孢菌素A、皮质类固醇等)可用于瞬时免疫抑制。
本发明方法中活性剂的“伴随施用”意指与试剂一起施用,施用时间使得所述剂将同时具有治疗效果。此类伴随施用可能涉及并行(即在相同时间)、先后施用剂。本领域的普通技术人员将不难确定施用特定药物与本发明的组合物的适当时限、顺序及剂量。
干细胞标志物。用于抗体介导的人造血干细胞消融的示例性标志物包括CD34;CD90(thy-1);CD59;CD110(c-mpl);c-kit(CD-117);等等。用于中胚层干细胞消融的标志物包括FcγRII、FcγRIII、Thy-1、CD44、VLA-4α、LFA-1β、HSA、ICAM-1、CD45、Aa4.1、Sca-1等。可以用对低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)有特异性的抗体对神经嵴干细胞进行阳性选择。本领域已经描述了神经干细胞/祖细胞,并且已经广泛讨论了它们在多种治疗方案中的用途。例如,尤其是,Uchida等(2000)Proc Natl Acad Sci U S A.97(26):14720-5;美国专利号6,638,501,Bjornson等;U.S.6,541,255,Snyder等;U.S.6,498,018,Carpenter;美国专利申请20020012903,Goldman等;Palmer等(2001)Nature 411(6833):42-3;Palmer等(1997)Mol Cell Neurosci.8(6):389-404;Svendsen等(1997)Exp.Neurol.148(1):135-46和Shihabuddin(1999)Mol Med Today.5(11):474-80;其各自特定地以引用方式并入本文。可以使用诸如SH2(CD105)、SH3和SH4及Stro-1的标志物消融人间充质干细胞。
在本发明的一个实施方案中,消耗的标志物是c-kit(CD117)。CD117是与干细胞因子(一种引起某些类型的细胞生长的物质)结合的III型受体酪氨酸激酶,所述干细胞因子也称为“青灰因子”或“c-kit配体”。当该受体与干细胞因子(SCF)结合时,它形成一种二聚体,所述二聚体激活其内在酪氨酸激酶活性,进而使细胞中传播信号的信号转导分子磷酸化并激活。参见,例如,人refseq条目Genbank NM_000222;NP_000213。CD117是用于鉴定骨髓中某些类型的造血(血液)祖细胞的重要细胞表面标志物。造血干细胞(HSC)、多能祖细胞(MPP)和普通髓系祖细胞(CMP)表达高水平的CD117。许多特异性结合人CD117的抗体是本领域已知的并且可商购获得,包括但不限于SR1、2B8、ACK2、YB5-B8、57A5、104D2等。感兴趣的是美国专利号8,436,150和7,915,391中描述的SR1的人源化形式AMG191,其为非糖基化的IgG1人源化抗体。
有效剂量的抗CD117抗体可以以一个或多个剂量(包括单剂量)施用,该施用可以在移植前至少约一周、移植前至少约5天、移植前至少约3天进行。给药和移植间隔的时间段足以从受者的循环中基本上消除抗CD117抗体。例如,施用后峰值血清水平的降低通常是足以使该水平从峰值水平降低至少约10倍,通常至少约100倍、1000倍、10,000倍或更多倍的时间。优选在洗脱期后,通常在约3天、约2天、约1天内或在清除时将供者干细胞引入空的微环境“窗口”内。
在一些实施方案中,抗CD117抗体的有效剂量高达约10mg/kg,高达约5mg/kg;高达约1mg/kg,高达约0.5mg/kg;高达约0.1mg/kg;高达约0.05mg/kg;其中剂量可以随特定抗体和受者而变化。
抗CD47剂。如本文所用,术语“抗CD47剂”或“提供CD47阻滞的剂”是指减少CD47(例如,在靶细胞上)与SIRPα(例如,在吞噬细胞上)的结合的任何剂。合适的抗CD47剂的非限制性实例包括SIRPα试剂,包括但不限于高亲和力SIRPα多肽、抗SIRPα抗体、可溶性CD47多肽和抗CD47抗体或抗体片段。在一些实施方案中,合适的抗CD47剂(例如抗CD47抗体、SIRPα试剂等)特异性结合CD47以减少CD47与SIRPα的结合。
抗CD47剂的有效剂量可随剂而变化,但通常范围将至多约50mg/kg,至多约40mg/kg,至多约30mg/kg,至多约20mg/kg,至多约10mg/kg,至多约5mg/kg;至多约1mg/kg,至多约0.5mg/kg;至多约0.1mg/kg;至多约0.05mg/kg;其中剂量可以随特定抗体和受者而变化。由于体内表达CD47的细胞的数量更多,所以可以以更高的剂量施用与CD47结合的剂,例如可溶性SIRPa多肽和抗CD47抗体。
抗CD47剂可以在移植前一天或几天施用,并且在一些实施方案中,每天施用,持续约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天或更多天,即约1至7天,约1至5天,约1至3天等。与抗c-kit剂一样,靶向CD47可能会在输注后影响供者干细胞,因此在输注造血细胞之前需要洗脱期。洗脱期可能比c-kit抗体短,但通常为至少约24小时,至少36小时,至少48小时,并且可能最长约一周,最长约5天,最长约3天等。
在一些实施方案中,合适的抗CD47剂(例如,抗SIRPα抗体、可溶性CD47多肽等)特异性结合SIRPα以减少CD47与SIRPα的结合。合适的结合SIRPα的抗CD47剂不会激活SIRPα(例如,在表达SIRPα的吞噬细胞中)。可以通过测定所述剂来评估合适的抗CD47剂的功效。在示例性测定中,在候选剂存在或不存在的情况下孵育靶细胞。用于本发明方法的剂将使吞噬作用与所述剂不存在时的吞噬作用相比上调至少5%(例如,至少10%,至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,至少100%,至少120%,至少140%,至少160%,至少180%,至少200%,至少500%,至少1000%)。类似地,对于SIRPα酪氨酸磷酸化水平的体外测定将显示与候选剂不存在时观察到的磷酸化相比,磷酸化降低至少5%(例如,至少10%,至少15%,至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少90%或100%)。
在一些实施方案中,抗CD47剂在结合时不激活CD47。当CD47被激活时,可能发生类似于细胞凋亡(即,程序性细胞死亡)的过程(Manna和Frazier,Cancer Research,64,1026-1036,2004年2月1日)。因此,在一些实施方案中,抗CD47剂不直接诱导表达CD47的细胞的细胞死亡。
SIRPα试剂。SIRPα试剂包含足以以可识别的亲和力与CD47结合,通常位于信号序列与跨膜结构域之间的SIRPα部分,或其保留结合活性的片段。合适的SIRPα试剂减少(例如,阻断、阻止等)天然蛋白质SIRPα与CD47之间的相互作用。SIRPα试剂通常将至少包含SIRPα的d1结构域。
在一些实施方案中,主题抗CD47剂是“高亲和力SIRPα试剂”,其包括SIRPα来源的多肽及其类似物(例如,CV1-hIgG4和CV1单体)。高亲和力SIRPα试剂在国际申请PCT/US13/21937中有描述,该国际申请特此以引用方式特定地并入。高亲和力SIRPα试剂是天然SIRPα蛋白的变体。提供增加的亲和力的氨基酸变化位于d1结构域中,因此高亲和力SIRPα试剂包含人SIRPα的d1结构域,其相对于d1结构域内的野生型序列具有至少有一个氨基酸变化。此类高亲和力SIRPα试剂任选地包含附加氨基酸序列,例如抗体Fc序列;野生型人SIRPα蛋白的除d1结构域以外的部分,包括但不限于天然蛋白的残基150至374或其片段,通常是与d1结构域邻接的片段;等等。高亲和力SIRPα试剂可以是单体或多聚体,即二聚体、三聚体、四聚体等。在一些实施方案中,高亲和力SIRPα试剂是可溶的,其中所述多肽缺乏SIRPα跨膜结构域并且相对于野生型SIRPα序列包含至少一个氨基酸变化,并且其中所述氨基酸变化例如通过使解离速率降低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或更多倍增加了SIRPα多肽与CD47结合的亲和力。
任选地,SIRPα试剂是一种融合蛋白,例如与第二多肽框内融合。在一些实施方案中,该第二多肽能够增加融合蛋白的大小,例如,使得融合蛋白不会迅速地从循环中清除。在一些实施方案中,该第二多肽是免疫球蛋白Fc区的一部分或全部。Fc区通过提供“吃我(eat me)”信号而有助于吞噬作用,这增强了对高亲和力SIRPα试剂提供的“不要吃我(don’t eat me)”信号的阻断。在其它实施方案中,该第二多肽是与Fc基本上相似的任何合适多肽,例如,提供增加的大小、多聚化结构域,和/或与Ig分子的附加结合或相互作用。
抗CD47抗体。在一些实施方案中,主题抗CD47剂是特异性结合CD47的抗体(即,抗CD47抗体)并且减少一种细胞(例如,受感染细胞)上的CD47与另一种细胞(例如,吞噬细胞)上的SIRPα之间的相互作用。在一些实施方案中,合适的抗CD47抗体在结合时不激活CD47。一些抗CD47抗体不会减少CD47与SIRPα的结合(因此在本文中不被视为“抗CD47剂”),并且此类抗体可称为“非阻断性抗CD47抗体”。作为“抗CD47剂”的合适的抗CD47抗体可以称为“CD47阻断性抗体”。合适的抗体的非限制性实例包括克隆B6H12、5F9、8B6和C3(例如,如国际专利公开WO 2011/143624中所述,其特定地以引用方式并入本文)。合适的抗CD47抗体包括此类抗体的完全人类、人源化或嵌合型式。人源化抗体(例如,hu5F9-G4)由于其抗原性低而特别适用于人体内的应用。类似地,犬源化、猫源化等抗体分别特别适用于狗、猫和其它物种的应用。目标抗体包括人源化抗体,或犬源化、猫源化、马源化、牛源化、猪源化等抗体及其变体。
抗SIRPα抗体。在一些实施方案中,主题抗CD47剂是特异性结合SIRPα的抗体(即,抗SIRPα抗体)并且减少一种细胞(例如,受感染细胞)上的CD47与另一种细胞(例如,吞噬细胞)上的SIRPα之间的相互作用。合适的抗SIRPα抗体可以结合SIRPα而不激活或刺激通过SIRPα的信号传导,因为激活SIRPα会抑制吞噬作用。相反,合适的抗SIRPα抗体有利于被攻击细胞优先于正常细胞被吞噬。相对于其它细胞(未感染细胞),表达更高水平的CD47的那些细胞(例如,感染细胞)将优先被吞噬。因此,合适的抗SIRPα抗体特异性结合SIRPα(而未激活/刺激足以抑制吞噬作用的信号传导反应)并阻断SIRPα与CD47之间的相互作用。合适的抗SIRPα抗体包括此类抗体的完全人类、人源化或嵌合型式。人源化抗体由于其抗原性低而特别适用于人体内的应用。类似地,犬源化、猫源化等抗体分别特别适用于狗、猫和其它物种的应用。目标抗体包括人源化抗体,或犬源化、猫源化、马源化、牛源化、猪源化等抗体及其变体。
可溶性CD47多肽。在一些实施方案中,主题抗CD47剂是特异性结合SIRPα的可溶性CD47多肽并且减少一种细胞(例如,感染细胞)上的CD47与另一种细胞(例如吞噬细胞)上的SIRPα之间的相互作用。合适的可溶性CD47多肽可以结合SIRPα而不激活或刺激通过SIRPα的信号传导,因为激活SIRPα会抑制吞噬作用。相反,合适的可溶性CD47多肽有利于感染细胞优先于非感染细胞被吞噬。相对于正常的非靶向细胞(正常细胞),表达更高水平的CD47的那些细胞(例如,感染细胞)将优先被吞噬。因此,合适的可溶性CD47多肽特异性结合SIRPα而未激活/刺激足以抑制吞噬作用的信号传导反应。
在一些情况下,合适的可溶性CD47多肽可以是融合蛋白(例如,如特定地以引用方式并入本文的美国专利公开US20100239579中从结构上描述的)。然而,只有不激活/刺激SIRPα的融合蛋白才适于本文提供的方法。合适的可溶性CD47多肽还包括包含变体或天然存在的CD47序列(例如,细胞外结构域序列或细胞外结构域变体)的任何肽或肽片段,所述肽或肽片段可以特异性结合SIRPα并抑制CD47与SIRPα之间的相互作用,而不刺激足以抑制吞噬作用的SIRPα活性。
在某些实施方案中,可溶性CD47多肽包含CD47的细胞外结构域,包括信号肽,使得CD47的细胞外部分的长度通常为142个氨基酸。本文描述的可溶性CD47多肽还包括CD47细胞外结构域变体,所述CD47细胞外结构域变体包含具有至少65%-75%、75%-80%、80-85%、85%-90%或95%-99%同一性(或65%至100%之间没有明确列举的任何百分比同一性)的氨基酸序列,所述变体保留了与SIRPα结合而不刺激SIRPα信号传导的能力。
在某些实施方案中,信号肽氨基酸序列可以被源自另一种多肽(例如,免疫球蛋白或CTLA4)的信号肽氨基酸序列取代。例如,与全长CD47(即穿过外细胞膜的细胞表面多肽)不同,分泌可溶性CD47多肽;因此,编码可溶性CD47多肽的多核苷酸可包括编码与通常从细胞分泌的多肽相关的信号肽的核苷酸序列。
在其它实施方案中,可溶性CD47多肽包含缺乏信号肽的CD47细胞外结构域。如本文所述,分泌蛋白或跨膜蛋白的细胞表面上未暴露信号肽,因为信号肽在蛋白易位期间被裂解或信号肽保持锚定在外细胞膜中(此类肽也称为信号锚)。据信CD47的信号肽序列在体内从前体CD47多肽上裂解下来。
在其它实施方案中,可溶性CD47多肽包含CD47细胞外结构域变体。此类可溶性CD47多肽保留了与SIRPα结合而不刺激SIRPα信号传导的能力。CD47细胞外结构域变体可具有与天然CD47序列具有至少65%-75%、75%-80%、80-85%、85%-90%或95%-99%同一性(包括介于所述任一范围之间的任何百分比同一性)的氨基酸序列。
瞬时免疫抑制剂。瞬时免疫抑制剂在短时间段内,通常是在供者细胞施用时或之前不久的时间段内,阻断免疫细胞,尤其是T淋巴细胞的活性。瞬时免疫抑制,即免疫抑制剂的有效血清水平可维持至少约3天,至少约1周,至少约2周,至少约3周,至少约4周,至少约5周,至少约6周,并且可以维持长达1个月,长达2个月,长达3个月,长达4个月,长达5个月,长达6个月或更长时间。在一些实施方案中,在即将施用供者细胞时或与供者细胞同时施用单剂量的剂。此类剂通常是抑制性的,而不会消融免疫细胞群。剂的初始剂量可在供者细胞施用约3天内,约2天内,约1天内或在供者细胞施用时进行。
瞬时免疫抑制可通过施用药理性免疫抑制剂来实现,所述药理性免疫抑制剂包括但不限于钙调磷酸酶抑制剂,其与结合蛋白组合以抑制钙调磷酸酶活性,并且包括例如他克莫司(tacrolimus)、环孢菌素A等。环孢菌素和他克莫司两者的水平必须小心监测。最初,水平可以保持在10-20ng/mL范围内,但是在3个月之后,水平可保持较低(5-10ng/mL)以降低肾毒性风险。用于此目的的其它药理剂包括类固醇、硫唑嘌呤(azathioprine)、吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil)和西罗莫司(sirolimus)等。
在一些实施方案中,瞬时免疫抑制剂阻断CD40和CD40配体的相互作用。CD40是在抗原呈递细胞(APC)上发现的共刺激蛋白,并且是所述抗原呈递细胞激活所需的。这些APC包括吞噬细胞(巨噬细胞和树突细胞)和B细胞。CD40是TNF受体家族的一部分。CD40的主要激活信号传导分子是IFNγ和CD40配体(CD40L)。
“CD40配体”(“CD40L”,也称为“CD154”)是II型跨膜蛋白。CD40L最初被视为限于活化的T淋巴细胞,其起到T细胞依赖性B细胞活化、增殖和分化的介质的作用。CD40L的表达起到作为肿瘤坏死因子(TNF)基因超家族的免疫和炎症的中枢介质的功能性作用。CD40/CD40L相互作用对于胸腺依赖性体液免疫应答的发展至关重要。CD40L调节生理过程,诸如T细胞介导的效应子功能和适当宿主防御所需的一般免疫反应,但也会触发促炎介质(诸如细胞因子、粘附分子)的表达和基质降解活性,所有这些都与慢性炎症性疾病(例如自身免疫性病症、关节炎、动脉粥样硬化和癌症)的发病机理相关。
鉴于其在介导免疫应答的许多方面中的关键作用,CD40/CD40L途径提供了预防移植排斥的治疗靶标。用抗CD40L抗体中断CD40/CD40L信号途径可有效预防动物模型和临床使用中的急性同种异体移植物排斥和同种异体抗体反应。随后的研究已经证明抗CD40L对许多啮齿动物模型(胰岛、肢体、角膜和骨髓)中移植物存活期的延长具有有益作用。
如本文所用,术语“抗CD40L剂”或“提供CD40L阻滞的剂”是指减少CD40L(例如,在靶细胞上)与CD40的结合的任何剂。合适的抗CD40L试剂的非限制性实例包括抗CD40抗体和抗CD40L抗体或抗体片段。目标剂还包括但不限于抗体的片段和小分子。例如,CDP7657是高亲和力聚乙二醇化单价Fab’抗CD40L抗体片段。抗体的有效剂量可为至多约50mg/kg,至多约25mg/kg;至多约10mg/kg,至多约5mg/kg;至多约1mg/kg;至多约0.5mg/kg;或更低,其中剂量可以随特定抗体和受者而变化。作为抗体的替代物,小分子抑制剂在例如Chen等(2017)J.Med.Chem.60,8906-8922中有描述,该文献特定地以引用方式并入本文。
T细胞消融。对于一些移植情形,如表1所示,希望删除内源性T细胞。在一些实施方案中,消融剂对T细胞有特异性,在其它实施方案中,它还作用于NK细胞。靶向T细胞的抗体包括例如对CD2、CD3、CD4、CD8、CD52(campath)、CD45和ATG有特异性的抗体。
关于时限,T细胞消耗剂理想地在供者细胞施用时或之前不久的时间段内有活性。消耗剂的治疗水平可在供者细胞施用之后维持至少约3天,至少约1周,至少约2周,至少约3周,至少约4周,至少约5周,至少约6周,并且可以维持长达1个月,长达2个月,长达3个月,长达4个月,长达5个月,长达6个月或更长时间。在一些实施方案中,在供者细胞施用约3天内、约2天内、约1天内或在供者细胞施用时施用一个剂量的剂,并且根据抗体,可在输注之前每天施用,持续数天,例如2、3、4天等。抗体的有效剂量可为至多约50mg/kg,至多约25mg/kg;至多约10mg/kg,至多约5mg/kg;至多约1mg/kg;至多约0.5mg/kg;或更低,例如至多约100μg/kg,至多约50μg/kg,至多约10μg/kg,至多约1μg/kg,其中剂量可以随特定抗体和受者而变化。基于抗体的疗法可以使用单克隆抗体(例如,莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3))或多克隆抗体;抗CD25抗体(例如,巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab))等。抗体包括例如ATG制剂、KT3、(美国专利号5,730,979,其公开内容特此以引用方式并入)。
多种抗人CD3 mAb正在临床开发中,包括替普利珠单抗(Teplizumab),而MGA031是通过将OKT3的互补决定区移植到人IgG1骨架中而开发的人源化IgG1抗体。奥立昔单抗(otelixizumab)(ChAglyCD3、TRX4、GSK2136525)源自大鼠抗体YTH12.5,并且是在γ1Fc部分中具有单突变以避免糖基化并因此抑制FcR结合的人源化IgG1。维西珠单抗(visilizumab)(Nuvion、HuM291)是因其Fc区中的两个点突变而使其不具促有丝分裂性的人源化IgG2抗体。佛拉鲁单抗(Foralumab)(28F11-AE;NI-0401)是全人抗CD3 mAb。
用于消耗T细胞和NK细胞的有用剂是抗CD52抗体,以临床批准的抗体Campath(阿仑单抗(alemtuzumab))为例,其是针对21-28kD细胞表面糖蛋白CD52的重组DNA来源的人源化单克隆抗体。Campath-1H是具有人可变框架和恒定区,以及来自鼠类(大鼠)单克隆抗体(Campath-1G)的互补决定区的IgG1κ抗体。Campath可以,例如以目前接受的临床剂量施用,例如在约3天至约7天的时间段内升高至30mg的最大单剂量。
NK细胞消融。对于一些移植情形,如表1所示,希望也删除内源性NK细胞。如上所述,一些剂作用于T细胞和NK细胞,例如抗CD2、CD52等的抗体。其它剂对NK细胞有特异性,并且可以与T细胞靶向剂组合施用。选择性靶向NK细胞的抗体包括例如对CD122和CD56有特异性的抗体。
关于时限,NK细胞消耗剂理想地在供者细胞施用时或之前不久的时间段内有活性。消耗剂的治疗水平可在供者细胞施用之后维持至少约3天,至少约1周,至少约2周,至少约3周,至少约4周,至少约5周,至少约6周,并且可以维持长达1个月,长达2个月,长达3个月,长达4个月,长达5个月,长达6个月或更长时间。在一些实施方案中,在供者细胞施用约3天内、约2天内、约1天内或在供者细胞施用时施用一个剂量的剂,并且根据抗体,可在输注之前每天施用,持续数天,例如2、3、4天等。抗体的有效剂量可为至多约50mg/kg,至多约25mg/kg;至多约10mg/kg,至多约5mg/kg;至多约1mg/kg;至多约0.5mg/kg;或更低,例如至多约100μg/kg,至多约50μg/kg,至多约10μg/kg,至多约1μg/kg,其中剂量可以随特定抗体和受者而变化。
“CD122”(也称为“白细胞介素-2受体亚基β”,IL2RB)是I型膜蛋白。CD122是白细胞介素2受体(IL2R)的亚基,其参与T细胞介导的免疫反应,并且其所存在的3种形式均能结合白细胞介素2。IL2R的低亲和力形式是α亚基的单体,不参与信号转导。中等亲和力形式由α/β亚基异二聚体组成,而高亲和力形式由α/β/γ亚基异三聚体组成。受体的中等和高亲和力形式都参与受体介导的内吞作用和来自白细胞介素2的促有丝分裂信号的转导。使用替代启动子产生编码相同蛋白的多种转录物变体。
如本文所用,术语“抗CD122剂”或“提供CD122阻滞的剂”是指消耗CD122阳性细胞(包括自然杀伤(NK)细胞)的任何剂。合适的抗CD122试剂的非限制性实例包括抗IL-2抗体和抗CD122抗体或抗体片段。
靶向CD56的抗体正在临床开发中并且可用于NK细胞消耗。例如,IMGN901是被设计成选择性地递送细胞毒性美登木素生物碱DM1的CD56靶向抗体-药物偶联物,其最大耐受剂量(MTD)为约75mg/m2,并且可以以例如约1至约60mg/m2的剂量施用。
“主要组织相容性复合物抗原”(“MHC”,也称为“人白细胞抗原”,HLA)是在细胞表面上表达的,赋予这些细胞独特抗原特性的蛋白分子。MHC/HLA抗原是由T细胞和自然杀伤(NK)细胞识别为源自与免疫效应细胞相同来源的造血干细胞(“自身(self)”)或识别为源自另一来源的造血重建细胞(“非自身(non-self)”)的靶分子。识别两种主要类别的HLA抗原:I类HLA和II类HLA。I类HLA抗原(在人类中为A、B和C)使得每个细胞可识别为“自身”,而II类HLA抗原(在人类中为DR、DP和DQ)参与淋巴细胞与抗原呈递细胞之间的反应。两种抗原均参与移植的器官的排斥。
HLA基因系统的重要方面为其多态性。每种基因I类MHC(A、B和C)和II类MHC(DP、DQ和DR)存在于不同的等位基因中。HLA等位基因由数字和下标命名。例如,两个无亲缘关系的个体可以分别携带I类HLA-B、基因B5和Bw41。等位基因产物的不同之处在于α和/或β结构域中的一个或多个氨基酸。使用大量特异性抗体或核酸试剂,使用表达I类和II类分子的白细胞对个体的HLA单倍型进行分型。对于HLA分型最重要的基因为六种I类MHC和II类MHC蛋白,对于HLA-A、HLA-B和HLA-DR中的每一个有两个等位基因。
HLA基因以存在于染色体位置6p21上的“超级基因座”形式成簇,所述染色体位置6p21编码六种经典移植HLA基因和至少132种蛋白编码基因,所述基因在免疫系统的调节以及一些其它基本的分子和细胞过程中具有重要作用。完整的基因座的大小为约3.6Mb,其具有至少224个基因座。这样成簇的一种效应是从一个亲本遗传的“单倍型”(即存在于单个染色体上的等位基因的集合)倾向于作为一个群组遗传。从每个亲本遗传的等位基因的集合形成单倍型,其中一些等位基因倾向于缔合在一起。识别患者单倍型可以帮助预测找到匹配供者的概率并且有助于开发搜索策略,因为一些等位基因和单倍型比其它等位基因和单倍型更常见并且它们以不同的频率分布在不同的种族和族群中。
如本文所用,术语“HLA匹配的”是指其中在供者与受者之间HLA抗原均未错配的供者-受者配对。HLA匹配(即其中6个等位基因全部匹配)的供者/受者配对相对于错配配对(即其中6个等位基因中的至少一个错配)具有降低的移植物抗宿主疾病(GVHD)的风险。HLA单倍型相合是指下述匹配,其中一条染色体至少在HLA-A、HLA-B和HLA-DR处匹配,并且可在染色体上的次要组织相容性基因座处匹配;但不一定在第二条染色体上匹配。此类供者经常出现在家庭中,例如,父母与孩子是单倍型相合的;并且同胞可以是单倍型相合的。
如本文所用,术语“HLA错配的”是指其中在供者与受者之间至少一种HLA抗原(尤其是就于HLA-A、HLA-B和HLA-DR而论)是错配的供者-受者配对。在一些情况下,一个单倍型是匹配的而另一个是错配的。这种情形经常见于活供者或死亡供者的器官中。HLA错配的供者/受者配对相对于完全匹配配对(即其中6个等位基因全部匹配)具有增加的GVHD风险。
HLA等位基因通常以多种详细水平来标注。大多数名称以HLA-和基因座名称开始,然后是*以及指示等位基因的一些(偶数)数量的数字。前两个数字指示一组等位基因。较早的分型方法常常无法充分区分等位基因,因此停留在该水平。第三至第四位数字指示同义等位基因。第五至第六位数字指示基因编码框内的任何同义突变。第七和第八位数字区分编码区外部的突变。字母诸如L、N、Q或S可紧跟在等位基因名称之后,以指示关于所了解的该基因的表达水平或其它非基因组学数据。因此,充分描述的等位基因可以长达9位数字,不包括HLA-前缀和基因座符号。
如本文所用,“受者”是已为其转移来自另一个体(供者)(通常为相同物种)的器官、组织或细胞的个体。出于本公开的目的,受者和供者是HLA匹配的或HLA错配的。
如本文所用,“抗体”包括对与特定抗原有免疫反应性的免疫球蛋白分子的提及,并且包括多克隆抗体和单克隆抗体。该术语还包括基因工程改造的形式,诸如嵌合抗体(例如,人源化鼠类抗体)和异源偶联抗体。术语“抗体”还包括抗体的抗原结合形式,包括具有抗原结合能力的片段(例如,Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv和rIgG)。该术语还指重组单链Fv片段(scFv)。该术语抗体还包括二价或双特异性分子、双链抗体、三链抗体和四链抗体。
用于内源性干细胞消融和瞬时免疫抑制的抗体的选择可以基于多种标准(包括选择性、亲和力、细胞毒性等)来进行。当提及蛋白或肽时,短语与抗体“特异性(或选择性)结合”或“特异性(或选择性)免疫反应”,是指确定在异源蛋白群和其它生物制剂中存在所述蛋白的结合反应。因此,在指定的免疫测定条件下,指定抗体与特定蛋白序列的结合是本底的至少两倍,更通常是本底的10至100倍。一般而言,本发明的抗体在效应细胞(诸如自然杀伤细胞或巨噬细胞)的存在下结合靶细胞表面上的抗原。效应细胞上的Fc受体识别结合的抗体。Fc受体交联发信号给效应细胞通过细胞溶解或细胞凋亡杀伤靶细胞。在一个实施方案中,通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)来实现诱导。在替代实施方案中,抗体在靶细胞的生长抑制中具有活性,通过干扰生长因子信号传导实现消融,例如对生长因子受体诸如c-kit有特异性的抗体。
与特定抗原具有免疫反应性的抗体可以通过重组方法,例如在噬菌体或类似载体中选择重组抗体文库,或通过用抗原或用编码该抗原的DNA使动物免疫来产生。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。可替代地,抗体可以是单克隆抗体。可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中,通常用免疫剂对适当的宿主动物实施免疫以引发淋巴细胞产生或能够产生将会与免疫剂特异性结合的抗体。可替代地,淋巴细胞可以体外实施免疫。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)使淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞。
可以使用本领域中已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。类似地,可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如,其中内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠)中来制备人抗体。在攻击后,观察到人抗体产生,这在所有方面(包括基因重排、组装和抗体库)都与在人类中所见十分类似。
抗体也作为许多通过用各种肽酶消化产生的经充分表征的片段存在。因此胃蛋白酶在铰链区中的二硫键下方对抗体进行消化以产生F(ab)’2,即Fab的二聚体,所述二聚体本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)’2可在温和条件下被还原以使铰链区中的二硫键断裂,从而将F(ab)’2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体基本上是具有铰链区的一部分的Fab。虽然根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段,但是技术人员将认识到可以用化学方法或使用重组DNA方法从头合成此类片段。因此,如本文所用,术语抗体还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段,或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如,单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段。
“人源化抗体”是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白分子。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体),其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供者抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基置换。在一些情况下,人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基置换。人源化抗体还可包含既不存在于受者抗体中也不存在于导入的CDR或骨架序列中的残基。一般而言,人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部,其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区,并且所有或基本上所有的框架(FR)区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。人源化抗体还将最佳包含免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。
可以测试用于消融的目标抗体诱导ADCC(抗体依赖性细胞毒性)的能力。可以通过检测来自溶解细胞的标记或乳酸脱氢酶的释放,或检测降低的靶细胞活力(例如膜联蛋白测定)来监测和量化抗体相关的ADCC活性。细胞凋亡的测定可以通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的地高辛-11-dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定来进行(Lazebnik等,Nature:371,346(1994)。细胞毒性也可以通过本领域已知的检测试剂盒(诸如来自Roche Applied Science(Indianapolis,Ind.)的细胞毒性检测试剂盒)直接检测。优选地,本发明的抗体诱导靶细胞的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或80%的细胞毒性。
在一些实施方案中,抗体与效应物部分偶联。效应物部分可以是任何数量的分子,包括标记部分,诸如放射性标记或荧光标记,或者可以是细胞毒性部分。细胞毒性剂是多种多样的,包括但不限于细胞毒性药物或毒素或此类毒素的活性片段。合适的毒素及其相应的片段包括白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)、皂草素(saporin)、奥瑞他汀-E(auristatin-E)等。细胞毒性剂还包括通过使放射性同位素与抗体偶联而制备的放射化学物质。将细胞毒性部分靶向跨膜蛋白用于增加靶向区域中细胞毒性部分的局部浓度。
术语干细胞在本文中用于指具有自我更新和产生分化后代的能力的哺乳动物细胞(参见Morrison等(1997)Cell 88:287-298)。通常,干细胞还具有以下一种或多种性质:进行异步或对称复制的能力,即分裂后的两个子细胞可具有不同表型的情况;广泛的自我更新能力;以有丝分裂静止形式存在的能力;以及干细胞所存在的所有组织的克隆再生,例如造血干细胞重建所有造血谱系的能力。
为了植入的目的,将包含造血干细胞的组合物施用给患者。此类方法是本领域公知的。干细胞任选(但不一定)是纯化的。大量报告探索了各种纯化干细胞和随后植入的方法,包括流式细胞术;isolex系统(Klein等(2001)Bone Marrow Transplant.28(11):1023-9;Prince等(2002)Cytotherapy 4(2):137-45);免疫磁性分离(Prince等(2002)Cytotherapy 4(2):147-55;Handgretinger等(2002)Bone Marrow Transplant.29(9):731-6;Chou等(2005)Breast Cancer.12(3):178-88);等等。这些参考文献中的每一篇均特定地以引用方式并入本文,尤其是关于用于造血干细胞移植的程序、细胞组合物和剂量。
造血干细胞可以通过从骨髓或从外周血中收获而获得。通常是在供者处于局部麻醉或全身麻醉下从后髂嵴抽吸骨髓。可以从前髂嵴获得另外的骨髓。通常认为每千克1X108和2X 108个骨髓单核细胞的剂量分别是在自体和同种异体骨髓移植中建立植入所需的。可以用粒细胞集落刺激因子(G-CSF;非格司亭(filgrastim)[Neupogen])引发骨髓以增加干细胞计数。出于本文描述的目的提及的“全骨髓”通常是指源自骨髓的尚未针对特定免疫细胞子集进行选择的单核细胞的组合物。“分级骨髓”可以例如耗尽T细胞,例如CD8+细胞、CD52+细胞、CD3+细胞等;富含CD34+细胞等。
还从脐血获得造血干细胞。脐血是用于同种异体造血干细胞移植的几乎无限的造血干细胞来源。已建立脐血库(CBB)用于有亲缘或无亲缘关系的UCBT,超过400,000个单位可用并且在儿童和成人中进行了超过20,000次脐带血移植。UCB造血祖细胞富含能够在体内产生长期再生干细胞的原始干细胞/祖细胞。然而,与其它来源相比,可从任何单一供者获得的细胞数量相对较少。
诸如G-CSF或GM-CSF等细胞因子将干细胞从骨髓动员到外周血中已导致广泛采用通过单采术收集外周血祖细胞进行造血干细胞移植。用于动员的G-CSF剂量为10μg/kg/天。然而,在经过大量预处理的自体供者中,可以给予高达40μg/kg/天的剂量。Mozobil可以与G-CSF结合使用,以将造血干细胞动员到外周血中以便收集。
施用的干细胞剂量可取决于输注的细胞组合物的所需纯度和细胞来源。目前的指导原则表明,对于自体和同种异体移植而言植入所需的最小剂量为1-2x 106个CD34+细胞/kg体重。较高剂量可包括例如3x106个、4x106个、5x106个、6x106个、7x106个、8x106个、9x106个、107个或更多。经常,剂量受可用细胞的数量限制。通常,不管来源如何,剂量都是通过存在的CD34+细胞的数量来计算。CD34+细胞的百分数对于未分级的骨髓或动员的外周血而言可以较低
CD34+细胞可以通过亲和方法从供者造血细胞样品中选择,所述亲和方法包括但不限于磁珠选择、流式细胞术等。HSPC组合物可为至少约50%纯度,正如由群体中为CD34+的细胞百分比定义的那样,可为至少约75%纯度,至少约85%纯度,至少约95%纯度或更高。用HSPC组合物递送的CD3+细胞的最大数量优选不超过约106个CD3+细胞/kg受者体重,不超过约105个CD3+细胞/kg受者体重,不超过约104个CD3+细胞/kg受者体重。可替代地,可以串联选择细胞群用于表达CD34和CD90,所述细胞群可以是高度纯化的,例如至少约85%是CD34+CD90+细胞,至少约90%是CD34+CD90+细胞,至少约95%是CD34+CD90+细胞并且可高达约99%是CD34+CD90+细胞或更多。可替代地,使用未经处理的骨髓或动员的外周血群体。
造血干细胞也可以在体外产生,例如由万能胚胎干细胞、诱导性万能细胞等产生。例如,参见Sugimura等(2017)Nature 545:432-438,其特定地以引用方式并入本文,其详述了用于产生造血祖细胞的方案。
采用的细胞可以是新鲜的、冷冻的,或已经过前期培养。所述细胞可以是胎儿的、新生儿的、成人的等等。造血干细胞可以从胎儿肝脏、骨髓、血液(尤其是G-CSF或GM-CSF动员的外周血)或任何其它常规来源获得。使用于植入的细胞任选地与其它细胞分离,其中将干细胞与造血谱系或其它谱系的其它细胞分离的方式对于本发明并不关键。如果需要,通过选择性分离不含与分化细胞相关的标志物,而展示出与干细胞相关的表位特征的细胞,可以获得基本上同源的干细胞或祖细胞群。
可以对细胞进行遗传改变以便引入对分化细胞有用,例如对单个、可选择标志物等中遗传缺陷的修复有用的基因,或者在针对未分化ES细胞的选择中有用的基因。还可以对细胞进行遗传修饰以增强存活,控制增殖等。可以通过用合适的载体转染或转导、同源重组或其它适当的技术对细胞进行遗传改变,使所述细胞表达目标基因。在一个实施方案中,通常在异源启动子下用编码端粒酶催化组分(TERT)的基因转染细胞,所述异源启动子使端粒酶表达增加超过在内源启动子下发生的端粒酶表达(参见国际专利申请WO 98/14592)。在其它实施方案中,引入可选择标志物,以提供更高纯度的所需分化细胞。可以在8-16小时内使用含载体的上清液对细胞进行遗传改变,然后将其交换到生长培养基中保持1-2天。使用药物选择剂诸如嘌呤霉素(puromycin)、G418或杀稻瘟菌素(blasticidin)选择经遗传改变的细胞,然后再培养。
还可以对本发明的细胞进行遗传改变以增强其参与组织再生或向施用位点递送治疗基因的能力。使用所需基因的已知编码序列设计载体,所述已知编码序列与组成型、泛特异性的,在分化细胞类型中具有特异性活性等的启动子可操作地连接。合适的诱导型启动子在所需的靶细胞类型(转染的细胞或其后代)中激活。通过转录激活,预期转录将增加超过靶细胞中的基础水平至少约100倍,更通常至少约1000倍。已知在不同细胞类型中诱导的各种启动子。
许多载体均可用于将外源基因转移到哺乳动物靶细胞中。载体可为附加型,例如质粒,病毒来源的载体诸如巨细胞病毒、腺病毒等,或者可以通过同源重组或随机整合而整合到靶细胞基因组中,例如逆转录病毒来源的载体诸如MMLV、HIV-1、ALV等。对于干细胞的修饰,优选慢病毒载体。慢病毒载体诸如基于HIV或FIV gag序列的载体可用于转染非分裂细胞,诸如静止期的人干细胞。逆转录病毒和适当的包装细胞系的组合也可以使用,其中衣壳蛋白将具有感染靶细胞的功能。通常,将细胞和病毒在培养基中孵育至少约24小时。然后在一些应用中使细胞在培养基中生长短暂间隔期,例如24-73小时,或至少两周,并且在分析之前可以使其生长五周或更长时间。常用的逆转录病毒载体是“有缺陷的”,即不能产生生产性感染所需的病毒蛋白。载体的复制需要在包装细胞系中生长。载体可以包括之后必须去除的基因,例如使用重组酶系统诸如Cre/Lox,或例如通过包括允许选择性毒性的基因诸如疱疹病毒TK、bcl-xs等破坏表达它们的细胞。
除非另有说明,否则如本文所用的嵌合率通常是指造血系统的嵌合率。通过分析来自移植物受者的造血细胞样品,例如本领域已知的外周血、骨髓等,确定个体是完全嵌合体、混合嵌合体还是非嵌合体。可以通过任何方便的分型方法进行分析。在一些实施方案中,使用以用于微卫星分析的探针进行的PCR,定期监测所有单核细胞、T细胞、B细胞、CD56+NK细胞和CD15+嗜中性粒细胞中的嵌合程度。例如,可以利用区分供者和宿主来源的短末端重复长度的多态性的商业试剂盒。自动化读取器基于来自人工供者和宿主细胞混合物的标准曲线提供供者型细胞的百分比。
在移植后的任何时间通过此类分析在给定血细胞谱系中展示出超过95%供者细胞的个体被称为在该移植患者群组中具有完全供者嵌合状态。在此类分析中混合嵌合状态被定义为有大于1%的供者但小于95%的供者DNA。表现出混合嵌合状态的个体可以根据嵌合状态的演化进一步分类,其中提高混合嵌合率被定义为供者细胞的比例在至少6个月期间连续增加。稳定的混合嵌合率被定义为受者细胞的百分比随时间波动,而不会完全失去供者细胞。
用于本发明目的的“患者”包括人和其它动物,尤其是哺乳动物,包括宠物和实验动物,例如小鼠、大鼠、兔等。因此,所述方法适用于人类疗法和兽医应用。在一个实施方案中,患者是哺乳动物,优选灵长类动物。在其它实施方案中,患者为人。
其它术语。术语“治疗(treatment/treating/treat)”在本文中通常用于指获得所需的药理学和/或生理学效应。该效应就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的,和/或就部分或完全稳定或治愈疾病和/或可归因于该疾病的不利影响而言可以是治疗性的。术语“治疗(treatment)”涵盖在哺乳动物、尤其是人中的疾病的任何治疗,并且包括:(a)预防疾病和/或症状在可能易患该疾病或症状但尚未被诊断为患上该疾病的受试者中出现;(b)抑制疾病和/或症状,即阻止其发展;或(c)减轻疾病症状,即引起疾病和/或症状的消退。需要治疗的患者包括那些已经患病的患者(例如,患有癌症的那些患者,已感染的那些患者等)以及需要预防的那些患者(例如,对癌症的易感性增加的那些患者,感染可能性增加的那些患者,怀疑患有癌症的那些患者,怀疑携带感染的那些患者等)。
植入方法
本发明的方法提供了干细胞在移植入受者后的改良植入。该受者可以是有免疫能力的,并且该移植可以在不存在清髓性预处理的情况下进行,即在不存在放射和/或化学治疗药物的情况下进行。联合施用一组根据细胞和HLA匹配选择的剂对受者进行预处理。在表1中列出了剂的选择,这为优化的预处理方案提供了指导。“+”表示对于指定的剂、HLA匹配和细胞来源,应包括该剂;“-”表示不需要该剂,但可以任选地被包括。如上文所公开的,某些剂可以消耗T细胞和NK细胞两者,因此两者仅需单一剂。不同剂的时限和剂量如上所示。本发明的预处理方案选择性消融内源性干细胞,并提供对内源性免疫反应的合适、选定抑制,所述预处理方案即使是在非匹配的受者中也允许植入。
在预处理方案之后,在瞬时免疫抑制期间向受者施用有效剂量的包含外源性干细胞的细胞组合物。干细胞可以是自体的、同种异体的或异种的,包括但不限于同种异体单倍型相合干细胞、错配的同种异体干细胞、基因工程改造后的自体细胞等。
输注HSPC是在床边进行的相对简单的过程。骨髓产品通常新鲜使用,并在数小时内通过中央静脉输注。自体产品经常冷冻保存;如果是这样的话,会在床边将其解冻并在几分钟内迅速输注。PBMC可以短暂存储过夜或冷冻。
当供者与受者为同种异体时,可以测试供者和受者的HLA类型是否匹配,或使用单倍型相合细胞。可以通过CD34或CD34CD90选择来操纵HLA-单倍型相合的供者。而且,HLA-单倍型相合的供者现广泛地(并且可超过HLA相合型)用于其它适应症。对于HLA匹配,传统上,匹配的关键基因座是HLA-A、HLA-B和HLA-DR。现在在确定供者的适合程度时还考虑了HLA-C和HLA-DQ。完全匹配的同胞供者通常被认为是理想供者。对于无亲缘关系的供者,认为完全匹配或单一错配对于大多数移植是可接受的,但在某些情况下,耐受更大的错配。优选地,匹配是血清学和分子的。在供者是脐血的情况下,可耐受的HLA差异程度大得多,并且6种HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1抗原中有3-4种匹配足以进行移植。可以使用多种方法去除有免疫能力的供者T细胞,以减小或消除移植物抗宿主病(GVHD)发展的可能性。
在一些实施方案中,通过确定受者循环中是否存在宿主来源的骨髓细胞(例如CD15+细胞)来监测该程序的成功。由于骨髓细胞的短寿命性质,血液骨髓嵌合率是真正HSC植入的指标。在HCT后约8周后,本文描述的方法提供了例如至少约1%的供者型CD15+细胞,至少约2%的供者型CD15+细胞,至少约4%的供者型CD15+细胞,至少约8%的供者型CD15+细胞或更多的可测量和持续水平的血液骨髓嵌合率。
可以在不存在清髓性放射或化疗的情况下提供的预处理剂根据以上讨论的具体要求施用。施用一些剂以在HSPC施用后具有活性,而其它剂需要洗脱期。
瞬时免疫抑制剂以使活化T细胞活性降低至少10倍、至少100倍、至少1000倍、至少100,000倍或更多倍的剂量提供。有效剂量将取决于个体和特定剂,但是当所述剂为抗体时,剂量可为至少约50μg/kg体重,至少约250μg/kg,至少约500μg/kg,至少约750μg/kg,至少约1mg/kg,且至多约2.5mg/kg,至多约5mg/kg,至多约7.5mg/kg,至多约10mg/kg,至多约15mg/kg,至多约25mg/kg,至多约50mg/kg,至多约100mg/kg。
将预处理剂配制成药物组合物。确切的剂量将取决于治疗的目的,并且将由本领域技术人员使用已知技术确定(例如,Ansel等,Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery;Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992年),Dekker,ISBN0824770846,082476918X,0824712692,0824716981;Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999);和Pickar,Dosage Calculations(1999))。如本领域已知的,针对患者状况、全身与局部递送以及年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病状的严重程度进行的调整可能是必要的,并且将可以由本领域技术人员通过常规实验确定。
如上文所讨论的,可以以多种方式进行药剂的施用,包括但不限于经口、皮下、静脉内、鼻内、经皮、腹膜内、肌肉内或眼内。可以通过静脉内注射递送抗体。
在一个实施方案中,所述药物组合物呈水溶性形式,诸如以药学上可接受的盐形式存在,所述药学上可接受的盐意在包括酸加成盐与碱加成盐。“药学上可接受的酸加成盐”是指与诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸以及诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等有机酸形成的保留游离碱的生物有效性并且在生物学或其它方面并非不合需要的那些盐。“药学上可接受的碱加成盐”包括衍生自无机碱的那些碱加成盐,诸如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。特别有用的是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐以及镁盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括以下的盐:伯胺、仲胺以及叔胺;经取代胺,包括天然存在的经取代胺;环胺;以及碱性离子交换树脂,诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺以及乙醇胺。
所述药物组合物还可包括下列中的一种或多种:载体蛋白,诸如血清白蛋白;缓冲剂;填充剂,诸如微晶纤维素、乳糖、玉米淀粉和其它淀粉;粘合剂;甜味剂和其它调味剂;着色剂;和聚乙二醇。
所述药物组合物可根据施用方法以多种单位剂型施用。例如,适于经口施用的单位剂型包括但不限于粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂和菱形片剂。应当认识到,本发明的组合物在口服施用时应防止被消化。这通常通过使分子与组合物复合以使其对酸和酶水解具有抗性,或通过将分子包装在适当的抗性载体(诸如脂质体或保护屏障)中来实现。保护药剂免受消化的方式是本领域熟知的。
供施用的组合物通常将包含溶解在药学上可接受的载体(优选水性载体)中的抗体或其它剂。可以使用各种水性载体,例如,缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不合需要的物质。这些组合物可以通过常规的熟知灭菌技术灭菌。所述组合物可以含有接近生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质,诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等,例如,乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可以变化很大,并将主要基于流体体积、粘度、体重等,根据所选特定施用模式和患者的需要来选择(例如,Remington’s Pharmaceutical Science(第15版,1980年)及Goodman和Gillman,ThePharmacological Basis of Therapeutics(Hardman等编辑,1996年))。
对于治疗性治疗,可以施用含有消融剂(例如抗体、可溶性SIRPα等)的组合物。如上所述,组合物以足以基本上消融靶向内源性干细胞的量向患者施用。将足以实现此目的的量定义为“治疗有效剂量”。可以根据患者所需和耐受的剂量和频率进行组合物的单次或多次施用。治疗所需的特定剂量将取决于哺乳动物的医疗状况和病史,以及其它因素,诸如年龄、体重、性别、施用途径、效率等。
在本发明的方法中,所述药剂在移植前作为短程疗法施用。通常,该治疗在移植前至少约一周、在移植前至少约5天、在移植前至少约3天完成。如有必要,可以重复该过程,例如可以根据清除微环境的需要重复两次、三次、四次、五次或更多次。
治疗条件
干细胞移植的适应症根据疾病类别而有所不同,并且受以下因素影响,诸如细胞遗传学异常、对先前疗法的反应、患者年龄和行为状态、疾病状态(缓解与复发)、疾病特异性预后因素、合适移植物来源的可用性、转诊时间和移植时间。
自体HSCT目前用于治疗以下疾病:多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkinlymphoma)、霍奇金病(Hodgkin disease)、急性髓性白血病、神经母细胞瘤、生殖细胞肿瘤、自身免疫性病症-全身性红斑狼疮(SLE)、全身性硬皮病、淀粉样变性病。
同种异体HSCT目前用于治疗以下病症:急性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病;慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性病症、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、再生障碍性贫血、纯红细胞再生障碍、阵发性睡眠性血红蛋白尿、范科尼贫血(Fanconi anemia)、重型地中海贫血、镰状细胞性贫血、重症联合免疫缺陷(SCID)、威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、先天性代谢缺陷(例如,粘多糖贮积病、戈谢病(Gaucherdisease)、异染性脑白质营养不良和肾上腺脑白质营养不良)、大疱性表皮松解、重症先天性中性粒细胞减少症、舒-戴二氏综合征(Shwachman-Diamond syndrome)、戴-布二氏贫血(Diamond-Blackfan anemia)、白细胞粘附缺陷症等。
本发明的实施方案包括移植到患有遗传性血液病症的患者体内,其中将正常表型的外源性干细胞移植到患者体内。此类疾病包括但不限于治疗由缺陷性血红蛋白合成(血红蛋白病)引起的贫血。干细胞可以是正常表型的同种异体干细胞,或者可以是已经基因工程改造以删除不合需要的遗传序列,和/或引入矫正遗传缺陷的遗传序列的自体细胞。
镰状细胞疾病包括HbS疾病;镰形细胞贫血;新月形红细胞症。慢性溶血性贫血几乎只发生在黑人中,其特征在于由Hb S纯合遗传产生的镰状RBC。纯合体有镰状细胞贫血;杂合体不贫血,但可以在体外展示出镰状化性状(镰状细胞性贫血)。在Hb S中,缬氨酸取代β链第六个氨基酸中的谷氨酸。脱氧-Hb S的溶解性远低于脱氧-Hb A;它形成棒状类晶团聚体的半固体凝胶,从而导致RBC在低PO2的部位镰状化。变形、非柔性的RBC粘附于血管内皮并堵塞小动脉和毛细血管,从而导致闭塞和梗塞。因为镰状RBC太脆弱而不能承受循环的机械创伤,所以在它们进入循环后发生溶血。在纯合体中,临床表现是由导致组织缺血和梗塞的贫血和血管闭塞事件引起的。生长和发育受损,对感染的易感性增加。贫血通常很严重,但在患者之间高度不同。在儿童中因脾脏中的镰状细胞的急性隔离,可加剧贫血。
地中海贫血是一类慢性、遗传性、小红细胞性贫血,其特征在于缺陷性Hb合成和无效性红细胞生成,在地中海、非洲和东南亚血统的人群中尤为常见。地中海贫血是最常见的遗传性溶血性病症之一。它由至少一条球蛋白多肽链(β、α、γ、δ)的产生减少导致的Hb合成不平衡引起。
再生障碍性贫血由RBC前体损失引起,这种损失是由干细胞库中的缺陷或支持骨髓的微环境损伤引起的,并且常常具有临界高MCV值。术语再生障碍性贫血通常暗示骨髓全面发育不全(panhypoplasia),伴有白细胞减少和血小板减少。
联合免疫缺陷是一类特征在于B细胞和T细胞系统先天性缺陷且通常为遗传性缺陷,淋巴组织发育不全和胸腺发育不全的病症。联合免疫缺陷包括重症联合免疫缺陷、瑞士无丙种球蛋白血症、伴腺苷脱氨酶或核苷磷酸化酶缺乏的联合免疫缺陷,以及伴免疫球蛋白的联合免疫缺陷(尼兹诺夫综合征(Nezelof syndrome))。大多数患者早期出现鹅口疮、肺炎和腹泻感染。如果不治疗,大多数会在2岁前死亡。大多数患者B细胞和免疫球蛋白严重缺乏。特征如下:淋巴细胞减少、T细胞水平低或不存在、对有丝分裂原的增殖反应差、皮肤无变应性、不存在胸腺阴影和淋巴组织减少。肺孢子虫肺炎和其它机会性感染很常见。
实验
实施例1
用于单倍型相合造血干细胞移植的非基因毒性预处理方案
材料和方法
小鼠。所有供者和受者小鼠均在8至12周龄之间。供者小鼠是Shizuru实验室培育的AKR x Hz F1小鼠。AKR x Hz F1小鼠对于45.1和45.2以及H2Kb和H2Kk为双阳性。受者小鼠是来自JAX的CB6F1。CB6F1小鼠对于45.2为单阳性,并且对于H2Kb和H2Kd为双阳性。所有程序均经国际动物护理和使用委员会批准。小鼠品系保持在斯坦福大学的研究动物机构(Stanford University’s Research Animal Facility)。
抗体。用于体内预处理的所有抗体均购自Bio X Cell,包括抗CD47(克隆3/克隆mIAP410)、抗CD117(克隆ACK2)、抗CD40L(克隆MR-1)和抗CD122(克隆TM-b1)。
骨髓移植。在第-8天,向受者CB6F1小鼠腹膜内给予100ug初免剂量的抗CD47。在第-6天,给予小鼠500ug抗CD117的眶后注射。在抗CD117处理之前,给予小鼠Benadryl的腹膜内注射。在第-6天至第-2天,还每天给予小鼠500ug抗CD47的腹膜内注射。在第-2天,给予小鼠高达250ug的抗CD122。在第0天,在移植前几小时给予500ug抗CD40L。
为进行移植,从8-12周龄的AKR x Hz小鼠收获全骨髓。全骨髓取自胫骨、股骨、髋部和脊柱。溶解红细胞并对剩余细胞进行计数并且适当地重新悬浮,之后进行注射。利用眶后注射递送细胞。
嵌合率检查。定期通过眶后穿刺对受者小鼠进行放血以测量供者嵌合率。用针对CD45.1、CD45.2、CD3、CD19、CD11b和Gr-1的荧光抗体对血液进行染色。
结果
如图1A-1F所示,对c-kit、CD47、CD40L和CD122有特异性的抗体与上述方案的组合能够使单倍型相合全骨髓有效植入有免疫能力的动物中。图2中示出了每个组群中嵌合小鼠的百分比以及总供者、T细胞、B细胞和粒细胞嵌合率的平均水平。在低细胞剂量下,如图3所示,需要用抗CD122消耗NK细胞。
实施例2
抗体预处理可实现MHC错配的造血干细胞移植和器官移植物耐受性
通过造血细胞移植(HCT)替换患者的患病血液系统可以治疗或治愈血液和免疫系统的遗传性病症,包括白血病、自身免疫性疾病和免疫缺陷。在HCT中,通常使用毒性“预处理方案”(化疗和/或放射)消融患者的血液和免疫系统,然后用含有造血干细胞(HSC)的供者细胞替换以再生健康的血液系统。虽然HCT是一种基础治疗,但它的使用和安全性受到移植物抗宿主病(其可以通过移植无污染性供者T细胞的纯化HSC而克服)和由预处理方案引起的致死性毒性的阻碍。因此,一个决定性的目标是用更具特异性、更安全的剂(例如,单克隆抗体)来实现HCT预处理,从而避免对毒性化疗或放射的需要。
在这里,我们证实六种单克隆抗体的组合可以安全且特异性地消耗有免疫能力的小鼠的宿主HSC、T细胞和NK细胞,并容许外源(同种异体)HSC植入。植入的供者HSC在一半(单倍型相合)或全部MHC基因中错配,并且在两种情况下都产生了与宿主血细胞稳定共存的供者血液和免疫系统。这些嵌合免疫系统具有功能性,表现为对HSC供者品系心脏组织的耐受性和对第三方心脏的排斥。这些研究证明了抗体预处理,可以作为再生医学的平台应用于纯化的人HSC移植,从而有利于包括外源器官移植和各种血液和免疫系统病症的治疗在内的应用。
通过造血细胞移植(HCT)可以治疗许多遗传性血液和免疫系统病症:实例包括地中海贫血、镰状细胞贫血、范科尼贫血、遗传性免疫缺陷、自身免疫性疾病(例如,多发性硬化)和代谢性蓄积病症。当用健康的移植血细胞替换个体的血液系统时,这些疾病可以得到矫正,所述移植血细胞稳定地源自HCT移植物中移植的罕见造血干细胞(HSC)。在供者来源的血液和免疫系统再生后,HCT受者对来自HSC供者的器官移植物具有免疫耐受性。虽然血液系统的任何单基因或多基因遗传性病症都可以通过同种异体HCT治愈,但非恶性血液或免疫病症的治疗仅占2015年欧洲报道的总HCT病例的6%。
为了克服HCT在治疗非恶性血液病症方面异常不频繁使用的情况并扩大所述HCT的影响范围,必须解决两个关键性挑战:安全性问题和供者可用性。目前,同种异体HCT导致由供者来源的污染性T细胞引起的临床或亚临床移植物抗宿主病(GvHD);但是通过移植无T细胞的纯化HSC可以克服GvHD。而且,HCT预处理需要化疗和放射,这可能诱导危及生命的副作用。
HCT用于遗传性血液病症所面临的另一个挑战是目前需要在人白细胞抗原(HLA,也称为主要组织相容性复合物[MHC])基因座处完全匹配的供者;虽然目前有75%的美国白人有匹配的供者,但为美国黑人(目前16-19%有匹配)或其它代表人数不足的族群找到完全匹配的供者显然更加困难。如果可以使用单倍型相合供者(其在一半的HLA基因座处匹配)安全地进行HCT,这就会显著扩大供者的可用性,从理论上使任何个体都能够从其父母、孩子或75%同胞接受HCT。最后,如果可以安全地移植完全HLA错配的HSC,这就会大规模开放可用供者库;具有额外益处,即受者将会对获自相同供者的外源器官或组织具有免疫耐受性。这样将会使HLA错配器官移植成为可能,而不需要预防对重要器官移植的排斥通常所需的终身免疫抑制。
如果用更具特异性的剂(诸如消耗免疫系统组分的单克隆抗体)替换毒性预处理方案(化疗和/或放射),HCT的安全性将大大提高。虽然先前的抗体预处理方案使得能够移植次要组织相容性抗原错配的HSC(参见,例如,专利公开WO 2016/033201),但先前尚未显示使用基于抗体的预处理来移植MHC错配的HSC。
在这里,我们证明使用六种单克隆抗体进行预处理使得野生型小鼠能够接受部分(单倍型相合)或完全MHC错配的HSC,因此使得能够替换血液系统并诱导对错配供者器官的耐受性而无需依赖于化疗或放射。
对于单倍型相合移植实验,将AKR x C57BL/6F1(以下称为AB6F1)小鼠用作骨髓或HSC供者且BALB/C X C57BL/6F1(CB6F1)(图4a)小鼠用作受者;这些小鼠品系仅在H2b单倍型处匹配,但对于H2k和H2d(即,在一半的主要组织相容性复合物[MHC]单倍型处)错配(图4b)。我们尝试确定是否可以用单克隆抗体(mAb)替换常规预处理。我们先前已经证明了免疫缺陷型小鼠可以使用抗Kit抗体进行预处理以实现同基因HSC植入,而有免疫能力的小鼠的同等预处理需要双重施用抗Kit和抗CD47阻断剂。CD47阻滞使巨噬细胞能够吞噬抗体结合(调理的)细胞,诸如受c-KIT抗体调理的KIT+HSC。
为了植入在MHC基因座处错配的同种异体HSC,可能需要抑制或消除T细胞和NK细胞两者,这些细胞排斥表达外源主要和次要组织相容性抗原的细胞或缺乏“自身”MHC的细胞。为了消除宿主NK细胞,我们使用抗CD122 mAb Tm-β1靶向CD122/Il2Rβ(其在人和小鼠NK细胞发育的整个过程中表达)以消耗这些细胞。为了防止T细胞介导的排斥,我们靶向CD40L(也称为CD154),所述CD40L是由活化的T细胞表达的共刺激细胞表面分子并且是所述活化的T细胞在CD40+抗原呈递细胞存在的情况下进行信号传导所必需的。CD40-CD40L轴的中断可以帮助诱导对造血细胞和皮肤移植物的耐受性,并且重要的是,因为在活化的T细胞上CD40L上调,所以不会消耗所有T细胞;我们使用抗CD40L抗体MR1来抑制CD40L。
在8天的过程中(图4c)用四种单克隆抗体(抗CD122、抗CD40L、抗Kit和抗CD47;在本文称为4Ab预处理)治疗小鼠,然后移植3000万个全骨髓(WBM)细胞。通过CD45等位基因差异定期测量嵌合率(图8a),并且在接受4Ab预处理的所有动物中均观察到多谱系混合嵌合状态(图8b-d)。重要的是,在长期HSC(LT-HSC)区室中也观察到混合嵌合状态(图4d),表明供者嵌合状态不是由植入长寿命成熟免疫细胞引起的,而是由供者干细胞积极维持的。
为了鉴定该混合物最低限度必需的组分,我们单独测试了每种抗体(图9),然后测试了四种抗体的各种组合。植入3000万个WBM细胞最低限度必需的混合物是抗CD47、抗c-KIT和抗CD40L(图4e-g)。然而,缺乏抗CD122的群组中仅有75%的小鼠是嵌合的。在接受完全4Ab预处理的群组中,100%的小鼠是嵌合的。有趣的是,来自两个群组的植入动物在20周内显示出相似水平的多谱系嵌合率。另外,4Ab预处理在移植前并未诱导粒细胞减少(图4h)。
我们通过调整WBM的剂量同时调节抗CD122的使用来测试可以植入的WBM的最低剂量。随着骨髓移植量的减少,嵌合小鼠的数量减少(图4i)。在300万个WBM细胞的情况下,20%的小鼠是嵌合的,没有抗CD122,而在具有NK消耗的该细胞剂量群组中80%的小鼠是嵌合的。
为了消除GvHD的可能性,接下来我们移植了富集的HSC群体(与WBM完全不同)。在这些实验中,移植了谱系-Sca1+Kit+(LSK)细胞(图5a),其高度富集HSC和多能祖(MPP)细胞。富含Kit的细胞和LSK细胞以对应于其在3000万个WBM细胞中的丰度的量给予(图5b)。在受辐照的对照中,所有三种类型的移植物均显示出完全、长期的多谱系嵌合状态。明显地,虽然经4Ab预处理的小鼠长期成功植入了WBM,但它们不是通过富含Kit的移植物或LSK移植物重建的(图5b)。因此,这表明富集的HSC群体可能需要附加预处理抗体才能成功植入。
为了促进LSK植入,我们尝试通过使用抗CD4和抗CD8消耗性抗体消除T细胞来提供附加免疫抑制(图5c)。向4Ab方案中添加抗CD4和抗CD8抗体强有力地消耗了来自外周血、脾脏和骨髓的T细胞(图5d和图10)。使用这六种抗体的混合物(将被称为6Ab预处理(抗CD122、抗CD40L、抗Kit、抗CD47、抗CD4和抗CD8 mAb))在移植了9000 LSK细胞的受者中诱导长期嵌合状态(图5e)。该细胞剂量对应大约360,000个LSK/kg,远低于在小鼠同种异体移植物的临床前试验和人类自体移植物中的临床使用中所见的HSC剂量。总之,6Ab预处理使得低剂量的细胞(例如纯化的HSC)能够在不依赖化疗或放射的情况下植入小鼠中。
为了确定这种混合物的六种组分是否全部有必要,我们使用还原方法来鉴定不必要的抗体。与完整6Ab预处理组群相比,去除抗CD40L、抗CD4和抗CD8在每个组群内产生更少的嵌合动物和更低的嵌合率(图5f和图11)。然而,与对照组群相比,去除抗CD122抗体未显著改变嵌合动物的百分比。与4Ab预处理方案不同,在6Ab预处理中由于NK对T细胞活化的依赖性,CD122可能不太必要,所述T细胞活化在6Ab预处理方案中丧失,因为T细胞几乎完全消耗。
重要的是,6Ab预处理后进行HSC移植诱导出了中枢介导的对供者遗传品系的免疫耐受性。中枢耐受性暗指对宿主免疫系统的胸腺再驯育(thymic re-education)以容许供者细胞植入。为了测量这些动物的中枢耐受性,我们测量了外周血中Vβ6(Vb6)TCR链的存在。Vb6对AKR品系中存在的编码Mtv-7原病毒的超级抗原具有反应性。因此,为了使AB6F1HSC共存于CB6F1中,必需以克隆方式使CB6F1内源性Vb6+ T细胞缺失。在移植了WBM和LSK的动物中,嵌合动物显示宿主Vb6+ T细胞缺失(图6a-b)。有趣的是,在用抗Kit、抗CD47和抗CD40L预处理的WBM组群中,唯一具有正常Vb6+ T细胞频率的动物也从未实现嵌合(图6b)。
明显地,我们发现经6Ab预处理的植入MHC错配的供者HSC的小鼠对来自相同供者品系的器官具有免疫耐受性。为此,我们将来自HSC供者(AB6F1)或第三方(DBA/1J品系,其就H2q而言是纯合的)新生幼犬的心脏移植物移植到未经实验的和经LSK-Ab预处理的嵌合动物的耳廓中(图6c)。在未经实验、未预处理、未移植的小鼠中,AB6F1和DBA1/J心脏均被迅速排斥(图6d)。在经6Ab预处理的嵌合小鼠中,DBA1/J心脏在14天内被排斥但具有活性,搏动的AB6F1心脏持续至少115天。在第34天收获代表性的耳-心移植物并通过免疫组织化学进行分析。经过肉眼检查,在耳廓中可见AB6F1心脏,而DBA/1J心脏不再明显(图6e)。H&E分析显示,缺乏免疫细胞的肌钙蛋白+心脏组织在移植了AB6F1的耳廓中浸润;然而,此时在含有DBA/1J心脏的耳廓内没有心脏或肌钙蛋白+组织(图6e)。因此,这表明MHC错配的供者HSC可以诱导经6Ab预处理的小鼠对来自相同遗传供者的心脏移植物的免疫耐受性。
最后,我们证明6Ab预处理方案使得能够成功植入完全MHC错配的HSC。我们使用DBA1/J(H2q)小鼠作为供者和CB6F1(H2b/d)作为宿主(图7a)。在移植9000个DBA1/J LSK细胞后,到第8周时我们在所有经6Ab预处理的CB6F1小鼠中均观察到高的供者-宿主嵌合率(图7b)。仅移植300万个WBM细胞的小鼠未能建立供者嵌合状态(证实了预处理的必要性),而40%经4Ab预处理的接受WBM的小鼠实现了低水平的嵌合。到移植后第9周,80%经辐照的移植了WBM的CB6F1小鼠死亡(图7c),这可能是GvHD所致,这在LSK移植中未观察到。
总之,这里我们开发了一种将一半(单倍型相合)和完全MHC错配的造血细胞组合物(包括纯化的HSC)移植到有免疫能力的动物中的方法;重要的是,这是在不使用化疗和/或放射的情况下完成的,并且没有发生在大多数(即便不是全部)其它类型的HCT移植中发生的GvHD。
这些结果与造血细胞移植的临床使用(例如用于治疗血液和免疫系统病症)相关。首先,与纯化的HSC移植组合的这种抗体预处理方案通过避免使用化疗/放射并且通过消除GvHD来提高血液和免疫系统替换的安全性。其次,通过促进单倍型相合、HLA错配的HSC的移植,这显著增加了供者库,使得大多数受者即便是他们的年龄或临床状态在先前的方案下已妨碍了HCT也能够找到匹配。例如,范科尼贫血患者对DNA损伤高度敏感,因此,常规的移植预处理方案对该组群造成严重风险。
最后,诱导对外源器官的免疫耐受性的能力为所有需要救命器官移植的患者开启了机会:具体地说,它避免了患者接受外源器官移植对终身免疫抑制的需要。具体而言,经抗体预处理的、移植供者HSC的动物的免疫系统对供者(但不是第三方)心脏具有耐受性。这些部分嵌合的动物中供者和宿主T细胞的共存可以为供者和宿主组织提供MHC限制性T细胞。
现今,器官、组织或HSC移植物的供者是活着的或刚刚去世的人。再生医学的目标是使万能(胚胎或诱导的万能)干细胞系在体外或在大型动物宿主(诸如猪)体内分化为HSC和其它所需的组织干细胞(诸如神经、骨和软骨或肝脏的干细胞)。这减少了人类为他人放弃他们的HSC和器官的需要。抗体预处理,然后进行万能干细胞来源的HSC和组织干细胞的共同移植,可以为患者递送救命器官,而无需依赖于长期免疫抑制。
方法
动物。所有实验均根据斯坦福大学实验动物护理管理小组(Stanford UniversityAdministrative Panel on Laboratory Animal Care)制定的指南进行。对AKR x C57BL/6F1供者实施内部杂交并培育。CB6F1和DBA1/J受者购自Jackson Laboratory。DBA1/J妊娠雌性购自Taconic Biosciences用于耳心移植。
抗体。抗CD47(mIAP410)、抗c-KIT(ACK2)、抗CD122(Tm-β1)、抗CD40L(MR1)、抗CD4(GK1.5)和抗CD8(YTS169.4)购自BioXCell。抗CD47在第-8天按100μg剂量经腹膜内给予,然后在整个预处理过程中按500μg剂量进行随后注射。眶后抗c-KIT和腹膜内抗CD40L均作为一次性500μg药丸给予。抗CD122按250μg剂量经腹膜内给予,而抗CD4和抗CD8按100μg腹膜内剂量给予。注射前15分钟经腹膜内给予接受抗c-KIT抗体的小鼠400μg的苯海拉明(diphenhydramine)。抗CD25(PC-61.5.3)购自BioXCell并作为一次性100μg腹膜内注射给予。
移植物制备和移植。从供者小鼠的胫骨、股骨、髋部和脊柱中提取全骨髓。将骨碾碎、过滤,随后进行红细胞(RBC)溶解。对于富含c-Kit的移植物,按照制造商的说明书使RBC溶解的全骨髓与Miltenyi CD117 MicroBead结合并在磁力分离后收集。对于LSK细胞移植物,按照制造商的说明书,使RBC溶解的全骨髓与Miltenyi谱系细胞消耗试剂盒混合物结合。收集来自磁力分离柱的流过物(flow through),并在含有2%FBS的PBS中,用最佳浓度的下列抗体染色:CD3 PE(17A2)、CD4 PE(GK1.5)、CD5 PE(53-7.3)、CD8a PE(53-6.7)、B220PE(RA3-6B2)、Gr-1 PE(RB6-8C5)、Mac-1 PE(M1/70)、Ter119 PE(TER119)、SCA1 Pe-Cy7(D7)和CD117 APC(2B8)。即将在BD Aria上分选时前,添加碘化丙啶作为活力染剂。将所有用于移植的细胞以所需浓度重新悬浮于含有2%FBS的PBS中。在移植之前,用两剂6.5Gy对辐照对照小鼠进行致死性辐照。使用异氟烷麻醉所有小鼠,然后通过眶后注射移植100uL细胞悬浮液。
外周血嵌合状态。通过眶后放血对小鼠进行定期放血,收集到EDTA包被的管中。然后将血液在37℃下在含有5mM EDTA的1%葡聚糖中孵育1小时。对每支管的上清液进行提取,溶解,然后用最佳浓度的下列抗体染色:CD3 APC(17A2)、CD19 PE-Cy7(ebio103)、Gr-1BV421(RB6-8C5)、Mac-1 APC-Cy7(M1/70)、CD45.1 FITC(A20)和CD45.2 PE(104)。在BDFortessa上分析样品,并基于CD45等位基因差异区分供者与宿主的嵌合状态。
耳-心移植。在出生1-2天后对新生小鼠实施安乐死并收获其心脏。通过在颅骨附近的耳背侧切一个小切口来准备受者小鼠。然后,使用套管针,通过从切口部位隧穿到耳廓顶端而产生囊腔。用套管针在囊腔的远端递送新生心脏。通过轻轻地将张起的皮肤推回到真皮来闭合隧道。通过解剖显微镜观察移植物来监测心脏搏动的活力。
参考文献
Lv et al.Autoimmune hematological diseases following haploidenticaldonor hematopoietic stem cell Transplant compared with matched sibling andunrelated donor.Oncotarget.2017;8(16):26505-26514.
Gandy and Weissman.Tolerance of allogeneic heart grafts in micesimultaneously reconstituted with purified allogeneic hematopoietic stemcells.Transplantation.1998;65(3):295-304.
Shizuru et al.Purified hematopoietic stem cell grafts inducetolerance to alloantigens and can mediate positive and negative T cellselection.Proc Natl Acad Sci USA.2000;97(17):9555-60.
Passweg et al.Use of haploidentical stem cell transplantationcontinues to increase:the 2015 European Society for Blood and MarrowTransplant activity survey report.Bone Marrow Transplant.2017;52(6):811-817.
Gragert et al.HLA match likelihoods for hematopoietic stem-cellgrafts in the U.S.registry.N Engl J Med.2014;371(4):339-48.
Cobbold SP,Martin G,Qin S,Waldmann H.Monoclonal antibodies to promotemarrow engraftment and tissue graft tolerance.Nature.1986:323(6084):164-6.
Palchaudhuri et al.Non-genotoxic conditioning for hematopoietic stemcell transplantation using a hematopoietic-cell-specific internalizingimmunotoxin.Nat Biotechnol.2016;34(7):738-45.
Czechowicz et al.Efficient transplantation via antibody-basedclearance of hematopoietic stem cell niches.Science.2007;318(5854):1296-9.
Chhabra et al.Hematopoietic stem cell transplantation inimmunocompetent hosts without radiation or chemotherapy.Sci Transl Med.2016;8(351):351ra105.
Ruggeri et al.Effectiveness of donor natural killer cellalloreactivity in mismatched hematopoietic transplants.Science.2002:295(5562):2097-100.
Durham et al.Cutting edge:administration of anti-CD40 ligand anddonor bone marrow leads to hemopoietic chimerism and donor-specific tolerancewithout cytoreductive conditioning.J Immunol.2000:165(1):1-4.
Wekerle et al.Allogeneic bone marrow transplantation with co-stimulatory blockade induces macrochimerism and tolerance withoutcytoreductive host treatment.Nat Med.2000;6(4):464-9.
Markees et al.Prolonged survival of mouse skin allografts inrecipients treated with donor splenocytes and antibody to CD40ligand.Transplantation.1997;64(2):329-35
Shizuru et al.Transplantation of purified hematopoietic stem cells:requirements for overcoming the barriers of allogeneic engraftment.Biol BloodMarrow Transplant.1996;2(1):3-14.
Negrin et al.Transplantation of highly purified CD34+Thy-1+hematopoietic stem cells in patients with metastatic breast cancer.Biol BloodMarrow Transplant.2000;6(3):262-71.
Tsao et al.Purified hematopoietic stem cell allografts reconstituteimmunity superior to bone marrow.Proc Natl Acad Sci USA.2009;106(9):3288-93.
本说明书中引用的每个出版物出于所有目的特此以引用方式整体并入。
应理解,本发明不限于所描述的特定方法、方案、细胞系、动物的种或属和试剂,因此可以变化。还应理解,本文所用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的,而非意图限制本发明的范围,本发明的范围将仅受所附权利要求限制。
除非上下文另外明确指出,否则如本文所用单数形式“一(a/an)”和“所述(该)”包括复数个指示物。因此,例如,对“一个细胞”的提及包括对多个此类细胞的提及,并且对“所述培养物”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或多种培养物及其等效物的提及,等等。除非另外明确指出,否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

Claims (24)

1.一种在哺乳动物受试者中提供干细胞植入的方法,所述方法包括预处理方案,所述预处理方案包括:
使所述受试者同时接触(i)与靶向组织中的内源性干细胞特异性结合的剂和(ii)阻断CD47与SIRPα之间的相互作用的剂;所述剂的剂量可有效消融来自所述受试者的靶向内源性干细胞;
使所述受试者接触(iii)诱导瞬时免疫抑制的剂;
在足以使所述受试者体内(i)和(ii)的血清水平降低至无毒水平的洗脱时间段后,向所述受试者引入包含外源性干细胞的细胞组合物;
其中所述外源性干细胞在不存在清髓性预处理的情况下植入。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述靶向组织是骨髓,并且所述靶向干细胞是造血干细胞。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述外源性干细胞相对于所述受试者是自体的或同种异体的。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述外源性干细胞经离体基因工程改造。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其中与靶向组织中的内源性干细胞特异性结合的所述剂是对c-kit有特异性的单克隆抗体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中阻断CD47与SIRPα之间的相互作用的所述剂选自:可溶性SIRPα多肽;对CD47有特异性的抗体、对SIRPa有特异性的抗体和可溶性CD47多肽。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其中诱导瞬时免疫抑制的所述剂选自抑制CD40/CD40L活性的剂;霉酚酸、环孢菌素A、雷帕霉素、FK506和皮质类固醇。
8.如权利要求7所述的方法,其中诱导瞬时免疫抑制的所述剂是对CD40L有特异性的抗体。
9.如权利要求8所述的方法,其中诱导瞬时免疫抑制的所述剂与所述外源性干细胞同时施用。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述受试者是有免疫能力的人。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述受试者相对于所述外源性干细胞是单倍型相合的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述外源性干细胞作为全骨髓单核细胞的组合物施用。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述干细胞与所述受者是MHC匹配的。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其还包括使所述受试者接触(iv)消耗T细胞和NK细胞中的一种或两种的剂,其中所述剂(iv)在所述外源性干细胞引入之前施用,并且任选地与所述外源性干细胞引入同时施用。
15.如权利要求14所述的方法,其中所述受试者相对于所述外源性干细胞是HLA错配的。
16.如权利要求14或15所述的方法,其中所述细胞组合物包含选自骨髓、脐血或外周血的用于CD34+表达的造血干细胞。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述细胞组合物包含至少50%的CD34+细胞。
18.如权利要求14所述的方法,其中所述细胞组合物包含源自体外多能细胞的造血干细胞。
19.如权利要求14-18中任一项所述的方法,其中所述细胞组合物包含至少105个CD34+细胞/kg受者体重。
20.如权利要求14-19中任一项所述的方法,其中所述剂(iv)消耗T细胞和NK细胞。
21.如权利要求20所述的方法,其中所述剂(iv)是选自以下的抗体:对CD2、CD52、CD45有特异性的抗体;或抗胸腺细胞球蛋白(ATG)。
22.如权利要求14-19中任一项所述的方法,其中选择性消耗T细胞的剂(iv)选自对CD3、CD4和CD8中的一种或多种有特异性的抗体。
23.如权利要求14-19中任一项所述的方法,其中选择性消耗NK细胞的剂(iv)选自对CD122和CD56中的一种或多种有特异性的抗体。
24.一种在哺乳动物受试者中提供干细胞植入的方法,所述方法包括:
对供者和受者进行HLA分型以确定HLA匹配或HLA错配的配对;
从所述供者获得包含CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)的造血细胞并任选地分离所需表型的HSPC;
配制有效剂量的所述HSPC细胞组合物;
在输注所述造血细胞之前,根据施用给所述受者的供者细胞数量、所述供者细胞的纯度、供者和受者之间主要组织相容性错配的程度及所述受者的免疫状态,为所述受者选择一组用于非基因毒性预处理方案的剂;
施用所述的这一组用于非基因毒性预处理的剂;
输注所述造血细胞;以及
监测所述受者的造血干细胞植入情况。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3471772A4 (en) 2016-06-17 2020-03-18 Magenta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR DEPLOYING CELLS
JOP20190009A1 (ar) 2016-09-21 2019-01-27 Alx Oncology Inc أجسام مضادة ضد بروتين ألفا منظم للإشارات وطرق استخدامها
WO2019183266A1 (en) 2018-03-21 2019-09-26 ALX Oncology Inc. Antibodies against signal-regulatory protein alpha and methods of use
CA3117816A1 (en) 2018-11-26 2020-06-04 Forty Seven, Inc. Humanized antibodies against c-kit
WO2020112870A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Forty Seven, Inc. Genetically modified hspcs resistant to ablation regime
JP2022533253A (ja) * 2019-05-24 2022-07-21 フォーティ セブン, インコーポレイテッド c-kit及びCD47に対する免疫療法剤の同時投与レジメン

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016033201A1 (en) * 2014-08-26 2016-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engraftment of stem cells with a combination of an agent that targets stem cells and modulation of immunoregulatory signaling
WO2016164502A1 (en) * 2015-04-06 2016-10-13 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for non-myeloablative conditioning

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5730979A (en) 1993-03-05 1998-03-24 Universite Catholique Delouvain LO-CD2a antibody and uses thereof for inhibiting T cell activation and proliferation
EP1783139B8 (en) 1996-10-01 2009-09-23 Geron Corporation Human telomerase catalytic subunit
US5968829A (en) 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US6638501B1 (en) 1997-09-29 2003-10-28 Neurospheres Holdings Ltd. Use of multipotent neural stem cell progeny to augment non-neural tissues
US5958767A (en) 1998-08-14 1999-09-28 The Children's Medical Center Corp. Engraftable human neural stem cells
AU2913801A (en) 1999-12-23 2001-07-03 Cornell Research Foundation Inc. A method for isolating and purifying multipotential neural progenitor cells and multipotential neural progenitor cells
JP2005525792A (ja) * 2001-12-21 2005-09-02 ゲンパト77 ファーマコジェネティクス エージー 免疫関連疾患および他の疾患に用いる治療的抗tirc7抗体
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之c-kit抗體
US8377448B2 (en) 2006-05-15 2013-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
US20100226927A1 (en) * 2006-11-03 2010-09-09 Weissman Irving L Selective immunodepletion of endogenous stem cell niche for engraftment
PL3789038T3 (pl) 2010-05-14 2023-01-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Humanizowane i chimeryczne przeciwciała monoklonalne wobec cd47
EP2804617B9 (en) 2012-01-17 2021-04-07 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University High affinity sirp-alpha reagents
JP6830437B2 (ja) * 2014-12-10 2021-02-17 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 疾患を処置するための遺伝子改変された細胞、組織および臓器
WO2016154588A1 (en) * 2015-03-25 2016-09-29 Children's Hospital Medical Center Use of kit inhibitors to condition subjects for a hematopoietic stem cell (hsc) transplantation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016033201A1 (en) * 2014-08-26 2016-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engraftment of stem cells with a combination of an agent that targets stem cells and modulation of immunoregulatory signaling
WO2016164502A1 (en) * 2015-04-06 2016-10-13 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for non-myeloablative conditioning

Also Published As

Publication number Publication date
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