CN111955422A

CN111955422A - 一种可用于异种器官移植的供体猪的构建方法

Info

Publication number: CN111955422A
Application number: CN202010851140.5A
Authority: CN
Inventors: 周小青; 唐成程; 邹庆剑; 陈敏; 赖良学
Original assignee: Wuyi University
Current assignee: Wuyi University
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2020-11-20

Abstract

本发明涉及动物基因工程领域，尤其涉及一种可用于异种器官移植的供体猪的构建方法。本发明的构建方法包括以下步骤：(1)在猪胎儿成纤维细胞的基础上，敲除GGTA1基因，同时转入基因HLA‑G5，得到GTKO/HLA‑G5+克隆细胞；(2)将GTKO/HLA‑G5+克隆细胞作为核供体进行体细胞核移植，培育得到重组胚，将重组胚移植入代孕母猪，妊娠后产仔得到供体猪。本发明构建了具有重要科研价值和应用前景的基因敲除和转基因GTKO/HLA‑G5+克隆猪，为异种器官移植提供重要的研究工具和新的研究途径。

Description

一种可用于异种器官移植的供体猪的构建方法

技术领域

本发明涉及动物基因工程领域，尤其涉及一种可用于异种器官移植的供体猪的构建方法。

背景技术

随着基础研究的不断深入和临床研究的日益完善，器官移植已经成为治疗终末期器官疾病的首选之法。临床医学的发展和免疫抑制剂的开发，更使得同种器官移植获得了显著疗效。但器官资源的严重短缺阻碍了同种器官移植的广泛应用，据统计，目前全球等待移植的病人有600多万人，病人数目还在不断增加，发达国家的器官供应只能满足15％的需要，约五分之一的病人在等待中死亡。日益突出的器官资源供求矛盾使异种器官移植研究应运而生。科学家们普遍认识到如果动物器官也能用于器官移植的话，那器官的来源问题将不再是难题。

目前，许多大动物已被应用于异种器官移植研究，猪，猴，猩猩，狒狒等，其中又以猪的研究最为广泛。究其原因，以猪的器官作为异种供体源，因其有着得天独厚的条件：其一，猪的同类器官与人的器官相比大小形态基本一致；其二，猪的繁殖周期短，生产力高，一窝产仔多；其三，与灵长类动物相比伦理问题相对较少。因此猪被认为是最理想的研究对象。虽然猪的器官结构和大小与人的器官相似，并可能作为异种器官移植的供体来解决器官短缺的问题，但是如果直接把正常的未经修饰的猪的器官移植到病人体内的话，会产生一系列免疫排斥反应，比如超急性排斥反应(HAR)，急性血管性排斥反应(AVR)，急性细胞排斥反应(ACR)等。解决这一问题的关键在于如何对猪的器官进行人源化改造，使其不被受体的免疫系统所排斥。

GGTA1，α-1，3-半乳糖基转移酶基因，其催化生成的α-Gal是超急性排斥反应(Hyperacuterejection，HAR)的诱因。抗原α-Gal存在于猪和其它低等动物的细胞表面，由GGTA1基因调控。人体内不具有α-Gal抗原，但血清中存在大量的抗α-Gal抗体。因此如果进行猪-人异种器官移植，人体内该种抗体将与存在于异种物血管内皮细胞表面的异种抗原特异结合，引起凝血连锁反应，特征为移植物短时间内出血、水肿、衰竭。因此在猪-人异种器官移植中会导致 HAR。移植实验研究发现，取自GGTA1基因敲除猪的心或肾，移植到已免疫抑制的狒狒体内，分别成活179d和83d，与以往的实验结果相比，延长了器官的存活时间，且都克服了HAR，因此敲除猪的GGTA1基因是克服猪异种器官移植免疫排斥反应的第一步。

异种器官移植过程中，NK细胞、CD4+和CD8+T细胞等免疫细胞的功能状态决定了移植物的命运。HLA-G作为一种免疫耐受分子，可与这些免疫细胞表面的特异性受体相互作用，抑制受体的免疫应答作用，延长移植物的存活时间，在移植免疫耐受产生与维持中发挥重要作用。

发明内容

本发明对猪成纤维细胞进行GGTA1基因敲除，同时转入HLA-G5基因，通过体细胞核移植技术获得GGTA1基因敲除且转HLA-G5的克隆猪，为异种器官移植提供新的研究工具和研究途径。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可用于异种器官移植的供体猪的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

(1)在猪胎儿成纤维细胞的基础上，敲除GGTA1基因，同时转入基因 HLA-G5，得到GTKO/HLA-G5+克隆细胞；

(2)将GTKO/HLA-G5+克隆细胞作为核供体进行体细胞核移植，培育得到重组胚，将重组胚移植入代孕母猪，妊娠后产仔得到供体猪。

作为本发明所述的构建方法的优选实施方式，所述敲除GGTA1基因为敲除 GGTA1基因外显子6，所述GGTA1基因外显子6的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。

作为本发明所述的构建方法的优选实施方式，所述敲除方法为TALENs技术。

作为本发明所述的构建方法的优选实施方式，所述TALENs的靶序列如SEQ IDNo.2所示。

作为本发明所述的构建方法的优选实施方式，所述HLA-G5的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。

作为本发明所述的构建方法的优选实施方式，所述转入为将HLA-G5连接到载体pCAG-neo上，然后转入细胞中。

作为本发明所述的构建方法的优选实施方式，所述猪为巴马猪。

作为本发明所述的构建方法的优选实施方式，所述器官包括心脏、脾脏、肺、肾脏、肝脏。

本发明还提供所述的构建方法在生物源性材料免疫学中的应用。

本发明的有益效果：

(1)成功敲除GGTA1基因的同时转基因HLA-G5，实现了基因敲除和转基因技术的结合，证实了多种基因修饰技术同时进行的可行性。

(2)MTT实验验证，GTKO/HLA-G5+克隆猪的PFF比野生型猪的细胞甚至是GTKO/HLA-G5-克隆猪的PFF细胞，在含补体的正常人血清中具有更高的免疫耐受性，说明获得的GTKO/HLA-G5+克隆猪比野生型，甚至是简单的 GGTA1敲除猪更适合用做异种器官移植供体。

附图说明

图1为本发明GGTA1基因TALENs靶序列图；A图为TALENs Set1靶点识别序列图示，RVD与碱基的识别规律：NI识别A、NG识别T、HD识别C、 NN识别G；B图为TALENs Set2靶点识别序列图示。

图2为本发明pCAG-HLA-G5-neo表达载体示意图。

图3为本发明pCAG-HLA-G5-neo表达载体的酶切鉴定电泳图；A图为Sca Ⅰ和SacⅠ双酶切鉴定；B图为HindⅢ单酶切鉴定；M为15000bp的Marker；1、 2分别为待鉴定的表达载体。

图4作为核移植供体的克隆HLA-G5转基因鉴定图；M为2000Marker，PC 为阳性对照，NC为阴性对照，H₂O为空白对照水。

图5为GTKO/HLA-G5+克隆猪图片。

图6为GTKO/HLA-G5+克隆猪转基因HLA-G5鉴定图；M为2000Marker， P为阳性对照，N为阴性对照，H₂O为空白对照水。

图7为Isolectin-GS-IB4细胞免疫荧光结果；WT为野生型PFF，G3为来自GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的PFF。

图8为Isolectin-GS-IB4流式细胞分析；WT为野生型PFF，G3为来自 GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的PFF。

图9为M86细胞免疫荧光结果；WT为野生型PFF，G3为来自 GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的PFF。

图10为M86免疫组化；WT为野生型PFF，G3为来自GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的PFF。

图11为HLA-G5 Weatern Blot；WT为野生型PFF，G3为来自 GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的PFF。

图12为HLA-G5组织免疫荧光；WT为野生型PFF，G3为来自 GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的PFF。

图13为HLA-G5细胞免疫荧光；WT为野生型PFF，G3为来自 GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的PFF。

图14为MTT比色法检测克隆猪细胞的免疫耐受性结果图；DMEM为空白对照，WT为野生型PFF，GTKO为GTKO/HLA-G5-克隆猪的PFF，GTKO/HLA-G 为GTKO/HLA-G5+克隆猪的PFF。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

本发明涉及的序列：

(1)SEQ ID No.1：猪GGTA1基因外显子6的核苷酸序列；

(2)SEQ ID No.2：TALENs Set1靶点识别序列；

(3)SEQ ID No.3：TALENs Set2靶点识别序列；

(4)SEQ ID No.4：HLA-G5基因氨基酸序列；

(5)SEQ ID No.5：HLA-G5基因核苷酸序列。

术语TALENs：TALENs(类转录激活因子效应物核酸酶)技术是一种新型的序列特异核酸酶介导的基因定点修饰技术，由黄单胞杆菌转录激活类效应子 TALE的DNA结合域和核酸内切酶FokⅠ的DNA切割域组成，前者负责识别靶 DNA，后者负责切割DNA。TALE蛋白含有一个串联重复结构域，由多个33～35个氨基酸重复模块组成，每个模块的氨基酸高度保守，仅在其第12和13位相邻的两个氨基酸是可变的(通常称为重复可变双残基，RVD)，每个RVD能特异识别一种核苷酸，识别规律为NG识别T，NN识别G，NI识别A，HD识别C。当TALEN与DNA结合后，其切割域Fok I与另一个相邻的、方向相反的切割域Fok I形成二聚体切割DNA，产生DNA双链断裂(DSB)，其DNA 断裂点在修复过程中可通过非同源末端连接(NHEJ)的不精确修复方式产生基因的定点突变，或通过同源重组(HR)精确的修复方式产生基因定点插入或替换。无论通过哪种修复方式，均可获得不同于野生型的DNA序列，因此TALENs 技术可实现对靶标基因的修饰。

实施例1 GGTA1-TALENs的构建

(1)TALENs靶序列的设计

根据TALENs靶序列设计原则，在猪GGTA1基因外显子6(核苷酸序列如 SEQ IDNo.1所示)设计靶序列，构建2对TALENs，TALENs Set1和TALENs Set2，TALENs靶点识别序列见图1中的A和B。TALENs Set1靶点识别序列长度分别为17bp、16bp，间隔序列长度为16bp；TALENs Set2靶点识别序列长度分别为16bp、16bp，间隔序列长度为19bp。

表1 TALENs靶序列

注：两侧的大写字母分别为左臂TALEN模块识别序列(L)和右臂TALEN 模块识别序列(R)，中间小写字母为间隔序列。

(2)GGTA1-TALENs双元表达载体的构建

①参考文献(Highly efficient generation of GGTA1 biallelic knockoutinbred mini-pigs with TALENs.Xin J,Yang H,Fan N,Zhao B,Ouyang Z,Liu Z,Zhao Y,Li X,Song J,Yang Y,Zou Q,Yan Q,Zeng Y,Lai L.)分别构建得到GGTA1-TALENs 双元表达载体GGTA1-TALENs Set1和GGTA1-TALENs Set2。

②质粒的选择

分别将构建好的载体GGTA1-TALENs Set1和GGTA1-TALENs Set2通过电转的方式转染PFF细胞，发现TALENs Set1打靶效率高达56％，远远高于 TALENs Set2(表2)，因此选择打靶效率较高的TALENs Set1作为打靶载体。大量提取GGTA1-TALENs Set1质粒，-80度冻存备用。

表2 TALENs预实验结果统计图

实施例2 pCAG-HLA-G5-neo表达载体的构建

将HLA-G5基因片段与pCAG-neo载体用相同的内切酶进行双酶切，切胶回收后16℃连接过夜，转化挑取单克隆进行酶切鉴定和测序鉴定。构建得到的pCAG-HLA-G5-neo表达载体总长7395bp，用ScaⅠ和SacⅠ双酶切进行酶切出现三条大小分别为4128bp、2169bp、1098bp的目的带(图3A)；用HindⅢ单酶切出现大小为6022bp和1373bp的目的带(图3B)。

酶切鉴定正确的两个质粒送华大基因进行测序鉴定，测序结果表明两个克隆都是正确的，随机选择1号作为最终使用的表达载体。用SacⅠ内切酶对表达载体进行线性化，酶切产物纯化回收后-80℃冻存备用。

实施例3 TALENs转染介导的GGTA1基因打靶PFF

(1)原代的巴马猪胎儿成纤维细胞PFF的分离

剖腹产手术取出妊娠35d猪胎儿，浸泡在添加50μg/mL的卡那霉素和 100IU/mL青霉素，100g/mL链霉素PBS中带回实验室。小心剥离胎儿及胎衣，将胎儿分别放置在PBS(含100IU/mL青霉素，100 g/mL链霉素)中，先取头，四肢，内脏等组织，装于EP管中，用于下步基因组提取。剩余胎儿组织清洗5 次，剪碎，加入猪原代PFFs分离消化液10mL，放入38℃培养箱消化约4h，其间多次用枪头吹打，并观察消化情况；待多数组织块消化为单个细胞后，将其转移到15mL的离心管中，1000rpm，5min，收集细胞，弃上清后将细胞用PFFs 培养基清洗2次，然后用含100IU/mL青霉素，100g/mL链霉素的PFFs培养基培养。第二天观察细胞贴壁情况，并换培养液，细胞形成细胞单层至80-90％汇合后，用0.05％胰酶消化后离心收集细胞，准备细胞冻存液，冻存细胞。

(2)将实施例1中提取得到的GGTA1-TALENs Set1质粒(20ug)与实施例2中得到的pCAG-HLA-G5-neo表达载体(20ug)混合共转入原代的巴马猪胎儿成纤维细胞PFF中，进行为期10天左右的G418筛选后，挑取一定量的细胞克隆后进行PCR扩增后测序鉴定。

总共挑取了124个细胞克隆，测序结果表明GGTA1基因的打靶效率为 56.4％，其中单敲效率38.7％，双敲效率17.7％(见表3)。在这些检测的双敲 GTKO克隆细胞(即两条染色体上的GGTA1基因都被敲除的克隆细胞)中， GGTA1基因的突变范围从2bp的插入到163bp的缺失不等。在这些双敲克隆中，选择培养状态和敲除方式较好的几株克隆作为核移植供体(见表4)，其中几乎百分之九十的细胞都是转HLA-G5阳性的克隆(见图4和表4)。

表3 GGTA1-TALENs Set1介导的基因打靶PFF统计图

表4核移植供体细胞

注：Indel表示碱基的插入或缺失；+表示HLA-G5阳性；-表示HLA-G5阴性。

实施例4 GTKO/HLA-G5+克隆猪的制作

为了增加受体怀孕率，避免单个细胞克隆影响胚胎质量，选择状态较好的几株不同敲除方式的GTKO/HLA-G5+克隆细胞混合后，作为核供体进行体细胞核移植，过夜培育后将重组胚移植入代孕母猪，自然妊娠约114天后产仔。

总共移植了1997个重组胚胎，分别植入12头代孕母猪，其中有7头经B 超检测成功怀孕到期，产下总共20头克隆仔猪(图5)。经测序鉴定，20头仔猪一半为阳性，即GTKO/HLA-G5+克隆猪，另一半为GTKO/HLA-G5-克隆猪(见表5、表6、图6)。

表5体细胞核移植和胚胎移植统计图

表6 GTKO/HLA-G5⁺克隆猪基因型

实施例5 GTKO/HLA-G5+克隆猪的组织学分析

(1)Gal表位的Isolectin-GS-IB4鉴定

Isolectin-GS-IB4是一种能与Gal表位结合的凝集素，当其与Gal表位结合的时候能产生一种在荧光显微镜下或流式细胞仪观察得到的绿色荧光，因此可用于检测Gal表位的有无。

利用细胞免疫荧光的方法，对从实施例4中得到的GTKO/HLA-G5+克隆猪 G3耳朵分离的PFF和野生型PFF进行了GS-IB4染色，结果表明：野生型PFF 可见明显的绿色荧光，而来自于GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的PFF则没有观察到绿色荧光(见图7)。

此外，我们还将GS-IB4染色的两种PFF经流式细胞分析，发现其和免疫细胞的结果一样，野生型PFF全部为Gal表位阳性，而来自于GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的PFF都表现为Gal表位阴性(见图8)，表明GTKO/HLA-G5+克隆猪细胞表面的Gal表位已经缺失。

(2)Gal表位的M86抗体鉴定

M86为抗Gal表位的抗体，可用于检测Gal表位的有无。

细胞免疫荧光结果显示：野生型PFF可见明显的绿色荧光，而来自于 GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的PFF则没有观察到绿色荧光(见图9)。各种组织的免疫组化结果显示：野生型猪的心、肝、脾、肺等组织有明显的Gal表位的表达，而来自于GTKO/HLA-G5+克隆猪的各种组织则没有Gal表位的表达(见图10)，皆表明GTKO/HLA-G5+克隆猪各组织细胞表面的Gal表位已经缺失。

(3)HLA-G5表达的鉴定

PCR鉴定克隆猪的基因型后，需要更进一步检测转基因HLA-G5的蛋白表达情况。分别取GTKO/HLA-G5+克隆猪和同龄野生型猪的猪耳、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等组织进行Western Blot，可见GTKO/HLA-G5+克隆猪的猪耳、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等组织皆有HLA-G5的表达，而野生型的各组织都没有(见图11)。

取各种组织的切片做组织免疫荧光，可见GTKO/HLA-G5+克隆猪的心脏、脾脏、肺、肾脏等组织皆有绿色荧光(即HLA-G5的表达)，而野生型的各组织都没有(见图12)。同时分离出GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的成纤维细胞PFF 进行细胞的免疫荧光，与组织免疫荧光的结果一致，来自GTKO/HLA-G5+克隆猪耳的PFF可见绿色荧光(即HLA-G5的表达)，而野生型PFF没有(图13)。这一系列实验结果皆表明：转基因HLA-G5在GTKO/HLA-G5+克隆猪各组织表达成功。

实施例6 GTKO/HLA-G5+克隆猪的功能学分析

MTT比色法(MTT Assay)：一种检测细胞存活和生长的方法。

为了检测克隆猪细胞的免疫耐受性，对来自GTKO/HLA-G5+克隆猪的PFF、来自GTKO/HLA-G5-克隆猪的PFF和野生型PFF进行人血清培养。

结果发现：经人血清培养48小时后，来自GTKO/HLA-G5+克隆猪的PFF 的细胞活性为75％，来自GTKO/HLA-G5-克隆猪的PFF细胞活性为62％，而野生型PFF仅为23％(见图14)。表明来自GTKO/HLA-G5+克隆猪的PFF比野生型猪的细胞甚至是GTKO/HLA-G5-克隆猪的PFF细胞，在含补体的正常人血清中具有更高的免疫耐受性。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 五邑大学

<120> 一种可用于异种器官移植的供体猪的构建方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 694

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atacattgag cattacttgg aggagttctt aatatctgca aatacatact tcatggttgg 60

ccacaaagtc atcttttaca tcatggtgga tgatatctcc aggatgcctt tgatagagct 120

gggtcctctg cgttccttta aagtgtttga gatcaagtcc gagaagaggt ggcaagacat 180

cagcatgatg cgcatgaaga ccatcgggga gcacatcctg gcccacatcc agcacgaggt 240

ggacttcctc ttctgcatgg acgtggatca ggtcttccaa aacaactttg gggtggagac 300

cctgggccag tcggtggctc agctacaggc ctggtggtac aaggcacatc ctgacgagtt 360

cacctacgag aggcggaagg agtccgcagc ctacattccg tttggccagg gggattttta 420

ttaccacgca gccatttttg ggggaacacc cactcaggtt ctaaacatca ctcaggagtg 480

cttcaaggga atcctccagg acaaggaaaa tgacatagaa gccgagtggc atgatgaaag 540

ccatctaaac aagtatttcc ttctcaacaa acccactaaa atcttatccc cagaatactg 600

ctgggattat catataggca tgtctgtgga tattaggatt gtcaagatag cttggcagaa 660

aaaagagtat aatttggtta gaaataacat ctga 694

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cttatcccca gaatactgct gggattatca tataggcatg tctgtggat 49

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cttccaaaac aactttgggg tggagaccct cccccagtcg gtggctcagc t 51

<210> 4

<211> 296

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro

1 5 10 15

Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr

20 25 30

Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro

35 40 45

Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu

50 55 60

Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln

65 70 75 80

Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu

85 90 95

Gln Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg

100 105 110

Gly Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn

115 120 125

Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser

130 135 140

Lys Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr

145 150 155 160

Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly

165 170 175

Lys Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His

180 185 190

His Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly

195 200 205

Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp

210 215 220

Gln Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly

225 230 235 240

Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln

245 250 255

Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met

260 265 270

Leu Arg Trp Ser Lys Glu Gly Asp Gly Gly Ile Met Ser Val Arg Glu

275 280 285

Ser Arg Ser Leu Ser Glu Asp Leu

290 295

<210> 5

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gcgggctccc actccatgag gtatttcagc gccgccgtgt cccggcccgg ccgcggggag 60

ccccgcttca tcgccatggg ctacgtggac gacacgcagt tcgtgcggtt cgacagcgac 120

tcggcgtgtc cgaggatgga gccgcgggcg ccgtgggtgg agcaggaggg gccagagtat 180

tgggaagagg agacacggaa caccaaggcc cacgcacaga ctgacagaat gaacctgcag 240

accctgcgcg gctactacaa ccagagcgag gccagttctc ataccctcca gtggatgatt 300

ggctgcgacc tggggtccga cggacgcctc ctccgcgggt atgaacagta tgcctacgat 360

ggcaaggatt acctcgccct gaacgaggac ctgcgctcct ggaccgcagc ggacactgcg 420

gctcagatct ccaagcgcaa gtgtgaggcg gccaatgtgg ctgaacaaag gagagcctac 480

ctggagggca cgtgcgtgga gtggctccac agatacctgg agaacgggaa ggagatgctg 540

cagcgcgcgg acccccccaa gacacacgtg acccaccacc ctgtctttga ctatgaggcc 600

accctgaggt gctgggccct gggcttctac cctgcggaga tcatactgac ctggcagcgg 660

gatggggagg accagaccca ggacgtggag ctcgtggaga ccaggcctgc aggggatgga 720

accttccaga agtgggcagc tgtggtggtg ccttctggag aggagcagag atacacgtgc 780

catgtgcagc atgaggggct gccggagccc ctcatgctga gatggagtaa ggagggagat 840

ggaggcatca tgtctgttag ggaaagcagg agcctctctg aagaccttta a 891

Claims

1.一种可用于异种器官移植的供体猪的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

(1)在猪胎儿成纤维细胞的基础上，敲除GGTA1基因，同时转入基因HLA-G5，得到GTKO/HLA-G5+克隆细胞；

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述敲除GGTA1基因为敲除GGTA1基因外显子6，所述GGTA1基因外显子6的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述敲除方法为TALENs技术。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述TALENs的靶序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述HLA-G5的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述转入为将HLA-G5连接到pCAG-neo载体上，然后转入细胞中。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述猪为巴马香猪。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述器官包括心脏、脾脏、肺、肾脏、肝脏。

9.权利要求1-8任一所述的构建方法在生物源性材料免疫学中的应用。