KR20240028557A - 줄기 세포 이식을 위한 비-유전독성 컨디셔닝 레지멘 - Google Patents

줄기 세포 이식을 위한 비-유전독성 컨디셔닝 레지멘 Download PDF

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KR20240028557A
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어빙 엘. 와이즈먼
쥬디스 에이. 시즈루
아칸샤 크하브라
벤슨 엠. 조지
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

본 발명은 방사선요법 또는 화학요법을 요함이 없이, 그리고 GVHD 또는 이식 거부의 전개 없이 수령체의 생착을 촉진하고 면역능숙도를 재구성하는 줄기 세포 이식의 임상적으로 적용가능한 방법을 제공한다.

Description

줄기 세포 이식을 위한 비-유전독성 컨디셔닝 레지멘{A Non-Genotoxic Conditioning Regimen for Stem Cell Transplantation}
교차 참조
본원은 하기 출원의 이점을 주장한다: 미국 특허 가출원 번호 62/452,218로, 2017년 1월 30일 출원되고, 그 출원은 본 명세서에 전체적으로 참고로 편입된다.
줄기 세포는 자기-재생하고 분화된 세포를 발생시키는 이들 세포의 능력을 통해, 특정 조직을 유지하고 회복하는 수단을 유기체에 제공한다. 임상적으로, 골수 및 조혈 줄기 세포 이식은 환자에게 혈구를 생성하는 능력을 제공하는 수단으로 널리 사용되는데, 일반적으로 여기서 환자는 고 용량 화학요법 또는 방사선에 의해 내인성 줄기 세포가 감손된다.
조혈 세포 이식 (HCT)은 일반적으로, 그것의 활성 서브셋이 조혈 줄기 세포 (HSC)인, 세포를 형성하는 자가 또는 동종이계 혈액의 정맥내 주입을 포함하며; 이들은 골수, 말초 혈액, 또는 탯줄 혈액으로부터 수집되고 골수 또는 면역계가 손상되거나 또는 결함 있는 환자에서의 조혈 기능을 재확립하기 위해 이식된다. 이 절차는 종종 골수 침윤성 과정, 예컨대 백혈병을 제거하거나, 또는 선천성 면역결핍 장애를 치료하기 위한 요법의 일부로 수행된다. 또한, HCT는 암 환자가 골수가 일반적으로 용인하는 것보다 더 높은 용량의 화학요법을 받을 수 있게 하는 데 사용된다; 골수 기능은 그런 다음 이전에 수확된 줄기 세포로 골수를 대체함에 의해 회복된다. HSC의 풍부한 또는 정제된 모집단은 또한 이식될 수 있고, 그리고 많은 것들이 숙주에 유해한 다른 세포로 오염되지 않는다.
예비적 또는 컨디셔닝 레지멘은 조혈 세포 이식 (HCT)에서 중요한 요소이다. 성공적인 이식에서, 골수 적소의 청소능은 공여체 조혈 줄기 세포 (HSC)가 이식되기 위해 반드시 달성되어야 한다. 예비적인 레지멘은 또한 이식된 이식편의 거부를 방지하기에 이식이 수행되는 질환을 근절하기에 충분한 면역억제를 제공할 수 있다. 틈새 공간을 청소하는 현행 방법은 방사선 및/또는 화학요법에 의존하는데, 이는 BMT의 잠재적 임상 유용성을 크게 제한하는 독성 역효과를 부여할 수 있다. 종래에, 골수절제 컨디셔닝이 수행된다.
골수절제 레지멘은, 방사선 또는 특정 약물의 용량을 최대로 내성인 용량까지 상승시킴에 의해 전개되는 요법인, 방사선-함유 또는 비 - 방사선-함유 레지멘으로 분류될 수 있다. 총-바디 조사 및 사이클로포스파마이드 또는 부설판 및 사이클로포스파마이드는 통상적으로 사용된 골수절제 요법이다. 이들 레지멘은 특히 공격적인 악성종양, 예컨대 백혈병에 사용된다. 그러나, 이러한 치료는 환자에 대한 독성의 관점에서 수 많은 약점을 수반한다.
조혈 줄기 세포를 포함한 줄기 세포의 생착을 위한 개선된 방법은 매우 임상적 관심이 있는 것이다. 본 발명은 이 요구를 다룬다.
발명의 요약
사전-이식 비-골수절제, 비-유전독성 컨디셔닝 레지멘으로 수령체를 치료하는 단계; 및 외인성 줄기 세포를 포함한 세포 모집단의 효과적인 용량을 투여하는 단계에 의해, 수령체에 비제한적으로 조혈 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포의 장기간 다계열 생착을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 컨디셔닝 레지멘은 다양한 목적을 위해 내인성 세포 모집단에 작용하는 제제의 투여를 포함한다. 본 방법은 혈액성 장애를 치료하기 위한 생착을 가능하게 하고, 또한 미래 장기 이식을 위한 공여체-유형에 대해 수령체를 용인시키기 위해 사용될 수 있다.
내인성 줄기 세포는 컨디셔닝 레지멘에 의해 감손된다. 내인성 줄기 세포를 감손시키는 제제는, 비제한적으로, c-키트에 대해 특이적인 항체 및 CD47 활성을 차단하는 제제를 포함한다. 이들 제제들은 또한 투여 후 외인성 줄기 세포를 감손시킬 수 있고, 따라서 제제가 투여된 시간부터 외인성 줄기 세포가 투여된 시간까지의 "세정" 기간을 요한다. 본 세정 기간은 내인성 줄기 세포를 무독성 수준으로 감손시키는 제제의 혈청 수준을 감소시키기에 충분하여, 줄기 세포의 고갈을 초래하지 않는다.
일부 구현예에서 적어도 하나의 제제가 세포독성 림프구의 일시적 면역 억제를 제공하는 컨디셔닝 레지멘에 포함된다. 비제한적으로 CD40/CD40L 활성을 억제하는 제제; 마이코페놀산, 사이클로스포린 A, 라파마이신, FK506, 코르티코스테로이드, 등을 포함한 다양한 생물학적 및 비-골수절제 약제학적 제제가 이러한 목적을 위해 이용가능하다. 일부 구현예에서 제제는 CD40L을 억제하고, 그리고 CD40L 특이적인 항체이다. 일시적 면역억제제가, 외인성 줄기 세포가 투여될 때 본 제제가 활성인 한, 외인성 줄기 세포 이전에 또는 그와 동시에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서 T 림프구 및 자연 살해 (NK) 세포 중 하나 또는 둘 모두를 감손시키는 적어도 하나의 제제가 컨디셔닝 레지멘에 포함된다. T 세포를 감손시키는 제제는 구체적으로 비제한적으로, CD3, CD4, CD8, 등에 대해 특이적인 항체를 포함한 제제를 포함한다. T 세포 및 NK 세포를 감손시키는 제제는 비제한적으로, CD2, CD52, CD45, 항-흉선세포글로불린 (ATG), 등에 특이적인 항체를 포함한 제제를 포함한다. NK 세포를 감손시키는 제제는 구체적으로 비제한적으로, CD122, CD56, 등에 특이적인 항체를 포함한 제제를 포함한다. 고갈 유도제(들)은 외인성 줄기 세포 주입 이전에 투여될 수 있고, 외인성 줄기 세포가 투여될 때 표적화된 세포가 감손되는 한, 주입 후 선택적으로 활성화한다.
일 구현예에서, 이식 이전에 비-유전 독성 컨디셔닝을 위해 적절한 세트의 제제의 선택 및 투여를 위한 방법이 제공된다. 줄기 세포의 성공적인 생착을 위한 사전-컨디셔닝 레지멘의 요건은 수령체에 투여된 공여체 세포의 수; 공여체 세포의 순도; 공여체와 수령체 사이의 주 조직적합성 부정합의 정도; 및 수령체의 면역 상태를 포함한 특정 파라미터에 따라 다양하다는 것이 본 명세서에 나타나 있다. 개체에 대한 제제의 적절한 세트를 선택하는 것과, 제제의 투여에 대한 타이밍은 이식의 치료적 결과를 최적화할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다: HLA-정합된 또는 HLA- 부정합된 쌍을 결정하기 위해 공여체 및 수령체를 HLA 타이핑하는 단계; HSPC로 지칭될 수 있는, CD34+ 조혈 줄기 및 선조 세포를 포함한 공여체로부터 조혈 세포를 수득하는 단계; 선택적으로 원하는 표현형, 예를 들어 CD34+ 세포의 HSPC를 분리하고, HSPC의 효과적인 용량을 형성하는 단계; 수령체에 투여된 공여체 세포의 수; 공여체 세포의 순도; 공여체와 수령체 사이의 주 조직적합성 부정합의 정도; 및 수령체의 면역 상태에 기반한 조혈 세포의 주입 이전에 수령체에 대한 비-유전독성 컨디셔닝 레지멘을 위한 제제의 세트를 선택하는 단계; 비-유전독성 컨디셔닝을 위한 제제의 세트를 투여하는 단계; 조혈 세포를 주입하는 단계; 및 조혈 줄기 세포 생착에 대해 수령체를 모니터링하는 단계.본 명세서에서 기재된 방법은 하기에 적용한다: HLA-정합된 및 HLA-부정합된 이식 조건 양자, 예를 들어 HLA-부정합되고 반수체 아닌 이식, 반수체 이식; 등.
일부 구현예에서 HSPC는 공여체 조혈 세포 샘플로부터 수득된다. 일부 구현예에서 조혈 세포 샘플은 골수이다. 일부 구현예에서 HSPC는 탯줄 혈액으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 조혈 세포 샘플은 공여체 고정 말초 혈액으로부터 분리반출법에 의해 수득된다. 일부 구현예에서 HSPC는 시험관내 생성된다. HSPC 공여체는 동종이계 또는 자가일 수 있고, 예를 들어 여기서 HSPC는, 예를 들어 생체외 배양 동안, 재-주입 이전에 유전 물질의 도입 또는 결실에 의해 유전자적으로 조작된다. 동종이계 공여체는 수령체에 대해 정합된 MHC일 수 있다. 공여체는 수령체에 대해 반수체일 수 있거나 또는 단상-동일하지 않을 수 있다. 공여체는 하나 이상의 MHC 유전자좌에서 부정합될 수 있고, 예를 들어 MHC 부정합에 대해 주요 유전자좌 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에서 부정합될 수 있다.
HSPC는 CD34의 발현을 위한 조혈 세포 샘플로부터 선택적으로 단리된다. 단리는 CD90의 발현을 위한 선택을 추가로 포함할 수 있다. 정제된 HSPC는, 모집단에서 CD34+인 세포의 백분율에 의해 정의될 때, 적어도 약 45% 순수할 수 있고, 적어도 약 50% 순수, 적어도 약 60% 순수, 적어도 약 70% 순수, 적어도 약 80% 순수, 적어도 약 90% 순수할 수 있다. CD34+ 세포의 효과적인 용량은 약 105 내지 약 107 CD34+ 세포/수령체 체중의 kg일 수 있고, 적어도 약 5 x 105 CD34+ 세포/수령체 체중의 kg, 적어도 약 106 CD34+ 세포/수령체 체중의 kg, 적어도 약 3 x 106 CD34+ 세포/수령체 체중의 kg, 적어도 약 5 x 106 CD34+ 세포/수령체 체중의 kg일 수 있고, 그리고 107 CD34+ 세포/수령체 체중의 kg 또는 그 초과일 수 있다. CD34+ 세포의 용량; 세포의 순도, 및 전달된 세포의 총수, 즉 주입액에서 CD34+ 및 CD34- 세포 둘 모두의 총 용량은 비-유전독성 컨디셔닝제의 선택을 위한 중요한 파라미터이다.
HSPC 조성물로 전달된 CD3+ 세포의 최대 수는 약 106 CD3+ 세포/수령체 체중의 kg 이하, 약 5 x 105 CD3+ 세포/수령체 체중의 kg 이하, 약 3 x 105 CD3+ 세포/수령체 체중의 kg 이하, 약 104 CD3+ 세포/수령체 체중의 kg 이하일 수 있다. 주입액에서 CD3+ 세포의 수는 세포독성 림프구를 억제하는 제제의 선택을 위한 변수일 수 있고, 여기서 CD3+ 세포의 증가된 수는 비제한적으로 CD3, CD4, CD8, 등에 특이적인 항체를 포함한 T 세포를 제거하는 하나 이상의 제제를 주입 직전, 또는 주입 시에 투여를 요할 수 있다.
일부 구현예에서, 이식은 골수절제 컨디셔닝의 부재에서 수행된다. 일부 구현예에서 수령체는 면역적격이다. 사전-이식 컨디셔닝 레지멘의 투여는 원하는 수준의 절제를 달성하기 위해 필요에 따라 반복된다.
일부 구현예에서 CD47 차단은 고친화도 SIRPα 변이체 폴리펩타이드일 수 있는 가용성 SIRPα 폴리펩타이드를 투여함에 의해 달성된다. 다른 구현예에서, SIRPα및 CD47 중 하나 또는 둘 모두에 특이적인 항체가 투여된다.
공여체 줄기 세포로 이식에 따라, 수령체는 공여체 세포에 대한 키메라 또는 혼합된 키메라일 수 있다. 본 발명의 방법은 표적화된 조직의 기능에 관여된 분화된 세포를 제거하는 바람직하지 않은 효과뿐만 아니라 다른 조직에 (예를 들어 위장관계, 모발성장의 세포에) 바람직하지 않은 부작용, 뿐만 아니라 이차 악성종양의 증가 위험이 있는 비-선택적 절제방법, 예를 들어 방사선 또는 화학요법의 부재에서 효과적인 줄기 세포 생착을 가능하게 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 줄기 세포는 자가 조혈 줄기 세포, 유전자 변형된 조혈 줄기 세포, 및 동종이계 조혈 줄기 세포 중 하나 이상, 일반적으로 동종이계 줄기 세포이다. 이러한 줄기 세포는 다양한 혈액 장애, 예를 들어 재생불량 빈혈; 겸상적혈구 질환; 지중해 빈혈; 중증 면역 결핍; 골수 부전 상태, 면역 결핍, 이상혈색소증, 백혈병, 림프종, 면역-내성 유도, 골수이식에 의해 치료가능한 유전적 장애 및 다른 혈액 장애를 포함한 유전적 장애, 및 기타 동종의 것의 치료에 사용된다.
본 발명의 방법은 또한 환자에서 내성, 예를 들어 예를 들어 장기 이식에서 공여체 조직에 대한 내성; 예를 들어 자가면역 질환의 치료의 맥락에서 자가항원에 대한 내성; 등의 유도에 유용하다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포독성 림프구가 비제한적으로 T 세포, 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함할 수 있는, 세포독성 림프구의 수 또는 활성을 감소시키는 제제의 하나 또는 세트의 효과적인 용량의 투여와 조합하여 수행된; 비제한적으로 c-키트에 특이적인 항체를 포함한, 줄기 세포를 표적화하는 제제 및 CD47 활성을 차단하는 제제의 환자에게 투여하는 투여를 포함하는, 환자에서 내성을 유도하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서 비제한적으로 CD40/CD40L 활성을 억제하는 제제를 포함한, 세포독성 림프구의 일시적 면역 억제를 제공하는 적어도 하나의 제제가 포함된다. 일부 구현예에서 본 제제는 CD40L에 특이적인 항체이다. 일부 구현예에서 본 방법은 유전독성 컨디셔닝의 부재에서 수행된다. 컨디셔닝 레지멘에 따라, 수령체에는 효과적인 용량의 조혈 줄기 및 선조 세포가 주입되고, 그것에 의해 미래 장기 이식에 대해 공여체 세포에 면역 관용을 제공한다.
본 발명은 첨부된 도면과 함께 판독되는 경우 하기의 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해된다. 통상의 실무에 따라, 도면의 다양한 특징부는 일정한 비율로 축척되지 않음이 강조된다. 이에 반하여, 다양한 특징부의 치수는 명확성을 위해 임의로 확대되거나 축소된다. 하기의 도면이 도면에 포함되어 있다.
도 1a-1f. ACK2, 클론 3, MR-1 및 CD122는 면역 능숙한 동물 안으로 반수체 전체의 골수의 효율적인 생착을 가능하게 한다. 도 1a 30e6 AKR x Hz F1 전체의 골수가 수확되고 각각 Balb/c x C57BL/6 수령체 안으로 안와후로 이식되었다. 키메리즘은 CD45 대립유전자 차이에 의해 결정되었다. 도 1b 각각의 항체는 컨디셔닝을 위한 마킹된 일에 제공되었다. -8일째에, 100ug의 클론 3이 제공되고; 모두 후속하는 일에 500ug의 클론 3이 제공된다. -6일째에, 500ug의 ACK2가 제공된다. -1일째에, 250ug의 Tm-β1이 제공된다. 0일째에, 500ug의 MR1이 제공된다. c-f. 마우스는 각각의 항체의 상이한 조합을 사용하여 컨디셔닝되었다. 총 공여체 키메리즘은 T-세포 도 1d, B-세포 도 1e, 및 과립구 도 1f 키메리즘에 부가하여, 도 1c의 13 주에 걸쳐 측정되었다. ACK2 + 클론 3 + MR1 집단에서 비키메라 마우스가 검열된다.
도 2. 항체 컨디셔닝된 마우스의 16주 공여체 키메리즘.도면은 집단 당 키메라인 마우스의 백분율 및 총 공여체, T-세포, B-세포, 및 과립구 키메리즘의 평균 수준을 도시한다. ACK2 + 클론 3 + MR1 집단에서 비키메라 마우스가 검열된다.
도 3a-3f. 낮은 세포 용량 골수의 생착을 위해 NK-세포 고갈이 필요하다. 도 3a 다양한 양의 AKR x Hz F1 전체의 골수가 수확되고 각각의 Balb/c x C57BL/6 수령체 안으로 안와후로 이식되었다. 키메리즘은 CD45 대립유전자 차이에 의해 결정되었다. 도 3b 각각의 항체는 컨디셔닝을 위한 마킹된 일에 제공되었다. -8일째에, 100ug의 클론 3이 제공되고; 모두 후속하는 일에 500ug의 클론 3이 제공된다. -6일째에, 500ug의 ACK2가 제공된다. -2일째에, 250ug의 Tm-β1이 제공된다. 0일째에, 500ug의 MR1이 제공된다. c-f. 각각의 그룹은 클론 3, ACK2, 및 MR1로 최소로 컨디셔닝되었다. CD122가 또한 2개의 지시된 집단에 첨가되었고; 따라서 모두 4개의 항체를 수령했다. 컨디셔닝된 마우스는 30 x 106, 106, 3 x 106 또는 105 전체의 골수 중 어느 하나를 수령했다. 총 공여체 키메리즘은 T-세포 도 3d, B-세포 도 3e, 및 과립구 도 3f 키메리즘에 부가하여 도 3c의 3주에서 측정되었다.
도 4. 단클론성 항체 칵테일은 장기간 다중-계열 조혈 재구성을 포함할 수 있다. (a) AKRB6F1 공여체 및 CB6F1 수령체를 사용한 반수체 이식 스키마. (b) 공여체 및 수령체 균주에 대한 MHC 부류 I의 유세포측정 분석. (c) 컨디셔닝 레지멘에 대한 투약 계획. (d) Ab 컨디셔닝에 따른 장기간 HSC 구획 (Lin- c-키트+ Sca1+ CD150+ Flk2- CD34-)에서 공여체 키메리즘. (e-g) Ab 컨디셔닝은 WBM 이식 후 장기간 다중-계열 키메리즘을 가능하게 한다. (h) 0일째에 WBM Ab 컨디셔닝에 따른 CBC. (i) NK 세포 고갈을 갖거나 갖지 않는, 다양한 WBM 용량에서 키메라인 동물의 백분율.
도 5. 단클론성 항체 칵테일은 저용량 정제된 HSC의 장기간 다중-계열 조혈 재구성을 유도할 수 있다. (a) 이식을 위한 LSK 및 c-키트+ 세포를 계산하고 분리하기 위해 사용된 분류 반응식. (b) 다양한 조혈 세포 이식에 따른 과립구 키메리즘. (c) LSK Ab 컨디셔닝에 대한 투약 계획. (d) LSK Ab 컨디셔닝에 따른 골수에서 성숙한 면역 세포 모집단 존재도. (e) LSK 이식에 따른 총 말초 혈액 공여체 키메리즘. (f) LSK Ab 칵테일의 개별 구성요소의 배제에 이어 키메라인 동물의 백분율.
도 6. 비-유전독성 컨디셔닝 레지멘을 통한 저용량 LSK 이식은 공여체 조직에 대한 내성을 가능하게 한다. (a-b) WBM (a) 및 LSK (b) 이식에 따른 말초 혈액에서 공여체-반응 숙주 T-세포의 존재도. (c) 귀-심장 이식 모식도. (d) 공여체 심장 생존. (e) 조직 이식에 따른 34일에 대표적인 귀-심장 이식의 총 시험, H&E, 및 IF.
도 7. 조혈 줄기 세포는 전체 MHC 미스매치에도 불구하고 접목될 수 있다. (a) DBA1/J가 공여체이고 CB6F1이 숙주인 이식 모식도. (b) WBM 및 LSK 이식에 따른 8주 후 공여체 생착의 퍼센트. (c) 이식된 동물의 전체 생존. (d) 내인성 HSC를 감손하고 숙주 T 및 NK 세포를 표적화함에 의해 일시적 면역 억제를 제공하는 모든-항체 컨디셔닝 레지멘을 기술하는 개요.
도 8. (a) 숙주와 공여체 사이의 CD45 대립유전자 차이에 의한 말초 혈액 키메리즘을 결정하는 분류 반응식. WBM 이식에 이은 16주의 다중-계열 말초 혈액 키메리즘이 (b) T-세포, (c) B 세포 및 (d) 과립구에 대해 도시된다.
도 9. 단클론성 항체를 사용한 단일치료적 컨디셔닝에 따른 말초 혈액 공여체 키메리즘.
도 10. 컨디셔닝이 이식 없이 완료된 1일 후 동물로부터 전 혈구 계산치 (a), 말초 혈액 부분 모집단 (b) 및 비장 부분 모집단 (c).
도 11. LSK Ab 컨디셔닝의 변이에 따른 16-주 말초 혈액 키메리즘.
줄기 및 선조 세포를 포함하는 세포 조성물의 주입 이전에 비-유전독성, 비-골수절제 조건으로 치료에 의해 대상체에서 줄기 세포의 생착을 위한 방법이 제공된다.
방사선 요법 또는 화학요법을 요함이 없이, 또는 GVHD 또는 이식 거부의 전개 없이, 생착을 촉진하고 수령체의 면역능숙도를 재구성하는 줄기 세포 이식의 임상적으로 적용할 수 있는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 공여체 줄기 세포 모집단의 특성 및 용량, 및 공여체와 수령체 사이의 HLA 부정합의 정도에 기반한 적절한 컨디셔닝 레지멘을 선택하기 위한 지침이 또한 제공된다.
본 발명의 양태는 조혈 줄기 세포 (HSC)의 효율적인 생착을 촉진하는 내인성 줄기 세포 틈새의 고갈은, 선택적으로 일시적 면역 억제와 조합되고; 그리고 선택적으로 T 및/또는 NK 세포를 감손시키고 공여체 세포의 안전한 생착을 허용하는 제제와 조합된, 내인성 줄기 세포, 예를 들어 항-c-키트 항체를 표적화하는 제제와 CD47 및 SIRPα의 상호작용을 차단함에 의해 내인성 줄기 세포의 사멸을 고양하는 제제의 사용을 배합시킴에 의해 달성된다는 발견에 기반된다. 특히, 본 발명은 외인성 줄기 세포의 수령체에 대한 투여와 조합하여, 내인성 줄기 세포의 이 개선된 선택적 절제를 조합하여, 효율적인, 장기간 생착 및 내성을 초래한다.
본 발명은 이러한 방법, 장치 및 제형이, 물론 다양할 수 있는 바와 같이, 기재된 특정한 방법론, 생성물, 장치 및 인자에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에 사용되는 용어가 오직 특정 실시형태만을 기재하기 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 이는 오직 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 이해해야 한다.
본 명세서에, 그리고 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형 하나의 그리고 상기는 문맥에서 명백히 다르게 나타내지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함하는 것을 주의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 약물 후보 물질"에의 언급은 이러한 후보물질 중 하나 또는 혼합물을 지칭하며, "상기 방법"에의 언급은 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있는 동등한 단계 및 방법에의 언급을 포함하는 등이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학용어는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 언급되는 모든 간행물은 간행물에 기재되고, 본 명세서에 기재된 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 장치, 제형 및 방법을 설명하고 개시하기 위하여 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
소정의 범위의 값이 제공되는 경우, 문맥에서 명백하게 다르게 나타내지 않는 한, 상기 범위의 상한과 하한 사이에 하한의 단위의 1/10까지 각 개재하는 값, 그리고 언급된 범위에서 임의의 다른 언급된 또는 개재하는 값은 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더욱 작은 범위의 상한과 하한은 더욱 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고, 또한, 본 발명에 포함되고, 언급된 범위 내에 임의의 구체적으로 배제된 한계에 종속된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계의 하나 또는 둘 모두를 배제하는 범위 또한 본 발명에 포함된다.
하기의 설명에서, 본 발명의 더욱 완전한 이해를 제공하기 위하여 수 많은 구체적인 상세사항이 기재된다. 그러나, 본 발명이 이들 구체적인 상세사항 중 하나 이상 없이 실시될 수 있는 것이 해당 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 해당 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있는 널리 알려진 특징 및 절차는 본 발명을 모호하게 하는 것을 피하기 위하여 기재되지 않는다.
일반적으로, 단백질 합성, 재조합 세포 배양 및 단백질 단리의 통상의 방법, 및 해당 분야의 기술내의 재조합 DNA 기법이 본 발명에 이용된다. 이러한 기술은 참고로 하기 문헌에서 완전하게 설명되어 있다: 예를 들어, Maniatis, Fritsch &Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (1982); Sambrook, Russell and Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2001); Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); 및 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988).
정의
컨디셔닝 레지멘.동종이계 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)을 겪은 환자가 공여체 줄기 세포의 생착을 허용하기 위해 수령체의 면역계를 억제할 수 있고 내인성 줄기 세포를 감손할 수 있는 소위 컨디셔닝 레지멘으로 준비된다.
종래의 컨디셔닝 레지멘의 강도는 상당히 다양할 수 있다. 레지멘의 설명은 골수절제 또는 비-골수절제 레지멘과 관련하여 중첩할 수 있는 유전독성 또는 비-유전독성 레지멘을 지칭할 수 있다. 하기 문헌 참고, 예를 들어, Bacigalupo 등 (2009) Biol Blood Marrow Transplant. 15(12):1628-1633, 본 명세서에 구체적으로 참고로 편입됨.
유전독성 레지멘은, 적어도 부분적으로, DNA에 대해 직접 또는 간접적 효과를 갖는 제제의 투여: 돌연변이의 유도, 시기를 놓친 사건 활성화, 및 돌연변이를 초래하는 직접적인 DNA 손상을 포함함다. 유전독성 제제의 예는 방사선 및 특정 화학치료 약물, 예컨대 DNA 복제에 관여된 효소의 알킬화제, 개재 물질 및 억제제를 포함한다. 본 발명의 방법은 비-유전독성이고, 따라서 이러한 제제의 사용을 배제하다.
골수절제 컨디셔닝 레지멘은 투여로부터 1-3주 이내에 심오한 범혈구감소증 및 골수절제를 생성할 것으로 기대된 제제의 조합이다; 범혈구감소증은, 조혈이 조혈 줄기 세포 주입에 의해 회복되지 않는 한, 오래 지속되고, 일반적으로 비가역적이고 대부분의 사례에서 치명적이다. 그 예는 총 바디 조사 및/또는 알킬화제; 플루다라빈, 디메틸부설판, 에토포시드 (VP16); 등의 투여를 포함한다. 유전독성 및 골수절제 제제에서 상당한 중첩이 있다.
비-골수절제 컨디셔닝 레지멘은 전형적으로 최소 혈구감소증, 및 초기에 거의 적은 독성을 야기하지만, 효과적인 용량의 HSPC의 투여가 이어지는 경우 공여체 림프-조혈 줄기 세포의 생착을 초래할 정도로 면역 억제성이다.
본 명세서에 제공된 컨디셔닝 레지멘은 비-유전독성 및 비-골수절제이고, 주로 오래 지속하는 범혈구감소증을 야기함이 없이 생착을 방지하는 내인성 세포의 고갈을 위해 표적화된 제제를 이용한다. 비록 일부 사례에서 비-유전독성, 표적화된 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린 A, 코르티코스테로이드, 등이 일시적 면역억제를 위해 사용될 수 있지만, 본 방법은 유전독성 화학치료제 또는 방사선을 이용하지 않는다.
본 발명의 방법에서 활성제의 "수반되는 투여"는 제제가 동시에 치료 효과를 가질 그러한 시간에 시약과 함께 투여를 의미한다. 그러한 수반되는 투여는 제제의 동반 (즉 동시에), 이전, 또는 후속적인 투여를 포함할 수 있다. 해당 분야의 숙련자는 특정 약물과 본 발명의 조성물에 대한 투여의 적절한 시기, 순서 및 투여량을 결정하는데 어려움이 없을 것이다.
줄기 세포 마커. 인간 조혈 줄기 세포의 항체 매개된 절제를 위한 예시적인 마커는 하기를 포함한다: CD34; CD90 (thy-1); CD59; CD110 (c-mpl); c-키트 (CD-117); 등 . 중배엽 줄기 세포의 절제를 위해 유용한 마커는 하기를 포함한다: FcγRII, FcγRIII, Thy-1, CD44, VLA-4α, LFA-1β, HSA, ICAM-1, CD45, Aa4.1, Sca-1, 등. 신경능 줄기 세포는 저-친화성 신경 성장 인자 수용체 (LNGFR)에 특이적인 항체로 양성으로 선택될 수 있다. 신경 줄기/선조 세포는 당 업계에서 기재되어 있고, 다양한 치료적 프로토콜에서 이의 용도가 널리 논의되었다. 예를 들어, 특히, Uchida 등 (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97(26):14720-5. 미국특허 번호 6,638,501, Bjornson 등; 미국 6,541,255, Snyder 등; 미국 6,498,018, Carpenter; 미국특허 출원 20020012903, Goldman 등; Palmer 등 (2001) Nature 411(6833):42-3; Palmer 등 (1997) Mol Cell Neurosci.8(6):389-404; Svendsen 등 (1997) Exp. Neurol. 148(1):135-46 및 Shihabuddin (1999) Mol Med Today.5(11):474-80; 각각은 본 명세서에 구체적으로 참고로 편입됨. 인간 간엽 줄기 세포는 마커 예컨대 SH2 (CD105), SH3 및 SH4 및 Stro-1을 사용하여 제거될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 고갈에 대한 마커는 c-키트 (CD117)이다. CD117은 "강철 인자" 또는 "c-키트 리간드"로도 알려진, 줄기 세포 인자 (특정 유형의 세포가 성장하게 하는 서브스턴스)에 결합하는 수용체 티로신키나제 유형 III이다. 이 수용체가 줄기 세포 인자 (SCF)에 결합하는 경우 이것은 그것의 고유 티로신 키나제 활성, 차례로 포스포릴레이트를 활성화시키고, 세포에서 신호를 전파하는 신호 형질도입 분자를 활성화시키는 이량체를 형성한다. 예를 들어, 인간 refseq 도입 유전자 은행 NM_000222; NP_000213을 참고한다. CD117은 골수에서 특정 유형의 조혈 (혈액) 선조를 동정하는데 사용된 중요한 세포 표면 마커이다. 조혈 줄기 세포 (HSC), 다분화능 선조 (MPP), 및 공통 골수 전구세포 (CMP)는 높은 수준의 CD117을 발현한다. 특이적으로 인간 CD117을 결합하는 수 많은 항체가 당해 기술에 공지되어 있고, 비제한적으로, SR1, 2B8, ACK2, YB5-B8, 57A5, 104D2, 등을 포함하여 상업적으로 입수가능하다. 관심 있는 것은 SR1의 인간화된 형태, AMG 191로, 하기에 기재되어 있다: 미국 특허 번호8,436,150, 및 7,915,391로 이것은 비당화된 IgG1 인간화된 항체이다.
효과적인 용량의 항-CD117 항체는 단일 용량을 포함한 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있고, 이것은 다음과 같을 수 있다: 이식 이전 적어도 약 1주, 이식 이전 적어도 약 5일, 이식 이전 적어도 약 3일. 투약과 이식 사이의 기간은 수령체의 순환으로부터 항-CD117 항체를 실질적으로 제거하기에 충분하다. 예를 들어 투여에 따른 피크 혈청 수준에서의 감소는 일반적으로 수준을 피크 수준으로부터 적어도 약 10-배, 일반적으로 적어도 약 100-배, 1000-배, 10,000-배, 또는 그 초과로 감소시키기에 충분한 시간이다. 일반적으로 청소능의 시간에서 약 3일, 약 2일, 약 1일 이내, 또는 그 시간에 세정 기간에 따른 비어있는 틈새 "윈도우" 내에 공여체 줄기 세포를 도입하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, 효과적인 용량의 항-CD117 항체는 최대 약 10 mg/kg, 최대 약 5 mg/kg; 최대 약 1 mg/kg, 최대 약 0.5 mg/kg; 최대 약 0.1 mg/kg; 최대 약 0.05 mg/kg이고; 여기서 본 용량은 특이적 항체 및 수령체에 따라 다양할 수 있다.
항-CD47 작용제. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항-CD47 제제" 또는 "CD47 차단에 제공하는 제제"는 다음과 같은 임의의 제제를 지칭한다: SIRPα (예를 들어, 식균 세포 상)에 대한 CD47 (예를 들어, 표적 세포 상)의 결합을 감소시키는 것. 적합한 항-CD47 시약의 비-제한적인 예는 비제한적으로 고친화도 SIRPα 폴리펩타이드, 항-SIRPα 항체, 가용성 CD47 폴리펩타이드, 및 항-CD47 항체 또는 항체 단편을 포함한 SIRPα 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 항-CD47 제제 (예를 들어 항-CD47 항체, SIRPα 시약, 등)는 특이적으로 CD47을 결합하여 다음의 결합을 감소시킨다: SIRPα에 대한 CD47.
항-CD47 제제의 효과적인 용량은 제제에 따라 다양할 수 있지만, 일반적으로 다음 범위로 될 것이다: 최대 약 50 mg/kg, 최대 약 40 mg/kg, 최대 약 30 mg/kg, 최대 약 20 mg/kg, 최대 약 10 mg/kg, 최대 약 5 mg/kg; 최대 약 1 mg/kg, 최대 약 0.5 mg/kg; 최대 약 0.1 mg/kg; 최대 약 0.05 mg/kg; 여기서 본 용량은 특이적 항체 및 수령체에 따라 다양할 수 있다. CD47에 결합하는 제제, 예를 들어 가용성 SIRPa 폴리펩타이드 및 항-CD47 항체는 신체에서 CD47 발현 세포의 더 큰 수에 기인하여 더 높은 용량으로 투여될 수 있다.
항-CD47 제제는 이식 이전 1 또는 복수의 일 투여될 수 있고, 일부 구현예에서 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7 또는 그 초과 일, 즉 약 1 내지 7일, 약 1 내지 5일, 약 1 내지 3일, 등의 기간 동안 매일 투여된다. 항-c-키트 제제로, CD47을 표적화하는 것은 주입 후 공여체 줄기 세포에 영향을 줄 수 있고, 따라서 조혈 세포의 주입 전에 세정 기간이 요구된다. 세정 기간은 c-키트 항체로보다는 더 짧을 수 있지만, 전형적으로 적어도 약 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간이고, 그리고 최대 약 1주, 최대 약 5일, 최대 약 3일, 등일 수 있다.
일부 구현예에서, 적합한 항-CD47 제제 (예를 들어, 항-SIRPα 항체, 가용성 CD47 폴리펩타이드, 등)는 특이적으로 SIRPα를 결합하여 다음의 결합을 감소시킨다: SIRPα에 대한 CD47. SIRPα에 결합하는 적합한 항-CD47 작용제는 (예를 들어, SIRPα-발현 포식 세포에서) SIRPα를 활성화시키지 않는다. 적합한 항-CD47 작용제의 효능은 작용제를 검정함으로써 평가될 수 있다. 예시적인 검정에서, 표적 세포는 후보 제제의 존재 또는 부재에서 인큐베이션된다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 작용제는 상기 작용제의 부재 하의 식세포 작용에 비하여, 식세포 작용을 적어도 5% (예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 120%, 적어도 140%, 적어도 160%, 적어도 180%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%) 상향-조절할 것이다. 유사하게, 시험관내 SIRPα의 티로신 인산화의 수준에 대한 검정은 후보 제제의 부재에서 관측된 인산화에 비교하여 인산화에서 적어도 5% (예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%) 감소를 나타낼 것이다.
일부 실시형태에서, 항-CD47 작용제는 결합시에 CD47을 활성화시키지 않는다. CD47이 활성화되는 경우, 아폽토시스(즉, 세포 예정사)와 유사한 과정이 발생할 수 있다 (문헌 [Manna and Frazier, Cancer Research, 64, 1026-1036, Feb. 1 2004]). 따라서, 일부 실시형태에서, 항-CD47 작용제는 CD47-발현 세포의 세포사를 직접적으로 유도하지 않는다.
SIRPα 시약. SIRPα 시약은 신호 서열과 막관통 도메인 사이에 정상적으로 놓인, 인식가능한 친화성으로 CD47을 결합하기에 충분한 SIRPα의 부분, 또는 결합 활성을 함유하는 이의 단편을 포함한다. 적합한 SIRPα 시약은 천연단백질 SIRPα와 CD47 사이의 상호작용을 감소시킨다 (예를 들어, 차단한다, 예방한다, 등). SIRPα 시약은 일반적으로 적어도 SIRPα의 d1 도메인을 포함할 것이다.
일부 구현예에서, 대상체 항-CD47 제제는 다음과 같다: "고친화도 SIRPα 시약", 이것은 하기를 포함한다: SIRPα-유래된 폴리펩타이드 및 그것의 유사체 (예를 들어, CV1-hIgG4, 및 CV1 단량체). 고친화성 SIRPα 시약은 본 명세서에 구체적으로 참조로 포함되는 국제 출원 PCT/US13/21937호에 기재되어 있다. 고친화도 SIRPα 시약은 천연 SIRPα 단백질의 변이체이다. 증가된 친화성을 제공하는 아미노산 변화는 d1 도메인에 국소화되고, 따라서 고친화도 SIRPα 시약은 d1 도메인 내의 야생형 서열에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변화를 갖는 인간 SIRPα의 d1 도메인을 포함한다. 이러한 고친화도 SIRPα 시약은 선택적으로 추가의 아미노산 서열, 예를 들어 항체 Fc 서열; 비제한적으로 천연 단백질 또는 이의 단편의 잔기 150 내지 374, 일반적으로 d1 도메인과 인접한 단편을 포함한 d1 도메인 이외의 야생형 인간 SIRPα 단백질; 등을 포함한다. 고친화도 SIRPα 시약은 다음과 같을 수 있다: 단량체 또는 다량체, 즉 이량체, 삼량체, 사량체, 등. 일부 구현예에서, 고친화도 SIRPα 시약은 가용성이고, 여기서 폴리펩타이드는 SIRPα 막관통 도메인을 결하고 야생형 SIRPα 서열에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변화를 포함하고, 그리고 상기 아미노산 변화는, 예를 들어 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배, 적어도 500-배, 또는 그 초과로 오프-레이트를 감소시킴에 의해 CD47에 결합하는 SIRPα 폴리펩타이드의 친화성를 증가시킨다.
선택적으로 SIRPα 시약은 융합 단백질로, 예를 들어, 제2 폴리펩타이드를 갖는 프레임에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 융합 단백질의 크기를 증가시킬 수 있고, 예를 들어, 그래서 상기 융합 단백질은 순환으로부터 빠르게 제거되지 않을 것이다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 면역글로불린 Fc 영역의 일부 또는 전부이다. Fc 영역은 고친화도 SIRPα 시약에 의해 제공된 "나를 먹지마" 신호의 차단을 증진하는, "나를 먹어" 신호를 제공함에 의해 식균작용을 돕는다. 다른 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 Fc에 실질적으로 유사한 임의의 적합한 폴리펩타이드로, 예를 들어, 증가된 크기, 다량체화 도메인, 및/또는 추가의 결합 또는 Ig 분자와 상호작용을 제공한다.
항-CD47 항체. 일부 실시형태에서, 대상체 항-CD47 작용제는 CD47에 특이적으로 결합하며 (즉, 항-CD47 항체), 하나의 세포 (예를 들어, 감염된 세포) 상의 CD47과 또 다른 세포 (예를 들어, 포식 세포) 상의 SIRPα 간의 상호작용을 감소시키는 항체이다. 일부 실시형태에서, 적합한 항-CD47 항체는 결합시에 CD47을 활성화시키지 않는다. 일부 항-CD47 항체는 SIRPα에 대한 CD47의 결합을 감소시키지 않고 (그리고 따라서 본 명세서에서 "항-CD47 제제"인 것으로 간주되지 않고) 그리고 이러한 항체는 하기로 지칭될 수 있다: "비-차단 항-CD47 항체." "항-CD47 제제"인 적합한 항-CD47 항체는 하기로 지칭될 수 있다: "CD47-차단항체". 적합한 항체의 비-제한적인 예는 클론 B6H12, 5F9, 8B6, 및 C3을 포함한다 (예를 들어, 본 명세서에 구체적으로 참고로 편입된, 국제 특허 공개 WO 2011/143624호에 기재된 바와 같음). 적합한 항-CD47 항체는 완전 인간, 인간화 또는 키메라 버전의 이러한 항체를 포함한다. 인간화 항체 (예를 들어, hu5F9-G4)는 그들의 낮은 항원성으로 인하여 인간에서의 생체내 응용에 특히 유용하다. 유사하게, 개화, 고양이화 등의 항체는 각각 개, 고양이 및 다른 종에서의 응용에 특히 유용하다. 관심 대상항체는 인간화 항체, 또는 개화, 고양이화, 말화, 소화, 돼지화 등의 항체 및 그들의 변이체를 포함한다.
항-SIRPα 항체. 일부 실시형태에서, 대상체 항-CD47 작용제는 SIRPα에 특이적으로 결합하며 (즉, 항-SIRPα 항체), 하나의 세포 (예를 들어, 감염된 세포) 상의 CD47과 또 다른 세포 (예를 들어, 포식 세포) 상의 SIRPα 간의 상호작용을 감소시키는 항체이다. 적합한 항-SIRPα 항체는 SIRPα의 활성화가 식세포 작용을 억제할 것이기 때문에, SIRPα를 통한 신호전달을 활성화시키거나 자극하지 않고, SIRPα에 결합할 수 있다. 대신에, 적합한 항-SIRPα 항체는 정상 세포에 비하여 영향을 받은 세포의 우선적인 식세포 작용을 용이하게 한다. 다른 세포 (비-감염 세포)에 비하여 더 높은 수준의 CD47를 발현하는 그들 세포 (예를 들어, 감염 세포)는 우선적으로 식세포 작용될 것이다. 따라서, 적합한 항-SIRPα 항체는 (식세포 작용을 억제하기에 충분한 신호전달 반응의 활성화/자극없이) SIRPα에 특이적으로 결합하며, SIRPα와 CD47 간의 상호작용을 차단한다. 적합한 항-SIRPα 항체는 완전 인간, 인간화 또는 키메라버전의 이러한 항체를 포함한다. 인간화 항체는 그들의 낮은 항원성으로 인하여 인간에서의 생체내 응용에 특히 유용하다. 유사하게, 개화, 고양이화 등의 항체는 각각 개, 고양이 및 다른 종에서의 응용에 특히 유용하다. 관심 대상항체는 인간화 항체, 또는 개화, 고양이화, 말화, 소화, 돼지화 등의 항체 및 그들의 변이체를 포함한다.
용해성 CD47 폴리펩타이드. 일부 실시형태에서, 대상체 항-CD47 작용제는 SIRPα에 특이적으로 결합하며, 하나의 세포 (예를 들어, 감염 세포) 상의 CD47과 또 다른 세포 (예를 들어, 포식 세포) 상의 SIRPα 간의 상호작용을 감소시키는 용해성 CD47 폴리펩타이드이다. 적합한 용해성 CD47 폴리펩타이드는 SIRPα의 활성화가 식세포 작용을 억제할 것이기 때문에, SIRPα를 통한 신호전달의 활성화 또는 자극없이 SIRPα에 결합할 수 있다. 대신에, 적합한 용해성 CD47 폴리펩타이드는 비-감염 세포에 비하여 감염 세포의 우선적인 식세포 작용을 용이하게 한다. 정상, 비-표적 세포 (정상 세포)에 비하여 더 높은 수준의 CD47을 발현하는 그들 세포 (예를 들어, 감염 세포)는 우선적으로 식세포 작용될 것이다. 따라서, 적합한 용해성 CD47 폴리펩타이드는 식세포 작용을 억제하기에 충분한 신호전달 반응의 활성화/자극없이 SIRPα에 특이적으로 결합한다.
일부 경우에, 적합한 용해성 CD47 폴리펩타이드는 융합 단백질일 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 구체적으로 참조로 포함되는 미국 특허 공개 US20100239579호에 구조적으로 기재된 바와 같음). 그러나, SIRPα를 활성화/자극하지 않는 융합 단백질만이 본 명세서에 제공되는 방법에 적합하다. 적합한 용해성 CD47 폴리펩타이드는 또한 식세포 작용을 억제하기에 충분한 SIRPα 활성의 자극없이 SIRPα에 특이적으로 결합하고, CD47과 SIRPα 간의 상호작용을 억제할 수 있는 변이체 또는 천연적으로 존재하는 CD47 서열 (예를 들어, 세포외 도메인 서열 또는 세포외 도메인 변이체)을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 펩타이드 단편을 포함한다.
특정 실시형태에서, 용해성 CD47 폴리펩타이드는 신호 펩타이드를 포함하는 CD47의 세포외 도메인을 포함하여, CD47의 세포외 부분이 전형적으로 142개 아미노산 길이이게 한다. 본 명세서에 기재된 용해성 CD47 폴리펩타이드는 또한, 아미노산 서열을 적어도 65% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80 내지 85%, 85% 내지 90% 또는 95% 내지 99% (또는 65%와 100% 사이의 구체적으로 열거되지 않은 임의의 동일성 백분율) 포함하는 CD47 세포외 도메인 변이체를 포함하며, 이 변이체는 SIRPα 신호전달의 자극 없이 SIRPα에 결합하는 능력을 유지한다.
특정 실시형태에서, 신호 펩타이드 아미노산 서열은 또 다른 폴리펩타이드 (예를 들어, 면역글로불린 또는 CTLA4)로부터 유래되는 신호 펩타이드 아미노산 서열로 치환될 수 있다. 예를 들어, 세포외 막을 횡단하는 세포 표면 폴리펩타이드인 전장 CD47과 달리, 용해성 CD47 폴리펩타이드는 분비되며; 따라서, 용해성 CD47 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 세포로부터 보통 분비되는 폴리펩타이드와 회합된 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 용해성 CD47 폴리펩타이드는 신호 펩타이드가 결여된 CD47의 세포외 도메인을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 신호 펩타이드가 단백질의 전좌 동안 절단되거나 신호 펩타이드가 세포외 막에 계속 부착되기 때문에 (이러한 펩타이드는 신호 앵커(앵커)로도 지칭됨), 신호 펩타이드는 분비된 단백질 또는 막관통 단백질의 세포 표면 상에 노출되지 않는다. CD47의 신호 펩타이드 서열은 생체내에서 전구체 CD47 폴리펩타이드로부터 절단되는 것으로 여겨진다.
다른 실시형태에서, 용해성 CD47 폴리펩타이드는 CD47 세포외 도메인 변이체를 포함한다. 이러한 용해성 CD47 폴리펩타이드는 SIRPα 신호전달을 자극하지 않고, SIRPα에 결합하는 능력을 유지한다. CD47 세포외 도메인 변이체는 고유 CD47 서열과 적어도 65% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80 내지 85%, 85% 내지 90% 또는 95% 내지 99% (기재된 범위 중 어느 하나 사이의 임의의 동일성 백분율 포함) 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일시적 면역억제제. 일시적 면역억제제는 짧은 기간, 일반적으로 공여체 세포의 투여 시 또는 직전의 기간 동안 면역 세포, 특히 T 림프구의 활성을 차단한다. 일시적 면역억제, 즉 면역억제제(들)의 효과적인 혈청 수준은 적어도 약 3일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주 동안 유지될 수 있고, 최대 1개월, 최대 2개월, 최대 3개월, 최대 4개월, 최대 5개월, 최대 6개월, 또는 그 초과 동안 유지될 수 있다. 일부 구현예에서 제제의 단일 용량은 공여체 세포 직전에, 또는 동시에 투여된다. 이러한 제제는 면역 세포 모집단의 절제 없이 일반적으로 억제성이다. 제제의 초기 용량은 공여체 세포 투여 약 3일, 약 2일, 약 1일 이내에, 또는 투여 시에 제조될 수 있다.
일시적 면역억제는, 칼시뉴린 활성을 억제하기 위해 결합 단백질과 조합하고, 그리고 예를 들어, 타크롤리무스, 사이클로스포린 A, 등을 포함하는, 비제한적으로 칼시뉴린 억제제를 포함한 약리적 면역억제제의 투여에 의해 달성될 수 있다. 사이클로스포린 및 타크롤리무스 둘 모두의 수준은 주의하여 모니터링되어야 한다. 초기에, 수준은 10-20 ng/mL의 범위에서 유지될 수 있지만, 3개월 후에, 수준은 신독성의 위험을 감소시키기 위해 더욱 낮게 (5-10 ng/mL) 유지될 수 있다. 이러한 목적을 위한 다른 약리적 제제는 스테로이드, 아자티오프린, 마이코페놀레이트모페틸, 및 시롤리무스, 등을 포함한다.
일부 구현예에서 일시적 면역억제제는 CD40 및 CD40 리간드의 상호작용을 차단한다. CD40은 항원 제시 세포 (APC) 상에서 발견된 공동 자극 단백질이고 그것의 활성화를 위해 필요하다. 이들 APC는 식균세포 (대식세포 및 수지상 세포) 및 B 세포를 포함한다. CD40은 TNF 수용체 계열의 일부이다. CD40에 대한 일차 활성화 신호전달 분자는 IFNγ 및 CD40 리간드 (CD40L)이다.
"CD40 리간드" ("CD40L", 또한 소위 "CD154")는 유형 II 막관통 단백질이다. CD40L은 T 세포-의존적 B 세포 활성화, 증식, 및 분화의 매개체로서 작용하는 활성화된 T 림프구에 제한되어 본래 간주되었다. CD40L의 발현은 종양 괴사 인자 (TNF) 유전자 상과의 면역력 및 염증의 중심 매개체로 기능적 역할을 수행한다. CD40/CD40L 상호작용은 가슴샘-의존적 체액성 면역반응의 전개에 필수적이다. CD40L은 생리적 과정, 예컨대 T 세포-매개된 효과기 기능 및 적절한 숙주 방어에 필요한 일반적인 면역 반응을 조절할 뿐만 아니라 전-염증 매개체, 예컨대 사이토카인, 접착 분자, 및 매트릭스 분해 활성의 발현을 촉발시키고, 이들 모두는 만성 염증성 질환, 예를 들어, 자가면역 장애, 관절염, 죽상경화증, 및 암의 발병과 연관된다.
면역 반응의 많은 양태를 매개하는 데 있어 그것의 중대한 역할을 고려하면, CD40/CD40L 경로는 이식 거부의 방지를 위한 치료 표적을 제공한다. 항-CD40L 항체로 CD40/CD40L 신호경로를 차단하는 것은 동물 모델 및 임상 사용에서 급성 동종이식편 거부반응 및 동종항체 반응을 방지하는데 효과적일 수 있다. 후속적인 연구는 수 많은 설치류 모델 (소도, 팔다리, 각막 및 골수)에서 이식 생존의 연장에 대해 항-CD40L의 유익한 효과를 실증했다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항-CD40L 제제" 또는 "CD40L 차단에 제공하는 제제"는 CD40에 대한 CD40L의 결합 (예를 들어, 표적 세포 상)을 감소시키는 임의의 제제를 지칭한다. 적합한 항-CD40L 시약의 비-제한적인 예는 항-CD40 항체, 및 항-CD40L 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 관심 있는 제제는 또한, 비제한적으로, 항체 및 소분자의 단편을 포함한다. 예를 들어, CDP7657은 고친화도 페길화된 1가 Fab' 항-CD40L 항체 단편이다. 항체의 효과적인 용량은 최대 약 50 mg/kg, 최대 약 25 mg/kg; 최대 약 10 mg/kg, 최대 약 5 mg/kg; 최대 약 1 mg/kg; 최대 약 0.5 mg/kg; 또는 그 미만일 수 있고, 여기서 본 용량은 특이적 항체 및 수령체에 따라 다양할 수 있다. 항체에 대한 대안적인 것으로, 소분자 억제제가 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다: Chen 등 (2017) J. Med. Chem. 60, 8906-8922, 본 명세서에 구체적으로 참고로 편입됨.
T 세포 절제. 일부 이식 상황에 대해, 표 1에서 설명된 바와 같이, 내인성 T 세포를 제거시키는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서 절제 제제는 T 세포에 특이적이고, 다른 경우에 이것은 또한 NK 세포 상에 작용한다. T 세포를 표적화하는 항체는, 예를 들어, CD2, CD3, CD4, CD8, CD52 (캄파쓰), CD45, 및 ATG에 특이적인 항체를 포함한다.
타이밍에 관하여, T 세포 고갈 유도제는 바람직하게는 공여체 세포의 투여시 또는 투여 직전의 기간에서 활성이다. 고갈 제제의 치료 수준은 공여체 세포의 투여에 이어 적어도 약 3일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주 동안 유지될 수 있고, 그리고 최대 1개월, 최대 2개월, 최대 3개월, 최대 4개월, 최대 5개월, 최대 6개월, 또는 그 초과 동안 유지될 수 있다. 일부 구현예에서 제제의 용량은 공여체 세포의 투여 약 3일 이내, 약 2일 이내, 약 1일 이내, 또는 투여 시에 투여되고, 그리고 항체에 의존하여, 주입 이전 며칠, 예를 들어 2, 3 4 등 동안 매일 투여될 수 있다. 항체의 효과적인 용량은 최대 약 50 mg/kg, 최대 약 25 mg/kg; 최대 약 10 mg/kg, 최대 약 5 mg/kg; 최대 약 1 mg/kg; 최대 약 0.5 mg/kg; 또는 그 미만, 예를 들어 최대 약 100 ㎍/kg, 최대 약 50 ㎍/kg, 최대 약 10 ㎍/kg, 최대 약 1 ㎍/kg일 수 있고, 여기서 본 용량은 특이적 항체 및 수령체에 따라 다양할 수 있다. 항체-기반 요법은 단클론성 (예를 들어, 무로모납-CD3) 또는 다클론성 항체; 항-CD25 항체 (예를 들어, 바실릭시마맙, 다클리주맙), 등을 사용할 수 있다. 항체는, 예를 들어, 하기를 포함한다: ATG 제제, KT3, BTI-322® (미국 특허 번호 5,730,979호로 그것의 개시내용은 이로써 참고로 편입된다).
다중 항-인간 CD3 mAb는 테플리주맙을 포함하여 임상 전개 중에 있고, 그리고 MGA031은 인간 IgG1 백본 안으로 OKT3의 상보성 결정 영역을 그라프팅함에 의해 전개된 인간화된 IgG1 항체이다. 오텔릭시주맙 (ChAglyCD3, TRX4, GSK2136525)은 랫트 항체 YTH12.5로부터 유래되고, 당화를 피하고 따라서 FcR 결합을 억제하기 위해 γ1 Fc 부분에서 단일 돌연변이로 인간화된 IgG1이다. 비실리주맙 (Nuvion, HuM291)은 그것의 Fc 영역에서 2개의 점 돌연변이에 의해 비 미토겐성이 부여된 인간화된 IgG2 항체이다. 포랄루맙 (28F11-AE; NI-0401)은 전적으로 인간 항-CD3 mAb이다.
T 세포 및 NK 세포의 고갈을 위해 유용한 제제는 임상적으로 승인된 항체 캄파쓰 (알렘투주맙)에 의해 예시된 항-CD52 항체이고, 이것은 21-28 kD 세포 표면 당단백질, CD52에 대해 지향된 재조합 DNA-유래된 인간화된 단클론성 항체이다. 캄파쓰-1H는 쥣과 (랫트) 단클론성 항체 (캄파쓰-1G)로부터 인간 가변 프레임워크 및 불변영역, 및 상보성-결정 영역을 갖는 IgG1 카파 항체이다. 캄파쓰는, 예를 들어, 현재 허용된 임상 용량, 예를 들어 약 3 내지 약 7일의 기간에 걸쳐 30 mg의 최대 단일 용량으로 상승하는 용량으로 투여될 수 있다.
NK 세포 절제. 일부 이식 상황에 대해, 표 1에서 설명된 바와 같이, 내인성 NK 세포를 또한 제거하는 것이 바람직하다. 상기에서 나타낸 바와 같이, 일부 제제는 T 세포 및 NK 세포 둘 모두, 예를 들어 CD2, CD52, 등에 대한 항체에 작용한다. 다른 제제는 NK 세포에 특이적이고 T 세포 표적화된 제제와 조합하여 투여될 수 있다. NK 세포를 선택적으로 표적화하는 항체는, 예를 들어, CD122 및 CD56에 특이적인 항체를 포함한다.
타이밍에 관하여, NK 세포 고갈 유도제는 바람직하게는 공여체 세포의 투여시 또는 투여 직전의 기간에서 활성이다. 고갈 제제의 치료 수준은 공여체 세포의 투여에 이어 적어도 약 3일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주 동안 유지될 수 있고, 그리고 최대 1개월, 최대 2개월, 최대 3개월, 최대 4개월, 최대 5개월, 최대 6개월, 또는 그 초과 동안 유지될 수 있다. 일부 구현예에서 제제의 용량은 공여체 세포의 투여 약 3일 이내, 약 2일 이내, 약 1일 이내, 또는 투여 시에 투여되고, 그리고 항체에 의존하여, 주입 이전 며칠, 예를 들어 2, 3, 4 등 동안 매일 투여될 수 있다. 항체의 효과적인 용량은 최대 약 50 mg/kg, 최대 약 25 mg/kg; 최대 약 10 mg/kg, 최대 약 5 mg/kg; 최대 약 1 mg/kg; 최대 약 0.5 mg/kg; 또는 그 미만, 예를 들어 최대 약 100 ㎍/kg, 최대 약 50 ㎍/kg, 최대 약 10 ㎍/kg, 최대 약 1 ㎍/kg일 수 있고, 여기서 본 용량은 특이적 항체 및 수령체에 따라 다양할 수 있다.
"CD122" (또한 소위 "인터류킨-2 수용체 서브 유닛 베타", IL2RB)는 유형 I 막 단백질이다. CD122는 T 세포-매개된 면역 반응에 관여되고 인터류킨 2에 결합하는 능력에 관하여 3가지 형태로 존재하는 인터류킨 2 수용체 (IL2R)의 서브유닛이다. IL2R의 저친화도 형태는 알파 소단위의 단량체이고 신호 형질도입에는 관여되지 않는다. 중간 친화성 형태는 알파/베타 서브유닛 이종이량체로 구성되고, 반면에 고 친화도 형태는 알파/베타/감마 서브유닛 헤테로트리머로 구성된다. 수용체의 중간 및 고 친화도 형태 둘 모두는 인터류킨 2로부터 미토겐성 신호의 형질도입과 수용체-매개된 세포내이입에 관여된다. 대안적인 프로모터의 사용은 동일한 단백질을 인코딩하는 다중 전사 변이체를 초래한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항-CD122 제제" 또는 "CD122 차단에 제공하는 제제"는 자연 살해 (NK) 세포를 포함하여, CD122 양성 세포를 감손시키는 임의의 제제를 지칭한다. 적합한 항-CD122 시약의 비-제한적인 예는 항-IL-2 항체, 및 항-CD122 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
CD56을 표적화하는 항체는 임상 전개 중에 있고 NK 세포 고갈에 사용된다. 예를 들어, IMGN901은 약 75 mg/m2의 최대 내성 용량 (MTD)을 가지고, 예를 들어, 약1 내지 약 60 mg/m2의 용량으로 투여될 수 있는 세포독성 메이탄시노이드 DM1의 선택적 전달을 위해 설계된 CD56-표적화 항체-약물 콘주게이트이다.
"주요 조직적합성 복합체 항원" ("MHC", 또한 "인간 백혈구 항원", HLA로 불림)은 이들 세포에 독특한 항원성 실체를 부여하는 세포의 표면 상에서 발현된 단백질 분자이다. MHC/HLA 항원은 면역작동체세포와 조혈 줄기 세포의 동일한 공급원으로부터 유래된 ("자기") 또는 조혈 재구성 세포의 다른 공급원으로부터 유래된 ("비자기") 것으로 T-세포와 자연 킬러 (NK) 세포에 의해 인식되는 표적 분자이다. HLA 항원의 2개의 주요 부류가 인식된다: HLA 부류 I 및 HLA 부류 II.HLA 부류 I 항원 (인간에 있어 A, B, 및 C)은 "자기"로 인식가능한 각각의 세포를 부여하고 반면에 HLA 부류 II 항원 (인간에 있어 DR, DP, 및 DQ)은 림프구와 항원 제시 세포 사이의 반응에 관여된다. 둘 모두 이식된 장기의 거부 반응에 연루되었다.
HLA 유전자 시스템의 중요한 양상은 이의 다형성이다. 각 유전자, MHC 부류 I (A, B와 C) 및 MHC 부류 II (DP, DQ와 DR)는 상이한 대립형질에서 존재한다. HLA 대립형질은 숫자와 아래 첨자에 의해 지정된다. 예로서, 2명의 관련 없는 개체는 각각, 부류 I HLA-B, 유전자 B5, 그리고 Bw41을 운반할 수 있다. 대립유전자 유전자 산물은 α 및/또는 β 도메인(들)에서 하나 이상의 아미노산에서 상이하다. 큰 패널의 특이적 항체 또는 핵산 시약이 부류 I과 부류 II 분자를 발현하는 백혈구를 이용하여, 개체의 HLA 일배체형을 형 결정하는데 이용된다. HLA 형 결정을 위해 가장 중요한 유전자는 6개의 MHC 부류 I과 부류 II 단백질, 각 HLA-A에 대한 2개의 대립형질; HLA-B와 HLA-DR이다.
HLA 유전자는 염색체 위치 6p21에서 존재하는 "슈퍼좌위"에서 군집되고, 이것은 면역계의 조절에서뿐만 아니라 일부 다른 근본적인 분자와 세포 과정에서 중요한 역할을 갖는 6개의 고전적 이식 HLA 유전자 및 최소한 132개 단백질 코딩 유전자를 인코딩한다. 완전한 좌위는 크기가 거의 3.6 Mb이고, 최소한 224개의 유전자 좌위를 갖는다. 이러한 군집화의 한가지 효과는 "일배체형", 다시 말하면, 한 부모로부터 유전되는, 단일 염색체상에 존재하는 대립형질의 세트가 하나의 군으로서 유전되는 경향이 있다는 것이다. 각 부모로부터 유전된 대립형질의 세트가 일배체형을 형성하고, 여기서 일부 대립형질은 서로 연관되는 경향이 있다. 환자의 일배체형을 확인하는 것은 적합 공여체를 발견하는 확률을 예측하는데 도움을 주고 검색 전략을 개발하는데 보조할 수 있는데, 그 이유는 일부 대립형질과 일배체형이 다른 것들보다 더욱 통상적이고, 그리고 이들이 상이한 민족군과 인종군에서 상이한 빈도로 분포되기 때문이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "HLA 정합된"은 HLA 항원 중에서 어느 것도 공여체와 수용체 사이에 부정합되지 않는 공여체 수용체쌍을 지칭한다. HLA 정합된 (즉, 6개 대립형질 모두 정합된다) 공여체/수용체 쌍은 부정합된 쌍 (즉, 6개 대립형질 중에서 최소한 하나가 부정합된다)에 비하여 이식편대 숙주 질환 (GVHD)의 줄어든 위험을 갖는다. HLA 반수체는 하나의 염색체가 적어도 HLA-A; HLA-B 및 HLA-DR에서 정합되고, 염색체 상의 소수의 조직적합성 유전자좌에서 정합될 수 있지만; 제2 염색체 상에서는 반드시 정합되지 않는 매칭을 지칭한다. 이러한 공여체는 빈번하게 가족에서 발생하고, 예를 들어 모체는 아동에 대해 반수체이고; 형제자매는 반수체일 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "HLA 부정합된"은 특히 HLA-A, HLA-B와 HLA-DR에 대하여 최소한 하나의 HLA 항원이 공여체와 수용체 사이에 부정합되는 공여체 수용체 쌍을 지칭한다. 일부 경우에, 한 일배체형은 정합되고, 그리고 다른 것은 부정합된다. 이러한 환경은 살아있는 또는 사망한 공여체로부터의 장기에서 빈번하게 발견된다. HLA 부정합된 공여체/수용체 쌍은 완벽하게 정합된 쌍 (즉, 6개 대립형질 모두 정합된다)에 비하여 GVHD의 증가된 위험을 갖는다.
HLA 대립형질은 전형적으로, 다양한 수준의 상세에서 언급된다. 대부분의 지명은 HLA- 및 좌위 명칭으로 시작하고, 이후 * 및 대립형질을 명시하는 일부 한자리 숫자 (짝수)가 뒤따른다. 처음 2개의 숫자는 대립형질의 군을 명시한다. 더욱 오래된 형 결정 방법론은 종종, 대립형질을 완전하게 식별할 수 없었고, 따라서 이러한 수준에서 중지되었다. 세 번째 내지 네 번째 숫자는 동의의 대립형질을 명시한다. 다섯 번째 내지 여섯 번째 숫자는 유전자의 코딩프레임 내에서 임의의 동의의 돌연변이를 표시한다. 일곱 번째와 여덟 번째 숫자는 코딩 영역외부에 돌연변이를 식별한다. 문자, 예를 들면, L, N, Q, 또는 S가 발현수준 또는 이에 관해 공지된 다른 비게놈 데이터를 명시하기 위해 대립형질의 지명을 뒤따를 수 있다. 따라서, 완전하게 설명된 대립형질은 HLA-접두사와 좌위 표기법을 포함하지 않고 최대 9개 숫자일 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "수용체"는 통상적으로 동일한 종의 다른 개체 (공여체)로부터 장기, 조직 또는 세포가 이전되는 개체이다. 본 발명의 목적으로, 수용체와 공여체는 HLA-정합되거나 또는 HLA-부정합된다.
본 명세서에 사용되는 "항체"는 특정 항원과 면역학적으로 반응성인 면역글로불린 분자에의 언급을 포함하며, 다클론성 및 단클론성 항체 둘 모두를 포함한다. 상기 용어는 또한, 유전자 조작된 형태, 예를 들어, 키메라 항체 (예를 들어, 인간화 쥣과 항체) 및 헤테로컨쥬게이트 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 항원-결합 능력을 갖는 단편을 포함한 항체의 항원 결합 형태를 포함한다 (예를 들어, Fab', F(ab')2, Fab, Fv 및 rIgG. 또한, 상기 용어는 재조합 단쇄 Fv 단편 (scFv)을 지칭한다. 또한, 용어 항체는 2가 또는 이중특이적 분자, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다.
내인성 줄기 세포 절제 및 일시적 면역억제를 위한 항체 선택은 하기를 포함한 다양한 기준에 기반될 수 있다: 선택성, 친화성, 세포독성, 등. 단백질 또는 펩타이드에 대해 언급하는 경우, 어구 항체에 "구체적으로 (또는 선택적으로) 결합한다" 또는 "구체적으로 (또는 선택적으로) 면역반응"은 단백질 및 다른 생물제제의 불균질 모집단에서, 단백질의 존재에 결정적인 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 표기된 면역 검정 조건하에, 특정 항체는 특정 단백질 서열에 백그라운드의 적어도 2배로, 더욱 전형적으로는 백그라운드의 10 내지 100배 초과로 결합한다. 일반적으로 본 발명의 항체는 효과기 세포 (예를 들어, 자연 살해 세포 또는 대식구)의 존재 하에 표적 세포의 표면상의 항원에 결합한다. 효과기 세포 상의 Fc 수용체는 결합된 항체를 인식한다. Fc 수용체의 가교결합은 효과기 세포에 세포용해 또는 세포자멸사에 의해 표적 세포를 사멸하도록 신호한다. 일 구현예에서, 유도는 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)에 의해 달성된다. 대안적인 구현예에서, 항체는 표적화된 세포의 성장 억제에서 활성이고, 절제는 성장 인자 신호전달, 예를 들어 성장 인자 수용체 예컨대 c-키트에 특이적인 항체로 방해함에 의해 달성된다.
특정 항원과 면역학적으로 반응성인 항체는 재조합 방법, 예를 들어, 파지 또는 유사한 벡터내의 재조합 항체의 라이브러리의 선택에 의해 또는 동물을 항원 또는 항원을 인코딩하는 DNA로 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 다클론성 항체의 제조 방법은 숙련자에게 알려져 있다. 항체는 대안적으로 단클론성 항체일 수 있다. 단클론성 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 적절한 숙주 동물을 전형적으로 면역화제로 면역화시켜, 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나, 이를 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 형성한다.
인간 항체는 파지디스플레이 라이브러리를 포함하는 해당 분야에 알려져 있는 다양한 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화되는 마우스 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 시험 감염시에, 인간 항체 생성이 관찰되며, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 포함하는 모든 면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다.
항체는 또한, 다양한 펩티다제로의 분해에 의해 생성되는 다수의 널리-특성화된 단편으로서 존재한다. 따라서 펩신은 자체로 디설파이드 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄인 Fab의 이량체인, F(ab)'2를 생성하는 힌지 영역에서의 디설파이드 연결기 아래 항체를 소화한다. F(ab)'2는 힌지 영역에서의 디설파이드 연결을 파괴하도록 온화한 조건하에서 감소될 수 있고, 그것에 의해 F(ab)'2이량체를 Fab' 단량체로 전환시킨다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab이다. 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 소화의 관점에서 정의되어 있지만, 통상의 기술자는 이러한 단편이 화학적으로나 또는 재조합 DNA 방법론을 사용함에 의해 새로이 합성될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 항체는 또한 전체의 항체의 변형에 의해 생산된 항체단편이나, 또는 재조합 DNA 방법론 (예를 들어, 단일사슬 Fv)을 사용하여 새로이 합성된 것들 또는 파아지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 확인된 것들 포함한다.
"인간화 항체"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 면역글로불린 분자이다. 인간화 항체는 수여자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간종 (공여체 항체), 예를 들어, 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수여자 항체)을 포함한다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해서 대체된다. 인간화된 항체는 또한 수용체 항체에서도 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하며, 프레임워크(FR) 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것들이다. 인간화 항체는 또한, 면역글로불린 불변영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 최적으로 포함할 것이다.
절제에 대한 관심 있는 항체는 ADCC (항체-의존적 세포의 세포독성)을 유도하는 그것의 능력에 대해 시험될 수 있다. 항체-관련 ADCC 활성을 용해된 세포로부터의 표지 또는 락트산염 탈수소효소 중 어느 하나의 방출의 검출 또는 감소된 표적 세포 생존력의 검출 (예를 들어, 아넥신 검정)을 통해 모니터링하고 정량화시킬 수 있다. 세포자멸사에 대한 검정은 말단 데옥시뉴클레오티딜 전달효소-매개된 디곡시제닌-11-dUTP 틈새 말단 라벨링 (TUNEL) 검정에 의해 수행될 수 있다 (Lazebnik 등, Nature: 371, 346 (1994). 또한, 세포 독성은 해당분야에 알려져 있는 검출 키트, 예를 들어, 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)(미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재)로부터의 세포독성 검출 키트에 의해 직접적으로 검출될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 표적 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 80% 세포독성을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 효과기 모이어티에 접합된다. 효과기 모이어티는 라벨링 모이어티 예컨대 방사성 라벨 또는 형광 라벨을 포함한 임의의 수의 분자일 수 있거나, 또는 세포독성 모이어티일 수 있다. 세포독성 약물은 수 많게 다양하고, 비제한적으로, 세포독성 약물 또는 독소나 이러한 독소의 활성 단편을 포함한다. 적합한 독소 및 그것의 상응하는 단편은 디프테리아 A 사슬, 외독소 A 사슬, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 쿠르신, 크로틴, 페노마이신, 에노마이신, 사포린, 아우리스타틴-E 및 기타 동종의 것을 포함한다. 세포독성 약물은 또한 항체에 방사성동위원소를 접합함에 의해 제조된 방사성화학물질을 포함한다. 막관통 단백질에 세포독성 모이어티를 표적화하는 것은 표적화된 영역에서 세포독성 모이어티의 국소 농도를 증가시키는 작용을 한다.
용어 줄기 세포는 자기-재생하고 분화된 자손을 발생시키는 능력 둘 모두를 가지는 포유동물 세포를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다 (다음 문헌 참고: Morrison 등 (1997) Cell 88:287-298). 일반적으로, 줄기 세포는 또한 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: 비동시적인, 또는 대칭 복제를 당하는 능력, 즉 분할 후 2개의 딸 세포가 상이한 표현형을 가질 수 있음; 광범위한 자기-재생 능력; 유사분열로 휴지기 형태로 존재하는 능력; 및 이들이 존재하는 모든 조직에서 클론 재생, 예를 들어 모든 조혈 계열을 재구성하는 조혈 줄기 세포의 능력.
생착 목적을 위해, 조혈 줄기 세포를 포함하는 조성물이 환자에게 투여된다. 이러한 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 줄기 세포는, 꼭 그렇지는 않지만, 선택적으로 정제된다. 풍부한 보고서는 하기를 포함하여, 줄기 세포의 정제 및 후속적인 생착에 대한 다양한 방법을 탐구한다: 유세포측정; 세포선별장치 시스템 (Klein 등 (2001) Bone Marrow Transplant.28(11):1023-9; Prince 등 (2002) Cytotherapy 4(2):137-45); immunomagnetic separation (Prince 등 (2002) Cytotherapy 4(2):147-55; Handgretinger 등 (2002) Bone Marrow Transplant.29(9):731-6; Chou 등 (2005) Breast Cancer.12(3):178-88); 및 기타 동종의 것. 각각의 이들 참조문헌은, 특히 조혈 줄기 세포 이식을 위한 절차, 세포 조성물 및 용량에 관하여 본 명세서에 구체적으로 참고로 편입된다.
조혈 줄기 세포는 골수로부터 또는 말초 혈액으로부터 수확함에 의해 수득될 수 있다. 골수는 일반적으로 공여체가 국소 또는 전신 마취 하에 있는 동안 후측 장골 볏으로부터 흡인된다. 추가의 골수는 전측 장골 볏으로부터 수득될 수 있다. 킬로그램당 1 X 108 및 2 X 108 골수 단핵 세포의 용량이 일반적으로 자가 및 동종이계 골수 이식 각각에서 생착을 확립하기에 바람직한 것으로 간주된다. 골수는 줄기 세포 수를 증가시키기 위해 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF; 필그라스팀 [뉴포겐])로 프라이밍될 수 있다. 본 명세서에 기재된 목적을 위한 "전체의 골수"에 대한 언급은 일반적으로 특이적 면역 세포 서브셋을 위해 선택되지 않은 골수로부터 유래된 단핵 세포의 조성물을 지칭한다. "분별된 골수"는, 예를 들어, T 세포, 예를 들어 CD8+ 세포, CD52+ 세포, CD3+ 세포, 등이 감손될 수 있고; CD34+ 세포, 등이 풍부할 수 있다.
조혈 줄기 세포는 또한 제대혈로부터 수득된다. 제대혈은 동종이계 조혈 줄기 세포 이식을 위한 조혈 줄기 세포의 거의 비제한된 공급원이다. 제대혈 은행 (CBB)은 소아 및 성인에서 수행된 20,000 초과 탯줄 혈액 이식 및 이용가능한 400,000 단위 초과를 갖는 관련된 또는 관련 없는 UCBT에 대해 확립되었다. UCB 조혈 선조는 생체내 장기간 재이식 줄기 세포를 생산할 수 있는 원시 줄기/선조 세포에서 풍부하다. 그러나, 임의의 단일 공여체로부터 이용가능한 세포의 수는 다른 공급원과 비교하여 상대적으로 낮을 수 있다.
G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인에 의해 골수로부터 말초 혈액 안으로 줄기 세포의 동원은 조혈 줄기 세포 이식을 위한 분리반출법에 의한 말초 혈액 선조 세포 수집의 널리 퍼진 채택을 초래한다. 동원을 위해 사용된 G-CSF의 용량은 10 ㎍/kg/1일이다. 그러나, 심하게 사전 처리된 자가공여체에서는, 최대 40 ㎍/kg/1일의 용량이 주어질 수 있다. 모조빌은 수집용 말초 혈액으로 조혈 줄기 세포를 동원하기 위해 G-CSF와 공조하여 사용될 수 있다.
투여된 줄기 세포의 용량은 주입된 세포 조성물의 원하는 순도, 및 세포의 공급원에 의존할 수 있다. 현행 지침은 생착을 위해 필요한 최소 용량은 1-2 x 106 CD34+ 세포/자가 및 동종이계 이식을 위한 체중 kg이다는 것을 나타낸다. 더 높은 용량은, 예를 들어, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 107 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 빈번하게 용량은 이용가능한 세포의 수에 의해 제한된다. 전형적으로, 공급원에 무관하게, 용량은 존재하는 CD34+ 세포의 수에 의해 계산된다. CD34+ 세포의 퍼센트 수는 미분별된 골수 또는 동원된 말초 혈액에 대해 낮을 수 있고; 이 경우에 투여된 세포의 총수는 훨씬 높다.
CD34+ 세포는 공여체 조혈 세포 샘플로부터의 비제한적으로 자기 비드 선택, 유세포측정, 및 기타 동종의 것을 포함한, 친화성 방법에 의해 선택될 수 있다. HSPC 조성물은 모집단에서 CD34+인 세포의 백분율에 의해 정의될 때 적어도 약 50% 순수할 수 있고, 적어도 약 75% 순수, 적어도 약 85% 순수, 적어도 약 95% 순수, 또는 그 초과로 순수할 수 있다. 바람직한 HSPC 조성물로 전달된 CD3+ 세포의 최대수는 약 106 CD3+ 세포/수령체 체중의 kg 이하, 약 105 CD3+ 세포/수령체 체중의 kg 이하, 약 104 CD3+ 세포/수령체 체중의 kg 이하이다. 대안적으로 세포 모집단은 CD34 및 CD90의 발현에 대해 무작위로 선택될 수 있어, 세포 모집단은 고순도, 예를 들어 적어도 약 85% CD34+CD90+ 세포, 적어도 약 90% CD34+CD90+ 세포, 적어도 약 95% CD34+CD90+ 세포일 수 있고 그리고 최대 약 99% CD34+CD90+ 세포 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 조작되지 않은 골수 또는 동원된 말초 혈액 모집단이 사용된다.
조혈 줄기 세포는 또한, 예를 들어 만능 배아 줄기 세포, 유도된 만능 세포, 및 기타 동종의 것으로부터 시험관내 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 구체적으로 참고로 편입된 문헌 [Sugimura 등 (2017) Nature 545:432-438]을 참고하고, 이것은 조혈 선조의 생성에 대한 프로토콜을 상설한다.
이용되는 세포는 신선하거나, 냉동될 수 있거나, 또는 사전 배양되었다. 이들은 태아, 신생아, 성인, 등일 수 있다. 조혈 줄기 세포는 태아 간, 골수, 혈액, 특히 G-CSF 또는 GM-CSF 동원된 말초 혈액, 또는 임의의 다른 통상적인 공급원으로부터 수득될 수 있다. 생착을 위한 세포는 다른 세포로부터 선택적으로 단리되고, 줄기 세포가 조혈 또는 다른 계열의 다른 세포로부터 분리되는 방식은 본 발명에 중요하지 않다. 요망하는 경우, 줄기 또는 선조 세포의 실질적으로 균질한 모집단은 줄기 세포와 연관된 에피토프 특성을 나타내는 동안 분화된 세포와 연관된 마커의 세포 유리의 선택적 단리에 의해 수득될 수 있다.
세포는 분화된 세포에서 유용한 유전자, 예를 들어 개체, 선별 마커, 등에서 유전적 결손의 회복, 또는 미분화된 ES 세포에 대한 선택에서 유용한 유전자를 도입하기 위해 유전자적으로 변경될 수 있다. 세포는 또한 생존, 조절 증식, 및 기타 동종의 것을 고양하기 위해 유전자적으로 변형될 수 있다. 세포는 적합한 벡터, 상동성 재조합, 또는 다른 적절한 기술로 형질감염 또는 형질도입에 의해 유전자적으로 변경되고 있을 수 있어, 이들은 관심 유전자를 발현한다. 일 구현예에서, 세포는 전형적으로 내인성 프로모터 하에서 발생하는 것을 넘어 텔로머라제 발현을 증가시키는 이종성 프로모터 하에서, 텔로머라제 촉매적 성분 (TERT)을 인코딩하는 유전자로 형질감염된다, (국제 특허 출원 WO 98/14592호 참고). 다른 구현예에서, 선별 마커는 원하는 분화하는 세포의 그 초과 순도를 제공하기 위해 도입된다. 세포는 8-16 h 기간에 걸쳐 벡터 함유 상청액을 사용하여 유전자적으로 변경될 수 있고, 그 다음 1-2일 동안 성장 배지로 교환된다. 유전자적으로 변화된 세포는 약물 선택 제제 예컨대 퓨로마이신, G418, 또는 블라스티사이딘을 사용하여 선택되고, 그 다음 재배양된다.
본 발명의 세포는 또한 조직 재생에 관여되는 그것의 능력을 고양하거나 또는 투여 부위에 치료적 유전자를 전달하기 위해 유전자적으로 변경될 수 있다. 벡터는 구성적, 범-특이적, 분화된 세포 유형에서 구체적으로 활성, 등인 프로모터에 작동가능하게 연결된, 원하는 유전자에 대한 알려진 인코딩 서열을 사용하여 설계된다. 적합한 유도성 프로모터는 형질감염된 세포, 또는 이들의 자손 중 어느 하나인 원하는 표적 세포 유형에서 활성화된다. 전사 활성화에 의해, 전사는 표적 세포에서의 기저 수준보다 적어도 약 100배, 더 일반적으로 적어도 약 1000배 이상 증가될 것이라는 것이 의도된다. 상이한 세포 유형에서 유도된 다양한 프로모터가 알려져 있다.
표적 포유동물 세포 안으로 외인성 유전자를 이송시키는데 유용한 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터는 에피솜, 예를 들어 플라스미드, 사이토메갈로바이러스, 아데노바이러스, 등과 같은 바이러스 유래된 벡터일 수 있거나, 또는 상동성 재조합 또는 랜덤 통합, 예를 들어 MMLV, HIV-1, ALV, 등과 같은 레트로바이러스 유래된 벡터를 통해 표적 세포 게놈 안으로 통합될 수 있다. 줄기 세포의 변형을 위해, 렌티바이러스 벡터가 바람직하다. 렌티바이러스 벡터 예컨대 HIV 또는 FIV gag 서열에 기반된 것들이 비-분할 세포, 예컨대 인간 줄기 세포의 휴지기를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 및 적절한 패키징 라인의 조합은 또한 캡시드 단백질이 표적 세포를 감염시키는데 기능적일 곳에서 사용할 수 있다. 일반적으로, 세포 및 바이러스는 배양 배지에서 적어도 약 24시간 동안 인큐베이션될 것이다. 세포는 그런 다음 일부 적용에서 짧은 간격, 예를 들어. 24-73시간 동안, 또는 적어도 2주 동안 배양 배지에서 성장하도록 허용되고, 분석 전 5주 이상 동안 성장하도록 허용될 수 있다. 통상적으로 사용된 레트로바이러스 벡터는 "결함 있는", 즉. 생산적인 감염에 필요한 바이러스 단백질을 생산할 수 없다. 벡터의 복제는 포장 세포 주에서 성장을 요한다. 벡터는 예를 들어 재조합효소 시스템 예컨대 Cre/Lox를 사용하여 추후 제거되어야 하는 유전자, 또는 예를 들어 하기와 같은 선택적 독성을 허용하는 유전자를 포함시킴에 의해 파괴된 이들을 발현하는 세포를 포함할 수 있다: 헤르페스바이러스 TK, bcl-xs, 등.
키메라현상은 본원에서 이용된 바와 같이, 달리 언급되지 않으면 조혈계의 키메라현상을 일반적으로 지칭한다. 개체가 전체 키메라, 혼합된 키메라, 또는 제작된 비-키메라성인지 여부의 결정은, 당해 분야에서 알려진 바와 같이, 이식 수령체로부터의 조혈 세포 샘플, 예를 들어 말초 혈액, 골수, 등의 분석에 의해 이루어 질 수 있다. 분석은 임의의 편리한 타이핑 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 모든 단핵세포, T 세포, B 세포, CD56+ NK 세포, 그리고 CD15+ 호중구 사이에서 키메라현상의 정도는 미소부수체 분석을 위한 프로브로 PCR을 이용하여, 규칙적으로 모니터링된다. 예로서, 공여체와 숙주 기원의 짧은 말단 반복 길이에서 다형성을 식별하는 상업적인 키트가 가용하다. 자동화된 판독기는 인공 공여체와 숙주 세포 혼합물로부터 표준 곡선에 기초하여 공여체 유형 세포의 백분율을 제공한다.
이식 후 임의의 시점에서 이런 분석에 의해 소정의 혈액 세포 계통에서 95%보다 큰 공여체 세포를 전시한 개체는 이러한 이식 환자군에서 완전한 공여체 키메라현상을 갖는 것으로서 지칭된다. 혼합된 키메라현상은 이런분석에서 1%보다 큰 공여체, 하지만 95%보다 적은 공여체 DNA로서 규정된다. 혼합된 키메라현상을 전시하는 개체는 키메라현상의 진화에 따라 더욱 분류될 수 있는데, 여기서 혼합된 키메라현상을 향상시키는 것은 최소한 6-개월 기간에 걸쳐 공여체 세포의 비율에서 연속적 증가로서 규정된다. 안정된 혼합된 키메라현상은 공여체 세포의 완전한 상실없이, 시간의 흐름에서 수용체 세포의 백분율에서 변동으로서 규정된다.
본 발명의 목적을 위한 "환자"는 인간 및 다른 동물 양자, 특히 애완 및 실험실 동물, 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼, 등을 포함한 포유동물을 포함한다. 따라서 본 방법은 인간 요법 및 수의과 적용 둘 모두에 적용가능하다. 일 실시형태에서, 환자는 포유류, 바람직하게는 영장류이다. 다른 실시형태에서, 환자는 인간이다.
추가의 용어들. 용어 "치료", "치료하는", "치료하다" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 획득하는 것을 지칭하기 위해 본원에서 이용된다. 효과는 질환 또는 이들의 증상(들)을 예방적 관점에서 완전히 또는 부분적으로 예방할 수 있고 및/또는 질환 및/또는 질환에 기인하는 역효과를 치료적 관점에서 부분적인 또는 완전한 안정화 또는 치료를 할 수 있다. 용어 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환의 임의의 치료를 포괄하고, 하기를 포함한다: (a) 질환 또는 증상에 취약할 수 있지만 아직 그것을 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환 및/또는 증상(들)이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환 및/또는 증상(들)을 억제하는 것, 즉, 그것의 발달을 억류하는 것; 또는 (c) 질환 증상(들)을 완화하는 것, 즉, 질환 및/또는 증상(들)의 퇴행을 야기하는 것.치료의 필요성이 있는 이들은 이미 영향 받은 이들 (예를 들어, 암이 있는 이들, 감염이 있는 이들, 등)뿐만 아니라 예방이 요구되는 이들 (예를 들어, 암에 대해 증가된 감수성이 있는 이들, 감염의 증가된 가능성이 있는 이들, 암이 있는 것으로 의심되는 이들, 감염을 보유하는 것으로 의심되는 이들, 등)을 포함한다.
생착을 위한 방법
본 발명의 방법은 수령체에 이식 후 줄기 세포의 개선된 생착을 제공한다. 수령체는 면역적격일 수 있고, 이식은 골수 절제 컨디셔닝의 부재, 즉 방사선 및/또는 화학치료 약물의 부재에서 수행될 수 있다. 수령체는 세포 및 HLA 정합에 따라 선택된 제제의 세트를 병용 투여로 컨디셔닝된다. 제제의 선택은 최적화된 컨디셔닝 프로토콜에 대한 지침을 제공하는 표 1에 나타나 있다. "+"는 지시된 제제 HLA 정합 및 세포 공급원에 대해, 제제가 반드시 포함되어야 한다는 것을 나타내고; 그리고 "-"는 선택적으로 포함될 수는 있지만, 이것이 요구되지는 않는다는 것을 나타낸다. 상기에 개시된 바와 같이, 특정 제제는 T 세포 및 NK 세포 둘 모두를 감손시킬 수 있고, 따라서 단지 단일 제제가 둘 모두를 위해 필요하다. 상이한 제제에 대한 타이밍 및 용량은 상기에서 나타낸 바와 같다. 본 발명의 컨디셔닝 레지멘은 선택적으로 내인성 줄기 세포를 제거하고, 내인성 면역 반응의 적합하고 선택된 억제에 제공하여, 비-정합된 수령체에서도 생착을 허용한다.
컨디셔닝 레지멘에 이어, 외인성 줄기 세포를 포함한 세포 조성물의 효과적인 용량이 일시적 면역억제의 기간 동안 수령체에 투여된다. 줄기 세포는 비제한적으로 동종이계 반수체 줄기 세포, 부정합된 동종이계 줄기 세포, 유전자적으로 조작된 자가 세포, 등을 포함하여 자가, 동종이계 또는 이종발생성일 수 있다.
HSPC의 주입은 부수로 수행되는 상대적으로 간단한 과정이다. 골수 생성물 일반적으로 신선하게 사용되고 몇 시간의 기간에 걸쳐 중심 정맥을 통해 주입된다. 자가 생성물은 빈번하게 동결보존되고; 그래서 이들이 부수적으로 해동되는 경우 몇 분의 기간에 걸쳐 빠르게 주입된다. PBMC는 간단히 밤새 저장 또는 냉동될 수 있다.
공여체가 수령체에 대해 동종이계인 경우, 공여체 및 수령체의 HLA 유형은 정합에 대해 시험될 수 있거나, 또는 반수체 세포가 사용된다. HLA-반수체 공여체는 CD34 또는 CD34CD90 선택에 의해 조작될 수 있다. 나아가, HLA-단상-동일한 공여체가 다른 징후에 대해 현재 널리 사용되고 있다 (그리고 HLA-동일한 것을 능가할 수 있다). HLA 부정합에 대해, 종래에, 부정합에 대해 중요한 유전자좌는 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR이다. HLA-C 및 HLA-DQ는 또한 현재 공여체의 적절성이 결정될 때 고려된다. 완전히 정합된 형제자매 공여체는 일반적으로 이상적인 공여체로 고려된다. 관련 없는 공여체의 경우, 완전한 정합 또는 단일 부정한이 최상의 이식을 위해 허용가능한 것으로 간주되고, 반면 특정 상황에서는, 보다 큰 부정합도 용인된다. 바람직하게는 부정합은 혈청적 및 분자의 부정합 둘 모두이다. 공여체가 탯줄 혈액일 경우 용인가능한 HLA 격차의 정도는 보다 크고, 및 6 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1 항원 중 3-4를 넘는 정합이 이식에 대해 충분하다. 면역적격 공여체 T 세포는 이식편대숙주 질환 (GVHD)이 전개할 가능성을 감소시키거나 제거하기 위한 다양한 방법을 사용하여 제거될 수 있다.
일부 구현예에서, 절차의 성공은 수령체의 순환에 숙주 유래된 골수 세포, 예를 들어 CD15+ 세포의 존재를 결정함에 의해 모니터링된다. 혈액 골수 키메리즘은 골수 세포의 단 수명 특성에 기인하여 진성 HSC 생착의 지표이다. 후-HCT 약 8주 후, 본 명세서에서 기재된 방법은, 예를 들어 적어도 약 1% 공여체 유형 CD15+ 세포, 적어도 약 2% 공여체 유형 CD15+ 세포, 적어도 약 4% 공여체 유형 CD15+세포, 적어도 약 8% 공여체 유형 CD15+ 세포, 또는 그 초과의 혈액 골수 키메리즘의 측정가능하고 지속된 수준에 대해 제공된다.
골수절제 방사선 또는 화학요법의 부재에서 제공될 수 있는 컨디셔닝제는 상기에 논의된 특이적 요건에 따라 투여된다. 일부 제제는 HSPC의 투여에 이어 활성이 되도록 투여되고, 반면 다른 제제는 세정 기간을 요한다.
일시적 면역억제제는 활성화된 T 세포 활성을 적어도 10-배, 적어도 100-배, 적어도 1000-배, 적어도 100,000-배 또는 그 초과 감소시키는 용량으로 제공된다. 효과적인 용량은 개체 및 특이한 제제에 의존할 것이지만, 제제가 항체인 경우, 용량은 적어도 약 50 ㎍/체중 kg, 적어도 약 250 ㎍/kg, 적어도 약 500 ㎍/kg, 적어도 약 750 ㎍/kg, 적어도 약 1 mg/kg, 그리고 최대 약 2.5 mg/kg, 최대 약 5 mg/kg, 최대 약 7.5 mg/kg, 최대 약 10 mg/kg, 최대 약 15 mg/kg, 최대 약 25 mg/kg, 최대 약 50 mg/kg, 최대 약 100 mg/kg일 수 있다.
컨디셔닝제는 약제학적 조성물에 제형화된다. 정확한 용량은 치료의 목적에 의존할 것이고, 알려진 기술 (예를 들어, 문헌 [Ansel 등, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery]; [Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992), Dekker, ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692, 0824716981]; [Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)]; 및 [Pickar, Dosage Calculations (1999)])을 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 확인가능할 것이다. 당 업계에서 알려진 바와 같이, 환자 상태에 대한 조정, 전신 대 국소화된 전달, 뿐만 아니라 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 다이어트, 투여 시간, 약물 상호작용 및 병태의 중증도가 필요할 수 있고, 당해 분야의 숙련가에 의한 일상적인 실험과정으로 확인가능할 것이다.
제제의 투여는 비제한적으로, 경구로, 피하로, 정맥내로, 비강내로, 경피로, 복강내로, 근육내로, 또는 안구내로를 포함하여 상기에 논의된 바와 같이 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 항체는 정맥내 주사에 의해 전달될 수 있다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 산 및 염기 부가염 양자를 포함하는 것으로 의도되는, 약제학적으로 허용가능한 염으로 존재하는 것과 같이, 수용성 형태로 된다. "약제학적으로 허용가능한 산 부가염"은 유리 염기의 생물학적 유효성을 보유하고, 무기산 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 및 동종의 것, 및 유기산 예컨대 아세트산, 프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 및 기타 동종의 것으로 형성된, 생물학적으로되지 않거나 또는 그렇지 않으면 바람직하지 않은 염들을 지칭한다. "약제학적으로 허용가능한 염기 부가염"은 무기 염기 예컨대 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 및 기타 동종의 것으로부터 유래된 것들을 포함한다. 특히 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘, 및 마그네슘 염이 유용하다. 약제학적으로 허용가능한 유기 무독성 염기로부터 유래된 염은 일차, 이차, 및 삼차 아민, 자연 발생 치환된 아민을 포함한 치환된 아민, 환형 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 및 에탄올아민의 염을 포함한다.
약제학적 조성물은 또한 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 운반 단백질 예컨대 혈청 알부민; 완충액; 충전제 예컨대 미세결정성 셀룰로스, 락토스, 옥수수 및 다른 전분; 결합제; 감미제 및 다른 풍미제; 착색제; 및 폴리에틸렌글리콜.
약제학적 조성물은 투여 방법에 따라 다수의 단위 투여형으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적합한 단위 투여형은 분말, 정제, 알약, 캡슐 및 로젠지를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 조성물은 경구 투여되는 경우 소화로부터 보호되어야 하는 것이 인식된다. 이것은 전형적으로 분자를 조성물과 복합체화시켜 그들이 산성 및 효소적 가수분해에 저항성이 되게 함으로써, 또는 분자를 적절한 저항성의 담체, 예를 들어, 리포좀 또는 보호 장벽에 포장함으로써 달성된다. 소화로부터의 보호제의 수단은 해당 분야에 널리 알려져 있다.
투여용 조성물은 통상적으로 약제학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 항체 또는 다른 제제를 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 완충 염수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균이며, 일반적으로 바람직하지 않은 물질이 존재하지 않는다. 이들 조성물은 통상적인, 널리 알려져 있는 멸균기법에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절 및 완충화제, 독성 조절제 등, 예컨대, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등과 같이 생리학적 조건에 근사화하는데 필요한 약제학적으로 허용되는 보조물질을 함유할 수 있다. 이들 제형에서 활성 작용제의 농도는 광범위하게 달라질 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 요구에 따라, 주로 유체 부피, 점도, 체중 등에 기반하여 선택될 것이다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., 1980)] 및 문헌 [Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman 등, eds., 1996)]).
절제 제제, 예를 들어 항체, 가용성 SIRPα, 등을 함유하는 조성물이 치료적 처치를 위해 투여될 수 있다. 조성물은, 상기에 기재된 바와 같이, 표적화된 내인성 줄기 세포를 실질적으로 제거하기에 충분한 양으로 환자에게 투여된다. 이것을 달성하기에 적절한 양은 "치료학적 유효량"으로서 정의된다. 조성물의 단일 또는 다중 투여는 환자에 의해 요구되고 허용되는 투여량 및 빈도에 따라 투여될 수 있다. 치료에 필요한 특정 용량은 포유류의 의학적 상태 및 병력, 및 다른 인자, 예를 들어, 연령, 체중, 성별, 투여 경로, 효능 등에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 방법에서, 제제는 이식 이전 요법의 짧은 과정으로 투여된다. 일반적으로 치료는 이식 이전 적어도 약 1주, 이식 이전 적어도 약 5일, 이식 이전 적어도 약 3일에 완료된다. 과정은 필요하면 반복될 수 있고, 예를 들어 필요에 따라 틈새를 제거하기 위해 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 그 이상 반복될 수 있다
치료를 위한 조건
줄기 세포 이식에 대한 징후는 질환 카테고리에 따라 다양하고, 세포 유전적 비정상, 이전 요법에 대한 반응, 환자 나이 및 행동 상태, 질환 상태 (차도 대 재발), 질환-특이적 예후 인자, 적합한 이식 공급원의 이용가능성, 추천 시간, 및 이식하는 시간과 같은 인자에 의해 영향을 받는다.
자가 HSCT는 현재 하기 병태를 치료하기 위해 사용된다: 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 급성 골수 백혈병, 신경교세포종, 생식 세포 종양, 자가면역 장애 - 전신 홍반성낭창 (SLE), 전신 경화증, 아밀로이드증.
동종 HSCT는 현재 하기 장애를 치료하기 위해 사용된다: 급성 골수 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 골수 백혈병; 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 장애, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 재생불량 빈혈, 순수한 적혈구 무형성증, 발작성 야행성 혈색소뇨증, 판코니 빈혈, 종증성 지중해 빈혈, 겸상적혈구 빈혈, 중증 복합성 면역결핍 (SCID), 비스코트-알드리치 증후군, 혈구포식세포 림프조직구증 (HLH), 대사의 선천성 이상 - Eg, 점액다당류증, 고셔병, 변성염색성 백혈구감소증, 및 부신백반이영양증, 수포성 표피박리증, 중증 선천성 호중구감소증, 슈와크만-다이아몬드 증후군, 다이아몬드-블랙판 빈혈, 백혈구 접착 결핍, 및 기타 동종의 것.
본 발명의 구현예들은 유전적 혈액 장애를 앓고 있는 환자에 이식을 포함하고, 여기서 정상 표현형의 외인성 줄기 세포가 환자에 이식된다. 이러한 질환은, 비제한적으로, 결함 있는 헤모글로빈 합성 (이상혈색소증)에 의해 야기된 빈혈의 치료를 포함한다. 줄기 세포는 정상 표현형의 동종이계 줄기 세포일 수 있거나, 또는 바람직하지 않은 유전적 서열을 결실하도록, 및/또는 유전적 결손을 바로 잡는 유전적 서열을 도입하도록 유전자적으로 조작된 자가 세포일 수 있다.
겸상적혈구 질환은 HbS 질환; 예비진성 빈혈; 만성남성뇨증을 포함한다. 블랙에서 거의 독점적으로 발생하고 Hb S의 동종접합성 상속에 의해 야기된 겸상-형상화된 RBC를 특징으로 하는 만성 용혈성 빈혈.동형접합체는 겸상적혈구 빈혈을 가지고; 이형접합체는 빈혈이 아니지만, 겸상세포생성 특성 (겸상적혈구징후)이 시험관내 실증될 수 있다. Hb S에서, 발린이 베타 사슬의 6번째 아미노산에 있는 글루탐산에 대해 치환된다. 데옥시-Hb S는 데옥시-Hb A보다 매우 덜 가용성이고; 이것은 낮은 PO2의 부위에서 겸상에 대해 RBC를 야기하는 막대형 반고형결정체의 반고형겔을 형성한다. 뒤틀린, 비가요성 RBC는 혈관 내피 및 플러그 작은 세동맥과 모세관에 점착하여, 폐색 및 경색을 유발시킨다. 겸상 RBC는 순환의 기계적 외상을 견디기에 너무 취약하기 때문에, 이들이 순환에 도입된 후 용혈이 발생한다. 동형접합체에서, 임상 징후는 조직 허혈 및 경색을 초래하는 빈혈 및 혈관-폐쇄성 사건에 의해 야기된다. 성장 및 발달이 손상되고, 감염에 대한 민감성이 증가한다. 빈혈은 일반적으로 중증이지만 환자들 사이에서 아주 다양하다. 빈혈은 비장에서 겸상 세포의 급성 격리에 의해 소아에서 악화될 수 있다.
지중해빈혈은 결함 있는 Hb 합성 및 효과 없는 적혈구 생성을 특징으로 하는 만성, 선천적, 소적혈구성 빈혈의 군으로, 특히 지중해인, 아프리카인, 동남아시아 계통의 사람에게서 흔하다. 지중해빈혈은 가장 흔한 선천적 용혈성 장애 중 하나이다. 이것은 적어도 하나의 글로빈 폴리펩타이드 사슬 (β, α, γ, δ)의 줄어든 생산에 의해 야기된 비균형 Hb 합성에서 유래한다.
재생불량 빈혈은 줄기 세포 풀에서의 결함 또는 골수를 지지하는 미세환경에 대한 손상으로부터 RBC 전구체의 손실로부터, 그리고 종종 높은 MCV 값을 경계선으로 하여 유래한다. 용어 재생불량 빈혈은 통상적으로 연관된 백혈구감소증 및 혈소판감소증을 갖는 골수의 범형성저하증을 의미한다.
조합된 면역결핍은 양 B- 및 T- 세포 시스템, 림프양 무형성증, 및 흉선 이형성증의 선천성 및 일반적으로 선천성 결핍을 특징으로 하는 장애의 군이다. 조합된 면역결핍은 중증 복합성 면역결핍, 스위스 무감마글로불린혈증, 아데노신 데아미나제 또는 뉴클레오사이드 포스포릴라제 결핍과 조합된 면역결핍, 및 면역글로불린과 조합된 면역결핍 (네젤로프 증후군)을 포함한다. 대부분의 환자는 아구창, 폐렴, 및 설사로 감염의 조기 발병을 갖는다. 만일 치료되지 않으면, 대부분 2세 이전에 사망한다. 대부분의 환자는 B 세포와 면역글로블린의 심각한 결핍을 가지고 있다. 하기 특징이 있다: 림프구감소증, 낮은 또는 부재인 T-세포 수준, 미토겐에 대한 불량한 증식성 반응, 피부무력증, 흉선 음영 부재, 및 줄어든 림프양 조직. 폐포자충 폐렴 및 다른 기회 감염은 일반적이다.
실험
실시예 1
반수체 조혈 줄기 세포 이식을 위한 비-유전독성 컨디셔닝 레지멘
물질 및 방법
마우스. 모든 공여체 및 수령체 마우스는 8 및 12주령 사이이다. 공여체 마우스는 Shizuru 실험실에서 자란 AKR x Hz F1 마우스였다. AKR x Hz F1 마우스는 45.1 및 45.2, 그리고 H2Kb 및 H2Kk에 대해 이중 양성이다. 수령체 마우스는 JAX로부터의 CB6F1이였다. CB6F1 마우스는 45.2에 대해 단일 양성이고 H2Kb 및 H2Kd에 대해 이중 양성이다. 모든 절차는 국제 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다. 마우스 균주는 스탠포드 대학의 연구 동물 설비에서 유지되었다.
항체. 항-CD47 (클론 3/클론 mIAP410), 항-CD117 (클론 ACK2), 항-CD40L (클론 MR-1), 및 항-CD122 (클론 TM-b1)를 포함하여 생체내 컨디셔닝을 위한 모든 항체는 Bio X Cell로부터 구매되었다.
BM 이식. 수령체 CB6F1 마우스에는 -8일째에 복강내로 100ug의 항-CD47의 프라이밍 용량이 제공되었다. -6일째에, 마우스에 항-CD117의 500ug 안와후 주사가 제공되었다. 항-CD117 치료 이전에, 마우스에는 Benadryl의 복강내 주사가 제공되었다. -6 내지 -2일째에, 마우스에는 또한 항-CD47의 매일 500ug 복강내 주사가 제공되었다. -2일째에, 마우스에는 최대 250ug의 항-CD122가 제공되었다. 0일째에, 500ug의 항-CD40L이 이식 몇 시간 이전에 제공된다.
이식을 위해, 전체의 골수는 8-12주령 AKR x Hz 마우스로부터 수확된다. 전체의 골수는 정강뼈, 대퇴골, 엉덩이, 및 척추로부터 취해진다. 적혈구는 용해되고 나머지 세포는 카운트되고 주사 이전에 적절하게 재현탁된다. 세포는 안와후 주사로 전달된다.
키메리즘 검사. 수령체 마우스는 공여체 키메리즘을 측정하기 위해 안와후 천공으로 주기적으로 출혈된다. 혈액은 CD45.1, CD45.2, CD3, CD19, CD11b, 및 Gr-1에 대해 형광 항체로 염색된다.
결과
도 1a-1f에서 나타낸 바와 같이, 상기에 기재된 프로토콜로 c-키트, CD47, CD40L 및 CD122에 특이적인 항체의 조합은 면역 능숙한 동물 안으로 반수체 전체의 골수의 효율적인 생착을 가능하게 했다. 집단당 키메라와 총 공여체, T-세포, B-세포, 및 과립구 키메리즘의 평균 수준인 마우스의 백분율이 도 2에 도시되어 있다. 세포의 저용량에서, 도 3에서 나타낸 바와 같이, 항-CD122로 NK 세포 고갈이 요구된다.
실시예 2
항체 컨디셔닝은 MHC-부정합된 조혈 줄기 세포 이식편 및 장기 이식 내성을 가능하게 한다.
환자의 이환 혈액 시스템을 조혈 세포 이식 (HCT)으로 대체하는 것은 백혈병, 자가면역 질환 및 면역결핍을 포함한, 혈액 및 면역계의 유전적 장애를 치료 또는 치유할 수 있다. HCT에서, 환자의 혈액 및 면역계는 독성 "컨디셔닝 레지멘" (화학요법 및/또는 방사선)을 사용하여 전형적으로 제거되고 그 다음 조혈 줄기 세포 (HSC)를 함유하는 공여체 세포로 대체되어 건강한 혈액 시스템을 재생한다. HCT는 기초적인 치료이지만, 그것의 사용 및 안전성은 이식편대숙주 질환 (공여체 T 세포를 오염시키지 않은 정제된 HSC를 이식함에 의해 극복될 수 있음) 및 컨디셔닝 레지멘에 의해 야기된 치명적인 독성에 의해 저해된다. 따라서, 결정적인 목표는 보다 특이적이고, 더 안전한 제제 (예를 들어, 단클론성 항체)로 HCT 컨디셔닝을 달성하여, 독성 화학요법 또는 방사선에 대한 필요성을 제거하는 것이다.
여기서 본 발명자들은 6개의 단클론성 항체의 조합이 면역-능숙한 마우스의 숙주 HSC, T 세포 및 NK 세포를 안전하고 구체적으로 감손시키고 외래 (동종이계) HSC 생착을 허용할 수 있음을 보여준다. 접목된 공여체 HSC는 절반 (반수체) 또는 모든 MHC 유전자에서 부정합되었고, 양 사례에서 숙주 혈구와 안정적으로 공존하는 공여체 혈액 및 면역계를 생성했다. 이들 키메라 면역계는 HSC 공여체 균주 심장 조직에 대한 내성과 3자 심장의 거부에 의해 나타난 바와 같이 기능적이었다. 이들 연구는 항체 컨디셔닝을 입증하여, 외래 장기이식 및 다양한 혈액과 면역계 장애의 치료를 포함한 적용을 용이하게 하는, 재생 의약에 대한 플랫폼으로서 정제된 인간 HSC 이식에 적용될 수 있다.
다수의 유전적 혈액 및 면역계 장애가 조혈 세포 이식 (HCT)에 의해 치료될 수 있다: 그 예는 지중해 빈혈, 겸상적혈구 빈혈, 판코니 빈혈, 선천적 면역결핍, 자가면역 질환 (예를 들어, 다발성 경화증), 및 대사 축적 장애를 포함한다. 이들 질환은 개체의 혈액 시스템이, HCT 이식에서 이식된 드문 조혈 줄기 세포 (HSC)로부터 안정적으로 기인하는 건강한, 이식된 혈구로 대체될 때 정정될 수 있다. 공여체-유래된 혈액 및 면역계의 재생 후, HCT 수령체는 HSC 공여체로부터의 장기 이식에 대해 면역학적으로 내성이 된다. 혈액 시스템의 임의의 단일-유전자 또는 다중-유전자 유전적 장애가 동종이계 HCT에 의해 치유될 수 있었지만, 비-악성 혈액학적 또는 면역학적 장애는 단지 2015년 유럽에서 보고된 총 HCT 사례 중 6% 만을 설명했다.
비-악성 혈액 장애를 치료하고 도달 범위를 확대하기 위해 HCT의 불균형적으로 드문 사용을 극복하기 위해서, 두 가지 주요 문제인: 안전 문제와 공여체 이용가능성이 반드시 해결되어야 한다. 현재는, 동종이계 HCT는 공여체-유래된 T 세포를 오염시킴에 의해 야기된 임상 또는 준임상 이식편대숙주 질환 (GvHD)을 유발시킨다; 그러나 GvHD는 T 세포가 결여된 정제된 HSC를 이식함에 의해 극복될 수 있다. 나아가, HCT 컨디셔닝은 생명위협 부작용을 유도할 수 있는 화학요법 및 방사선을 요한다.
유전적 혈액 장애에 대해 HCT가 직면한 또 다른 도전은 인간 백혈구 항원 (HLA, 달리는 주 조직적합성 복합체 [MHC]로 알려짐) 유전자좌에서 완전하게 정합된 공여체에 대한 현재 필요성이다; 백인계 미국인의 75%는 현재 공여체와 정합되지만, 흑인계 미국인 (16-19%는 현재 정합) 또는 기타 제시 이하의 민족 군에 대해 완전하게-정합된 공여체를 찾는 것이 현저하게 어렵다. 반수체 공여체 (HLA 유전자좌 중 절반에서 정합됨)를 사용하여 안전하게 HCT를 수행하는 것이 가능하다면, 이것은 이론적으로 임의의 개체가 그것의 모체, 아동 또는 형제자매 중 75%로부터 HCT를 받을 수 있도록 공여체의 이용가능성을 상당히 확대할 수 있다. 마지막으로, 완전하게 HLA-부정합된 HSC를 안전하게 이식하는 것이 가능하다면, 수령체가 동일한 공여체로부터 수득된 외래 기관 또는 조직에 대해 면역학적으로 내성이 있다는 부가적 이점으로; 이것은 이용가능한 공여체의 풀을 엄청나게 개방할 수 있다. 이것은 생명유지관련 장기 이식에 대한 거부를 방지하는데 통상적으로 필요한 평생 동안 면역억제 없이 HLA-부정합된 장기 이식을 가능하게 할 것이다.
HCT의 안전성은 독성 컨디셔닝 레지멘 (화학요법 및/또는 방사선)을 보다 특이한 제제, 예컨대 면역계의 단클론성 항체 감손 성분으로 대체하는 경우 상당히 개선될 것이다. 이전 항체 컨디셔닝 레지멘이 부 조직적합성 항원-부정합된 HSC의 이식을 가능하게 하지만 (예를 들어, 특허 공보 WO 2016/033201호 참고), 항체-계 컨디셔닝을 사용한 MHC-부정합된 HSC의 이식은 이전에는 개시되어 않았다.
여기서 본 발명자들은 6개의 단클론성 항체를 사용한 컨디셔닝이 야생형 마우스가 부분적으로- (반수체) 또는 완전하게-MHC 부정합된 HSC를 수용할 수 있게 하고 따라서 화학요법 또는 방사선에 의지함이 없이 부정합된 공여체 기관에 혈액 시스템 대체 및 내성의 유도를 가능하게 한다는 것을 입증한다.
반수체 이식 실험의 경우, AKR x C57BL/6 F1 (이후에 AB6F1로 칭함) 마우스가 골수 또는 HSC 공여체로 사용되었고 BALB/C X C57BL/6 F1 (CB6F1) (도 4a) 마우스가 수령체로 작용되었다; 이들 마우스 균주는 H2 b 일배체형에서만 정합되었지만 H2 k 및 H2 d 에 대해서는 부정합되었다 (즉, 주 조직적합성 복합체 [MHC] 일배체형의 절반) (도 4b). 본 발명자들은 종래의 컨디셔닝이 단클론성 항체 (mAb)로 대체될 수 있는지를 판단하고자 하였다. 본 발명자들은 면역-결핍 마우스가 동계의 HSC 생착을 가능하게 하는 항-키트 항체를 사용하여 컨디셔닝될 수 있다는 것을 이전에 실증했으나, 반면에 면역-능숙한 마우스의 비교할만한 컨디셔닝은 항-키트 및 항-CD47 차단제의 이중 투여를 요했다. CD47 차단은 항-c-키트 항체에 의해 옵소닌화된 키트+ HSC와 같이, 항체-결합된 (옵소닌화된) 세포를 대식세포가 식균할 수 있게 한다.
MHC 유전자좌에서 부정합된 동종이계 HSC를 이식하기 위해서는, 외래 주 및 부 조직적합성 항원을 발현하는 세포를 거부하거나 또는 "자체" MHC를 결여하는, T 세포 및 NK 세포 둘 모두를 억제하거나 제거해야 하는 것이 필요할 수 있다. 숙주 NK 세포를 제거하기 위해 본 발명자들은 CD122/Il2Rb (인간 및 마우스 NK 세포 전개 전반에 걸쳐 발현됨)를 감손하기 위해 항-CD122 mAb Tm-β1를 사용하여 이들 세포를 표적화했다. T-세포 매개된 거부를 방지하기 위해 본 발명자들은 활성화된 T-세포에 의해 발현된 공통자극 세포 표면 분자이고, CD40+ 항원 제시 세포로 그것의 신호전달에 필요한 CD40L (CD154로도 알려짐)을 표적화했다. CD40-CD40L 축의 차단은 조혈 세포 및 피부 이식에 대한 내성을 유도하는 데 도움이 될 수 있고, 중요하게는 CD40L이 활성화된 T 세포에서 상향조절되기 때문에 모든 T 세포를 감손하지 않는다; 본 발명자들은 항-CD40L 항체 MR1을 사용하여 CD40L를 억제했다.
마우스는 4개의 단클론성 항체 (항-CD122, 항-CD40L, 항-키트 및 항-CD47; 본 명세서에서는 4Ab 컨디셔닝으로칭함)로 8일의 과정에 걸쳐 처리되고 (도 4c) 그리고 그 다음 3천만 전체의 골수 (WBM) 세포가 이식되었다. 키메리즘은 CD45 대립유전자 차이에 의해 주기적으로 측정되었고 (도 8a) 다중-계열 혼합된 키메리즘이 4Ab 컨디셔닝을 수용한 모든 동물에서 관측되었다 (도 8b-d). 중요하게는, 혼합된 키메리즘은 또한 장기간 HSC (LT-HSC) 구획에서 관측되어 (도 4d), 공여체 키메리즘이 장수하는 성숙한 면역 세포의 생착을 초래하지 않았지만, 공여체 줄기 세포에 의해 활동적으로 유지됨을 나타낸다.
이 칵테일의 최소로 필요한 성분을 확인하기 위해, 본 발명자들은 각각의 항체를 단리하여 시험하였고 (도 9) 그 다음 4개의 항체의 다양한 조합으로 시험하였다. 이식하기 위한 3천만 WBM 세포에 대한 최소로 필요한 칵테일은 항-CD47, 항-c-키트, 및 항-CD40L이였다 (도 4e-g). 그러나, 항-CD122를 결하는 그룹에서 마우스 중 단지 75%가 키메라였다. 완전한 4Ab 컨디셔닝을 수용한 그룹에서, 마우스의 100%가 키메라였다. 흥미롭게도, 양 군으로부터 이식된 동물이 12주에 걸쳐 다중-계열 키메리즘의 유사한 수준을 보였다. 추가로, 4Ab 컨디셔닝은 이식 이전에 과립구감소증을 유도하지 않았다 (도 4h).
본 발명자들은 항-CD122의 용법을 조절하면서 WBM의 용량을 적정함에 의해 이식될 수 있는 WBM의 최저 용량을 시험했다. 키메라 마우스의 수는 이식된 골수의 양이 줄어듦에 따라 줄었다 (도 4i). 3백만 WBM 세포에서, 20%의 마우스는 항-CD122 없는 키메라였고, 반면 80%의 마우스는 이 세포 용량 그룹에서 NK 고갈을 갖는 키메라였다.
GvHD의 가능성을 제거하기 위해, 다음으로 본 발명자들은 (WBM과는 대조적으로) 풍부한 HSC 모집단을 이식했다. 이들 실험 계열-에서 HSC 및 다분화능 선조 (MPP) 세포가 아주 풍부한 Sca1+ 키트+ (LSK) 세포 (도 5a)가 이식되었다. 키트 풍부 및 LSK 세포 둘 모두가 3천만 WBM 세포에서 그것의 존재도에 상응하는 양으로 제공되었다 (도 5b). 이식편의 모든 3가지 유형은 조사된 대조군에서 완전한, 장기간 다중-계열 키메리즘을 나타냈다. 현저하게, 4Ab-컨디셔닝된 마우스는 WBM에 의해 장기간 성공적으로 이식되었지만, 이들은 키트-풍부한 또는 LSK 이식에 의해 재구성되지 않았다 (도 5b). 따라서 이것은 성공적으로 이식하기 위해 추가의 컨디셔닝 항체가 풍부한 HSC 모집단에 필요할 수 있다는 것을 나타낸다.
LSK 생착을 촉진하기 위해 본 발명자들은 항-CD4 및 항-CD8 감손하는 항체를 사용하여 T 세포를 제거함에 의해 추가의 면역억제를 제공하고자 시도하였다 (도 5c). 4Ab 요법에 항-CD4 및 항-CD8 항체의 첨가는 말초 혈액, 비장 및 골수로부터 T-세포를 견고하게 감손시켰다 (도 5d 및 도 10). 6Ab 컨디셔닝 (항-CD122, 항-CD40L, 항-키트, 항-CD47, 항-CD4 및 항-CD8 mAbs)으로 지칭될 이 6개의 항체 칵테일의 용법은 9000 LSK 세포가 이식된 수령체에서 장기간 키메리즘을 유도했다 (도 5e). 이 세포 투약량은 대략 360,000 LSK/kg에 상응하여, 마우스에서 동종이식편에 대한 전임상 시험 및 인간에서 자가이식에서의 임상 용법에서 나타난 HSC 용량보다 매우 낮다. 요약하면, 6Ab 컨디셔닝은 저 용량의 세포, 예를 들어 정제된 HSC를 화학요법 또는 방사선에 의지함이 없이 마우스에 이식하는 것을 가능하게 한다.
이 칵테일의 모든 6개의 성분이 필요한지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 분배성 항체를 동정하기 위한 환원 과정을 사용했다. 항-CD40L, 항-CD4, 및 항-CD8의 제거는 완전한 6Ab 컨디셔닝 집단에 비교할 때 각각의 집단 내에 보다 적은 키메라 동물 및 보다 낮은 키메리즘을 초래했다 (도 5f 및 도 11). 그러나, 항-CD122 항체의 제거는 대조군 집단에 비교될 때 키메라 동물의 백분율을 상당히 변화시키기 않았다. 4Ab 컨디셔닝 레지멘에서와 달리, CD122는, T-세포의 거의 완전한 고갈이 있기 때문에 6Ab 컨디셔닝 레지멘에서 소실되는, T-세포 활성화에 대한 NK 의존에 기인하여 6Ab 컨디셔닝에 거의 필요하지 않을 수 있다.
중요하게는, 6Ab 컨디셔닝 이어서 HSC 이식은 공여체 유전적 균주에 집중적으로-매개된 면역학적 내성을 유도했다. 중심 내성은 공여체 세포 생착을 허용하도록 숙주 면역계의 흉선 재-교육을 의미한다. 이들 동물에서 중심 내성을 측량하기 위해, 본 발명자들은 말초 혈액에서 V 베타 6 (Vb6) TCR 사슬의 존재를 측정하였다. Vb6은 AKR 균주에 존재하는 Mtv-7 프로바이러스-인코딩 슈퍼-항원에 반응성이다. 따라서, CB6F1에 공존하는 AB6F1 HSC의 경우, CB6F1 내인성 Vb6+ T-세포는 클론적으로 반드시 결실되어야 한다. WBM- 및 LSK-이식된 동물 둘 모두에서, 키메라 동물은 숙주 Vb6+ T-세포의 결실을 나타냈다 (도 6a-b). 흥미롭게도, 항-키트, 항-CD47, 및 항-CD40L로 컨디셔닝된 WBM 집단에서, 정상 Vb6+ T-세포 빈도를 갖는 동물만이 또한 키메리즘을 결코 달성하지 않았다 (도 6b).
현저하게, 본 발명자들은 MHC-부정합된 공여체 HSC가 이식된 6Ab-컨디셔닝된 마우스는 동일한 공여체 균주로부터의 기관에 대해 면역학적으로 내성이었다는 것이 발견했다. 이를 위해, 본 발명자들은 HSC 공여체 (AB6F1) 또는 제3자 (DBA/1J 균주, H2q에 대해 동종접합성임) 신생 강아지로부터의 심장 이식편을 미접촉 및 LSK-Ab 컨디셔닝된 키메라 동물의 귀의 귓바퀴에 이식했다 (도 6c). 미접촉, 컨디셔닝되지 않은, 이식되지 않은 마우스에서, AB6F1 및 DBA1/J 심장 둘 모두는 빠르게 거부되었다 (도 6d). 6Ab 컨디셔닝된 키메라 마우스에서, DBA1/J 심장은 14일 이내에 거부된 반면, 활성인 박동하는 AB6F1 심장은 적어도 115일 동안 지속했다. 대표적인 귀-심장 이식편은 34일에서 수확되었고 면역조직화학에 의해 분석되었다. 총 시험에 의해, AB6F1 심장은 귓바퀴에서 가시적인 반면 DBA/1J 심장은 더 이상 분명하지 않다 (도 6e). H&E 분석은 AB6F1-접목된 귓바퀴에서 면역 세포 침윤물을 결하는 트로포닌+ 심장 조직을 나타냈다; 그러나, 이 시점까지 DBA/1J 심장을 함유하는 귓바퀴 내에 심장 또는 트로포닌 + 조직이 없었다 (도 6e). 따라서 이것은 MHC-부정합된 공여체 HSC가 동일한 유전적 공여체로부터 심장 이식편에 대해 6Ab-컨디셔닝된 마우스의 면역학적 내성을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
마지막으로, 본 발명자들은 6Ab 컨디셔닝 레지멘이 완전하게 MHC-부정합된 HSC의 성공적인 생착을 가능하게 했다는 것을 실증했다. 본 발명자들은 공여체로 DBA1/J (H2q) 마우스 및 숙주 CB6F1 (H2b/d)를 사용했다 (도 7a). 9000 DBA1/J LSK 세포를 이식한 후, 본 발명자들은 모든 6Ab-컨디셔닝된 CB6F1마우스에서 8주까지 높은 공여체-숙주 키메리즘 관측했다 (도 7b). 3백만 WBM 세포가 이식된 마우스는 단독으로 (컨디셔닝에 대한 필수요건을 확인하는) 공여체 키메리즘을 확립하지 못한 반면 WBM을 수용한 4Ab-컨디셔닝된 마우스의 40%는 저수준의 키메리즘을 달성했다. WBM이 이식된 조사된 CB6F1 마우스의 80%는 GvHD에 의해서와 마찬가지로, 이식에 이어 9주까지 사망하였고 (도 7c), 이것은 LSK 이식에서는 관측되지 않았다.
요약하면, 여기서 본 발명자들은 정제된 HSC를 포함하는 절반- (반수체) 및 완전하게-MHC 부정합된 조혈 세포 조성물을 면역-능숙한 동물에게 이식하는 방법을 개발했다; 중요하게는 이것은 화학요법및/또는방사선의 사용 없이, 그리고 대부분 모든 유형이 아닌 다른 유형의 HCT 이식에서 발생하는 GvHD 없이 달성된다.
이들 발견은 조혈 세포 이식의 임상 용도, 예를 들어 혈액 및 면역계 장애의 치료에 관련된다. 첫째로, 이 항체 컨디셔닝 레지멘―정제된 HSC 이식과 조합된 것―은 화학요법/방사선의 사용을 회피하고 GvHD를 제거함에 의해 혈액 및 면역계 대체의 안전성을 개선한다. 둘째로, 반수체, HLA-부정합된 HSC의 이식을 용이하게 함에 의해, 이것은 그것의 나이 또는 임상 상태가 이전의 프로토콜 하에서 HCT를 예방할 수 있었다 하더라도 대부분의 수령체가 정합을 찾을 수 있도록 공여체 풀을 상당히 증가시킨다. 예를 들어, 판코니 빈혈이 있는 환자는 DNA 손상에 대해 고감수성이고, 따라서, 종래의 이식 컨디셔닝 레지멘은 이 집단에 대해 심각한 위험을 제기한다.
마지막으로, 외래 기관에 대한 면역학적 내성을 유도하는 능력은 구명의 장기 이식이 필요한 모든 환자에게 기회를 열어준다; 구체적으로, 환자가 장기 이식을 받도록 평생동안 면역억제에 대한 필요성을 배제한다. 특히, 항체-컨디셔닝된, 공여체 HSC-이식된 동물에서의 면역계는 공여체 (그러나 제3가는 아님) 심장에 대해 내성이다. 이들 부분적으로-키메라 동물에서 공여체와 숙주 T 세포의 공존은 공여체 및 숙주 조직 둘 모두에 대해 MHC-제한된 T 세포를 제공할 수 있다.
오늘날, 장기, 조직 또는 HSC 이식의 공여체는 살아 있거나 또는 최근에 사망한 사람이다. 재생 의약의 목표는 큰-동물 숙주 (예컨대 돼지) 내에서 시험관내 또는 생체내 중 어느 하나에서 만능 (배아 또는 유도된 만능) 줄기 세포주를 HSC 및 다른 필요한 조직 줄기 세포 (예컨대 신경, 뼈 및 연골, 또는 간의 것들) 안으로 분화시키는 것이다. 이것은 인간이 다른 사람을 위해 그것의 HSC 및 기관을 포기할 필요성을 완화한다. 항체 컨디셔닝, 이어서 만능줄기 세포-유래된 HSC 및 조직 줄기 세포의 공동-이식은 장기 면역 억제제에 의지함이 없이 환자의 생명을 구하는 기관을 전달할 수 있다.
방법
동물. 모든 실험은 스탠포드 대학 실험실 동물 관리 위원회 행정 패널에 의해 확립된 지침에 따라 수행되었다. AKR x C57BL/6 F1 공여체가 교배되고 하우스에서 배양되었다. CB6F1 및 DBA1/J 수령체는 Jackson Laboratory로부터 구매되었다. DBA1/J 임신한 암컷은 귀 심장 이식편을 위해 Taconic Bioscience로부터 구매되었다.
항체. 항-CD47 (mIAP410), 항-c-키트 (ACK2), 항-CD122 (Tm-β1), 항-CD40L (MR1), 항-CD4 (GK1.5), 및 항-CD8 (YTS169.4)은 BioXCell로부터 구매되었다. 항-CD47은 컨디셔닝 과정 전반에 걸쳐 후속적인 주사를 위해 -8일째에 100 ㎍ 용량으로 그 다음 500 ㎍ 용량으로 복강내로 제공되었다. 안와후 항-c-키트 및 복강내 항-CD40L은 양자가 일회 500 ㎍ 볼러스로 제공되었다. 항-CD122는 250 ㎍ 용량으로 복강내로 제공되고 반면 항-CD4 및 항-CD8은 100 ㎍ 복강내 용량으로 제공되었다. 항-c-키트 항체를 수용한 마우스는 주사 15분 이전 400 ㎍의 디펜히드라민이 복강내로 제공되었다. 항-CD25 (PC-61.5.3)는 BioXCell로부터 구매되어 1회용 100 ㎍ 복강내 주사로 제공되었다.
이식편 준비 및 이식. 전체의 골수 공여체 마우스 정강뼈, 대퇴골, 엉덩이, 및 척추로부터 추출되었다. 뼈는 분쇄되고, 여과되고, 그리고 후속으로 적혈구 (RBC) 용해되었다. c-키트 풍부한 이식편의 경우, RBC 용해된 전체의 골수는 제조자의 지침에 따라 Miltenyi CD117 MicroBeads에 결합되고 자기 분리 후 수집되었다. LSK 세포 이식편의 경우, RBC 용해된 전체의 골수는 제조자의 지침에 따라 Miltenyi 계열 세포 고갈 키트 칵테일에 결합되었다. 자기 분리 칼럼으로부터 나온 유동액이 수집되고 하기 항체의 최적의 농도로 2% FBS로 PBS에서 염색되었다: CD3 PE (17A2), CD4 PE (GK1.5), CD5 PE (53-7.3), CD8a PE (53-6.7), B220 PE (RA3-6B2), Gr-1 PE (RB6-8C5), Mac-1 PE (M1/70), Ter119 PE (TER119), SCA1 Pe-Cy7 (D7), 및 CD117 APC (2B8). 프로피듐 아이오다이드가 BD Aria 상에서 분류 직전에 생존력 염색으로 첨가되었다. 이식을 위한 모든 세포는 2% FBS로 PBS에서 원하는 농도에서 재현탁되었다. 조사 대조군 마우스는 이식 이전에 6.5Gy의 2개 용량으로 치명적으로 조사되었다. 모든 마우스는 이소플루란을 사용하여 마취되고 그 다음 안와후 주사를 통해 100uL의 세포 현탁액으로 이식되었다.
말초 혈액 키메리즘. 마우스는 안와후 출혈을 통해 EDTA 코팅된 튜브 안으로 주기적으로 출혈되었다. 혈액은 그런 다음 37C에서 1시간 동안 5mM EDTA로 1% 덱스트란에서 인큐베이션되었다. 각각의 튜브로부터 상청액이 추출되고, 용해되고 그 다음 하기 항체의 최적의 농도로 염색되었다: CD3 APC (17A2), CD19 PE-Cy7 (ebio103), Gr-1 BV421 (RB6-8C5), Mac-1 APC-Cy7 (M1/70), CD45.1 FITC (A20), 및 CD45.2 PE (104). 샘플은 BD Fortessa 상에서 분석되었고, 공여체 대 숙주 키메리즘은 CD45 대립유전자 차이에 기반하여 구분되었다.
귀-심장 이식편. 신생아 마우스는 생후 1-2일에 안락사되고 그것의 심장이 수확되었다. 수령체 마우스는 두개골 근처 그것의 귀의 배면 상에 작은 절개를 만들어 준비되었다. 그 후, 투관침을 사용하여, 파우치가 절개 부위에서부터 귓바퀴의 선단까지 터널링하여 만들어졌다. 신생아 심장은 투관침으로 파우치의 원위 말단에 전달되었다. 터널은 들어 올린 피부를 부드럽게 진피로 뒤로 밀어 넣어 폐쇄되었다. 심장 생존력은 해부 현미경을 통해 이식편을 시각화함에 의해 박동을 모니터링하였다.
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본 명세서에 열거된 각 간행물은 모든 목적을 위하여 그의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속 및 시약이 달라질 수 있음에 따라, 본 발명이 이에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어가 오직 특정 실시형태를 기재하기 위한 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 이것이 오직 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 단수형인 하나의 그리고 상기는 문맥에서 명백하게 다르게 언급되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 세포"에의 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하며, "상기 배양물"에의 언급은 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있는 하나 이상의 배양물 및 그의 등가물에의 언급을 포함하는 등이다. 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 명백하게 다르게 나타내지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

Claims (24)

  1. 포유동물 대상체에서 줄기 세포 생착을 위해 제공하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 컨디셔닝 레지멘을 포함하는, 방법:
    상기 대상체를 (i) 표적화된 조직에서 내인성 줄기 세포에 특이적으로 결합하는 제제 및 (ii) CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 차단하는 제제와; 상기 대상체로부터 표적화된 내인성 줄기 세포를 제거하기에 효과적인 용량으로, 동시에 접촉시키는 단계;
    상기 대상체를 (iii) 일시적 면역억제를 유도하는 제제와 접촉시키는 단계;
    대상체에서 (i) 및 (ii)의 혈청 수준이 무독성 수준으로 감소하기에 충분한 세정 기간에 이어서 상기 대상체에 외인성 줄기 세포를 포함하는 세포 조성물를 도입하는 단계;
    상기 외인성 줄기 세포는 골수절제 컨디셔닝의 부재에서 이식됨.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적화된 조직은 골수이고 상기 표적화된 줄기 세포는 조혈 줄기 세포인, 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 외인성 줄기 세포는 대상체에 대해 자가 또는 동종이계인, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 줄기 세포는 생체외에서 유전자적으로 조작되는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 표적화된 조직에서 내인성 줄기 세포에 특이적으로 결합하는 상기 제제는 c-키트에 특이적인 단클론성 항체인, 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 차단하는 제제는: 가용성 SIRPα 폴리펩타이드; CD47에 특이적인 항체, SIRPa에 특이적인 항체, 및 가용성 CD47 폴리펩타이드로부터 선택되는, 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 일시적 면역억제를 유도하는 제제는 CD40/CD40L 활성을 억제하는 제제; 마이코페놀산, 사이클로스포린 A, 라파마이신, FK506, 및 코르티코스테로이드로부터 선택되는, 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 일시적 면역억제를 유도하는 제제는 CD40L에 특이적인 항체인, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 일시적 면역억제를 유도하는 제제는 외인성 줄기 세포와 동시에 투여되는, 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 면역적격 인간인, 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 외인성 줄기 세포에 대해 반수체인, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 줄기 세포는 전체의 골수 단핵 세포의 조성물로 투여되는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포는 수령체에 정합된 MHC인, 방법.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체를 (iv) T 세포 및 NK 세포 중 하나 또는 둘 모두를 감손시키는 제제와 접촉시키는 단계를 더 포함하고, 상기 제제 (iv)는 외인성 줄기 세포의 도입 이전 및 선택적으로 외인성 줄기 세포의 도입과 동반하여 투여되는, 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 대상체는 외인성 줄기 세포에 대해 HLA-부정합되는, 방법.
  16. 청구항 14 또는 15에 있어서, 상기 세포 조성물은 골수, 제대혈, 또는 말초 혈액으로부터 CD34+ 발현을 위해 선택된 조혈 줄기 세포를 포함하는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 세포 조성물은 적어도 50% CD34+ 세포를 포함하는, 방법.
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 세포 조성물은 시험관내 만능 세포로부터 유래된 조혈 줄기 세포를 포함하는, 방법.
  19. 청구항 14 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 조성물은 적어도 105 CD34+ 세포/수령체 체중의 kg을 포함하는, 방법.
  20. 청구항 14 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제 (iv)는 T 세포 및 NK 세포를 감손시키는, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 제제 (iv)는 CD2, CD52, CD45에 특이적인 항체; 또는 항-흉선세포 글로불린 (ATG)으로부터 선택된 항체인, 방법.
  22. 청구항 14 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 T 세포를 감손시키는 제제 (iv)는 CD3, CD4, 및 CD8 중 하나 이상에 특이적인 항체로부터 선택되는, 방법.
  23. 청구항 14 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 NK 세포를 감손시키는 제제 (iv)는 CD122 및 CD56 중 하나 이상에 특이적인 항체로부터 선택되는, 방법.
  24. 포유동물 대상체에 줄기 세포 생착을 제공하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법:
    HLA-정합된 또는 HLA- 부정합된 쌍을 결정하기 위해 공여체 및 수령체를 HLA 타이핑하는 단계;
    CD34+ 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC)를 포함한 공여체로부터 조혈 세포를 수득하고 선택적으로 원하는 표현형의 HSPC를 분리하는 단계;
    HSPC 세포 조성물의 효과적인 용량을 형성하는 단계;
    수령체에 투여된 공여체 세포의 수; 공여체 세포의 순도; 공여체와 수령체 사이의 주 조직적합성 부정합의 정도; 및 수령체의 면역 상태에 기반한 조혈 세포의 주입 이전에 수령체에 대한 비-유전독성 컨디셔닝 레지멘을 위한 제제의 세트를 선택하는 단계;
    비-유전독성 컨디셔닝을 위한 제제의 세트를 투여하는 단계;
    조혈 세포를 주입하는 단계; 및
    조혈 줄기 세포 생착에 대해 수령체를 모니터링하는 단계.
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