CN112105369B

CN112105369B - 源自基因敲除猪的血液产品及其用途

Info

Publication number: CN112105369B
Application number: CN201980030378.7A
Authority: CN
Inventors: 戴一凡; 杨海元; 王盈
Original assignee: Chuangguan Suzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chuangguan Suzhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2024-05-14
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN108588123A; EP3791887A4; JP2021523175A; EP3791887A9; EP3791887A1; CN112105369A; JP7285578B2; EP3791887B1; US20210254004A1; WO2019214591A1

Abstract

提供了一种源自基因敲除猪的血液产品，以及该血液产品的应用。该血液产品与人血清中免疫球蛋白结合降低，对克服超急性免疫排斥反应有作用。

Description

源自基因敲除猪的血液产品及其用途

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及利用CRISPR/Cas9载体组合获得的源自基因敲除猪的血液产品及其用途。

背景技术

现代医学不断进步，输血在临床上被大量使用，但同样面临越来越多的问题，包括艾滋病、乙肝、丙肝等高发的传染病导致严重的输血风险。血液需求不断增多而献血量相对减少，血源资源日渐紧张。可以用动物红细胞(RBCs)研发出人RBCs输血的替代品。猪红细胞(pRBCs)已广泛用于异种输血红细胞的研发，pRBCs和人RBCs具有大量的相似性。同时，饲养在无特定病原体和生物安全条件下，pRBCs不携带人类的病原微生物。pRBCs不表达MHC抗原，即猪白细胞抗原(SLA)，因此降低了免疫原性。pRBCs没有细胞核，也不可能携带猪内源性逆转录病毒。

但是直接将野生型pRBCs用于临床输血还会导致很多问题。将野生型pRBCs输注到灵长类动物体中会产生一致的超急性排斥反应。例如，由于野生型pRBCs表达了人类具有天然溶血抗体的Gal和非Gal抗原，能够通过抗体-抗原结合和/或补体激活直接导致血细胞的裂解。

因此目前亟待获得改造的能够直接用于人输血的pRBCs。

发明内容

本申请提供源自基因敲除猪的血液产品，以及所述血液产品的应用。本申请的所述血液产品具备以下性质中的至少一个：1)与人血清中免疫球蛋白结合显著降低；2)对克服超急性免疫排斥反应有显著作用；3)有效解决了临床缺血的问题；4)为临床输血提供宝贵的材料来源；5)有效敲除了猪的GGTA1基因；6)有效敲除了猪的CMAH基因；7)有效敲除了猪的β4GalNT2基因；8)适于大规模批量生产；9)能够有效进行质量管控；和/或，10)安全可靠，不携带病原微生物和/或病毒。

本申请令人惊奇地发现，通过将待敲除基因中合适的外显子进行敲除，例如，通过针对待敲除基因的特定外显子设计合适的靶向的SgRNA序列，可以借助CRISPR/Cas9载体组合显著提高对所述待敲除基因(例如，包含GGTA1基因、CMAH基因和/或β4GalNT2基因)的敲除效率。进而得到源自该基因敲除猪的血液产品，从而有效降低异种移植所带来了超急性免疫排斥反应，使其可以作为一种人血的替代产品，发挥多种的试验和临床功能。

一方面，本申请提供了一种源自基因敲除猪的血液产品，所述基因敲除猪的GGTA1基因、CMAH基因和β4GalNT2基因被敲除，其中所述β4GalNT2基因中编码8号外显子中一个或多个氨基酸的一个或多个核苷酸缺失，从而使得所述β4GalNT2基因被敲除。

在某些实施方式中，所述GGTA1基因中编码3号外显子中一个或多个氨基酸的一个或多个核苷酸缺失，从而使得所述GGTA1基因被敲除。

在某些实施方式中，所述CMAH基因中编码6号外显子中一个或多个氨基酸的一个或多个核苷酸缺失，从而使得所述CMAH基因被敲除。

在某些实施方式中，所述基因敲除猪通过使用CRISPR/Cas9载体组合制备。

在某些实施方式中，所述GGTA1基因的3号外显子、所述CMAH基因的6号外显子以及所述β4GalNT2基因的8号外显子作为CRISPR/Cas9所靶向的部分。

在某些实施方式中，所述CRISPR/Cas9载体组合包括GGTA1-CRISPR/Cas9载体、CMAH-CRISPR/Cas9载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体，所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体含有SEQ ID No:1所示的特异性靶向GGTA1基因的SgRNA核苷酸序列，所述CMAH-CRISPR/Cas9载体含有SEQ ID No:2所示的特异性靶向CMAH基因的SgRNA核苷酸序列，且所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体含有SEQ ID No:3所示的特异性靶向β4GalNT2基因的SgRNA核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体包含SEQ ID No:4所示的核苷酸序列，所述CMAH-CRISPR/Cas9载体包含SEQ ID No:5所示的核苷酸序列，且所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体包含SEQ ID No:6所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述血液产品中包含所述基因敲除猪的红细胞。在某些实施方式中，所述血液产品中包含所述基因敲除猪的外周血单核细胞(PBMC)。

在某些实施方式中，所述红细胞具有降低的aGal抗原水平、降低的Neu5Gc抗原水平和降低的Sd^a样抗原水平。

在某些实施方式中，所述PBMC具有降低的aGal抗原水平、降低的Neu5Gc抗原水平和降低的Sd^a样抗原水平。

在某些实施方式中，与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞与人免疫球蛋白的结合水平降低。在某些实施方式中，与源自野生型猪的PBMC相比，所述基因敲除猪的PBMC与人免疫球蛋白的结合水平降低。

在某些实施方式中，与源自人的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞与人免疫球蛋白的结合水平相当。在某些实施方式中，与源自人的PBMC相比，所述基因敲除猪的PBMC与人免疫球蛋白的结合水平相当。

在某些实施方式中，所述人免疫球蛋白包括人IgG和/或人IgM。

在某些实施方式中，与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞与人血清的凝集反应降低。在某些实施方式中，所述凝集反应由抗血型抗原的IgM抗体和/或抗血型抗原的IgG抗体引起。

在某些实施方式中，与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞被输入人体后发生溶血性输血反应的可能性降低。

另一方面，本申请提供所述的血液产品用于制备向人输注的血液制品的用途。

在某些实施方式中，所述向人输注的血液制品基本不引起和/或能够改善超急性免疫排斥反应。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

具体实施方式

在本申请中，术语“基因敲除”通常是指使基因沉默和/或无法表达出其编码的蛋白质的基因工程手段。例如，所述基因敲除可以使用CRISPR/Cas系统。

在本申请中，术语“GGTA1基因”通常是指编码α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)的基因。在本申请中，猪(Sus scrofa)的GGTA1基因在Ensemble的登录号为ENSSSCG00000005518。猪的GGTA1假基因(pseudogene)的GenBank登录号为396733。

在本申请中，术语“CMAH基因”通常是指编码单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH)的基因。在本申请中，猪(Sus scrofa)的CMAH基因在Ensemble的登录号为ENSSSCG00000001099。猪的CMAH基因的GenBank登录号为396918。

在本申请中，术语“β4GalNT2基因”通常是指编码β1,4N-乙酸氨基半乳糖转移酶(β-1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase 2，β4GalNT2)的基因。在本申请中，猪(Susscrofa)的β4GalNT2基因在Ensemble的登录号为ENSSSCG00000040942。猪的β4GalNT2基因的GenBank登录号为100621328。猪的β4GalNT2基因及其产物可以为引起异种移植排斥反应的重要非Gal抗原。

在本申请中，术语“外显子”通常是指真核生物基因的一部分。在本申请中，所述外显子可以为在剪接(splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质的编码基因。所述外显子又可称为表达序列。线性表达的真核生物的基因可以具备多个所述外显子。例如，所述外显子可以被内含子所阻断。在本申请中，外显子X(所述X为正整数)，可以表示该基因的第X个外显子。

在本申请中，术语“血液产品”通常是指血液和基于血液制备的产品。例如，所述血液产品可以包括血液、红细胞及其成分制品、血小板及其成分制品、血浆、血浆蛋白制品和/或凝血因子制品。

在本申请中，术语“CRISPR/Cas9载体组合”通常是指利用包含CRISPR(即成簇规律间隔的短回文重复序列Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats，CRISPR)和Cas基因的载体的组合。在本申请中，可以利用所述CRISPR/Cas9载体组合实现所述基因敲除(参见Deveau et al.,2008；Horvath and Barrangou,2010)。

在本申请中，术语“SgRNA”通常是指人工CRISPR/Cas9系统中，单链嵌合抗体RNA(Single guide RNA，sgRNA)(参见Deltcheva et al.,2011；Bikard and Marraffini,2013)。所述SgRNA的长度可以为约20bp。在本申请中，所述SgRNA可以与靶序列配对结合后，然与Cas9蛋白结合形成复合物。

在本申请中，术语“红细胞”通常是指血液中将氧气运送到各个组织的细胞，又可称为“红血球”或“血红细胞”。所述红细胞的主要功能分子可以为血红蛋白，其可以在肺部与氧气分子结合，再在组织中将结合的氧气分子释放。在本申请中，所述红细胞也可以运送二氧化碳。在本申请中，哺乳动物(例如猪)的所述红细胞可以是无细胞核的。所述红细胞也可以没有线粒体。

在本申请中，术语“外周血单核细胞(PBMC)”通常是指拥有圆形的细胞核的外周血细胞(peripheral blood mononuclear cell)。所述PBMC可以包括淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)和单核细胞。所述PBMC可以从哺乳动物(例如猪)的全血中提取(例如，可以经梯度离心获得)。

在本申请中，术语“αGal抗原”通常是指由α1，3半乳糖基转移酶(aGal、GGTA、GGT1、GT、αGT、GGTA1或GGTA-1)基因编码的酶(GT、αGal或α1，3半乳糖基转移酶)。所述αGal抗原可以为人免疫系统识别的抗原表位或抗原。从转基因器官材料中去除αGal抗原无法消除该材料所引起的人免疫应答。

在本申请中，术语“Neu5Gc抗原”通常是指N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)。所述Neu5Gc抗原可以是由所述CMAH催化生成的一种唾液酸。在本申请中，所述CMAH可以催化唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)转化为Neu5Gc。所述Neu5Gc抗原可以为人免疫系统识别的抗原表位或抗原。

在本申请中，术语“Sd^a样抗原”通常是指猪的一种糖基转移酶。所述Sd^a样抗原可以是由β1,4N-乙酸氨基半乳糖转移酶催化合成的。在本申请中，所述Sd^a样抗原可以包括与血型或血液测试相关的Sd^a和类似聚糖。

在本申请中，术语“野生型猪”通常是指没有经过任何基因水平和/或蛋白质水平的改造(例如，一个或多个核苷酸和/或一个或多个氨基酸的缺失、插入、替换和/或修饰)的已知的任何猪(Sus scrofa)。例如，所述野生型猪可以为家猪(Sus scrofa domestica)，例如可以为巴克夏猪、切斯特白猪、杜洛克猪、汉普夏猪、海福特猪、长白猪、波中猪、花斑猪或约克夏猪。例如，所述野生型猪可以为野猪。在本申请中，所述野生型猪可以为完整的猪的个体，也可以为猪的器官、组织、体液和/或细胞。

在本申请中，术语“人免疫球蛋白”通常是指人免疫系统经抗原刺激后产生的免疫物质。例如，所述人免疫球蛋白可以包含IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM亚型。所述人免疫球蛋白可以称为抗体(例如IgG亚型)，其单体可以为一个Y形的分子，所述抗体可以由4条多肽链组成。其中包括两条相同的重链，以及两条相同的轻链，所述轻链和所述重链可以包含发生变化的部分——V区(又可称为变化区或可变区)，和不发生变化的部分——C区(又可称为恒定区)。

在本申请中，术语“血型抗原”通常是指人红细胞所含的AB抗原标准中的A、B、AB和O型血的抗原。

在本申请中，术语“凝集反应”通常是指因抗原和抗体结合而引起的一种血清学反应。在本申请中，所述抗原(例如，所述基因敲除猪的红细胞)可以称为凝集原。所述抗体(例如抗血型抗原的IgM抗体和/或抗血型抗原的IgG抗体)凝集素。所述凝集反应可以表现为出现肉眼可见的凝集小块。

在本申请中，术语“溶血性输血反应”通常是指免疫溶血性输血反应。例如，当受血者被输入不相容红细胞或存在同种抗体的供者血浆，所述不相容红细胞和/或所述供者血浆可以导致红细胞破坏。例如，所述溶血性输血反应可以包括急性(例如，在输血后24小时内产生反应)溶血性输血反应(AHTR)和迟发性(例如，在输血后数天或数周后产生反应)溶血性输血反应(DHTR)。例如，所述溶血性输血反应可以包括血管内溶血和血管外溶血。

在本申请中，术语“超急性免疫排斥反应”(HAR，Hyperacute rejection)通常是指在外源器官、组织和/或细胞移植入受体后，快速(例如移植后几分钟内)发生的衰竭。所述HAR可以发生于心脏和/或肾脏。所述HAR可能与胸腺T细胞相关。

在本申请中，术语“Gal”通常是指α1,3-galactosyltransferase(GGTA1)产生的一种末端低聚糖。在哺乳动物(例如人)中，所述Gal可以为体内天然产生的抗体的主要结合抗原。在本申请中，所有不结合所述Gal的抗体或其抗原结合片段，可以被认为属于非Gal抗体。

源自基因敲除猪的血液产品及其用途

例如，所述β4GalNT2基因中编码8号外显子中一个或多个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)氨基酸的一个或多个例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)核苷酸可以缺失或增加，从而使得所述β4GalNT2基因被敲除和/或不表达有功能的β4GalNT2编码产物。在本申请中，所述β4GalNT2基因的敲除效率可以为约40％以上，例如，可以为约41％以上、约42％以上、约43％以上、约44％以上、约45％以上、约46％以上、约47％以上、约48％以上、约49％以上或约50％以上。

在本申请中，所述GGTA1基因中编码3号外显子中一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)氨基酸的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)核苷酸可以缺失或增加，从而使得所述GGTA1基因被敲除和/或不表达有功能的GGTA1编码产物。在本申请中，所述GGTA1基因的敲除效率可以为约55％以上，例如，可以为约56％以上、约57％以上、约58％以上、约59％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上或约85％以上。

在本申请中，所述CMAH基因中编码6号外显子中一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)氨基酸的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)核苷酸可以缺失或增加，从而使得所述CMAH基因被敲除和/或不表达有功能的CMAH编码产物。在本申请中，所述CMAH基因的敲除效率可以为约60％以上，例如，可以为约61％以上、约62％以上、约63％以上、约64％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上或约85％以上。

在本申请中，所述基因敲除猪可以通过使用CRISPR/Cas9载体组合制备。

例如，所述GGTA1基因的3号外显子、所述CMAH基因的6号外显子和/或所述β4GalNT2基因的8号外显子可以作为CRISPR/Cas9所靶向的部分。

例如，所述GGTA1基因的CRISPR靶序列可以位于该基因的外显子3中，接近起始密码子。所述GGTA1基因的敲除还可以包括在该基因的外显子3中插入一个或多个(例如，可以插入1个、2个、3个、4个、5个或更多个)碱基(例如，可以插入一个碱基)。例如，可以在所述GGTA1基因的外显子3的T和C之间插入T。

例如，所述CMAH基因的CRISPR靶序列可以位于该基因的外显子6中，接近起始密码子。所述CMAH基因的敲除还可以包括在该基因的外显子3中插入一个或多个(例如，可以插入1个、2个、3个、4个、5个或更多个)碱基(例如，可以插入一个碱基)。例如，可以在所述GGTA1基因的外显子6的A和G之间插入A。

例如，所述β4GalNT2基因的CRISPR靶序列可以位于该基因的外显子8中。例如，所述β4GalNT2基因的敲除可以包括在该基因的外显子8中删除一个或多个(例如，可以删除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)碱基。例如，可以删除10个碱基。例如可以删除碱基ACTCACGAAC。

在某些情形下，所述β4GalNT2基因CRISPR靶序列可以不位于该基因的外显子2中。

本申请令人惊奇地发现，针对所述β4GalNT2基因的外显子8进行基因敲除，可以显著提高所述β4GalNT2基因的敲除效率。并且，针对所述β4GalNT2基因的外显子8进行敲除导致的所述β4GalNT2基因的敲除效率可以显著高于针对所述β4GalNT2基因的外显子2进行敲除的敲除效率。

在本申请中，所述CRISPR/Cas9载体组合可以包括GGTA1-CRISPR/Cas9载体、CMAH-CRISPR/Cas9载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体。例如，所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体可以含有SEQ ID No:1所示的特异性靶向GGTA1基因的SgRNA核苷酸序列。例如，所述CMAH-CRISPR/Cas9载体可以含有SEQ ID No:2所示的特异性靶向CMAH基因的SgRNA核苷酸序列。和/或，例如，所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体可以含有SEQ ID No:3所示的特异性靶向β4GalNT2基因的SgRNA核苷酸序列。

在某些情形下，所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体可以包含SEQ ID No:4所示的核苷酸序列。在某些情形下，所述CMAH-CRISPR/Cas9载体可以包含SEQ ID No:5所示的核苷酸序列。和/或，在某些情形下，所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体可以包含SEQ ID No:6所示的核苷酸序列。

例如，所述血液产品中可以包含所述基因敲除猪的红细胞。又例如，所述血液产品中可以包含所述基因敲除猪的外周血单核细胞(PBMC)。

在本申请中，所述红细胞可以具有降低的aGal抗原水平、降低的Neu5Gc抗原水平和降低的Sd^a样抗原水平。

在本申请中，所述PBMC可以具有降低的aGal抗原水平、降低的Neu5Gc抗原水平和降低的Sd^a样抗原水平。

在本申请中，所述GGTA1基因可以编码α1,3半乳糖基转移酶。功能性α1,3半乳糖基转移酶可以催化在糖蛋白上形成半乳糖α1,3-半乳糖(aGal)残基。所述aGal抗原可以是被人免疫系统识别的抗原或其抗原表位。

在本申请中，所述CMAH基因可以负责合成N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。例如，所述CMAH基因可以编码胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶，该酶可以催化唾液酸N-乙酰神经氨酸转化为所述Neu5Gc抗原。所述Neu5Gc抗原可以是被人免疫系统识别的抗原或其抗原表位。

在本申请中，所述β4GalNT2基因可以编码β1,4N-乙酰半乳糖胺基转移酶2糖基转移酶(β4GalNT2)。功能性β4GalNT2可以产生Sd^a样聚糖(例如，所述Sd^a样抗原)。所述Sd^a样抗原可以是被人免疫系统识别的抗原或其抗原表位。

在本申请中，例如，与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞与人免疫球蛋白的结合水平可以降低(例如，可以降低至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍或更多)。又例如，与源自野生型猪的PBMC相比，所述基因敲除猪的PBMC可以与人免疫球蛋白的结合水平降低(例如，可以降低至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约65倍、至少约70倍或更多)。

在本申请中，例如，与源自人的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞可以与人免疫球蛋白的结合水平相当(例如，可以为人的红细胞与人免疫球蛋白的结合水平的约135％～125％、约125％～115％、约115％～105％、约105％～95％、约95％～85％左右或约85％～75％)。又例如，与源自人的PBMC相比，所述基因敲除猪的PBMC可以与人免疫球蛋白的结合水平相当(例如，可以为人的PBMC与人免疫球蛋白的结合水平的约135％～125％、约125％～115％、约115％～105％、约105％～95％、约95％～85％左右或约85％～75％)。

在本申请中，所述人免疫球蛋白可以包括人IgG和/或人IgM。

在本申请中，与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞在人血清中的凝集反应可以降低(例如，可以降低至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍或更多)。在本申请中，所述凝集反应可以由抗血型抗原的IgM抗体和/或抗血型抗原的IgG抗体引起。

在本申请中，与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞被输入人体后发生溶血性输血反应的可能性可以降低(例如，可以降低至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍或更多)。

在本申请中，所述向人输注的血液制品基本可以不引起和/或能够改善超急性免疫排斥反应。在本申请中，所述改善的目的在于向治疗和/或缓解超急性免疫排斥反应的方向上取得任何的推进或进展。例如，所述的血液产品可以用于改善选自以下组中的至少一种与所述超急性免疫排斥反应相关的症状：血栓性闭塞、移植物脉管系统出血、嗜中性粒细胞流入、缺血、斑块、水肿、发绀、水肿、器官衰竭、器官功能下降和/或坏死、肾小球毛细管血管血栓形成、溶血、发热、凝血、胆汁产生降低、低血压、血清转氨酶含量升高、碱性磷酸酶水平升高、黄疸、嗜睡、酸中毒、高胆红素血症和/或血小板减少症。

在某些情形下，所述血液制品可以包括血浆、血白蛋白、胎盘血白蛋白、静脉注射用免疫球蛋白、肌注用免疫球蛋白、组织胺免疫球蛋白、特异性免疫球蛋白、乙肝免疫球蛋白、狂犬病免疫球蛋白、破伤风免疫球蛋白、凝血因子VIII、凝血酶原复合物、纤维蛋白原、抗淋巴细胞免疫球蛋白、抗凝血酶III、外用冻干纤维蛋白粘合剂、冻干凝血酶和/或S/D-FFP。

发明目的：为了解决现有异种红细胞临床输血中存在的免疫排斥反应，本申请提供了一种CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用。

技术方案：本申请所述CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用，所述基因敲除猪为敲除了GGTA1基因、CMAH基因和β4GalNT2基因的猪，所述CRISPR/Cas9载体组合包括GGTA1-CRISPR/Cas9载体、CMAH-CRISPR/Cas9载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体；所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体含有SEQ ID No:1所示的特异性靶向GGTA1基因的SgRNA核苷酸序列，所述CMAH-CRISPR/Cas9载体含有SEQ ID No:2所示的特异性靶向CMAH基因的SgRNA核苷酸序列，所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体含有SEQ ID No:3所示的特异性靶向β4GalNT2基因的SgRNA核苷酸序列。

例如，所述血液制品可以为红细胞。

例如，所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示；所述CMAH-CRISPR/Cas9载体的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。

其中，所述CRISPR/Cas9载体组合可以按如下方法构建得到：

(1)用BbsI酶酶切pX330质粒，酶切后的质粒使用琼脂糖凝胶分离，然后用胶回收试剂盒纯化回收酶切产物；

(2)在SgRNA核苷酸序列的5’末端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’末端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后退火得到双链片段；

(3)将步骤(1)得到的酶切产物和步骤(2)得到的双链片段使用连接酶进行连接；

(4)用质粒安全核酸外切酶处理步骤(3)得到的体系，去除错误连接的质粒；

(5)将步骤(4)得到的重组质粒转化到感受态细胞中进行培养；

(6)从步骤(5)培养的感受态细胞中提取重组质粒进行测序，确定载体构建成功；

当所述CRISPR/Cas9载体为GGTA1-CRISPR/Cas9载体时，步骤(2)中所述SgRNA核苷酸序列可以如SEQ ID No:1所示；当所述CRISPR/Cas9载体为CMAH-CRISPR/Cas9时，步骤(2)中所述SgRNA核苷酸序列可以如SEQ ID No:2所示；当所述CRISPR/Cas9载体为β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体时，步骤(2)中所述SgRNA核苷酸序列可以如SEQ ID No:3所示。

CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用，可以包括以下步骤：

(1)将CRISPR/Cas9载体组合转化至猪的胎儿成纤维细胞中；

(2)对步骤(1)得到的成纤维细胞进行抗性筛选，将具有抗性的成纤维细胞进行PCR扩增基因测序，获得敲除GGTA1基因、CMAH基因和β4GalNT2基因的成纤维细胞；

(3)将步骤(2)得到的成纤维细胞的细胞核移植到去核的猪卵母细胞中培养至囊胚阶段；

(4)将步骤(3)得到的囊胚移植到代孕猪中进行饲养，生产；

(5)静脉抽取步骤(4)生产的断奶后小猪的血液，置于抗凝管中保存，分离出红细胞。

所述红细胞的分离步骤可以如下所示：取抗凝管中保存的血液加入离心管中，用PBS溶液稀释，然后加入Ficoll-paque分离液形成分离体系，离心得到四层溶液，从上到下依次为血浆层、单核细胞层、Ficoll-paque层和红细胞层，弃去上三层，并用PBS溶液清洗红细胞，即得红细胞溶液。例如，所述分离体系中血液、PBS溶液和Ficoll-paque分离液的体积比可以为2:2:3。

例如，所述离心条件可以为：19℃，400g离心40min。

在本申请中，术语“一(a)”和“一个(an)”和“所述(the)”和“至少一种”以及相似指示词的使用应理解为包括单数和复数。除非在本文中另有说明或者与上下文明显矛盾，当使用的术语“至少一种”后接一项或多项列举项(例如，“至少一种A和B”)时，应理解为表示选自所列项的一项(A或B)或者所列项中两项或多项的任意组合(A和B)。

在本申请中，除非另有注明，术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”都应理解为开放性术语(即，意思是“包括，但不限于”)。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的装置、方法和系统的工作方式，而不用于限制本申请发明的范围。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：

图1显示了CRISPR/Cas9载体组合特异性靶向GGTA1、CMAH和β4GalNT2基因的SgRNA核苷酸序列；

图2显示了GGTA1-CRISPR/Cas9载体的质粒图谱；

图3显示了CMAH-CRISPR/Cas9载体的质粒图谱；

图4显示了β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体的质粒图谱；

图5显示了本申请所述基因敲除猪(TKO)出生时和断奶后的情况；

图6显示了本申请所述基因敲除猪(TKO)中GGTA1基因、CMAH基因和β4GalNT2基因均被成功敲除；

图7A-7B显示了本申请所述基因敲除猪(TKO)与人的免疫球蛋白结合情况；

图8显示了本申请所述基因敲除猪(TKO)红细胞的抗原流式结果；

图9A-9B显示了本申请所述基因敲除猪(TKO)红细胞与人血清中IgM和IgG结合结果；

图10显示了本申请所述基因敲除猪(TKO)红细胞的凝集试验结果。

图11显示了本申请所述基因敲除猪(TKO)红细胞的凝集试验结果。

图12显示了本申请所述基因敲除猪(TKO)红细胞的凝集的效价。

图13显示了本申请所述基因敲除猪(TKO)红细胞的凝集试验结果。

图14显示了本申请所述基因敲除猪(TKO)红细胞的凝集试验结果。

图15显示了本申请所述基因敲除猪(TKO)红细胞的MMA试验的结果。

实施例

实施例1构建CRISPR/Cas9载体

首先根据GGTA1/CMAH/β4GalNT2基因的DNA序列，合成靶向GGTA1、CMAH和β4GalNT2基因的sgRNA(single guide RNA)，以pX330为骨架质粒，分别构建GGTA1-CRISPR/Cas9载体、CMAH-CRISPR/Cas9载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体。

1.1GGTA1-CRISPR/Cas9载体的制备

首先根据Genbank中公布的猪GGTA1基因序列，选取GGTA1基因的3号外显子exon3作为CRISPR/Cas9靶点，根据cas9靶点设计原则：5’端为G，3’端为PAM序列(NGG)，设计SgRNA序列为GAAAATAATGAATGTCAA，如图1所示。其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

GGTA1-CRISPR/Cas9载体按如下方法制备得到：

步骤一、根据cas9靶点设计原则：5’端为G，3’端为PAM序列(NGG)，在GGTA1基因上寻找靶点位置；

步骤二、购买表达hSpCas9和gRNA的pX330骨架质粒(Addgene plasmid 423230)；

步骤三、合成5’端磷酸化寡核苷酸链SgRNA序列：在SgRNA核苷酸序列的5’末端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’末端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列：

5’–CACCGAAAATAATGAATGTCAA–3’(SEQ ID No:7)

3’–CTTTTATTACTTACAGTTCAAA–5’(SEQ ID No:8)。

SgRNA序列克隆到pX330骨架载体上，具体步骤如下：

1、用限制性内切酶BbsI消化1μg pX330质粒；

2、酶切的pX330质粒跑琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶浓度1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)分离，用胶回收试剂盒(QIAGEN)纯化回收酶切产物；

3、步骤三合成的正向和反向寡核苷酸序列按照以下程序退火：

1μL Oligo1(正向寡核苷酸序列)(10μM)
	1μL Oligo2(反向寡核苷酸序列)(10μM)
8μL ddH₂O
	共计：10μL

37℃30min

95℃5min然后以5℃/min的速率降至25℃

4、按照以下体系启动连接反应：室温反应10min

5、用质粒安全核酸外切酶处理连接体系，去除错误链接质粒：

37℃反应30min

6、转化

(1)取50μL感受态细胞(TIANGEN)置于冰浴中；

(2)向装有感受态细胞的离心管中加入15μL步骤5得到的去除错误连接质粒溶液，混匀后在冰浴中静置30min；

(3)将冰浴30min的感受态细胞置于42℃水浴中60～90s，然后迅速转移至冰浴中，使细胞冷却2～3min；

(4)向离心管中加入900μL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床150rpm振荡培养45min；

(5)将离心管放到离心机中12000rpm离心5min，然后弃去900μL上清，用剩余的100μL上清重悬感受态细胞沉淀，然后将重悬的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将感受态细胞涂布均匀；将涂布有感受态细胞的LB固体琼脂培养基倒置于37℃培养箱中培养12～16h。

7、小提质粒，测序，鉴定打靶质粒构建成功。

所构建的CRSAPR/Cas9载体命名为GGTA1-CRISPR/Cas9，其核苷酸序列如SEQ IDNo:4所示。

1.2、CMAH-CRISPR/Cas9载体的制备

首先根据Genbank中公布的猪CMAH基因序列，选取CMAH基因的6号外显子exon6作为CRISPR/Cas9靶点，根据cas9靶点设计原则：5’端为G，3’端为PAM序列(NGG)，设计SgRNA向导序列为GAGTAAGGTACGTGATCTGT，如图1所示。其核苷酸序列SEQ ID No:2所示。

CMAH-CRISPR/Cas9载体按如下方法制备得到：

步骤一、根据cas9靶点设计原则：5’端为G，3’端为PAM序列(NGG)，在CMAH基因上寻找靶点位置；

步骤三、公司合成5’端磷酸化寡核苷酸链SgRNA序列：在SgRNA核苷酸序列的5’末端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’末端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列：

5’–CACCGGAGTAAGGTACGTGATCTGT–3’(SEQ ID No:9)

3’–CCTCATTCCATGCACTAGACACAAA–5’(SEQ ID No:10)。

将SgRNA序列克隆到pX330骨架载体上，具体步骤如下：

1、用限制性内切酶BbsI消化1μg pX330质粒；

37℃30min

95℃5min然后以5℃/min的速率降至25℃。

4、按照以下体系启动连接反应：室温反应10min

37℃反应30min

6、转化

(1)取50μL感受态细胞(TIANGEN)置于冰浴中；

7、小提质粒，进行测序，鉴定打靶质粒构建成功。

所构建的CRSAPR/Cas9载体命名为CMAH-CRISPR/Cas9，其核苷酸序列如SEQ IDNo:5所示。

1.3、β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体的制备

首先根据Genbank中公布的猪β4GalNT2基因序列，选取β4GalNT2基因的8号外显子exon8作为CRISPR/Cas9靶点，根据cas9靶点设计原则：5’端为G，3’端为PAM序列(NGG)，设计向导序列GGTAGTACTCACGAACACTC见图1，核苷酸序列SEQ ID No:3所示。

β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体按如下方法制备得到：

步骤一、根据cas9靶点设计原则：5’端为G，3’端为PAM序列(NGG)，在β4GalNT2基因上寻找靶点位置；

5’–CACC GGTAGTACTCACGAACACTC–3’(SEQ ID No:11)

3’–CCATCATGAGTGCTTGTGAGCAAA–5’(SEQ ID No:12)

将SgRNA序列克隆到pX330骨架载体上，具体步骤如下：

1、用限制性内切酶BbsI消化1μg pX330质粒；

37℃30min

95℃5min然后以5℃/min的速率降至25℃。

4、按照以下体系启动连接反应：室温反应10min

37℃反应30min

6、转化

(1)取50μL感受态细胞(TIANGEN)置于冰浴中；

7、小提质粒，司测序，鉴定打靶质粒构建成功。

所构建的CRSAPR/Cas9载体命名为β4GalNT2-CRISPR/Cas9，其核苷酸序列如SEQID No:6所示。

能广泛存在哺乳动物中分别表达GGTA1/CMAH/β4GalNT2基因的GGTA1-CRISPR/Cas9载体、CMAH-CRISPR/Cas9载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体(其图谱可依次参见图2、3和4)包含U6启动子，CMV联合鸡β-肌动蛋白(CMV-chicken-β-actin enhancer)基因的增强子，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因—新霉素(Neomycin)基因和原核细胞中筛选用的抗性基因—氨苄青霉素(ampicillin)基因。这种能广泛性表达的β-骨骼肌肌动蛋白(CMV-chicken-β-actin promoter)基因的U6启动子可保证下游基因广泛性表达。

实施例2利用体细胞克隆的方法构建GGTA1/CMAH/β4GalNT2三基因敲除猪

将实施例1构建好的GGTA1-CRISPR/Cas9载体、CMAH-CRISPR/Cas9载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体通过与tdTomato质粒共转染猪胎儿成纤维细胞。通过G418筛选获得单细胞克隆，测序鉴定获得GGTA1/CMAH/β4GalNT2三基因敲除的猪胎儿成纤维细胞，通过体细胞核移植(SCNT)制备GGTA1/CMAH/β4GalNT2三基因敲除的长白猪。提取刚出生的小猪基因组，利用PCR引物进行扩增，连接T载体进行基因型鉴定。

步骤一、猪原代成纤维细胞复苏

1、从液氮中取出冻存的原代猪成纤维细胞，在37℃水浴中解冻；

2、将解冻的细胞转入无菌的15mL离心管中，然后加入3mL细胞培养基，1500rpm离心5min；

其中，细胞完全培养基的配方为：16％胎牛血清(Gibco)和84％DMEM培养基(Gibco)，所述百分比为体积百分比。

3、弃去上清，加入2mL完全培养基重悬细胞沉淀，然后将重悬的细胞铺入6cm细胞培养皿中，补加2mL完全培养基，置于37℃，5％CO₂(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养；

4、将细胞培养至长满皿底90％左右时使用0.05％(5g/100mL)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15mL离心管中，1500rpm离心5min，弃去上清，使用2mL完全培养基重悬细胞，对细胞计数，将细胞总量调整至1.5×10⁶以备下一步核转染实验。

步骤二、使用构建好的GGTA1-PX330，CMAH-PX330，β4GalNT2-PX330和tdTomato质粒(Clontech,PT4069-5)共转染猪原代成纤维细胞

使用哺乳动物成纤维细胞核转染试剂盒(Lonza)与Lonza Nucleofactor^TM2b核转仪进行核转染实验

1、配制核转染反应液，体系如下：

核转染基本溶液 82μL

补充成分 8μL

2、将构建好的三个质粒与Tdtomato质粒分别按照质量比5:1的比例加入本步骤1获得的100μL核转反应液中混匀，过程中注意切勿产生气泡；

3、将步骤一制备得到的细胞悬液使用DPBS杜氏磷酸缓冲液(Gibco)洗两遍，37℃消化2min，用含体积百分比为10％胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化后，1500rpm离心5min，弃去上清，使用本步骤2中含有质粒的核转反应液重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；

4、将该核转体系小心加入到试剂盒带有的电转杯中，注意防止气泡。先用含有100μLPBS的电转杯放置于Lonza核转仪的杯槽内，选择U023核转程序调试程序后，将含有细胞的电转杯电击转染后立即在超净台内将电转杯中液体轻柔吸出，转入到1mL含体积百分比为16％胎牛血清的DMEM完全培养基中，轻轻混匀；

5、准备含8mL完全培养基的培养皿(10cm)若干，吸取核转后的细胞悬液加入含有完全培养基的培养皿中，混匀，在显微镜下观察细胞数量，计数，使得培养皿在显微镜下一个视野内约有50～60个细胞，其余皿均按照此细胞悬液最终用量加入，混匀后放置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中进行培养。

步骤三、三基因敲除细胞系的筛选

1、将步骤二所得细胞培养24h后将细胞培养基更换为含有1mg/mL G418的完全培养基，放置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中进行培养，每2～3天更换一次细胞培养基，期间根据细胞生长状况逐渐降低G418的药物浓度，G418终浓度为0.3mg/mL，培养10～14天左右培养皿中会陆续长出G418抗性的单克隆细胞系；

2、使用克隆环挑取细胞系，将挑取的单克隆细胞系接种于铺有0.3mg/mLG418完全培养基的24孔板中，放置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基；

3、待24孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中4/5细胞接种到含有0.3mg/mL G418完全培养基的12孔板或6孔板中(根据细胞量)，剩余的1/5的细胞留在24孔板中继续培养；

4、待12孔板或6孔板细胞铺满孔底后使用0.05％(5g/100mL)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％胎牛血清+10％DMSO，体积比)将细胞冻存；

步骤四、三基因敲除细胞系的基因鉴定

1、待24孔板中细胞长满孔底后使用0.05％(5g/100mL)的胰蛋白酶消化并收集细胞，然后在细胞中加入25ml NP-40裂解液裂解细胞提取细胞基因组DNA，裂解程序为：55℃60min——95℃5min——4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；

2、针对GGTA1/CMAH/β4GalNT2基因靶点信息设计相应的PCR引物，PCR引物序列分别为：

GGTA1

正向引物为：5’-CCTTAGTATCCTTCCCAACCCAGAC-3’(SEQ ID No:13)

反向引物为：5’-GCTTTCTTTACGGTGTCAGTGAATCC-3’(SEQ ID No:14)

PCR目的产物长度为428bp；

CMAH

正向引物为：5’-CTTGGAGGTGATTTGAGTTGGG-3’(SEQ ID No:15)

反向引物为：5’-CATTTTCTTCGGAGTTGAGGGC-3’(SEQ ID No:16)

PCR目的产物长度为485bp；

β4GalNT2

正向引物为：5’-CCCAAGGATCCTGCTGCC-3’(SEQ ID No:17)

反向引物为：5’-CGCCGTGTAAAGAAACCTCC-3’；(SEQ ID No:18)

PCR目的产物长度为399bp；

3、使用PCR反应扩增GGTA1/CMAH/β4GalNT2靶点基因，PCR反应体系如下：

反应条件如下

CMAH靶点基因的扩增同上述步骤；β4GalNT2靶点基因的扩增同上述步骤。

4、将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)，电泳结束后在紫外线下切下目的条带，然后使用胶回收试剂盒(QIAGEN)回收目的条带，并使用NanoDrop 200测定回收的PCR产物的浓度；

5、将回收的PCR产物使用TAKARA pMD^TM18-T Vector Cloning Kit链接T载体，T载体反应体系如下：

pMD18-T vector 1μL

胶回收PCR产物 81.7ng*

ddH₂O 补齐体系至10uL

*注：TAKARA pMD^TM18-T Vector Cloning Kit说明书上对Insert DNA(本次为胶回收PCR产物)用量的要求0.1～0.3pM，本次选取0.2pM，用量计算方法为：Insert DNA的使用量(ng)＝nmol数×660×Insert DNA的bp数。

T载体链接的反应条件为16℃反应30min；

6、将本步骤5所得的T载体链接产物使用感受态细胞(TIANGEN)进行转化，转化后将感受态细胞涂布于Amp抗性的LB琼脂固体培养基上，37℃恒温培养箱培养过夜；

从培养过夜的培养基上挑取10～15个单克隆菌落送测序公司进行测序，然后将测序结果与靶点GGTA1/CMAH/β4GalNT2信息进行比对，从而判断该细胞系是否为GGTA1/CMAH/β4GalNT2基因敲除细胞系；

本次挑取的单克隆细胞系共27个，其中三个基因同时敲除的双等位基因敲除细胞系1个，编号为50#，该克隆基因型情况见表1：

表1 GGTA1/CMAH/β4GalNT2基因敲除的长白猪成纤维细胞的基因鉴定

GGTA TTTTCCCAGGAGAAAATAATGAATGTCAAAGGAAGAGTGGTTCTGTC WT

50# TTTTCCCAGGAGAAAATAATGAATGTtCAAAGGAAGAGTGGTTCTGTC+1

CMAH AGGTCCATGCAGGCGTGAGTAAGGTACGTGATCTGTTGGAAGACAGT WT

50# AGGTCCATGCAGGCGTGAGTAAaGGTACGTGATCTGTTGGAAGACAGT+1

β4GalNT2 GGGTAGTACTCACGAACACTCCGGAGCATGGTCATGAGCTTGTGGGG WT

50# GGGTAGT----------ACTCCGGAGCATGGTCATGAGCTTGTGGGG-10

结果发现，敲除GGTA1(表1中WT的GGTA1片段的核苷酸序列如SEQ ID No:19所示)、CMAH(表1中WT的CMAH片段的核苷酸序列如SEQ ID No:20所示)、β4GalNT2(表1中WT的β4GalNT2片段的核苷酸序列如SEQ ID No:21所示)基因的敲除效率分别为56％、63％和41％。

由于GGTA1/CMAH/β4GalNT2三基因敲除和GGTA1/CMAH两基因敲除相比，与人的IgM，IgG的结合明显降低，因此三基因敲除是必须的。

步骤五、体细胞核移植

1、从屠宰场购买六月龄以上的母猪卵巢，人工抽取卵泡中未成熟的卵母细胞，在显微镜下挑取质量较好的卵母细胞并置于38.5℃，5％CO₂恒温培养箱中培养42～44h至卵母细胞成熟；

2、利用显微操作系统将本步骤(1)中成熟的卵母细胞去核，然后复苏步骤四获得的GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除单克隆细胞系，将GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除细胞作为核供体注入去核卵母细胞中，每个去核卵母细胞注射一个GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除细胞；

3、将注射好的细胞利用电融合技术将核移植后得重构胚胎激活，将胚胎置于38.5℃培养箱培养5天发育成桑椹胚；

4、将发育情况良好的胚胎移植到代孕母猪的子宫中，小心护理代孕母猪，移植一个月后使用B超检测受体猪的怀孕情况，期间及时监控直至代孕母猪分娩。

步骤六、三基因敲除长白猪的基因型分析

1、GGTA1/CMAH/β4GalNT2基因敲除小猪出生后剪取小猪耳部组织，然后使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取小猪基因组DNA；

2、使用本步骤1中所得小猪基因组DNA进行PCR反应，PCR反应条件同步骤四3，然后将PCR反应产物送测序公司进行测序，将测序结果与GGTA1/CMAH/β4GalNT2基因靶点序列进行比对。

本次共出生8只GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除猪(TKO)编号为1-8(如图5所示)，出生的8头公猪与细胞基因型结果一致。

按照实施例2中的步骤，将实施例1构建好的GGTA1-CRISPR/Cas9载体、单独使用，得到GGTA1单基因敲除(GGTA1-KO)猪。

实施例3 GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除猪的性质

3.1、GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除猪的GGTA1/CMAH/β4GalNT2确被敲除

实施例2制备得到的GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除的猪(TKO)断奶以后，抽血、分离外周血单个核细胞(PBMC)，通过流式细胞仪测定小猪的基因敲除情况。

通过以下方法分离PBMC：取100μL抗凝血，加3倍体积的红细胞裂解液(BD，用去离子水稀释10倍)，室温裂解5min～10min。离心后，弃上清，用预冷洗涤液0.1％FBS(溶剂为PBS，0.1％即0.1g FBS/100mL PBS)(增强细胞沉降)，漂洗，离心，即获得PBMC沉淀。

商业化的人血清56℃水浴锅灭活30min后，孵育获得的PBMC，冰上孵育2h，5000rpm转离心5min，用PBS洗三次，体积比为10％山羊血清4℃封闭30min后，PBS洗三次。与特异性结合GGTA1、CMAH和β4GalNT2的抗体孵育后，PBS洗掉抗体，重悬，上机检测平均荧光强度。

结果如图6所示，图6从上到下依次表示GGTA1、CMAH和β4GalNT2表达的情况。其中PBS对照组为空白对照，同型对照组为鸡IgY，WT为野生型猪。结果显示，TKO猪不表达这三种抗原(α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)，CMP-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(β4GalNT2))，即TKO中GGTA1基因、CMAH基因和β4GalNT2基因均被成功敲除。

3.2、外周血单个核细胞(PBMC)与人血清中免疫球蛋白结合水平

按照3.1中的方法分离实施例2制备得到的GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除的猪(TKO)、GGTA1-KO猪，以及人和野生型猪的PBMC。

商业化的人血清56℃水浴锅灭活30min后，孵育分离得到的所述PBMC，冰上孵育2h，5000rpm转离心5min，用PBS洗三次，体积比为10％山羊血清4℃封闭30min后，PBS洗三次。孵育人特异性的免疫球蛋白抗体(即抗人IgM抗体和抗人IgG抗体)后，PBS洗掉抗体，重悬，上机检测平均荧光强度。

结果如图7A-7B所示，图7A-7B依次表示与人血清中免疫球蛋白IgM和IgG的结合水平。结果显示，与野生型猪相比，TKO的PBMC与人免疫球蛋白IgM和IgG的结合水平大大降低，与正常情况下人PBMC的结合水平差异不大。而GGTA1-KO猪尽管稍优于野生型猪，与人免疫球蛋白IgM和IgG的结合水平仍显著与人PBMC不同。可见TKO的PBMC可以克服人超急性免疫排斥。

实施例4TKO的RBC的特征

(1)红细胞(RBCs)分离

固定实施例2制备得到的GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除的猪(TKO)，用无菌注射器从前腔静脉丛抽取5mL血液，置于抗凝管中，4℃保存一周。取2mL抗凝血，加到15mL离心管中，再加2mL PBS溶液稀释混匀。缓慢将稀释好的血液加入装有3mL Ficoll-paque分离液(GE公司)的15mL离心管中，分上下两层，上层为血液，下层为Ficoll-paque分离液。19℃，400g离心40min后取出，此时液相分为四层，从上到下依次为血浆层、单核细胞层、Ficoll-paque层和红细胞层。弃去上层液，留下红细胞，并加7mL PBS溶液重悬混匀，19℃，400g离心10min后取出，弃去上层液。加5mL PBS溶液重悬混匀，19℃，400g离心10min后取出，弃去上层液，加2mL PBS重悬即可使用。

按此方法，分别得到人RBCs和野生型猪(WT)的RBCs。

(2)和IB4凝集素或DBA孵育

IB4凝集素与由GGTA1的表达产物产生的α半乳糖连接的碳水化合物相互作用；DBA凝集素与β4GalNT2的表达产物产生的碳水化合物结构相互作用。

取1×10⁵步骤(1)制备的红细胞于1.5mL EP管中，3000rpm离心5min，弃去上清液。用PBS稀释好的IB4凝集素(购自Invitrogen)或DBA凝集素(购自Invitrogen)稀释液(稀释比例1：1000)200μL重悬细胞沉淀，4℃避光孵育1h，将未孵育凝集素的样品作为空白对照。用PBS溶液洗两次，离心的沉淀用200μL PBS溶液重悬，使用BD FACSCalibur流式细胞仪检测，使用FlowJo 10.0软件进行分析，结果如图8所示。

图8的第一列和第二列依次表示分别与IB4凝集素和DBA凝集素孵育后的结果。其中，WT为野生型猪。图8的结果说明，与WT不同，TKO和人的RBC(人O型的RBC)对IB4凝集素和DBA凝集素的抗原流式结果均为阴性。

(3)和Neu5Gc抗体孵育

CMAH基因能够合成糖分子Neu5Gc。

取1×10⁵步骤(1)制备的红细胞于1.5mL EP管中，3000rpm离心5min，弃去上清液。用稀释好的0.5％封闭液(不含哺乳动物血清)200μL重悬细胞，4℃避光孵育30min。用PBS溶液洗两次后，再用PBS溶液稀释好的Neu5Gc抗体(Purified anti-Neu5Gc Antibody(biolegend,146903))稀释液(稀释比例1：1000)200μL重悬细胞沉淀并4℃孵育1h，将未孵育抗体的样品作为空白对照。用PBS溶液洗两次后，再用PBS溶液稀释好的山羊抗鸡IgY抗体(invitrogen，A11039)稀释液(稀释比例1：1000)200μL重悬细胞沉淀并避光4℃孵育1h，3000rpm离心5min，弃去上清。用PBS溶液洗两次后，离心的沉淀用200μL PBS溶液重悬。使用BD FACSCalibur流式细胞仪检测，使用FlowJo 10.0软件进行分析，结果如图8所示。

图8的第三列表示与Neu5Gc抗体孵育后的结果。其中，WT为野生型猪。图8的结果说明，与WT不同，TKO和人的RBC(人O型的RBC)对Neu5Gc抗体的抗原流式结果均为阴性。

(4)人IgG/IgM结合实验

预先将人AB型血清在56℃孵育30min灭活。取1×10⁵步骤(1)制备的红细胞于1.5mL EP管中，3000rpm离心5min，弃去上清液。用PBS溶液稀释好的15％(v/v)人AB血清稀释液200μL重悬细胞沉淀并4℃孵育1h，将未孵育人AB血清的样品作为空白对照。用PBS溶液洗两次后，再用10％(v/v)即用型正常山羊血清200μL重悬细胞，4℃孵育30min。用PBS溶液洗两次后，再用PBS溶液稀释好的山羊抗人IgG或IgM抗体(anti-human IgM(invitrogen,A18842)；anti-human IgG(invitrogen,A18830)稀释液(稀释比例1:1000)200μL重悬细胞沉淀并避光4℃孵育1h。3000rpm离心min，弃去上清。用PBS溶液洗两次后，离心的沉淀用200μL PBS重悬。使用BD FACSCalibur流式细胞仪检测，使用FlowJo 10.0软件进行分析，结果如图9A-9B所示。

图9A-9B的结果显示，其中，WT为野生型猪。图9A-9B的结果说明，人红细胞和TKO的红细胞对人IgG和IgM的结合能力的结合能力均显著低于野生型猪的红细胞。可见TKO的RBCs可以克服人超急性免疫排斥。

实施例5红细胞凝集实验

5.1凝集实验

RBC的获取方法参见实施例4。

采集的猪血三洗后制成3％红细胞悬液，取50μL 3％(v/v)RBCs(WT猪和TKO猪)悬液与100μL正常人群(A、B、AB和O型)血清分别加入玻璃试管中，37℃孵育30min，1500g 30s离心弃上清，生理盐水洗3遍，加抗人IgG抗体(上海血液生物医药有限责任公司)25μL，1000g 15s常温离心，轻轻摇晃后观察凝集程度。结果如图10所示。

图10的结果说明，无论性别，TKO猪的RBCs与人A、B、AB和O型的血清凝集强度明显低于野生型猪与人A、B、AB和O型凝集强度。在图10的纵坐标上凝集程度判定：0：无凝集或溶血；±：背景混浊，散在的不结实的小凝集块，振摇后凝集块不可见；1+：背景混浊，散在的不结实的小凝集块，振摇后凝集块仍可见；2+：不结实的凝集块，背景清晰，振摇后背景混浊；3+：数个结实凝集块，背景清晰；4+：一个结实的凝集块。随着数字的增加，凝集程度不断增加。

将抗A人多克隆抗体、抗B人多克隆抗体和抗D人多克隆抗体(均购自中国医学科学院输血研究所)各2滴，加入三洗后待检3％RBCs(WT猪、TKO猪和人)悬液1滴加入试管，混匀，1000g离心15秒，肉眼观察凝集程度。结果如图11-12所示。

图11的结果说明了与野生型猪的红细胞相比，TKO猪的红细胞与人血清的凝集反应程度明显减弱。

图12显示了WT猪和TKO猪红细胞分别与人AB血清的凝集反应的效价。以产生明显凝集现象的RBC的最高稀释度作为凝集反应的效价。在图12中，凝集程度判定：0：无凝集或溶血；±：背景混浊，散在的不结实的小凝集块，振摇后凝集块不可见；1+：背景混浊，散在的不结实的小凝集块，振摇后凝集块仍可见；2+：不结实的凝集块，背景清晰，振摇后背景混浊；3+：数个结实凝集块，背景清晰；4+：一个结实的凝集块。随着数字的增加，凝集程度不断增加。+S代表strong，即增强；+W代表weak，即减弱。3906(A型)、3353(O型)血样取自WT猪，0(A型)、3(O型)血样取自TKO猪。

5.2盐水法检测红细胞凝集

RBCs(WT猪、TKO猪和人)的获取方法参见实施例4，这些RBCs作为供者红细胞。

将人A型、B型、AB型、O型的血清(均采集自健康献血员)作为受者血清。

取小试管2支，分别标明主管和自身对照管。主管内加受者血清2滴和供者红细胞悬液1滴；自身对照管分别加受者血清2滴及受者红细胞悬液1滴。摇匀混和，以1000g离心15秒，肉眼观察凝集程度。结果如图13所示。

图13的结果说明了在检测抗血型抗原的IgM抗体引起的红细胞凝集反应中，TKO猪的红细胞较野生型猪的额红细胞在人各种血型血清中凝集反应显著降低。

5.3间接抗人球蛋白法检测红细胞凝集

按实施例5.2中所述盐水法的操作步骤完成所述主管和自身对照管的加样，混匀，置37℃孵育30分钟，三洗红细胞，末次洗涤后扣干，每管中加入抗人IgG抗体(购自上海血液生物医药有限责任公司)1滴，混合，1000g离心15秒，观察结果。结果如图14所示。

图14的结果说明了在检测抗血型抗原的IgG抗体引起的红细胞凝集反应中，TKO猪的红细胞较野生型猪的红细胞在人各种血型血清中凝集反应显著降低。

实施例6人单核细胞巨噬细胞分化关联蛋白(MMA)试验

材料和方法

1.血液标本

人血液样品取自献血员，献血员符合国家献血者健康检查标准。抽取全血5mL/(人)份，4℃保存备用。5497(A型)、5119(O型)血样取自WT猪，0#(A型)、3#(O型)血样取自TKO猪。

2.仪器与试剂

淋巴细胞分离液(AS1114545，Axis-Shield，挪威)，RPMI 1640基础培养基(gibco，美国)，胎牛血清(FBS，0500，Sciencell，美国)，瑞氏-吉姆萨染色液(DN0007，雷根生物技术有限公司)，甲醇(国药集团)。腔室系统(154534PK，Thermo Fisher，美国)，正置显微镜(BX53，Olympus，日本)。

3.人外周血单个核细胞(PBMCs)分离与培养

将5mL全血转入50mL离心管中，加入等量PBS稀释混匀。在50mL离心管中加入10mL淋巴细胞分离液，将稀释后的血液轻轻加到离心管的淋巴细胞分离液上层，以2200转/分钟室温下离心20min，离心速度慢升慢降。离心后PBMC所在的细胞层为白色，将该层细胞吸取到另一个50mL离心管中，加入PBS洗2次，重悬于RPMI 1640+10％FBS培养基，培养于腔室系统(每孔500μL，700000个细胞)，在5％CO₂孵箱37℃培养1小时使其贴壁。

4.猪红细胞(pRBCs)与血清共孵育处理

吸取猪红细胞pRBC(WT猪和TKO猪)，以PBS洗2次，计数。从人全血中吸取血清，将1.4×10⁸个红细胞与200μL血清混匀，5％CO₂孵箱37℃培养1小时。设置阳性对照组(人源抗D抗体与人血红细胞孵育)、阴性对照组(AB型血清与人O型红细胞孵育)。以PBS洗3次，重悬于500μL的RPMI 1640+10％FBS培养基。

5.MMA吞噬试验

将贴壁后的PBMCs吸去培养基，加入500μL已与血清反应后的pRBCs，在5％CO₂孵箱37℃培养2小时，PBS润洗2次，甲醇室温固定45s，瑞氏-吉姆萨染色液室温染色1分钟；加入等量的磷酸盐稀释液，室温放置5min，随后用水冲掉染料，干燥后拍照。

平均吞噬指数通过以下方法测得：使用显微镜观察、拍照，计数超过600个细胞。平均吞噬指数＝粘附或吞噬红细胞的细胞数/细胞总数×100％。

平均吞噬指数的结果参见图15。图15的结果说明，TKO猪的红细胞输入人体后发生溶血性输血反应的可能性远低于野生型猪的红细胞。

本文描述了本申请的实施方式，包括发明人所知晓的实施本申请的方式。在对上述说明书阅读的基础上，那些实施方式及其简单的变形方式对本领域普通技术人员而言是显而易见的。发明人预期熟练技术人员可以根据需要应用这样的变形方式，且发明人有意以本文中具体描述的方式以外的方式实施本申请。因此，本申请包括由适用法律所准许的本申请所附权利要求中所述主题的所有修饰和等同。而且，除非在本文中另有说明或者与上下文明显矛盾，本申请包括以上所述元素的所有可能的变形方式的任意组合。

序列表

<110> 创观（苏州）生物科技有限公司

<120> 源自基因敲除猪的血液产品及其用途

<130> 0094-PA-001CN

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 靶向GGTA1基因的SgRNA核苷酸序列

<400> 1

gaaaataatg aatgtcaa 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 靶向CMAH基因的SgRNA核苷酸序列

<400> 2

gagtaaggta cgtgatctgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 靶向β4GalNT2基因的SgRNA核苷酸序列

<400> 3

ggtagtactc acgaacactc 20

<210> 4

<211> 8505

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GGTA1-CRISPR/Cas9载体的核苷酸序列

<400> 4

tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 60

tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 120

aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 180

aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 240

taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 300

taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 360

agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 420

tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 480

cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 540

agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 600

gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 660

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 720

tgtgagggcc tatttcccat gattccttca tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga 780

gagataattg gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt 840

agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat 900

catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa 960

ggacgaaaca ccgaaaataa tgaatgtcaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 1020

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga 1080

gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca 1140

gacaaatggc tctagaggta cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 1200

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 1260

gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 1320

tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattgtgccc 1380

agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 1440

ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc 1500

cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg 1560

gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc 1620

ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga 1680

ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcga 1740

cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 1800

ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 1860

tagctgagca agaggtaagg gtttaaggga tggttggttg gtggggtatt aatgtttaat 1920

tacctggagc acctgcctga aatcactttt tttcaggttg gaccggtgcc accatggact 1980

ataaggacca cgacggagac tacaaggatc atgatattga ttacaaagac gatgacgata 2040

agatggcccc aaagaagaag cggaaggtcg gtatccacgg agtcccagca gccgacaaga 2100

agtacagcat cggcctggac atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg atcaccgacg 2160

agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg cacagcatca 2220

agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag gccacccggc 2280

tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc tatctgcaag 2340

agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga ctggaagagt 2400

ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc aacatcgtgg 2460

acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag aaactggtgg 2520

acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac atgatcaagt 2580

tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac gtggacaagc 2640

tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc atcaacgcca 2700

gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga cggctggaaa 2760

atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac ctgattgccc 2820

tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag gatgccaaac 2880

tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc cagatcggcg 2940

accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc ctgctgagcg 3000

acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct atgatcaaga 3060

gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg cagcagctgc 3120

ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc ggctacattg 3180

acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg gaaaagatgg 3240

acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg aagcagcgga 3300

ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac gccattctgc 3360

ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc gagaagatcc 3420

tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc agattcgcct 3480

ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa gtggtggaca 3540

agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag aacctgccca 3600

acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg tataacgagc 3660

tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg agcggcgagc 3720

agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc gtgaagcagc 3780

tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc tccggcgtgg 3840

aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt atcaaggaca 3900

aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg ctgaccctga 3960

cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc cacctgttcg 4020

acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc aggctgagcc 4080

ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg gatttcctga 4140

agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac agcctgacct 4200

ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg cacgagcaca 4260

ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca gtgaaggtgg 4320

tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg atcgaaatgg 4380

ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga atgaagcgga 4440

tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc gtggaaaaca 4500

cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg gatatgtacg 4560

tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggaccat atcgtgcctc 4620

agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc gacaagaacc 4680

ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag aactactggc 4740

ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg accaaggccg 4800

agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag ctggtggaaa 4860

cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac actaagtacg 4920

acgagaatga caagctgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc aagctggtgt 4980

ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac taccaccacg 5040

cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag taccctaagc 5100

tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag atgatcgcca 5160

agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc aacatcatga 5220

actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg cctctgatcg 5280

agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt gggataaggg ccgggatttt gccaccgtgc 5340

ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg cagacaggcg 5400

gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc gccagaaaga 5460

aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc tattctgtgc 5520

tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg aaagagctgc 5580

tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac tttctggaag 5640

ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag tactccctgt 5700

tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg cagaagggaa 5760

acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc cactatgaga 5820

agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa cagcacaagc 5880

actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg atcctggccg 5940

acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag cccatcagag 6000

agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc cctgccgcct 6060

tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa gaggtgctgg 6120

acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc gacctgtctc 6180

agctgggagg cgacaaaagg ccggcggcca cgaaaaaggc cggccaggca aaaaagaaaa 6240

agtaagaatt cctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc 6300

tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 6360

ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg 6420

gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gagaatagca ggcatgctgg 6480

ggagcggccg caggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc 6540

gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc 6600

agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca ggggcgcctg atgcggtatt ttctccttac 6660

gcatctgtgc ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc 6720

ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 6780

gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 6840

ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 6900

ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 6960

acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 7020

actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg 7080

atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 7140

aaaatattaa cgtttacaat tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 7200

tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 7260

ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 7320

ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta 7380

taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 7440

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 7500

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 7560

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 7620

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 7680

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 7740

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 7800

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 7860

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 7920

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 7980

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 8040

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 8100

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 8160

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 8220

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtggaagccg cggtatcatt 8280

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 8340

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 8400

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 8460

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctc 8505

<210> 5

<211> 8508

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CMAH-CRISPR/Cas9载体的核苷酸序列

<400> 5

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 60

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 120

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 180

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 240

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 300

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 360

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 420

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 480

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agagataatt ggaattaatt tgactgtaaa cacaaagata ttagtacaaa atacgtgacg 840

tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta 900

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aggacgaaac accgagtaag gtacgtgatc tgtgttttag agctagaaat agcaagttaa 1020

aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttgtttt 1080

agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgttt ttagcgcgtg cgccaattct 1140

gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 1200

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atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattgtg 1380

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 1440

ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 1500

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ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 1680

cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 1740

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aattagctga gcaagaggta agggtttaag ggatggttgg ttggtggggt attaatgttt 1920

aattacctgg agcacctgcc tgaaatcact ttttttcagg ttggaccggt gccaccatgg 1980

actataagga ccacgacgga gactacaagg atcatgatat tgattacaaa gacgatgacg 2040

ataagatggc cccaaagaag aagcggaagg tcggtatcca cggagtccca gcagccgaca 2100

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ggctgaagag aaccgccaga agaagataca ccagacggaa gaaccggatc tgctatctgc 2340

aagagatctt cagcaacgag atggccaagg tggacgacag cttcttccac agactggaag 2400

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tggacgaggt ggcctaccac gagaagtacc ccaccatcta ccacctgaga aagaaactgg 2520

tggacagcac cgacaaggcc gacctgcggc tgatctatct ggccctggcc cacatgatca 2580

agttccgggg ccacttcctg atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc gacgtggaca 2640

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ccagcggcgt ggacgccaag gccatcctgt ctgccagact gagcaagagc agacggctgg 2760

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gcgaccagta cgccgacctg tttctggccg ccaagaacct gtccgacgcc atcctgctga 3000

gcgacatcct gagagtgaac accgagatca ccaaggcccc cctgagcgcc tctatgatca 3060

agagatacga cgagcaccac caggacctga ccctgctgaa agctctcgtg cggcagcagc 3120

tgcctgagaa gtacaaagag attttcttcg accagagcaa gaacggctac gccggctaca 3180

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tcctgacctt ccgcatcccc tactacgtgg gccctctggc caggggaaac agcagattcg 3480

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ccaacgagaa ggtgctgccc aagcacagcc tgctgtacga gtacttcacc gtgtataacg 3660

agctgaccaa agtgaaatac gtgaccgagg gaatgagaaa gcccgccttc ctgagcggcg 3720

agcagaaaaa ggccatcgtg gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg accgtgaagc 3780

agctgaaaga ggactacttc aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa atctccggcg 3840

tggaagatcg gttcaacgcc tccctgggca cataccacga tctgctgaaa attatcaagg 3900

acaaggactt cctggacaat gaggaaaacg aggacattct ggaagatatc gtgctgaccc 3960

tgacactgtt tgaggacaga gagatgatcg aggaacggct gaaaacctat gcccacctgt 4020

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ggcggcagct gctgaacgcc aagctgatta cccagagaaa gttcgacaat ctgaccaagg 4800

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aaacccggca gatcacaaag cacgtggcac agatcctgga ctcccggatg aacactaagt 4920

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tgtccgattt ccggaaggat ttccagtttt acaaagtgcg cgagatcaac aactaccacc 5040

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ccaagagcga gcaggaaatc ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac agcaacatca 5220

tgaacttttt caagaccgag attaccctgg ccaacggcga gatccggaag cggcctctga 5280

tcgagacaaa cggcgaaacc ggggagatcg tgtgggataa gggccgggat tttgccaccg 5340

tgcggaaagt gctgagcatg ccccaagtga atatcgtgaa aaagaccgag gtgcagacag 5400

gcggcttcag caaagagtct atcctgccca agaggaacag cgataagctg atcgccagaa 5460

agaaggactg ggaccctaag aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg gcctattctg 5520

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ctcagtgagc gagcgagcgc gcagctgcct gcaggggcgc ctgatgcggt attttctcct 6660

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agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc 6780

agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 6840

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atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 7560

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caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 8220

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<211> 8508

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体的核苷酸序列

<400> 6

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 60

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 120

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 180

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aggacgaaac accggtagta ctcacgaaca ctcgttttag agctagaaat agcaagttaa 1020

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agcagaaaaa ggccatcgtg gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg accgtgaagc 3780

agctgaaaga ggactacttc aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa atctccggcg 3840

tggaagatcg gttcaacgcc tccctgggca cataccacga tctgctgaaa attatcaagg 3900

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cctttaaaga ggacatccag aaagcccagg tgtccggcca gggcgatagc ctgcacgagc 4260

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accggggcaa gagcgacaac gtgccctccg aagaggtcgt gaagaagatg aagaactact 4740

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agaaggactg ggaccctaag aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg gcctattctg 5520

tgctggtggt ggccaaagtg gaaaagggca agtccaagaa actgaagagt gtgaaagagc 5580

tgctggggat caccatcatg gaaagaagca gcttcgagaa gaatcccatc gactttctgg 5640

aagccaaggg ctacaaagaa gtgaaaaagg acctgatcat caagctgcct aagtactccc 5700

tgttcgagct ggaaaacggc cggaagagaa tgctggcctc tgccggcgaa ctgcagaagg 5760

gaaacgaact ggccctgccc tccaaatatg tgaacttcct gtacctggcc agccactatg 5820

agaagctgaa gggctccccc gaggataatg agcagaaaca gctgtttgtg gaacagcaca 5880

agcactacct ggacgagatc atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagaga gtgatcctgg 5940

ccgacgctaa tctggacaaa gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgggat aagcccatca 6000

gagagcaggc cgagaatatc atccacctgt ttaccctgac caatctggga gcccctgccg 6060

ccttcaagta ctttgacacc accatcgacc ggaagaggta caccagcacc aaagaggtgc 6120

tggacgccac cctgatccac cagagcatca ccggcctgta cgagacacgg atcgacctgt 6180

ctcagctggg aggcgacaaa aggccggcgg ccacgaaaaa ggccggccag gcaaaaaaga 6240

aaaagtaaga attcctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 6300

atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 6360

cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 6420

ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagagaata gcaggcatgc 6480

tggggagcgg ccgcaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg 6540

ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc 6600

ctcagtgagc gagcgagcgc gcagctgcct gcaggggcgc ctgatgcggt attttctcct 6660

tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat acgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt 6720

agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc 6780

agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 6840

tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg 6900

cacctcgacc ccaaaaaact tgatttgggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga 6960

tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc 7020

caaactggaa caacactcaa ccctatctcg ggctattctt ttgatttata agggattttg 7080

ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt 7140

aacaaaatat taacgtttac aattttatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 7200

gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 7260

ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 7320

aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt 7380

ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga 7440

aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 7500

atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 7560

caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 7620

cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 7680

tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 7740

tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 7800

gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 7860

tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 7920

gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 7980

aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 8040

gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 8100

atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 8160

caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 8220

ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtggaag ccgcggtatc 8280

attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 8340

agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 8400

aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 8460

catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctc 8508

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GGTA1基因的SgRNA的正向引物

<400> 7

caccgaaaat aatgaatgtc aa 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GGTA1基因的SgRNA的反向引物

<400> 8

aaacttgaca ttcattattt tc 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CMAH基因的SgRNA的正向引物

<400> 9

caccggagta aggtacgtga tctgt 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CMAH基因的SgRNA的反向引物

<400> 10

aaacacagat cacgtacctt actcc 25

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> β4GalNT2基因的SgRNA的正向引物

<400> 11

caccggtagt actcacgaac actc 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> β4GalNT2基因的SgRNA的反向引物

<400> 12

aaacgagtgt tcgtgagtac tacc 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GGTA1基因的正向引物

<400> 13

ccttagtatc cttcccaacc cagac 25

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GGTA1基因的反向引物

<400> 14

gctttcttta cggtgtcagt gaatcc 26

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CMAH基因的正向引物

<400> 15

cttggaggtg atttgagttg gg 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CMAH基因的反向引物

<400> 16

cattttcttc ggagttgagg gc 22

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> β4GalNT2基因的正向引物

<400> 17

cccaaggatc ctgctgcc 18

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> β4GalNT2基因的反向引物

<400> 18

cgccgtgtaa agaaacctcc 20

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 19

ttttcccagg agaaaataat gaatgtcaaa ggaagagtgg ttctgtc 47

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 20

aggtccatgc aggcgtgagt aaggtacgtg atctgttgga agacagt 47

<210> 21

<211> 47

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 21

gggtagtact cacgaacact ccggagcatg gtcatgagct tgtgggg 47

Claims

1.源自基因敲除猪的血液产品，所述基因敲除猪的GGTA1基因、CMAH基因和β4GalNT2基因被敲除，其中所述β4GalNT2基因中编码8号外显子中一个或多个氨基酸的一个或多个核苷酸缺失，从而使得所述β4GalNT2基因被敲除，其中所述基因敲除猪通过使用CRISPR/Cas9载体组合制备，其中所述GGTA1基因的3号外显子、所述CMAH基因的6号外显子以及所述β4GalNT2基因的8号外显子作为CRISPR/Cas9所靶向的部分，其中所述CRISPR/Cas9载体组合包括GGTA1-CRISPR/Cas9载体、CMAH-CRISPR/Cas9载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体，所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体含有SEQ ID No:1所示的特异性靶向GGTA1基因的SgRNA核苷酸序列，所述CMAH-CRISPR/Cas9载体含有SEQ ID No:2所示的特异性靶向CMAH基因的SgRNA核苷酸序列，且所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体含有SEQ ID No:3所示的特异性靶向β4GalNT2基因的SgRNA核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的血液产品，其中所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体包含SEQ ID No:4所示的核苷酸序列，所述CMAH-CRISPR/Cas9载体包含SEQ ID No:5所示的核苷酸序列，且所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体包含SEQ ID No:6所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的血液产品，其中所述血液产品中包含所述基因敲除猪的红细胞。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的血液产品，其中所述血液产品中包含所述基因敲除猪的外周血单核细胞(PBMC)。

5.根据权利要求3所述的血液产品，其中所述红细胞具有降低的aGal抗原水平、降低的Neu5Gc抗原水平和降低的Sd^a样抗原水平。

6.根据权利要求4所述的血液产品，其中所述PBMC具有降低的aGal抗原水平、降低的Neu5Gc抗原水平和降低的Sd^a样抗原水平。

7.根据权利要求1-2中任一项所述的血液产品，其中与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞与人免疫球蛋白的结合水平降低。

8.根据权利要求1-2中任一项所述的血液产品，其中与源自野生型猪的PBMC相比，所述基因敲除猪的PBMC与人免疫球蛋白的结合水平降低。

9.根据权利要求1-2中任一项所述的血液产品，其中与源自人的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞与人免疫球蛋白的结合水平相当。

10.根据权利要求1-2中任一项所述的血液产品，其中与源自人的PBMC相比，所述基因敲除猪的PBMC与人免疫球蛋白的结合水平相当。

11.根据权利要求1-2中任一项所述的血液产品，其中所述人免疫球蛋白包括人IgG和/或人IgM。

12.根据权利要求1-2中任一项所述的血液产品，其中与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞在人血清中的凝集反应降低。

13.根据权利要求12所述的血液产品，其中所述凝集反应由抗血型抗原的IgM抗体和/或抗血型抗原的IgG抗体引起。

14.根据权利要求1-2中任一项所述的血液产品，其中与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞被输入人体后发生溶血性输血反应的可能性降低。

15.权利要求1-2中任一项的血液产品用于制备向人输注的血液制品的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述向人输注的血液制品基本不引起和/或能够改善超急性免疫排斥反应。